Summary
당사는 생체 내 수지상 세포 표적화를 위한 내분균 수용체 특이적 항체에 대한 모델 항원 배부안의 화학적 결합을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 항체의 정제, 항원의 화학적 융합, 공자의 정제 및 효율적인 유도의 검증을 포함한다.
Abstract
생체 내에서 수지상 세포(DC)를 교차 제시하는 표적 항원 전달은 T 이펙터 세포 반응을 효율적으로 유도하고 백신 설계에 있어 귀중한 접근법을 표시한다. 항원은 섭취량, 처리 및 MHC 급 I-및 II-프레젠테이션을 유도하는 DEC-205와 같은 내분비수용체에 특이적 항체를 통해 DC에 전달된다.
적합한 항체에 원하는 항원을 효율적이고 신뢰할 수 있는 유도는 DC 표적화에 중요한 단계이며 다른 요인들 사이에서는 항원의 형식에 달려 있다. 정제된 항체에 대한 전길이 단백질의 화학적 융합은 하나의 가능한 전략이다. 과거에는 마우스에서 생체내 DC 표적 연구를 위한 모델 항원 ovalbumin(OVA)과 DEC-205 특이적 IgG2a 항체(αDEC-205)의 교차 연결을 성공적으로 확립했습니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 NLDC(비 림프수성 수지상 세포)-145 hybridoma의 상퍼상에서 항체의 정제이다. 정제된 항체는 설포-SMCC(설포스쿠치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] 사이클로헥산-1-카박스실레이트)에 의해 화학적 결합을 위해 활성화되는 동시에 OVA 단백질의 황피드릴-그룹은 TCEP-HCl(2-카로이)을 가진 배양을 통해 노출된다. 과잉 TCEP-HCl 및 설포-SMCC는 제거되고 항원들은 밤새 결합을 위한 활성 항체와 혼합된다. 생성된 αDEC-205/OVA 컨쥬게이트는 비바운드 OVA에서 농축되고 해방됩니다. ΑDEC-205에 대한 OVA의 성공적인 결합은 서양 블롯 분석 및 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA)에 의해 검증된다.
우리는 성공적으로 간에서 세포 독성 T 세포 반응을 유도하고 DEC-205+ DC의 생체 내 표적에 따라 유머 및 세포 면역을 유도에 자신의 잠재력에 대한 다른 보조제를 비교하기 위해 화학적으로 교차 αDEC-205 / OVA를 사용했다. 그 외에도, 이러한 화학적으로 결합된 항체/항원 접합체는 종양 항원에 대한 백신 반응의 효율적인 유도를 위한 귀중한 도구를 제공하며 다양한 유형의 종양의 예방 및 치료에 관한 고전적인 예방 접종 접근법보다 우수하다는 것이 입증되었습니다.
Introduction
수지상 세포 (DC)는 면역 계통의 중앙 선수입니다. 그(것)들은 항원 프리젠 테이션에 전문화된 세포의 다양한 단이고 그들의 주요 기능은 선천적이고 적응성 면역1,2를다리를 하는 것입니다. 중요한 것은, DC는 효율적이고 특정 병원체 지향 반응에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 항종양 면역1,3의많은 측면에 관여한다.
호스트 면역에서 그들의 독점적인 역할 때문에, DC는 백신접종4를위한 표적 세포로 집중하게 되었습니다. 한 가지 접근법은 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 DC에 항원을 표적으로 하고 지난 몇 년 동안,많은 연구가 적합한 수용체를 정의하고 전략을1,4로지정하는 데 전념해 왔다. 한 가지 예는 C형 렉틴 수용체 DEC-205이며, 이는 내분비증을 유도하기 위해 DEC-205 특이적 항체에 의해 표적으로 할 수 있다. 중요한 것은, DEC-205 표적화는 적절한 보조제와 의 조합으로 수명이 다수 및 보호 CD4+ 및CD8+ T 세포뿐만 아니라 항체 반응뿐만 아니라, 종양 항원3,5,6,7,8,9에대해 효율적으로 유도하는 것으로 나타났다.
DC를 대상으로 한 공주항원을 보여주는 여러 연구가 있는데, 이는 공주항원3,5,10,11,12보다우수하다. 이를 통해 각 DC에 항원을 합산하여 DC 표적화 접근법의 중심 단계인 모이티를 표적으로 한다. 항체 또는 항체 단편을 통한 DC 표적화의 경우, 항원은 화학적으로 또는 유전적으로 연결될 수 있으며 어느 전략중 하나는 자체(dis)의 장점을제공한다. 한편, 유전자 조작된 항체-항원 구조에서는 로트1사이의 우수한 비교성을 제공하는 위치뿐만 아니라 항원 투여량에 대한 제어가 있다. 그러나 동시에 화학 적 융합은 더 적은 준비가 필요하며 특히 실험 및 전임상 모델에서 다른 항원 및 / 또는 예방 접종 전략을 테스트하고 비교하려고 할 때 더 많은 유연성을 제공합니다.
여기서, 우리는 OValbumin (OVA)의 효율적이고 신뢰할 수있는 화학 적 연상을 위한 프로토콜을 12-205 특이적 IgG2a 항체 (αDEC-205)로 단백질 항원으로 마우스에서 생체 내 DC 표적화에 적합한 프로토콜을 제시한다. 먼저, αDEC-205는 NLDC-145 혼종세포로부터 정제된다(13). 화학적 결합을 위해, 이트로비기능 크로스링커 설포시치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] CYclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), NHS (N-하이드록시스쿠니미드) 에스테르와 말리미드 군을 포함하는, 유자 결합을 허용- 유체 결합- 유체 - 유체 - 분자의 결합을 허용. 구체적으로, 항체의 1차 아민은 처음에 황포-SMCC와 반응하고 그 결과 남성-염활성 αDEC-205는 TCEP-HCl(Tris(2-carboxyethyl) 인산염염을 통해 감소된 황피드릴 함유 OVA 단백질과 반응한다. 최종 제품은 화학적으로 cojujugated αDEC-205/OVA(그림 1). 화학 적 공짜 자체를 넘어, 우리의 프로토콜은 공자에서 과잉 OVA의 제거뿐만 아니라 서쪽 얼룩 분석 및 특정 효소 연결 면역 소르벤트 분석을 통해 성공적인 컨쥬게이션의 검증을 설명합니다. 우리는 성공적으로 αDEC-205에 OVA 및 그밖 단백질 또는 면역원성 펩티드를 화학적으로 컨쥬게이트하기 위하여 과거에 이 접근을 성공적으로 채택했습니다. 우리는 생체 내 의 CD11c+ 세포뿐만 아니라 생체 내세포 및 유머 면역의 효율적인 유도에 효율적인 결합을 입증한다.
확실히, 최종 컨쥬게이트 내에서 항원의 정확한 투약에 로트-투-로트 비교및 와 같은 이 방법에 대한 단점이 있다. 그럼에도 불구하고, 화학 적 융합은 유전자 조작 된 구조에 비해 항체 및 단백질 항원의 선택에 실험적 유연성을 제공합니다. 따라서, 우리는 이 접근법이 임상 전 마우스 모형에 있는 DC 표적화에 있는 그들의 효율성을 위해 다른 항원 평가에 특히 가치가 있다고 믿습니다, 또한 특정 항종양 면역 반응의 맥락에서.
