Summary
Describimos un protocolo para la conjugación química del antígeno modelo ovoalbúmina a un anticuerpo específico del receptor de endocitosis para la orientación in vivo de células dendríticas. El protocolo incluye la purificación del anticuerpo, la conjugación química del antígeno, así como la purificación del conjugado y la verificación de una conjugación eficiente.
Abstract
La administración dirigida de antígenos a células dendríticas (CC) de presentación cruzada in vivo induce de manera eficiente las respuestas de las células efectoras T y muestra un enfoque valioso en el diseño de vacunas. El antígeno se administra a DC a través de anticuerpos específicos para los receptores de endocitosis como DEC-205 que inducen la absorción, el procesamiento y la presentación de MHC de clase I y II.
La conjugación eficiente y confiable del antígeno deseado a un anticuerpo adecuado es un paso crítico en la orientación de CC y, entre otros factores, depende del formato del antígeno. La conjugación química de proteína de longitud completa a anticuerpos purificados es una posible estrategia. En el pasado, hemos establecido con éxito la reticulación del antígeno modelo de ovoalbúmina (OVA) y un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) para estudios de orientación de CC in vivo en ratones. El primer paso del protocolo es la purificación del anticuerpo del sobrenadante del hibridoma NLDC (células dendríticas no linfoides)-145 por cromatografía de afinidad. El anticuerpo purificado se activa para la conjugación química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) mientras que al mismo tiempo los grupos sulfhidrilo de la proteína OVA se exponen a través de la incubación con TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina tris (2-carboxietilo)). El exceso de TCEP-HCl y sulfo-SMCC se eliminan y el antígeno se mezcla con el anticuerpo activado para el acoplamiento nocturno. El conjugado αDEC-205/OVA resultante se concentra y se libera del OVA no unido. La conjugación exitosa de OVA a αDEC-205 se verifica mediante el análisis de Western Blot y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Hemos utilizado con éxito αDEC-205/OVA reticulados químicamente para inducir respuestas citotóxicas de células T en el hígado y para comparar diferentes adyuvantes por su potencial en la inducción de inmunidad humoral y celular después de la orientación in vivo de DEC-205+ DC. Más allá de eso, tales conjugados anticuerpo/antígeno acoplados químicamente ofrecen herramientas valiosas para la inducción eficiente de las respuestas de la vacuna a los antígenos tumorales y se ha demostrado que son superiores a los enfoques clásicos de inmunización con respecto a la prevención y el tratamiento de varios tipos de tumores.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son actores centrales del sistema inmunitario. Son un grupo diverso de células especializadas en la presentación de antígenos y su función principal es tender puentes entre la inmunidad innata y adaptativa1,2. Es importante destacar que los DC no solo desempeñan un papel importante en respuestas eficientes y específicas dirigidas a patógenos, sino que también están involucrados en muchos aspectos de la inmunidad antitumoral1,3.
Debido a su papel exclusivo en la inmunidad del huésped, la DC se centró como células diana para la vacunación4. Un enfoque es dirigir antígenos a DC in vivo para inducir respuestas inmunes específicas de antígenos y en los últimos años, un gran número de estudios se han dedicado a definir receptores adecuados y estrategias de orientación1,4. Un ejemplo es el receptor de lectina de tipo C DEC-205, que puede ser dirigido por anticuerpos específicos de DEC-205 para inducir endocitosis. Es importante destacar que se ha demostrado que la orientación DEC-205 en combinación con adyuvantes adecuados induce de manera eficiente células T CD4+ y CD8+ de larga vida y protectoras, así como respuestas de anticuerpos, también contra antígenos tumorales3,5,6,7,8,9.
Hay una serie de estudios que muestran que los antígenos conjugados dirigidos a DC son superiores al antígeno libre no conjugado3,5,10,11,12. Esto hace que la conjugación del antígeno con la respectiva fracción de orientación de CC sea un paso central en los enfoques de orientación de CC. En el caso de la orientación de DC a través de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los antígenos pueden estar unidos química o genéticamente y cualquiera de las estrategias proporciona sus propias (des)ventajas1. Por un lado, en las construcciones de anticuerpos-antígenos genéticamente modificados existe un control sobre la dosis de antígenos, así como la ubicación que proporciona una comparabilidad superior entre los lotes1. Al mismo tiempo, sin embargo, la conjugación química necesita menos preparación y proporciona más flexibilidad, especialmente cuando se intenta probar y comparar diferentes antígenos y / o estrategias de vacunación en modelos experimentales y preclínicos.
Aquí, presentamos un protocolo para la conjugación química eficiente y confiable de la ovoalbúmina (OVA) como antígeno proteico modelo a un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) adecuado para la orientación de CC in vivo en ratones. En primer lugar, αDEC-205 se purifica a partir de células de hibridoma NLDC-14513. Para la conjugación química, se utiliza el reticulador heterobifuncional sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contiene éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y grupos maleimida, lo que permite la conjugación covalente de moléculas que contienen amina y sulfhidrilo. Específicamente, las aminas primarias del anticuerpo reaccionan inicialmente con sulfo-SMCC y la αDEC-205 activada por maleimida resultante y luego reaccionan con la proteína OVA que contiene sulfhidrilo reducida a través de TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina Tris(2-carboxietilo)). El producto final es αDEC-205/OVA conjugado químicamente (Figura 1). Más allá de la conjugación química en sí, nuestro protocolo describe la eliminación del exceso de OVA del conjugado, así como la verificación de la conjugación exitosa a través del análisis de Western Blot y un ensayo específico de inmunoabsorción ligado a enzimas. Hemos empleado con éxito este enfoque en el pasado para conjugar químicamente OVA y otras proteínas o péptidos inmunogénicos a αDEC-205. Demostramos la unión eficiente a células CD11c+ in vitro así como la inducción eficiente de inmunidad celular y humoral in vivo.