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Protocol
모든 기술된 동물 실험은 지방 정부 기관에 의해 승인되었다 (니데르세흐시쉬 란데삼트 퓌르 Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; 파일 번호 33.12-42502-04-10/0108) 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었다.
1. 하이브리드 종 세포주 NLDC-145에서 αDEC-205의 생산
- 항체 생산을 위해, 해동 극저온 보존 NLDC-145 세포는 수조에서 37°C에서 αDEC-205를 생산한다. 셀을 37°C 및 5% CO로 확장2. 2 75 cm2 병은 항체 생산을 진행하기 위하여 필요합니다. 안전한 작업 조건을 보장하고 배양물의 오염을 방지하기 위해 안전 캐비닛에서 세포 배양 절차를 수행해야 합니다.
- 해동 된 세포의 1 mL (1 x 106 - 5 x 106 세포 /mL)의 9 mL에서 1 % 페니실린 / 연쇄 상 절제술 (37 °C로 미리 데워져 37 °C)로 보충하여 세포 배양 플라스크 (25cm2)로재차 중단합니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 수평으로 37°C, 5% CO2로놓는다.
- 세포는 37°C 및 5% CO2에서70%까지 배양합니다. 이것은 일반적으로 24 - 48 시간 후에 달성되어야합니다.
- 일단 세포가 70% 컨실루인 후에, 1-10mL의 피펫이 있는 파이펫 컨트롤러를 사용하여 전체 NLDC-145 세포 서스펜션(10 mL)을 15mL 원심분리기 튜브로 이송한다. 실온에서 10 분 동안 250 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
- 수조에서 ISF-1 중간~37°C를 미리 데우고 1% 페니실린/연쇄절제술을 보충한 ISF-1 배지의 12mL에서 펠릿을 재연한다. 재중단된 세포 현탁액을 신선한 세포 배양 플라스크(75cm2)로옮기다.
- 37°C및 5%CO2에서1% 페니실린/연쇄절제술을 1% 보충한 ISF-1 배지에서 세포를 배양하고 확장하여 70%의 컨실루션과 99%까지 가능하다. 이것은 일반적으로 48 - 72 시간 후에 달성되어야합니다.
- 셀을 75cm2 플라스크 두 개로 분할합니다. 이를 먼저 세포 배양플라스크/배양 표면을 세포 현탁액으로 플러시하여 표면에서 모든 NLDC-145 세포를 제거한다. NLDC-145 셀 서스펜션 6mL을 각각 2개의 신선한 75cm2병 중 하나에 옮기고 1% 페니실린/연쇄 절제술을 1%로 보충한 사전 데운 ISF-1 배지를 최대 12mL로 추가합니다.
참고: NLDC-145 세포가 배지를 조절했기 때문에 세포 배양 배지를 갱신하지 마십시오. 세포를 배지와 함께 옮기고 배양을 원하는 부피로 신선한 배지로 채웁니다. 이것은 NLDC-145 세포에 의한 생존력 과 최대 항체 생산을 위해 중요합니다. - 세포 배양을 37°C 및 5% CO2로확장하여 일반적으로 48-72h 후에 달성되는 약 70%의 컨실수까지 확장합니다.
- 일단 세포가 70% 컨캔트되면, 75cm2병의 각에서 확장된 NLDC-145 셀 서스펜션의 10mL를 하나의 PETG(폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜) 롤러보병(1,050cm2)으로옮긴다. 이를 위해, 세포 배양 플라스크 바닥/배양 표면을 세포 현탁액으로 플러시하여 파이펫 컨트롤러 및 10mL 파이펫을 사용하여 표면에서 모든 세포를 제거한다.
- 140mL의 ISF-1 배지를 1%의 페니실린/연쇄절제술(37°C로 미리 데워링)을 중간 병에서 150mL 마크까지 채우는 NLDC-145의 각 NLDC-145에 직접 내다보도록 한다.
참고: 1.1.6 단계에서 참고 를 참조하십시오. - 37°C에서 롤러병을 배양하고, 3일 동안 5% CO2 및 25라운드/분으로 배양합니다.
- 150mL의 ISF-1 배지를 NLDC-145에 각각 1%의 페니실린/연쇄절제술(37°C로 미리 데워링)하여 300mL 마크까지 충전합니다.
- 37°C에서 각각 300mL 배양을 함유하고 있으며, 5% CO2 및 25라운드/분으로 3일간 배양한다.
- 1% 페니실린/연쇄절제술(37°C로 미리 데워져 37°C로 미리 데워져) 롤러병을 함유한 ISF-1 배지의 100mL를 추가하여 400mL 마크까지 채웁니다.
- 배양 롤러 병은 이제 37 °C에서 각각 400 mL 배양을 포함, 5 % CO2 및 25 라운드 / 분 또 다른 7 일 동안.
참고: 이번 주 동안 배양은 매우 조밀해지고(최대 95% 밀도) 생존율이 감소(최대 50%까지 감소)하여 최대 항체 방출을 가능하게 합니다.
- 배양으로부터 αDEC-205의 정제를 위해 NLDC-145 셀 서스펜션(두 롤러병에서)을 500mL 오토클레이브 원심분리병에 직접 부어 넣습니다.
참고: 총 800mL의 문화권량을 수집해야 합니다.- 원심분리기는 세포와 이물질을 제거하기 위해 8,600 x g 및 4°C에서 30분 동안 배양한다.
- 수퍼네이츠를 수집하고 펠릿을 버리고 멸균 시약 병에 슈퍼네티를 풀링합니다.
참고: αDEC-205의 정제는 즉시 시작될 수 있다(단계 2.) 또는 상퍼는 4°C에서 단기적으로 저장될 수 있다.
2. NLDC-145 세포 상수로부터 αDEC-205 항체의 정제
참고: NLDC-145 세포 상수체로부터 αDEC-205는 단백질 G 세포로즈 컬럼(재사용 가능)을 사용하여 정제된다. 컬럼 치수는 15mm x 74mm, 5mL 단백질 G 세파로즈는 열당 포장되어 있습니다.
- 단백질 G Sepharose 컬럼의 준비 및 세척을 위해, 단백질 G Sepharose 컬럼의 상부 개구부에 밀폐 고무 플러그를 두십시오. 두 개의 멸균 카누라 (20 G x 1/2", 0.90 x 40mm)로 고무 플러그를 펑크.
- 10mL 주사기를 두 캐뉼라 중 하나에 연결하고 유연한 실리콘 튜브(길이 약 100cm, 직경 2.5~ 3mm)에 튜브 커넥터를 두 번째 캐뉼라에 연결합니다.