Ciertamente, hay inconvenientes en este método, como en la comparabilidad de lote a lote y en la dosificación exacta del antígeno dentro del conjugado final. Sin embargo, la conjugación química proporciona flexibilidad experimental en la elección del anticuerpo y el antígeno proteico en comparación con las construcciones genéticamente modificadas. Por lo tanto, creemos que este enfoque es especialmente valioso en la evaluación de diferentes antígenos por su eficiencia en la orientación de CC en modelos preclínicos de ratón, lo que es importante también en el contexto de respuestas inmunes antitumorales específicas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por la agencia del gobierno local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; número de expediente 33.12-42502-04-10/0108) y se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales.
1. Producción de αDEC-205 a partir de la línea celular de hibridoma NLDC-145
- Para la producción de anticuerpos, descongele las células NLDC-145 criopreservadas que producen αDEC-205 a 37 °C en un baño de agua. Expandir las células a 37 °C y 5% de CO2. Dos 75 cm2 se necesitarán botellas para proceder a la producción de anticuerpos. Los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de seguridad para garantizar condiciones de trabajo seguras y evitar la contaminación de los cultivos.
- Resuspend 1 mL de células descongeladas (1 x10 6 - 5 x10 6 células/mL) en 9 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) en un matraz de cultivo celular (25 cm2). Coloque el matraz horizontalmente en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, 5% CO2.
- Cultivo de las células a 37 °C y 5% de CO2,hasta un 70% de confluencia. Esto normalmente debe lograrse después de 24 - 48 h.
- Una vez que las células sean 70% confluentes, transfiera la suspensión completa de células NLDC-145 (10 mL) a un tubo de centrífuga cónica de 15 mL utilizando un controlador de pipeta con una pipeta en un rango de volumen de 1-10 mL. Pellet las células por centrifugación a 250 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Precaliente ISF-1 medio a 37 °C en un baño de agua y resuspenda el pellet en 12 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%. Transferir la suspensión celular resuspendida a un matraz de cultivo celular fresco (75 cm2).
- Cultivar y expandir las células en medio ISF-1 suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2,hasta un 70% de confluente y un 99% viable. Esto normalmente debe lograrse después de 48 - 72 h.
- Divida las células en dos matraces de 75 cm2. Para hacer esto, primero enjuague el fondo del matraz de cultivo celular / superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células NLDC-145 de la superficie. Transfiera 6 ml de la suspensión celular NLDC-145 cada una en una de las dos botellas frescas de 75 cm2 y agregue un medio ISF-1 precalentado suplementado con penicilina / estreptomicina al 1% hasta 12 ml.
NOTA: No renueve el medio de cultivo celular ya que las células NLDC-145 habrán condicionado el medio. Transfiera las células junto con su medio y llene el cultivo hasta el volumen deseado con medio fresco. Esto es crucial para la viabilidad y la producción máxima de anticuerpos por parte de las células NLDC-145. - Ampliar los cultivos celulares a 37 °C y 5% de CO2,hasta aproximadamente un 70% de confluencia que generalmente se logra después de 48 - 72 h.
- Una vez que las células sean 70% confluentes, transfiera 10 ml de la suspensión de células NLDC-145 expandida de cada una de las botellas de 75 cm2 a una botella de rodillo petG (tereftalato glicol de polietileno) (1.050 cm2). Para esto, enjuague el fondo del matraz de cultivo celular / superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células de la superficie utilizando un controlador de pipeta y una pipeta de 10 ml.
- Agregue 140 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) directamente de la botella mediana a cada una de las botellas de rodillos nlDC-145 que las llenen hasta la marca de 150 ml.
NOTA: Consulte la nota en el paso 1.1.6. - Cultive las botellas de rodillos a 37 °C, 5% CO2 y 25 rondas/min durante tres días.
- Añadir 150 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada una de las botellas de rodillos nldc-145 que contengan llenándolas hasta la marca de 300 ml.
- Cultive las botellas de rodillos que ahora contienen 300 ml de cultivo cada una a 37 ° C, 5% de CO2 y 25 rondas / min durante otros tres días.
- Añadir otros 100 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada una de las botellas de rodillos que contienen NLDC-145, llenándolas así hasta la marca de 400 ml.
- Cultive las botellas de rodillos que ahora contienen 400 ml de cultivo cada una a 37 ° C, 5% de CO2 y 25 rondas / min durante otros siete días.
NOTA: Durante esta semana, el cultivo se vuelve muy denso (hasta un 95% de densidad) y la viabilidad disminuye (hasta tan solo el 50%), lo que permite la máxima liberación de anticuerpos.
- Para la purificación de αDEC-205 del sobrenadante de cultivo, vierta la suspensión celular NLDC-145 (de ambas botellas de rodillos) directamente a botellas de centrifugación en autoclave de 500 ml.
NOTA: Se debe recolectar un volumen total de 800 ml de cultivo.- Centrifugar el cultivo durante 30 min a 8.600 x g y 4 °C para eliminar células y escombros.
- Recoger los sobrenadantes, desechar los pellets y agrupar los sobrenadantes en un frasco de reactivo estéril.
NOTA: La purificación de αDEC-205 puede iniciarse inmediatamente (paso 2.) o el sobrenadante se puede almacenar a corto plazo a 4 °C.
2. Purificación del anticuerpo αDEC-205 del sobrenadante celular NLDC-145
NOTA: A partir del sobrenadante celular NLDC-145, la αDEC-205 se purifica utilizando una columna de proteína G Sepharose (reutilizable). Las dimensiones de la columna son de 15 mm x 74 mm y 5 ml de proteína G Sepharose se empaquetan por columna.
- Para la preparación y el lavado de la columna de proteína G Sepharose, coloque un tapón de goma hermético en la abertura superior de la columna de proteína G Sepharose. Pinche el tapón de goma con dos cánulas estériles (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
- Conecte una jeringa de 10 ml a una de las dos cánulas y un tubo de silicio flexible (aproximadamente 100 cm de largo, 2,5 - 3 mm de diámetro) con un conector de tubo a la segunda cánula.
NOTA: La construcción de la jeringa / tapón de goma es reutilizable y proporciona un vacío que resulta en un flujo continuo del gran volumen de cultivo sobrenadante a la columna de proteína G Sepharose. Con este fin, tire ligeramente hacia atrás del émbolo de la jeringa para garantizar un flujo continuo de líquido en los siguientes pasos. - Lave la columna con 50 ml de ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) para eliminar el anticuerpo potencialmente restante de cualquier purificación de anticuerpos anterior. Coloque el extremo del tubo de silicio en la botella de reactivo llena de ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M. Como resultado del vacío inducido, 50 ml del ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M corren a través de la columna de proteína G Sepharose.
NOTA: 0,1 M de ácido acético glacial (pH 2) debe almacenarse en una botella de reactivo o recién llenado en un vaso de precipitados. - Lave la columna con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 100-200 ml. Coloque el extremo del tubo de silicio en una botella de reactivo o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 100-200 ml de PBS corran gota a gota a través de la columna de proteína G Sepharose.
- Conecte una jeringa de 10 ml a una de las dos cánulas y un tubo de silicio flexible (aproximadamente 100 cm de largo, 2,5 - 3 mm de diámetro) con un conector de tubo a la segunda cánula.
- Para la purificación de anticuerpos del sobrenadante NLDC-145, cargue 800 ml del sobrenadante NLDC-145 (obtenido del paso 1.2.2.) sobre la columna. Coloque el extremo del tubo de silicio en la botella de reactivo llena de sobrenadante NLDC-145. Deje que el sobrenadante NLDC-145 de 800 ml corra en sentido directo a través de la columna.
- Lavar la columna con 500 mL de PBS. Coloque el extremo del tubo de silicio en una botella de reactivo o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 500 mL PBS se ejecuten gota a gota a través de la columna.
- Para la elución, utilice 20 tubos de 1,5 ml y pipetee 100 μL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) en cada tubo de 1,5 ml. Retire el tapón de goma de la columna y pipete 1 ml de glicina 0.1 M (pH 3) a la cámara superior de la columna de proteína G Sepharose para eluir el anticuerpo de la columna. Recoja el flujo directamente como eluido en uno de los tubos preparados de 1,5 ml.
- Repita el paso de elución (2.2.2.) para los 20 tubos (1,5 ml).
- Determine la densidad óptica de todas las fracciones de elución a 280 nm (OD280)utilizando un espectrofotómetro para identificar las fracciones que contienen anticuerpos.
NOTA: Utilice la primera fracción de elución como espacio en blanco. - Agrupar todas las fracciones con un OD280 superior a 0,5 (aproximadamente 10 fracciones).
- Almacene la columna de proteína G Sepharose llena de etanol al 20% a 4 °C.
- Dializar las eluciones agrupadas contra PBS de 1000 ml (en un vaso de precipitados de 2000 ml) a 4 °C durante la noche utilizando tubos de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa.
- Cortar el tubo de diálisis en trozos de 20 cm. Hervir el tubo de diálisis en 500-800 ml de 10 mM EDTA (pH 7.5) durante 30 minutos en un vaso de precipitados utilizando una placa caliente para eliminar la contaminación. Deseche la solución de EDTA de 10 mM (pH 7.5) y hierva el tubo de diálisis en agua desionizada durante 10 min.
NOTA: El tubo de diálisis se puede usar directamente o almacenar en solución de azida de sodio al 0,01% (NaN3)/H2O a 4 °C hasta el próximo uso. - Cierre la parte inferior del tubo de diálisis con un cierre de tubo de diálisis apropiado / abrazadera con bisagras de una sola pieza y pipetee cuidadosamente la elución de anticuerpos en el tubo de diálisis. Cierre la parte superior del tubo de diálisis con una segunda abrazadera.
- Fije la abrazadera superior del tubo de diálisis a un soporte flotante, colóquela con una barra de agitación magnética en el vaso de precipitados lleno de PBS y coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético.
- Dializar durante la noche revolviendo a 4 °C.
- Cortar el tubo de diálisis en trozos de 20 cm. Hervir el tubo de diálisis en 500-800 ml de 10 mM EDTA (pH 7.5) durante 30 minutos en un vaso de precipitados utilizando una placa caliente para eliminar la contaminación. Deseche la solución de EDTA de 10 mM (pH 7.5) y hierva el tubo de diálisis en agua desionizada durante 10 min.
- Para aumentar la concentración de αDEC-205, cargue el dializado completo en un concentrador centrífugo con 10 kDa MWCO. Abra una abrazadera del tubo y pipetee cuidadosamente el dializado completo del tubo de diálisis en el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
NOTA: No toque la parte inferior del concentrador con la punta de la pipeta.- Centrífuga durante 30 min a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C.
- Cargue el concentrador centrífugo con 10 ml de PBS y centrífuga a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C hasta que el volumen final de solución de anticuerpos restante sea de 1-1,5 ml.
NOTA: Si es necesario, repita la etapa de centrifugación de 2.4.1. para ajustarse a la cantidad deseada. - Utilizando un espectrofotómetro, determinar la densidad óptica de la solución concentrada de αDEC-205 a 280 nm (OD280). Utilice PBS como espacio en blanco.
- Calcule la concentración de αDEC-205 utilizando la siguiente fórmula:
concentración [mg/mL] = OD280/1.4. - Filtrar la solución αDEC-205 utilizando una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
NOTA: La purificación de αDEC-205 del sobrenadante de células de hibridoma NLDC-145 también se puede lograr mediante FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas). La αDEC-205 purificada se puede almacenar a 4 °C o a -18 °C para su almacenamiento a largo plazo.
3. Conjugación química de OVA a αDEC-205
NOTA: Se requiere una proporción de 0,5 mg de proteína OVA a 2,5 mg de αDEC-205 (1:5) para una conjugación química óptima. Sin embargo, esta proporción puede variar para otras proteínas y anticuerpos y debe optimizarse para conjugados alternativos. La reducción de los enlaces disulfuro de la proteína OVA se realiza mediante incubación con 30 mM TCEP-HCl, que expone los grupos sulfhidrilo para la conjugación química a αDEC-205 y se necesitan 240 μl de TCEP-HCl en el paso 3.2. Ambos pasos, la reducción inducida por TCEP de OVA (paso 3.1.) y la activación sulfo-SMCC de αDEC-205 (paso 3.2.), deben realizarse preferiblemente en paralelo.