참고: 주사기/고무 플러그 구조는 재사용 가능하며 진공을 제공하여 단백질 G Sepharose 컬럼에 상류성 배양물의 대량의 지속적인 흐름을 초래합니다. 이를 위해 주사기의 플런저를 약간 뒤로 당겨 다음 단계에서 연속 유체 흐름을 보장합니다. - 0.1 M 빙하 아세트산(pH 2)의 50mL로 컬럼을 세척하여 이전의 항체 정제로부터 잠재적으로 남은 항체를 제거한다. 실리콘 튜브의 끝을 0.1 M 빙하 아세트산(pH 2)에 넣고 시약병을 채운다. 유도진공의 결과로, 0.1M 빙하 아세트산(pH 2)의 50mL은 단백질 G 세파로즈 컬럼을 통해 드롭방향으로 실행된다.
참고: 0.1 M 빙하 아세트산(pH 2)은 시약병에 보관하거나 비커에 새로 채워져야 한다. - 100-200mL 인산염 완충식식염(PBS)으로 컬럼을 세척합니다. 실리콘 튜브의 끝을 PBS 채워진 시약 병 이나 비커에 넣습니다. 단백질 G 세파로즈 컬럼을 통해 100-200 mL PBS를 드롭방향으로 실행하십시오.
- 10mL 주사기를 두 캐뉼라 중 하나에 연결하고 유연한 실리콘 튜브(길이 약 100cm, 직경 2.5~ 3mm)에 튜브 커넥터를 두 번째 캐뉼라에 연결합니다.
- NLDC-145 상체로부터의 항체 정제를 위해 NLDC-145 상류체(1.2.2단계에서 얻은)의 800mL를 컬럼에 적재한다. NLDC-145 상수 채워진 시약 병에 실리콘 튜브의 끝을 넣습니다. 800 mL NLDC-145 상체가 열을 통해 드롭 방향으로 실행하자.
- PBS의 500mL로 열을 씻으시다. PBS 채워진 시약 병 또는 비커에 실리콘 튜브의 끝을 넣습니다. 500mL PBS가 열을 통해 드롭 방향으로 실행되도록 합니다.
- 용출의 경우, 각 1.5mL 튜브에 20 1.5 mL 튜브및 파이펫 100 μL을 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)을 사용하십시오. 컬럼으로부터 고무 플러그를 제거하고 0.1M 글리신(pH 3)의 페펫 1 mL을 단백질 G 세파로즈 컬럼의 상부 챔버로 제거하여 컬럼으로부터 항체를 엘로트한다. 준비된 1.5mL 튜브 중 하나에서 용출으로 직접 흐름을 수집합니다.
- 모든 20개의 튜브(1.5mL)에 대해 용출 단계(2.2.2.)를 반복한다.
- 항체 함유 분획을 식별하기 위해 분광계를 이용하여 280nm(OD280)에서모든 용출 분획의 광학 밀도를 결정한다.
참고: 첫 번째 용출 분획을 공백으로 사용합니다. - 0.5(약 10분수)를 초과하는 OD280의 모든 분수를 풀.
- 4°C에서 20% 에탄올로 채워진 단백질 G 세파로즈 컬럼을 저장합니다.
- 12-14kDa의 분자량 차단(MWCO)을 이용한 투석 튜브를 사용하여 하룻밤 4°C에서 1000mL PBS(2000mL 비커)에 대한 풀링 된 elutions를 투석합니다.
- 투석 튜브를 20cm 조각으로 자른다. 투석 튜브를 10m EDTA(pH 7.5)의 500-800mL로 끓여 온수판을 사용하여 비커에서 30분간 끓여 오염을 제거합니다. 10mM EDTA(pH 7.5) 용액을 버리고 투석 튜브를 10분 동안 탈온수로 끓입니다.
참고: 투석 튜브는 직접 사용하거나 다음 사용까지 4°C에서 0.01% 나트륨 아지드(NaN3)/H2O 용액에 저장할 수 있습니다. - 투석 튜브의 바닥을 적절한 투석 튜브 클로저/단일 피스, 힌지 클램프로 닫고 항체 용출을 투석 튜브에 조심스럽게 피펫합니다. 투석 튜브의 상단을 두 번째 클램프로 닫습니다.
- 투석 튜브의 상부 클램프를 부동 스탠드에 고정하고, 마그네틱 스터드 바와 함께 PBS 채워진 비커에 넣고 비커를 자기 교반기 위에 놓습니다.
- 4 °C에서 밤새 저어줍니다.
- 투석 튜브를 20cm 조각으로 자른다. 투석 튜브를 10m EDTA(pH 7.5)의 500-800mL로 끓여 온수판을 사용하여 비커에서 30분간 끓여 오염을 제거합니다. 10mM EDTA(pH 7.5) 용액을 버리고 투석 튜브를 10분 동안 탈온수로 끓입니다.
- αDEC-205의 농도를 높이기 위해 10kDa MWCO를 사용하여 원심 농축기에 완전한 투석기를 적재합니다. 튜브 의 하나의 클램프를 열고 조심스럽게 투석 튜브에서 원심 농축기 (10 kDa MWCO)로 투석 튜브에서 파이펫을 피펫.
참고: 피펫 끝으로 농축기 바닥을 만지지 마십시오.- 693 x g (2,000 rpm) 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리기.
- 10mL의 PBS 및 원심분리기의 원심 농축기를 693 x g(2,000rpm) 및 4°C로 로드하여 항체 용액의 최종 부피가 1-1.5mL가 될 때까지 적재한다.
참고: 필요한 경우 2.4.1의 원심 분리 단계를 반복합니다. 원하는 양에 맞게 조정합니다. - 분광계를 사용하여, 280 nm (OD280)에서농축 αDEC-205 용액의 광학 밀도를 결정한다. PBS를 빈 것으로 사용합니다.
- 다음 수식을 사용하여 αDEC-205의 농도를 계산합니다.
농도 [mg/mL] = OD280/1.4. - 0.22 μm 주사기 필터 장치를 사용하여 αDEC-205 용액을 필터링합니다.
참고: NLDC-145 하이브리드종 세포 상수로부터 αDEC-205의 정제는 또한 FPLC(빠른 단백질 액체 크로마토그래피)에 의해 달성될 수 있다. 정제 αDEC-205는 장기 저장을 위해 4°C 또는 -18°C에서 저장할 수 있다.
3. ΑDEC-205에 OVA의 화학적 융합
참고: 최적의 화학적 융합을 위해서는 0.5 mgOVA 단백질에서 2.5 mg αDEC-205(1:5)의 비율이 요구된다. 그러나, 이 비율은 그밖 단백질 및 항체를 위해 변화할 수 있고 대체 공인을 위해 최적화될 필요가 있습니다. OVA 단백질의 이황화 결합의 감소는 30mM TCEP-HCl을 통한 배양을 통해 수행되며, 이는 화학적 결합을 위한 설피킬-그룹을 αDEC-205 및 240 μl 단계 3.2단계에서 필요로 한다. 두 단계 모두, αDEC-205(step 3.2.)의 OVA(step 3.1.) 및 설포-SMCC 활성화의 TCEP 유도 감소(step 3.2.), 바람직하게는 병렬로 수행되어야 한다.
- 갓 125 mM TCEP-HCl 솔루션 (pH 7.0)를 준비합니다. 원하는 양의 TCEP-HCl을 계량하고 TCEP-HCl을 0.9 M Tris 베이스(pH 8.8)로 용해합니다. pH 표시기 스트립을 사용하여 125m TCEP-HCl 솔루션(중립)의 pH를 테스트하고 Tris 베이스(pH 8.8)로 pH를 조정합니다.