- Prepare recién una solución de TCEP-HCl de 125 mM (pH 7.0). Pesar la cantidad deseada de TCEP-HCl y disolver el TCEP-HCl en 0,9 M de base Tris (pH 8,8). Utilice tiras indicadoras de pH para probar el pH de la solución de TCEP-HCl de 125 mM (que debe ser neutra) y ajuste el pH con la base Tris (pH 8.8).
- Pipetear 200 μL de solución de proteína OVA (que contiene 0,5 mg de OVA) en un tubo estéril de 1,5 ml. Añadir 240 μl 125 mM de TCEP-HCl y 560 μL de agua ultrapura estéril a la proteína OVA utilizando una pipeta a una concentración final de 0,5 mg/mL de proteína OVA y 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
NOTA: 2,5 mg de OVA endogrado (liofilizado) se disuelve en 1 ml de PBS, lo que resulta en una solución de OVA de 2,5 mg/ ml. - Incubar el OVA/TCEP-HCl resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h.
NOTA: No extienda esta etapa de incubación.
- Pipetear 200 μL de solución de proteína OVA (que contiene 0,5 mg de OVA) en un tubo estéril de 1,5 ml. Añadir 240 μl 125 mM de TCEP-HCl y 560 μL de agua ultrapura estéril a la proteína OVA utilizando una pipeta a una concentración final de 0,5 mg/mL de proteína OVA y 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
- Para activar la αDEC-205 para la conjugación, disolver 2 mg de sulfo-SMCC en 100 μL de agua ultrapura.
NOTA: Sulfo-SMCC es susceptible a la hidrólisis. Por lo tanto, se deben manipular rápidamente cantidades mayores de sulfo-SMCC no disuelto o se deben usar alícuotas de 2 mg disponibles.- Diluir αDEC-205 en PBS para que 2,5 mg estén contenidos en 900 μL.
- Mezclar 2,5 mg de αDEC-205 (volumen de 900 μL; obtenido a partir del paso 3.2.1.) y 100 μL de sulfo-SMCC (obtenido a partir del paso 3.2.) en un tubo de 1,5 ml, lo que da como resultado un volumen total de 1 ml.
- Incubar la solución αDEC-205/sulfo-SMCC durante 30 min a 37 °C y 550 rpm en un bloque calefactor.
- Después de estas incubaciones, el exceso de sulfo-SMCC y TCEP-HCl se eliminan inmediatamente de las soluciones utilizando columnas de desalinización (MWCO 7 kDa; volumen de columna de 5 ml).
- Gire el cierre inferior de las columnas (MWCO 7 kDa), afloje la tapa y coloque la columna en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente para retirar el líquido.
- Coloque la columna en un tubo nuevo y retire la tapa. Cargue lentamente el anticuerpo/sulfo-SMCC y el OVA/TCEP-HCl, respectivamente, en el centro del lecho compacto de resina de una columna cada uno.
- Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
- Deseche las columnas después de su uso. Las soluciones que contienen anticuerpos y OVA preparadas para la conjugación están en los tubos.
- Mezclar inmediatamente ambas soluciones mediante pipeteo para la conjugación de αDEC-205 y OVA.
- Incubar la mezcla resultante de αDEC-205 y OVA durante la noche a 4°C.
- Después de la conjugación, el exceso de OVA no unido se elimina de la solución y el αDEC-205/OVA acoplado se concentra utilizando un concentrador de proteína centrífugo (MWCO 150 kDa).
- Enjuague previamente el concentrador centrífugo de proteínas (MWCO 150 kDa) mediante pipeteo de 12 ml de PBS en la columna y centrifugado durante 2 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
NOTA: Si es necesario, repita el paso de centrifugación (3.4.1.) hasta que un volumen de aproximadamente 5 ml haya pasado a través de la columna. - Antes de cargar la αDEC-205/OVA en el concentrador centrífugo de proteínas, guarde una muestra de 20 μL de la αDEC-205/OVA no concentrada para el análisis de western blot. Conservar esta alícuota a 4 °C hasta su análisis.
- Cargue la αDEC-205/OVA en el concentrador centrífugo de proteínas mediante pipeteo.
NOTA: Evite cualquier contacto con el lecho de la cámara superior del concentrador centrífugo. - Llene el concentrador a 15 ml con PBS y centrífique el concentrador durante 5 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
- Guarde una muestra del flujo a través (flujo a través de I) para el análisis de western blot y descarte el flujo restante.
- Llene el concentrador a 10 ml con PBS y centrifugue el concentrador durante al menos 8 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
- Guarde una muestra para el segundo flujo a través (flujo a través II) para el análisis de western blot y descarte el flujo restante.
- Una vez que se logra el enriquecimiento deseado (alrededor de 1,5 ml de la solución αDEC-205/OVA debe dejarse en la cámara superior), aspire suavemente la muestra concentrada.
NOTA: Si queda demasiado líquido en la cámara superior, la centrifugación se puede repetir, pero debe mantenerse lo más corta posible.
- Enjuague previamente el concentrador centrífugo de proteínas (MWCO 150 kDa) mediante pipeteo de 12 ml de PBS en la columna y centrifugado durante 2 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
- Determinar la concentración de proteínas de la αDEC-205/OVA resultante utilizando un espectrofotómetro de microvolumen. Utilice PBS como espacio en blanco.
- Filtre la αDEC-205/OVA utilizando una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
NOTA: Para análisis posteriores y experimentos in vivo, αDEC-205/OVA se puede almacenar a 4 °C o -18 °C.
4. Verificación de la conjugación química por western blot
NOTA: Para la verificación de la conjugación química exitosa, se realiza un análisis de western blot que detecta OVA (4.2) o αDEC-205 (4.10). La detección de OVA (4.2.) o αDEC-205 (4.10.) debe realizarse en paralelo. Se debe utilizar preferiblemente un agitador de plataforma orbital para todas las etapas de incubación de las membranas de western blot para permitir una distribución uniforme de las respectivas soluciones.
- Preparar geles estándar de SDS al 10% (dodecil sulfato de sodio) para SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio).
- Prepare las muestras para SDS-PAGE para detectar OVA conjugados y no conjugados y ejecutar electroforesis en gel.
- Diluir diferentes cantidades de αDEC-205/OVA acoplado (por ejemplo, 200, 100 y 50 ng), de OVA puro (por ejemplo, 80, 70, 60, 50, 40 y 30 ng), una alícuota de αDEC-205 no conjugado (por ejemplo, 100 y 50 ng), una muestra de conjugado αDEC-205/OVA no concentrado del paso 3.4.2. (por ejemplo, 125 ng) y una alícuota de flujo a través de I y II (pasos 3.4.5. y 3.4.7., respectivamente; opcional) en 4 x tampón de muestra SDS no reductor.
NOTA: Se cargan diferentes concentraciones de conjugado y proteína para garantizar que tanto el OVA libre como el conjugado se puedan detectar en la misma mancha. - Desnaturalizar las muestras a 65 °C durante 10 min y 550 rpm en un bloque calefactor.
- Diluir diferentes cantidades de αDEC-205/OVA acoplado (por ejemplo, 200, 100 y 50 ng), de OVA puro (por ejemplo, 80, 70, 60, 50, 40 y 30 ng), una alícuota de αDEC-205 no conjugado (por ejemplo, 100 y 50 ng), una muestra de conjugado αDEC-205/OVA no concentrado del paso 3.4.2. (por ejemplo, 125 ng) y una alícuota de flujo a través de I y II (pasos 3.4.5. y 3.4.7., respectivamente; opcional) en 4 x tampón de muestra SDS no reductor.
- Cargue las muestras y un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute SDS-PAGE.
- Realice la eliminación estándar de las proteínas del gel SDS a una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno) activada por metanol (75 min, 125 mA).
- Después de la secadura, coloque la membrana en un plato apropiado y bloquee la membrana pipeteando 25 ml de polvo de batido de reemplazo de comida al 4% / TBS-T (solución salina tamponada tris / 0.1% Tween 20) bloqueando el tampón en el plato que contiene la membrana.
- Incubar la membrana en la solución de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
- Deseche la solución de bloqueo y manche la membrana con el anticuerpo primario αOVA de conejo en polvo de batido de reemplazo de comida al 2% / tampón de anticuerpos TBS-T (dilución 1: 3,000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos primarios a la membrana en el plato.
- Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (use el agitador de plataforma).
- Deseche la solución de anticuerpos y lave la membrana en el plato (use el agitador de plataforma).
- Añadir 25 ml de TBS-T a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
- Añadir 25 ml de TBS-T/0,5 M de NaCl a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
- Añadir 25 ml de TBS-T/0,5% Triton X-100 a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
- Añadir 25 ml de TBS-T a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
- Teñir la membrana con el anticuerpo secundario de cabra αrabbit-IgG-HRPO (peroxidasa de rábano picante) en polvo de batido de reemplazo de comida al 2% / tampón de anticuerpos TBS-T (dilución 1: 2,000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos secundaria a la membrana en el plato.
- Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (en el agitador de plataforma).
- Lave la membrana de nuevo como se describe en el paso 4.7.1.- 4.7.4. utilizando el agitador de plataforma. Para esta membrana, continúe con el paso 4.16. (los siguientes pasos 4.10.- 4.15. (detección de αDEC-205) se puede realizar en paralelo a los pasos 4.2.- 4.9.).
- Prepare las muestras para la detección de αDEC-205 para SDS-PAGE y ejecute la electroforesis en gel.
- Diluir diferentes cantidades de αDEC-205/OVA (por ejemplo, 200, 100 y 50 ng), de la αDEC-205 no conjugada (por ejemplo, 250, 125, 62,5 ng), de OVA pura (por ejemplo, 80 y 70 ng), una muestra de αDEC-205/OVA no concentrada a partir de la etapa 3.4.2. (por ejemplo, 125 ng) y una alícuota de flujo a través de I y II (pasos 3.4.5. y 3.4.7., respectivamente; opcional) en 4 x tampón de muestra SDS no reductor.
- Desnaturalizar las muestras a 65 °C durante 10 min y 550 rpm en un bloque calefactor.
- Cargue las muestras y un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute la electroforesis en gel.
- Realice la eliminación estándar de las proteínas desde el gel SDS hasta una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno) activada con metanol (75 min, 125 mA).
- Después de la secadura, coloque la membrana en un plato apropiado y bloquee la membrana pipeteando 25 ml de tampón de bloqueo del 10% (leche en polvo / TBS-T) en el plato que contiene la membrana.
NOTA: Las soluciones de bloqueo difieren entre la detección αDEC-205 y OVA (paso 4.5.).- Incubar la membrana en la solución de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (utilizando el agitador de plataforma).
- Deseche la solución bloqueadora y manche la membrana con el anticuerpo αrat-IgG(H+L)-HRPO de cabra en un tampón de anticuerpos de leche en polvo al 5% /TBS-T (dilución 1:5.000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos a la membrana del plato.
NOTA: Los tampones de anticuerpos difieren entre la detección de αDEC-205 y la detección de OVA (pasos 4.6. / 4.8.).- Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (utilizando el agitador de plataforma).
- Lave bien la membrana en el plato como se describe en los pasos 4.7.1.- 4.7.4. (use el agitador de plataforma).
- Utilice un reactivo de detección apropiado para desarrollar la señal HRP y detectar la quimioluminiscencia en una habitación oscura utilizando una película de rayos X o a través de un sistema de imágenes.
5. Verificación de la conjugación química por ELISA
- Realice ELISA para una mayor verificación de la conjugación química exitosa que resulta en αDEC-205 / OVA.
- Cubra una placa ELISA apropiada de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de anticuerpo αOVA de conejo 3 ng/μL en tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO3) pH 9,6 diluido en H2O).
- Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
- Después del recubrimiento, lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, usando una lavadora ELISA.