- 파이펫 200 μL OVA 단백질 용액(0.5 mg OVA 함유)을 1.5mL 멸균 튜브로 넣습니다. 파이펫을 사용하여 멸균 초순수 240μl 125m TCEP-HCl 및 560 μL을 OVA 단백질에 추가하여 0.5 mg/mL OVA 단백질과 30mM TCEP-HCl(OVA/TCEP-HCl)의 최종 농도를 사용합니다.
참고: 2.5 mg 내 도 그레이드 OVA (lyophilized) 1 mL PBS에 용해 되 고 2.5 mg/mL OVA 솔루션. - 1.5 h에 대한 실온에서 결과 OVA / TCEP-HCl을 배양.
참고: 이 인큐베이션 단계를 확장하지 마십시오.
- 파이펫 200 μL OVA 단백질 용액(0.5 mg OVA 함유)을 1.5mL 멸균 튜브로 넣습니다. 파이펫을 사용하여 멸균 초순수 240μl 125m TCEP-HCl 및 560 μL을 OVA 단백질에 추가하여 0.5 mg/mL OVA 단백질과 30mM TCEP-HCl(OVA/TCEP-HCl)의 최종 농도를 사용합니다.
- αDEC-205를 활성화하려면 초순수 100μL에 2 mg의 설포-SMCC를 용해하십시오.
참고: Sulfo-SMCC는 가수 분해에 취약합니다. 따라서, 더 많은 양의 용해되지 않은 설포-SMCC를 신속하게 처리하거나 사용 가능한 2 mg 알리쿼트가 사용되어야 한다.- 2.5 mg이 900 μL에 포함되도록 PBS에서 αDEC-205를 희석하십시오.
- αDEC-205(900 μL 부피; 단계 3.2.1.에서 얻은) 및 1.5mL 튜브에서 설포-SMCC 100 μL(단계 3.2.에서 얻은)을 혼합하여 총 1mL의 부피를 초래한다.
- αDEC-205/sulfo-SMCC 용액을 37°C에서 30분, 가열 블록에서 550rpm에 배양한다.
- 이러한 인큐베이션에 따라 초과 설포-SMCC 및 TCEP-HCl은 탈염 열(MWCO 7 kDa; 5mL 컬럼 볼륨)을 사용하여 솔루션에서 즉시 제거됩니다.
- 컬럼(MWCO 7 kDa) 하단 클로저에서 비틀고 캡을 풀고 컬럼을 15mL 원추형 튜브에 넣습니다.
- 액체를 제거하기 위해 실온에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
- 열을 신선한 튜브에 놓고 뚜껑을 제거합니다. 항체/설포-SMCC 및 OVA/TCEP-HCl을 각각 하나의 컬럼의 소형 수지 침대의 중심으로 천천히 적재한다.
- 실온에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
- 사용 후 열을 삭제합니다. 공칭을 위해 준비된 항체 및 OVA를 포함하는 용액은 관에 있습니다.
- αDEC-205 및 OVA의 연상을 위해 파이펫팅을 통해 두 솔루션을 즉시 혼합합니다.
- 결과 αDEC-205 및 OVA 혼합물을 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 컨쥬게이션에 따라, 과도한 언바운드 OVA는 용액에서 제거되고 결합된 αDEC-205/OVA는 원심 단백질 농축기(MWCO 150 kDa)를 이용하여 농축된다.
- 원심 단백질 농축기(MWCO 150 kDa)를 기둥에 12mL의 PBS를 파이프팅하고 실온에서 2,000xg에서 2분 동안 원심분리를 하여 원심 단백질 농축기(MWCO 150 kDa)를 미리 헹구는 것입니다.
참고: 필요한 경우 약 5mL의 부피가 컬럼을 통과할 때까지 원심 분리 단계(3.4.1)를 반복합니다. - αDEC-205/OVA를 원심 단백질 농축기에 적재하기 전에, 서부 블롯 분석을 위해 농축되지 않은 αDEC-205/OVA의 20 μL 샘플을 저장한다. 분석될 때까지 이 알리쿼트를 4°C에 저장합니다.
- αDEC-205/OVA를 파이펫팅하여 원심 단백질 농축기에 적재한다.
참고: 원심 농축기의 상부 챔버의 침대와의 접촉을 피하십시오. - 농축기를 PBS로 15mL로 채우고 실온에서 2,000 x g에서 5 분 동안 농축기를 원심분리합니다.
- 웨스턴 블롯 분석을 위해 유동(흐름 통과 I)의 샘플을 저장하고 남은 흐름을 폐기합니다.
- 농축기를 PBS로 10mL로 채우고 실온에서 2,000 x g에서 최소 8분 동안 농축기를 원심분리합니다.
- 서부 블롯 분석을 위해 두 번째 흐름 통과(flow-through II)에 대한 샘플을 저장하고 나머지 흐름을 폐기합니다.
- 원하는 농축이 달성되면(αDEC-205/OVA 용액의 약 1.5mL은 상부 챔버에 남아 있어야 합니다)는 농축 된 샘플을 부드럽게 흡인시합니다.
참고: 상부 챔버에 너무 많은 유체가 남아 있으면 원심분리를 반복할 수 있지만 가능한 한 짧게 유지되어야 합니다.
- 원심 단백질 농축기(MWCO 150 kDa)를 기둥에 12mL의 PBS를 파이프팅하고 실온에서 2,000xg에서 2분 동안 원심분리를 하여 원심 단백질 농축기(MWCO 150 kDa)를 미리 헹구는 것입니다.
- 마이크로볼륨 분광계를 사용하여 결과 αDEC-205/OVA의 단백질 농도를 결정한다. PBS를 빈 것으로 사용합니다.
- 0.22 μm 주사기 필터 장치를 사용하여 αDEC-205/OVA를 필터링합니다.
참고: 이후 분석 및 생체 내 실험의 경우 αDEC-205/OVA를 4°C 또는 -18°C로 저장할 수 있습니다.
4. 서부 블롯에 의한 화학적 융합 검증
참고: 성공적인 화학 적 융합의 검증을 위해, OVA (4.2) 또는 αDEC-205 (4.10)를 검출하는 서양 얼룩 분석이 수행된다. OVA(4.2.) 또는 αDEC-205(4.10.)의 검출은 병렬로 수행되어야 한다. 궤도 플랫폼 셰이커는 바람직하게는 각각의 용액의 균일한 분포를 허용하기 위해 서쪽 블롯 멤브레인의 모든 인큐베이션 단계에 사용되어야한다.
- SDS-PAGE(나트륨 도데실 황산염 폴리아크라이아미드 젤 전기포레시스)에 대한 표준 10% SDS(나트륨 도데실 황산염) 젤을 준비합니다.
- SDS-PAGE에 대한 샘플을 준비하여 공주 및 비컨쥬게이트 OVA를 감지하고 겔 전기전도를 실행합니다.