- Bloquee la placa pipeteando 200 μL de tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) en cada pocillo de la placa e incube la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
- Diluir en serie αDEC-205/OVA (obtenido a partir del paso 3.6.) 1:2 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) para obtener diluciones que van desde 6 μg/mL hasta 93.8 ng/mL αDEC-205/OVA y agregar 100 μL/pocillo de estas cantidades decrecientes de αDEC-205/OVA a los pozos.
- Incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, usando una lavadora ELISA.
- Añadir 100 μL del anticuerpo de cabra αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (diluido a 1:2.000 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS)) a cada pocillo de la placa.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, con una lavadora ELISA.
- Añadir 50 μL de sustrato HRPO a los pozos. Cuando observe una reacción de color claro, detenga la reacción mediante la adición de una solución de detención de 150 μl(1MH 2 SO4) por pozo.
- Después de 5 min, lectura de absorción a 450 nm utilizando un lector ELISA.
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Representative Results
La conjugación química de αDEC-205 a la proteína OVA utilizando este protocolo normalmente permitirá la generación eficiente de αDEC-205/OVA para enfoques de orientación de CC in vivo. Existen diferentes estrategias para verificar la técnica en sí y probar la funcionalidad del conjugado producido. El análisis de Western blot y ELISA se utilizan para verificar la conjugación exitosa y al mismo tiempo detectar OVA potencialmente libre(Figura 2). Los estudios de unión in vitro (Figura 3) y las inmunizaciones in vivo (Figura 4) confirman la unión del conjugado a DEC-205 y la focalización de DC.
El análisis paralelo de western blot se utiliza para detectar tanto el OVA conjugado(Figura 2A)como el conjugado αDEC-205(Figura 2B). Específicamente, la señal positiva para OVA a nivel del peso molecular del anticuerpo en el blot confirma la asociación de OVA y el anticuerpo (Figura 2A). Además, la tinción para OVA en el análisis de western blot permite la detección de un exceso de OVA libre potencialmente aún presente junto al αDEC-205/OVA producido en el paso 3.6., que no es el caso para el blot mostrado (Figura 2A). En caso de que se detecten grandes cantidades de OVA libre, pasos 3.4.1. a 3.4.8. del protocolo debe repetirse. Complementaria a la tinción para OVA (Figura 2A), la tinción para αDEC-205 en el análisis de western blot verifica la conjugación exitosa a través de un aumento en el peso molecular entre αDEC-205 "desnuda" y el conjugado como se muestra en la Figura 2B.
Junto al western blotting, también un ELISA específico permite la verificación de la conjugación exitosa de αDEC-205 a OVA. Sin embargo, a diferencia de los análisis de western blot, este ELISA no permite la detección de αDEC-205 u OVA libre y no conjugado. Debido a la configuración del ensayo(Figura 2C),solo se produce una señal positiva si la conjugación fue eficiente. La asociación positiva entre la señal detectada (absorción a 450 nm) y la cantidad analizada de proteína verifica la generación exitosa de αDEC-205/OVA a través de la conjugación química como se muestra en la Figura 2D. Al mismo tiempo, la señal positiva ya emitida a partir de 9,38 ng del conjugado αDEC-205/OVA demuestra la fuerte sensibilidad de este método(Figura 2D). En caso de que no haya un aumento en la adsorción para cantidades crecientes del conjugado, la conjugación presumiblemente no tuvo éxito. En este caso, también los análisis de western blot arrojarían resultados negativos, es decir, ninguna detección del conjugado en el blot teñido para OVA y ningún aumento en el peso molecular en el blot teñido para αDEC-205.
Mientras que los ensayos western blot y ELISA se utilizan para evaluar la conjugación y la eliminación del antígeno libre como tal, se necesitan análisis funcionales posteriores para confirmar la unión a DEC-205 y la orientación de DC. Para ello, hemos realizado estudios de unión in vitro ( Figura3) e inmunizaciones in vivo (Figura 4). Para estos experimentos, se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 de 6-8 semanas y Balb/c de 8 a 12 semanas de fuentes comerciales o criados en las instalaciones de animales del Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones (HZI) y se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos. La Figura 3 muestra ensayos funcionales para la unión de un conjugado de αDEC-205 y la proteína HCV Core (αDEC-205/Core) a células CD11c+ in vitro. La citometría de flujo mostró claramente que αDEC-205/Core se une de manera eficiente a las células CD11c+ derivadas de la médula ósea(Figura 3A,B),así como a los esplenocitos CD11c+ de ratón recién aislados (datos no mostrados). Estos ensayos demuestran que la conjugación química no interfiere con la capacidad de unión de αDEC-205. Esto se confirma aún más mediante análisis de inmunofluorescencia que muestran la unión de αDEC-205 / Core a células MHC-II+ CD11c+ clasificadas a partir de células dendríticas derivadas de la médula ósea generadas in vitro (BMDC) (Figura 3C).
En el pasado, hemos demostrado que los conjugados αDEC-205/OVA producidos por el protocolo demostrado inducen eficientemente respuestas inmunes específicas de OVA in vivo en ratones, confirmando la generación exitosa del conjugado, así como la orientación funcional de DC(Figura 4)12,14. Específicamente, la vacunación subcutánea con αDEC-205/OVA indujo eficientemente respuestas inmunes humorales y celulares específicas de OVA. Es importante destacar que en un modelo de desafío de adenovirus recombinante detectamos células T CD8+ antivirales capaces de eliminar hepatocitos infectados por virus, lo que tiene fuertes implicaciones para las vacunas dirigidas a los virus hepatotrópicos12. Además, la inducción altamente efectiva de células T citotóxicas específicas de antígeno subraya el potencial de este enfoque para el cebado in vivo de la inmunidad antitumoral. Además, hemos utilizado con éxito αDEC-205/OVA para probar y comparar diferentes adyuvantes en el contexto de la orientación de CC in vivo 14. En la vacunación con αDEC-205/OVA junto con la combinación adyuvante Poly(I:C) (ácido poliinosínico-policitidílico) y CpG (oligodesoxinucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG no metilados) observamos en general (Figura 4A) y para algunos puntos de tiempo niveles significativamente más altos de IgG específica de OVA en comparación con la vacunación con OVA solo (Figura 4B). Además, αDEC-205/OVA indujo eficientemente las respuestas de células T CD4+ específicas de OVA y CD8+ (Figura 4C,D)y la respuesta de células T CD8+ inducida por OVA-205 / OVA superó significativamente la inducida por OVA solo(Figura 4D).