- 결합 된 αDEC-205 / OVA의 다른 양을 희석 (예 : 200, 100 및 50 ng), 순수 OVA (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40 및 30 ng), un-conjugated αDEC-205의 알리쿼트 (예를 들어, 100 및 50 ng), 비 농축 αDEC-205/OVA 컨주게이트의 샘플은 3.2. (예를 들어, 125 ng) 및 4 x 비 감소 SDS 샘플 버퍼에서 유동 I 및 II(각각 단계 3.4.5 및 3.4.7.; 선택 사항)의 알리쿼트.
참고: 동일한 블롯에서 무료 OVA와 컨쥬게이트를 모두 검출할 수 있도록 컨쥬게이트와 단백질의 다양한 농도가 로드됩니다. - 가열 블록에서 10 분 및 550 rpm에 대한 65 °C에서 샘플을 분해합니다.
- 결합 된 αDEC-205 / OVA의 다른 양을 희석 (예 : 200, 100 및 50 ng), 순수 OVA (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40 및 30 ng), un-conjugated αDEC-205의 알리쿼트 (예를 들어, 100 및 50 ng), 비 농축 αDEC-205/OVA 컨주게이트의 샘플은 3.2. (예를 들어, 125 ng) 및 4 x 비 감소 SDS 샘플 버퍼에서 유동 I 및 II(각각 단계 3.4.5 및 3.4.7.; 선택 사항)의 알리쿼트.
- 시료와 단백질 표준을 SDS 젤에 로드하고 SDS-PAGE를 실행합니다.
- SDS 젤에서 메탄올 활성화 PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인(75분, 125mA)까지 단백질의 표준 블로팅을 수행한다.
- 블로팅 에 이어, 적절한 접시에 멤브레인을 넣고 멤브레인을 포함하는 접시에 버퍼를 차단하는 버퍼를 차단하는 4 % 식사 대체 쉐이크 파우더 / TBS-T (Tris 완충 식염수 / 0.1 % Tween 20)의 25 mL을 파이프팅하여 멤브레인을 차단하십시오.
- 실내 온도에서 60분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 차단 용액의 멤브레인을 배양한다.
- 차단 용액을 폐기하고 토끼 αOVA 1 차 항체로 멤브레인을 2% 식사 대체 쉐이크 파우더/TBS-T 항체 버퍼(희석 1:3,000)에 넣어 15mL의 1차 항체 용액을 접시내막에 배관한다.
- 멤브레인을 실온에서 45분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다(플랫폼 셰이커 사용).
- 항체 용액을 버리고 접시에 멤브레인을 씻으십시오 (플랫폼 셰이커사용).
- 멤브레인에 25mL의 TBS-T를 추가하고 5 분 동안 배양합니다. 솔루션을 폐기합니다.
- 멤브레인에 25mL의 TBS-T/0.5 M NaCl을 추가하고 5분 동안 배양합니다. 솔루션을 폐기합니다.
- 25mL의 TBS-T/0.5% 트리톤 X-100을 멤브레인에 넣고 5분 동안 배양합니다. 솔루션을 폐기합니다.
- 멤브레인에 25mL의 TBS-T를 추가하고 5 분 동안 배양합니다. 솔루션을 폐기합니다.
- 염소 αrabbit-IgG-HRPO(말무 과로시다제) 이차 항체를 2% 식사 대체 쉐이크 파우더/TBS-T 항체 버퍼(희석 1:2,000)로 하여 15mL의 이차 항체 용액을 배관하여 접시에 막에 얼룩을 맞습니다.
- 실내 온도에서 45 분 또는 4 °C (플랫폼 셰이커에서) 하룻밤 동안 멤브레인을 배양하십시오.
- 4.7.1.-4.7.4 단계에서 설명한 대로 멤브레인을 다시 세척한다. 플랫폼 셰이커를 사용합니다. 이 멤브레인의 경우 다음 단계 4.16으로 계속하십시오. (다음 단계 4.10.- 4.15. (αDEC-205의 검출)은 4.2.-4.9.단계에 평행하게 수행될 수 있다.
- SDS-PAGE용 αDEC-205 검출을 위한 샘플을 준비하고 겔 전기포진을 실행한다.
- 다른 양의 αDEC-205/OVA(예를 들어, 200, 100 및 50 ng)를 순한 OVA의 un-conjugated αDEC-205(예: 250, 125, 62.5 ng), 순수 OVA(예: 80 및 70 ng)의 샘플은 un-DECdd α-25/250의 샘플을 희석시 (예를 들어, 125 ng) 및 4 x 비 감소 SDS 샘플 버퍼에서 유동 I 및 II(각각 단계 3.4.5 및 3.4.7.; 선택 사항)의 알리쿼트.
- 가열 블록에서 10 분 및 550 rpm에 대한 65 °C에서 샘플을 분해합니다.
- 시료와 단백질 표준을 SDS 젤에 적재하고 젤 전기포고를 실행합니다.
- SDS 젤에서 메탄올 활성화 PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인(75분, 125mA)까지 단백질의 표준 블로팅을 수행한다.
- 블로팅 후, 적절한 접시에 멤브레인을 넣고 멤브레인을 포함하는 접시에 10 % 차단 버퍼 (우유 분말 / TBS-T)의 25 mL을 파이프하여 멤브레인을 차단합니다.
참고: 차단 솔루션은 αDEC-205및 OVA 검출(단계 4.5.)마다 다릅니다.- 블로킹 용액에서 실내 온도에서 60분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 멤브레인을 배양한다(플랫폼 셰이커 사용).
- 차단 용액을 폐기하고 염소 αrat-IgG(H+L)-HRPO 항체를 5% 분유 분말/TBS-T 항체 버퍼(희석 1:5,000)로 사용하여 15mL의 항체 용액을 접시내막에 배관하여 폐기한다.
참고: 항체 버퍼는 αDEC-205 검출 및 OVA 검출(단계 4.6./ 4.8.)마다 다릅니다.- 멤브레인을 45분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다(플랫폼 셰이커 사용).
- 4.7.1.-4.7.4 단계에 설명된 대로 접시에 멤브레인을 철저히 세척한다. (플랫폼 셰이커를 사용).
- 적절한 검출 시약을 사용하여 HRP 신호를 개발하고 X-ray 필름을 사용하거나 이미징 시스템을 통해 어두운 방에서 화학 발광을 감지합니다.
5. ELISA의 화학 적 융합 검증
- αDEC-205/OVA의 결과로 성공적인 화학 연상의 추가 검증을 위해 ELISA를 수행하십시오.
- 코팅 버퍼에 100 μL/웰 3 ng/μL 토끼 αOVA 항체를 가진 적절한 96웰 ELISA 플레이트를 코팅한다(0.1M 중탄산염(NaHCO3)pH 9.6은 H2O로 희석).
- 4 °C에서 하룻밤 접시를 배양하십시오.
- 코팅 후, ELISA 세탁기를 사용하여 PBS로 플레이트를 세 번 세척하십시오.
- 플레이트의 각 웰에서 블로킹 버퍼(PBS의 10% FCS)의 200 μL을 파이프팅하여 플레이트를 차단하고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- αDEC-205/OVA(3단계에서 얻은) 1:2 차단 버퍼(PBS의 10% FCS)에서 6μg/mL에서 93.8 ng/mL αDEC-205/OVA까지 의 희석을 얻고, αDEC-205/OVA에 이러한 감소량의 100 μL/웰을 추가한다.
- 상온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 예를 들어 ELISA 세탁기를 사용하여 PBS로 플레이트를 세 번 씻으시다.
- 염소 αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO 항체의 100μL을 플레이트의 각 웰에 1:2,000블로 차단 버퍼(PBS의 10% FCS)로 희석합니다.
- 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 예를 들어 ELISA 세탁기를 사용하여 PBS를 사용하여 플레이트를 세 번 씻으시다.
- 우물에 HRPO 기판 50 μL을 추가합니다. 명확한 색 반응을 관찰할 때, 150 μl 정지 용액(1M H2SO4)을추가하여 반응을 중지합니다.
- 5 분 후, ELISA 독자를 사용하여 450 nm에서 흡수를 읽으십시오.
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Representative Results
αDEC-205를 이 프로토콜을 사용하여 OVA 단백질에 대한 화학적 융합은 일반적으로 생체 내 DC 표적화 접근법에 대한 αDEC-205/OVA의 효율적인 생성을 허용할 것이다. 기술 자체를 확인하고 산출된 컨쥬게이트의 기능을 테스트하기 위한 다양한 전략이 있습니다. 서양 블롯 분석 및 ELISA는 성공적인 컨쥬게이션을 검증하는 데 사용되며 동시에 잠재적으로 자유OVA(그림 2)를검출합니다. 시험관 내 결합연구(도 3)및 생체 내 예방 접종(도4)은DEC-205에 대한 공주물의 결합을 확인하고 DC의 표적화한다.
병렬 서부 블롯 분석은 컨쥬게이트OVA(도 2A)뿐만 아니라 컨쥬게이드 αDEC-205(도2B)를모두 검출하는 데 사용된다. 구체적으로, Blot에서 항체의 분자량 수준에서 OVA에 대한 양성 신호는 OVA 및 항체의 연관성을 확인한다(도2A). 더욱이, 서부 블롯 분석에서 OVA에 대한 염색은 잠재적으로 αDEC-205/OVA 옆에 존재하는 초과 무료 OVA의 검출을 가능하게 하며, 이는 도시된 블롯의 경우는아니다(도 2A). 많은 양의 무료 OVA가 감지되는 경우, 단계 3.4.1. 3.4.8. 프로토콜을 반복해야 합니다. 상기 도2B에도시된 바와 같이, 서양 블롯 분석에서 αDEC-205에 대한 염색에 대한 보완성, αDEC-205에 대한 염색은 도 2B에도시된 바와 같이 "벌거벗은" αDEC-205 와 컨쥬게이트 사이의 분자량증가를 통해 성공적인 컨쥬게이션을 검증한다.
서쪽 블로팅 옆에, 또한 특정 ELISA는 OVA에 αDEC-205의 성공적인 연상의 검증을 허용한다. 그러나 서부 블롯 분석과는 달리, 이 ELISA는 자유롭고 공주되지 않은 αDEC-205 또는 OVA의 검출을 허용하지 않는다. 분석설정(도 2C)으로인해 양수 신호는 컨쥬게이션이 효율적인 경우에만 생성됩니다. 검출된 신호(450nm에서의 흡수)와 분석된 단백질 양 사이의 양성 연관성은 도 2D에도시된 바와 같이 화학적 융합을 통해 αDEC-205/OVA의 성공적인 생성을 검증한다. 동시에 αDEC-205/OVA 컨쥬게이트의 9.38 ng에서 이미 산출된 양양성 신호는 이 방법의 강한 감도(도2D)를보여준다. 공자의 양을 늘리기 위한 흡착량이 증가하지 않는 경우, 공해는 성공하지 못했다고 합니다. 이 경우, 또한 서부 블롯 분석은 OVA에 얼룩진 얼룩진 얼룩내의 컨쥬게이트를 검출하지 않고 αDEC-205에 대해 염색된 블롯의 분자량의 증가가 없는 부정적인 결과를 산출할 것이다.
서부 블롯 및 ELISA 분석은 이와 같은 자유 항원제거를 평가하기 위해 사용되지만, DEC-205에 대한 결합과 DC의 표적화를 확인하기 위해서는 후속 기능 분석이 필요하다. 이를 위해, 우리는 시험관 내 결합연구(도 3)및 생체 내 예방 접종(도4)을수행하였다. 이러한 실험을 위해, 여성 6-8주 C57BL/6 및 8-12주 발브/c 마우스는 상업적 인 출처에서 얻어지거나 헬름홀츠 감염 연구 센터(HZI)의 동물 시설에서 사육되었으며 특정 병원균 없는 조건하에 사육되었다. 도 3은 αDEC-205및 HCV 코어 단백질(αDEC-205/Core)의 결합을 위한 기능적 해석을 CD11c+체외 세포로 입증한다. 유량 세포측정은 αDEC-205/Core를 명확하게 보여 골-골수 유래 CD11c+ 세포(도3A,B)뿐만 아니라 갓 분리된 마우스 CD11c +비백세포(데이터는 도시되지 않음)를 효율적으로 결합시켰다. 이러한 분석을 통해 αDEC-205의 결합 용량을 방해하지 않는 화학적 결합을 입증한다. 이는 ΑDEC-205/코어에서 MHC-II +CD11c+ 세포로부터 선별된 체외 생성 골수 유래 수지상 세포(BMDC) (BMDC) (도 3C)의결합을 나타내는 면역 형광 분석에 의해 더욱 확인된다.
과거에는, 입증된 프로토콜에 의해 생성된 αDEC-205/OVA 접합체가 마우스에서 생체내에서 OVA 특이적 면역 반응을 효율적으로 유도하고, DC(도4)12, 14의기능적 표적화뿐만 아니라 컨쥬게이트의 성공적인 생성을 확인하였다. 구체적으로, αDEC-205/OVA를 가진 피하 백신 접종은 효율적으로 유도된 유머 및 세포 OVA 특정 면역 반응을 유도합니다. 중요한 것은, 재조합 아데노바이러스 챌린지 모델에서 우리는 바이러스감염 간세포제거할 수 있는 항바이러스 CD8+ T 세포를 검출했는데, 이는 간편성바이러스(12)를향한 백신에 강한 영향을 미친다. 더욱이, 항원 특이적 세포독성 T 세포의 매우 효과적인 유도는 항종양 면역의 생체 내 프라이밍에 대한 이 접근법의 잠재력을 강조한다. 또한 αDEC-205/OVA를 성공적으로 사용하여 생체 내 DC 타겟팅14의맥락에서 다른 보조제를 테스트하고 비교했습니다. αDEC-205/OVA와 보조 조합 폴리(I:C) 및 CpG(미수정 CpG 모티브를 함유한 합성 올리고데옥시뉴클레오티드)와 함께 백신 접종을 통해 일반적으로 관찰하였다(그림4A)및 일부 시간 포인트에 대해 는 OVA와 비교하여 백신 접종과 비교하여 훨씬 높은 OVA 특이적 IgG 수준을관찰하였다. 더욱이, αDEC-205/OVA는 효율적으로 유도된 OVA 특이적 CD4+뿐만 아니라CD8+ T 세포반응(도 4C,D)및 αDEC-205/OVA 유도 CD8+ T 세포 반응이 OVA 단독으로 유도된 것을 크게 초과하였다(도4D).