Figura 1: Modelo de la conjugación química de αDEC-205 y OVA. En un primer paso, la amina primaria de αDEC-205 reacciona con el éster NHS del reticulador sulfo-SMCC dando como resultado αDEC-205 activado por maleimida. Tras la reducción de los enlaces disulfuro de la proteína OVA a través de la incubación con TCEP-HCl, la αDEC-205 activada por maleimida reacciona con la proteína OVA reducida por TCEP-HCl para formar el conjugado anticuerpo/antígeno αDEC-205/OVA. Abreviaturas: éster de N-hidroxisuccinimida (éster NHS); sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); Tris(2-carboxisethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Verificación de la αDEC-205/OVA conjugada químicamente. Para verificar la conjugación química efectiva de αDEC-205 y la proteína OVA, se realizan análisis de western blot(A, B)y ELISA(C, D). Las muestras de αDEC-205/OVA, αDEC-205 y diferentes concentraciones de proteína OVA se sometieron a SDS-PAGE (10%) y posterior análisis de western blot utilizando un anticuerpo primario αOVA de conejo y un anticuerpo secundario de cabra αrabbit-IgG-HRPO para detectar la proteína OVA(A)o un anticuerpo αrat-IgG(H+L)-HRPO de cabra para detectar αDEC-205 (B). (C) Representación esquemática del ELISA para la verificación del conjugado αDEC-205/OVA. El anticuerpo de recubrimiento αOVA de conejo se une a αDEC-205/OVA a través del OVA conjugado. La cabra αrat-IgG(H+L)-HRPO reconoce la fracción αDEC-205 del conjugado unido y una señal positiva confirma así la conjugación efectiva. (D) ELISA se realizó como se describe en (C). Se analizaron las cantidades diluidas en serie (1:2) de αDEC-205/OVA (600 ng a 9,38 ng). Los datos se muestran como la media de triplicados de un ensayo representativo. Abreviaturas: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA); peroxidasa de rábano picante (HRPO); ovoalbúmina (OVA); electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Los paneles A y B han sido modificados a partir de Volckmar et al.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Unión de αDEC-205/Core a células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) mediante citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Para analizar la capacidad de αDEC-205/Core para unir su molécula diana DEC-205 en BMDCs in vitro, se realizaron análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)(A,B)y microscopía de inmunofluorescencia(C). En resumen, las células de la médula ósea se aislaron de las patas traseras de ratones hembra Balb/c (n = 3) de 8 a 12 semanas de edad y se cultivaron en medio RPMI suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de glutamina, 0,25 mM de mercaptoetanol y 5 ng / ml GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos). El día 6, los BMDC no adherentes se cosecharon cuidadosamente y se utilizaron para análisis vinculantes. (A,B) Los BMDC generados in vitro se incubaron con 10 μg/mL αDEC-205/Core, αDEC-205 o medio (control) durante 1 h a 4 °C seguido de tinción con αCD11c marcado con APC [clon HL3]. La detección de αDEC-205/Core unido en la superficie de los BMDC se realizó mediante tinción adicional de las células con αrat de cabra marcado con PE (A) o αHCV Core de ratón [clon C7-50] seguido de tinción secundaria de αmouse-IgG1-PE (B). Los histogramas representativos muestran la señal de PE y el % de células PE positivas de las células CD11c+ cerradas. (C) Los BMDC generados in vitro a partir de ratones Balb/c ingenuos se clasificaron para células MHC-II+ y CD11c+ y se incubaron con 10 μg/mL αDEC-205/Core durante 1 h a 4 °C. La αDEC-205/Core unida a células se tiñó con αrat-IgG acoplada a Alexa 594 o con αHCV Core de ratón [clon C7-50] y αmouse-IgG acoplada a Alexa 488 durante 30 min a 4 °C después del lavado. Las células fueron visualizadas por microscopía de inmunofluorescencia (barra de escala = 20 μm). La capacidad de unión de αDEC-205/Core a BMDCs fue confirmada por una superposición de ambas tinciones (doble positivo = naranja). Abreviaturas: células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC); clasificación celular activada por fluorescencia (FACS); factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); virus de la hepatitis C (VHC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas de OVA después de la inmunización con αDEC-205/OVA. La funcionalidad de αDEC-205/OVA para dirigirse a la CC in vivo se comprobó a través de experimentos de inmunización como se publicó anteriormente en Volckmar et al.12. Brevemente, los ratones C57BL/6 hembras de 6-8 semanas de edad (n = 5) fueron inmunizados por vía subcutánea en los días 0, 14 y 28 con 30 μg αDEC-205/OVA conjugados junto con los adyuvantes 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 solo o 7 μg de proteína OVA sola en un volumen total de 50 μL PBS por animal. Los controles adicionales se trataron con PBS solo. (A,B) Para monitorizar la respuesta inmune humoral, los ratones vacunados fueron ligeramente anestesiados mediante inhalación de isoflurano y se recogieron muestras de sangre del seno retroorbital los días 0, 13 y 27 y por punción cardíaca el día 42. Los sueros fueron preparados como descritos y ensayados para la presencia de IgG específica de OVA por ELISA12. Los títulos de punto final se expresaron como el valor recíproco de la última dilución sérica que produjo una absorbancia dos veces superior a los valores de los controles negativos. Los resultados se compilan a partir de tres experimentos independientes. (A) Cinética de los títulos de IgG sérica total específica de OVA que se muestra como media del grupo. (B) Título de IgG específico de OVA en el día 27 y el día 42 mostrado para ratones individuales junto con la media del grupo. Estadísticas: prueba t de dos caras no apareada. (C,D) La inducción de las respuestas inmunes celulares se analizó mediante ensayos de manchas inmunoabsorbentes ligadas a enzimas (ELISPOT) utilizando el kit de detección de IFNγ murino en el día 42 como se publicó anteriormente12. Se agruparon esplenocitos aislados de ratones inmunizados para los grupos experimentales y se analizó el número de unidades formadoras de manchas IFNγ/106 células tras la estimulación con 5 mg/mLCD4+ (C) o CD8+ OVA péptido (D) (péptidos OVA: CD4323–339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) y CD8257–264 (SIINFEKL)). Las barras representan la media ± SEM (n = 5, triplicados de muestras agrupadas). Estadísticas: ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Abreviaturas: secuencias de oligonucleótidos de citosina-fosfato-guanina (CpG), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), mancha inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISPOT), ovoalbúmina (OVA), solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido poliinosínico-policitidílico (Poly(I:C)). Esta cifra ha sido modificada a partir de Volckmar et al.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La conjugación química de un anticuerpo específico del receptor de endocitosis y un antígeno proteico proporciona un enfoque eficiente y, lo que es más importante, también flexible para la orientación in vivo de DC en modelos preclínicos de ratón. Con nuestro protocolo proporcionamos un enfoque eficiente para la conjugación exitosa del modelo de antígeno OVA a un anticuerpo IgG específico de DEC-205.