그림 1: αDEC-205 및 OVA의 화학 적 융합모델. 첫 번째 단계에서, αDEC-205의 1차 아민은 크로스링커 설포-SMCC의 NHS 에스테르와 반응하여 말리미드 활성화 αDEC-205를 초래한다. TCEP-HCl을 통한 배양을 통해 OVA 단백질의 이황화 결합을 감소한 후, 남성 활성 αDEC-205는 αDEC-205/OVA 항체/항체/항원 컨쥬게이트를 형성하기 위해 TCEP-HCl 감소 OVA 단백질과 반응한다. 약어: N-하이드록시시시니미드 에스테르 (NHS 에스테르); 설포시치니미딜 4-[N-Maleimidomethyl]사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포-SMCC); 트리스 (2-카박스세틸)인스핀 염산염 (TCEP-HCl). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 화학적으로 수렴된 αDEC-205/OVA의 검증. αDEC-205 및 OVA 단백질의 효과적인 화학적 융합을 확인하기 위해, 서양 블롯분석(A,B)및 ELISA(C,D)가 수행된다. αDEC-205/OVA, αDEC-205 및 다양한 농도의 OVA 단백질은 토끼 αOVA 1차 항체및 염소 αrabbit-IgG-HRPO 이차 항체를 활용하여 SDS-PAGE(10%) 및 후속 서부 블롯 분석을 실시하여 OVA단백질(A)또는 염소 αrat-IgG(H+LDEC)-α-IgG(H+LDEC)-α-igG(H+LDEC)-α-igG(H+LDEC)-α-α-igG(H+LDEC)-α-igG(H+LDEC)-α-igG(20)-α-igG(H+L-α-igG)를 검출하였다. (C)αDEC-205/OVA 공주물의 검증을 위해 ELISA의 회로도 표현. 토끼 αOVA 코팅 항체는 공주 된 OVA를 통해 αDEC-205 /OVA를 결합합니다. 염소 αrat-IgG(H+L)-HRPO는 바운드 컨쥬게이트의 αDEC-205 분획을 인식하고 따라서 효과적인 결합을 확인한다. (D)ELISA는(C)에기재된 대로 수행하였다. αDEC-205/OVA(600 ng ~ 9.38 ng)의 직렬 희석량(1:2)을 분석하였다. 데이터는 대표 분석의 트리클리카의 평균으로 표시됩니다. 약어: 효소 연결 면역소벤트 분석(ELISA); 말 무 과산화제 (HRPO); ovalbuminin (OVA); 나트륨 도데딜 황산염 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스 (SDS-PAGE). 패널 A와 B는 볼크마르 외12에서수정되었습니다. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: αDEC-205/코어의 결합을 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 유동 세포및 면역형광 현미경 검사법에 의한 결합. αDEC-205/Core의 용량을 분석하여 시험관내, 형광 활성화 세포 선별(FACS) 분석(A,B) 및 면역형광현미경(C)에 BMDC에 표적 분자 DEC-205를 결합하였다. 간단히 말해서, 골수 세포는 암컷 발브/c 마우스(n=3) 8-12주 나이의 뒷다리로부터 분리되었고 RPMI 배지에서 배양되어 1% 페니실린/연쇄상구균신, 1% 글루타민, 0.25mM 머카토에탄올 및 5 ng/mL GM-CSF(granlocycy-stimting)로 보충하였다. 6일째에, 비부착BMDC는 신중하게 수확되고 결합 분석에 사용되었습니다. (A,B) 시험관 내 에서 생성된 BMDC는 10 μg/mL αDEC-205/코어, αDEC-205 또는 배지(control)로 4°C에서 1시간 동안 배양한 다음 APC 라벨αCD11c[클론 HL3]로 염색하였다. BMDC 표면의 바운드 αDEC-205/코어검출은 PE 라벨염소αrat(A)또는 마우스 αHCV 코어[클론 C7-50]를 가진 세포의 추가염색에 의해 수행되었고, 그 다음으로 이차 αmouse-IgG1-PE염색(B)이뒤따랐다. 대표적인 히스토그램은 게이트 CD11c+ 세포의 PE 신호 및 % PE 양성 세포를 나타낸다. (C)NAïve Balb/c 마우스로부터 체외에서 생성된 BMDC는 MHC-II+ 및 CD11c+ 세포로 분류되었고 4°C에서 1h에 10 μg/mL αDEC-205/Core로 배양하였다. 세포 바인딩 αDEC-205/코어는 알렉사 594-결합 αrat-IgG 또는 마우스 αHCV 코어 [클론 C7-50] 및 알렉사 488-결합 αmouse-IgG와 함께 세척 후 4°C에서 30분 동안 염색하였다. 세포는 면역 형광 현미경 검사법 (스케일 바 = 20 μm)에 의해 시각화되었다. αDEC-205/코어에서 BMDC에 대한 코어의 결합 용량은 두 스테인링(이중 긍정 = 주황색)의 오버레이에 의해 확인되었다. 약어: 골수 유래 수지상 세포 (BMDC); 형광 활성화 세포 분류 (FACS); 과립구-대식세포 식민지 자극 인자 (GM-CSF); C형 간염 바이러스 (HCV). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: αDEC-205/OVA를 접종한 후 OVA 특이적 유머 및 세포 면역 반응. αDEC-205/OVA의 기능은 이전에 볼크마르 외12에발표된 바와 같이 면역 실험을 통해 생체내에서 DC를 표적으로 하는 것으로 입증되었다. 간략하게, 여성 6-8주 령 C57BL/6마우스(n=5)는 0일에 피하예방접종을 받았고, 14 및 28은 30 μg αDEC-205/OVA 컨쥬게이트와 함께 50 μg 폴리(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 단독으로 또는 7μg OVA 단백질을 동물당 총 부피 50μL PBS로 단독으로 사용한다. 추가 제어는 PBS만으로 처리되었습니다. (A,B) 체액 면역 반응을 모니터링하기 위해, 예방 접종된 마우스는 0일, 13, 27일째에 레트로 궤도 부비동에서, 그리고 42일째에 심장 천자에 의해 이소플루란 흡입및 혈액 샘플을 통해 가볍게 마취되었다. 세라(12)에 의해 OVA 특이적 IgG의 존재를 위해설명되고 분석된 대로 세레고 분석하였다. 엔드포인트 티터는 음수 컨트롤값보다 2배 높은 흡광도를 산출한 마지막 혈청 희석의 상호값으로 표현되었다. 결과는 세 가지 독립적인 실험에서 컴파일됩니다. (A)그룹 평균으로 표시된 OVA 특이적 총 혈청 IgG 티터의 키네틱. (B)27일째 및 42일째에 OVA 특이적 IgG 티터가 개별 마우스에 대해 도시된 바와 같이 평균. 통계: 쌍이 없는 양면 t-테스트. (C,D) 세포 면역 반응의 유도는 앞서 발표된바와같이 42일째에 뮤린 IFNγ 검출 키트를 사용하여 효소-연결된 면역흡소벤트 스팟(ELISPOT) 분석방법에 의해 분석되었다. 면역마우스로부터의 분리된 비장구체는 5 mg/mL CD4+(C)또는CD8+ OVA 펩타이드(D)로 자극을 받은 다음 IFNγ 스팟형성 단위/106세포의 수에 대해 풀로 풀로 처리되었다(OVA 펩타이드: CD4 323-339(ISQAVHAHAEINEAGR) 및 CD4-28-CD4 (시인페클).). 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다(n=5, 풀로 된 샘플의 트리클리세이트). 통계: 던넷의 다중 비교 테스트(**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)를 갖춘 단방향 ANOVA. 약어: 세포신-인산염-구아닌 올리고뉴클레오티드 서열(CpG), 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA), 효소 연계 면역소벤트 스팟(ELISPOT), ovalbumin (OVA), 인산완충식식(PBS), 폴리이노산-폴리시디칼산(폴리시노신-폴리시틸다이슬산). 이 수치는 볼크마르 등12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
내분세포증 수용체 특이적 항체 및 단백질 항원의 화학적 결합은 임상 전 마우스 모델에서 생체 내 DC 표적화에 대한 효율적이고 또한 유연한 접근법을 제공한다. 우리의 프로토콜을 통해 우리는 모델 항원 OVA를 DEC-205 특이적 IgG 항체로 성공적으로 결합하기 위한 효율적인 접근법을 제공합니다.
우리의 프로토콜에서 αDEC-205는 혼종 세포주에서 정제되고 과거에, 우리는 기술된 바와 같이 단백질 G 혈소예를 사용하여 항체를 정제하였다. 참고로, 우리는 또한 나중에 연구에서 αDEC-205를 정화하기 위해 FPLC를 사용하고 후속 화학 활용도 도 마찬가지로 효율적이였다. 효율적인 화학 적 연상을위한 중요한 단계는 항체와 단백질 모두의 프라이밍입니다. 우리는 교차링커 설포-SMCC로 항체의 배양과 TCEP-HCl을 통한 단백질 의 감소를 최종적으로 수행하기 위해 다양한 프로토콜에서 이러한 단계를 최적화했습니다. 구체적으로, 이 시점에서 중요한 단계는 TCEP-HCl의 신선한 준비(단계 3.1.) 및 단백질을 가진 TCEP-HCl의 잠복기 의 지속시간,이는 연장해서는 안 된다(단계 3.1.2.)이다. 더욱이, TCEP-HCl을 통해 이황화 결합의 감소를 위해 사용되는 단백질 완충제는 TCEP-HCl에 의한 감소에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요하다. 또한, 활성화된 항체와 감소된 단백질(step 3.3.6.)을 즉시 혼합하여 컨쥬게이션에 대한 최적의 반응 조건을 보장하는 것이 중요하다. 우리의 손에, 이 접근 방식은 연상에 관하여 가장 효율적이고 신뢰할 수 있는 결과를 산출했습니다. 후속 생체 내 접근법에 대한 추가 중요한 단계는 αDEC-205/OVA 컨쥬게이트에서 언바운드 OVA를 제거하는 것입니다. 이 단계를 확인하기 위해, 우리는 서양 블롯 분석을 최적화하고 컨쥬게이트 αDEC-205뿐만 아니라 컨쥬게이드 OVA 단백질(도 2A 및 B)의검출을 권장합니다. 최종 컨쥬게이트 용액에 언바운드 OVA가 존재하는 경우, OVA의 알려진 농도를 블로팅 및 검출(도 2A에서와같이)은 SDS-PAGE에 로드된 총 단백질 양과 관련하여 미바운드 OVA의 양을 추정하는 데 도움이 된다. 컨쥬게이션이 비효율적이면, 트러블슈팅은 컨쥬게이션에 사용되는 항원/항체 비율을 해결해야 한다. 유주하는 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 효과적이었지만, 서양 얼룩 분석에 의해 검출될 수 없는 경우, 우리는 서부 블롯 분석(단계 4.6., 4.8., 4.14.) 가장 중요한 요인을 경험하였다.
우리의 접근의 주요 한계는 항체 분자의 수와 결합한 단백질의 양 사이 고정된 상관관계가 없는 때때로 변화하는 유도 효율입니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 입증 된 프로토콜이 안정적으로 재현 가능한 결과를 산출 DC 타겟팅의 후속 생체 내 연구를 허용한다는 것을 믿고 경험했다. 더욱이, 원칙적으로 당사의 프로토콜에서 αDEC-205뿐만 아니라 OVA 단백질은 다양한 관심사의 생체 내 연구를 위한 대체 항체 및 항원교환될 수 있지만, 화학적 융합의 개별 단계는 새로운 성분에 대해 새롭게 최적화될 필요가 있다. 이는 주로 최적의 항체/항원 비에 적용되며, 예를 들어 환생성 Cys 잔류물의 접근성에 의존할 수 있다. 우리의 접근에서, 성공적인 유도 반응의 결과 최적 비율은 HCV 단백질 NS3 (비구조적 단백질 3) 및 αDEC-205에 대한 OVA에 대한 1:5 및 1.35:1이었다. 각 공주에 대해, 항체의 항원 결합 용량에 대한 크로스링커 또는 컨쥬게이션의 부정적인 영향은 배제될 필요가 있다. 참고로, 전신 단백질 대신 면역원성 펩티드의 융합은 이 점에서 덜 문제가 된다. 그러나, 단백질은 후속 예방 접종에 있는 더 높은 항원 다양성을 제공합니다. 유전 융합 접근법은 화학적 융합에 대한 대안을 표시하고 또한 명확한 장점을 갖는다1. 궁극적으로 DC 타겟팅을 위한 항체와 항원을 연결하는 전략의 선택은 리소스, 연구 포커스 및 공자의 예상 응용 에 달려 있습니다. 항체 및 항원에 대한 상대적 유연성이 화학적 활용의 주요 이점을 나타내고 실제로 C형 간염 바이러스(HCV)의 상이한 단백질에 αDEC-205의 효율적인 화학적 융합을 위해 여기에 설명된 프로토콜을 사용했다고 믿습니다(도3 및 데이터는 도시되지 않음).
전반적으로, 우리는 αDEC-205/OVA와 같은 단백질 항원에게 내분비수용체 특이적 항체의 화학적 결합이 DC 표적화 접근법을 연구할 때 탁월한 가치의 항체/항원 접합을 생성하는 유연하고 신뢰할 수 있는 도구를 표시한다고 믿고 있으며, 특히 전임상 동물 모델에서 항종양 면역을 유도하는 것을 목표로 하는 것을 포함한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 전문 기술 지원을 위한 S. Prettin에게 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 얼라이언스의 일환으로 제공된 독일 연구 센터 (HGF)의 헬름홀츠 협회 (HGF)의 보조금에 의해 지원되었다 "암의 면역 요법"(HCC_WP2b).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
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