En nuestro protocolo, αDEC-205 se purifica a partir de una línea celular de hibridoma y en el pasado, hemos purificado el anticuerpo utilizando la proteína G sefarosa como se describe. Cabe destacar que también hemos utilizado FPLC para purificar αDEC-205 en estudios posteriores y la conjugación química posterior también fue eficiente. Los pasos críticos para una conjugación química eficiente son el cebado tanto del anticuerpo como de la proteína. Hemos optimizado estos pasos a partir de diferentes protocolos disponibles para finalmente realizar la incubación del anticuerpo con el reticulador sulfo-SMCC y la reducción de la proteína a través de TCEP-HCl. Específicamente, en este punto los pasos críticos son la preparación fresca de TCEP-HCl (paso 3.1.) y la duración de la incubación de TCEP-HCl con la proteína, que no debe extenderse (paso 3.1.2.). Además, el tampón proteico utilizado para la reducción de los enlaces disulfuro a través de TCEP-HCl es crítico, ya que puede afectar negativamente la reducción por TCEP-HCl. Además, es importante mezclar inmediatamente el anticuerpo activado y la proteína reducida (paso 3.3.6.) para garantizar condiciones de reacción óptimas para la conjugación. En nuestras manos, este enfoque produjo los resultados más eficientes y confiables con respecto a la conjugación. Otro paso crítico para los enfoques in vivo posteriores es la eliminación del OVA no unido del conjugado αDEC-205/OVA. Para verificar este paso, hemos optimizado los análisis de western blot y recomendamos la detección tanto de la αDEC-205 conjugada como de la proteína OVA conjugada(Figura 2A y B). En caso de que el OVA no unido esté presente en la solución conjugada final, la eliminación y detección de concentraciones conocidas de OVA (como en la Figura 2A)ayudará a estimar la cantidad de OVA no unido en relación con la cantidad total de proteína cargada para el SDS-PAGE. Si la conjugación fue ineficiente, la solución de problemas debe abordar la relación antígeno/anticuerpo utilizada para la conjugación. En caso de que la conjugación fuera efectiva según lo detectado por ELISA, pero no puede ser detectada por el análisis de western blot, hemos experimentado las concentraciones de anticuerpos en los análisis de western blot (pasos 4.6., 4.8., 4.14.) el factor más crítico.
La principal limitación de nuestro enfoque es una eficiencia de conjugación a veces variable en la que no existe una correlación fija entre el número de moléculas de anticuerpos y la cantidad de proteína acoplada. Sin embargo, creemos y hemos experimentado que el protocolo demostrado permite de manera confiable estudios in vivo posteriores de focalización de CC que producen resultados reproducibles. Además, mientras que en principio en nuestro protocolo tanto la αDEC-205 como la proteína OVA pueden intercambiarse por anticuerpos y antígenos alternativos para estudios in vivo de diversos intereses, los pasos individuales de la conjugación química deberán optimizarse recientemente para los nuevos componentes. Esto se aplica principalmente a la relación óptima anticuerpo/antígeno y puede depender, por ejemplo, de la accesibilidad de los residuos reducibles de Cys. En nuestros enfoques, las proporciones óptimas que resultaron en reacciones de conjugación exitosas fueron 1:5 para OVA a αDEC-205 y 1.35:1 para las proteínas NS3 (proteína no estructural 3) y Core a αDEC-205. Para cada conjugado, deben excluirse los efectos negativos del reticulador o de la conjugación como tal sobre la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo. Cabe destacar que la conjugación de péptidos inmunogénicos en lugar de proteínas de longitud completa es menos problemática en este sentido. Sin embargo, las proteínas proporcionan una mayor diversidad de antígenos en la inmunización posterior. Los enfoques de fusión genética muestran una alternativa a la conjugación química y también tienen claras ventajas1. En última instancia, la elección de la estrategia para vincular anticuerpos y antígenos para la orientación de DC dependerá de los recursos, el enfoque de la investigación y las aplicaciones anticipadas de los conjugados. Creemos que la flexibilidad relativa con respecto a los anticuerpos y antígenos muestra una gran ventaja de la conjugación química y, de hecho, hemos utilizado el protocolo descrito aquí para la conjugación química eficiente de αDEC-205 a diferentes proteínas del virus de la hepatitis C (VHC)(Figura 3 y datos no mostrados).
En general, creemos que la conjugación química de anticuerpos específicos del receptor de endocitosis a antígenos proteicos como en αDEC-205 / OVA muestra una herramienta flexible y confiable para generar conjugados anticuerpo/ antígeno de valor excepcional en el estudio de enfoques de orientación de DC, incluidos también aquellos que apuntan a inducir inmunidad antitumoral, especialmente en modelos animales preclínicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a S. Prettin la asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación Alemanes (HGF) que se proporcionó como parte de la Alianza Helmholtz "Inmunoterapia de Cánceres" (HCC_WP2b).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
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