Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

Abstract

שליטה אמינה בביטוי גנים בתאי יונקים דורשת כלים עם שינוי קיפול גבוה, רעש נמוך ופונקציות העברה נחושות של קלט לפלט, ללא קשר לשיטה שבה נעשה שימוש. לקראת מטרה זו, מערכות ביטוי גנים אופטוגנטיות זכו לתשומת לב רבה בעשור האחרון לשליטה מרחבית ברמות החלבון בתאי היונקים. עם זאת, רוב המעגלים הקיימים השולטים בביטוי גנים הנגרמים על ידי אור משתנים בארכיטקטורה, באים לידי ביטוי מפלסמידים, ומשתמשים בציוד אופטוגנטי משתנה, ויוצרים צורך לחקור אפיון ותקינה של רכיבים אופטוגנטיים בשורות תאים יציבים. כאן, המחקר מספק צינור ניסיוני של בניית מעגלי גנים אמינים, אינטגרציה ואפיון לשליטה בביטוי גנים בלתי חדירים לאור בתאי יונקים, תוך שימוש במעגל אופטוגנטי משוב שלילי כדוגמה למקרה. הפרוטוקולים גם ממחישים כיצד סטנדרטיזציה של ציוד אופטוגנטי ומשטרי אור יכולה לחשוף באופן מהימן תכונות מעגל גנים כגון רעש ביטוי גנים וגודל ביטוי חלבון. לבסוף, מאמר זה עשוי להיות שימושי עבור מעבדות שאינן מוכרות עם אופטוגנטיקה המעוניינים לאמץ טכנולוגיה כזו. הצינור המתואר כאן צריך לחול על מעגלים אופטוגנטיים אחרים בתאי יונקים, המאפשרים אפיון אמין ומפורט יותר ושליטה על ביטוי גנים ברמה התמלולית, הפרוטאומית, ובסופו של דבר פנוטיפית בתאי יונקים.

Introduction

בדומה לדיסציפלינות הנדסיות אחרות, ביולוגיה סינתטית שואפת לתקנן פרוטוקולים, ומאפשרת להשתמש בכלים עם פונקציות רב-תכליתיות לשחזור לחקר שאלות הרלוונטיות למערכות ביולוגיות1,2. תחום אחד בביולוגיה סינתטית שבו נבנו מערכות בקרה רבות הוא תחום ויסות ביטוי הגנים3,4. בקרת ביטוי גנים יכולה למקד הן את רמות החלבון והן את השונות (רעש או מקדם וריאציה, CV = σ/μ, הנמדדים כסטיית התקן על הממוצע), שהם מאפיינים תאיים קריטיים בשל תפקידם במצבים תאיים פיזיולוגיים ופתולוגיים5,6,7,8. מערכות סינתטיות רבות שיכולות לשלוט ברמות החלבון וברעש4,9,10,11,12 תוכננו, מה שיוצר הזדמנויות לתקנן פרוטוקולים בכלים שונים.

קבוצה חדשה אחת של כלים שיכולים לשלוט ברשתות גנים שהתפתחה לאחרונה היא אופטוגנטיקה, המאפשרת שימוש באור כדי לשלוט בביטוי הגנים13,14,15,16,17. בדומה לקודמיהם הכימיים, ניתן להכניס מעגלי גנים אופטוגנטיים לכל סוג תא, החל מחיידקים ועד יונקים, המאפשרים ביטוי של כל גן עניין במורד הזרם18,19. עם זאת, בשל הדור המהיר של כלים אופטוגנטיים חדשניים, התפתחו מערכות רבות המשתנות בארכיטקטורת מעגלים גנטיים, מנגנון הביטוי (למשל, מבוסס פלסמיד לעומת שילוב ויראלי), וציוד בקרת אספקת אור11,16,20,21,22,23,24,25 . לכן, זה משאיר מקום לתקנון של תכונות אופטוגנטיות כגון בניית מעגל גנים ואופטימיזציה, שיטת ניצול המערכת (למשל, אינטגרציה לעומת ביטוי חולף), כלים ניסיוניים המשמשים אינדוקציה וניתוח תוצאות.

כדי להתקדם בתקינון פרוטוקולים אופטוגנטיים בתאי יונקים, פרוטוקול זה מתאר צינור ניסיוני להנדס מערכות אופטוגנטיות בתאי יונקים באמצעות מעגל גנים משוב שלילי (NF) המשולב בתאי HEK293 (קו תאי כליה עובריים אנושיים) כדוגמה. NF היא מערכת אידיאלית להדגמת תקינה מכיוון שהיא שופעת מאוד בטבעה 26,27,28, ומאפשרת כוונון רמות חלבון ומזעור רעש להתרחש. בקצרה, NF מאפשר שליטה מדויקת בביטוי גנים על ידי מדכא המפחית את הביטוי שלו מספיק מהר, ובכך מגביל כל שינוי הרחק ממצב יציב. המצב היציב יכול להשתנות על ידי ממריץ כי מנטרל או מבטל את הדיכוי כדי לאפשר ייצור חלבון יותר עד מצב יציב חדש הוא הגיע עבור כל ריכוז ממריץ. לאחרונה, נוצרה מערכת אופטוגנטית מהונדסת של NF שיכולה לייצר תגובה דינמית רחבה של ביטוי גנים, לשמור על רעש נמוך ולהגיב לגירויים קלים המאפשרים את הפוטנציאל לשליטה בביטוי גנים מרחביים11. כלים אלה, המכונים מקלטים בלתי ניתנים למניעה לאור (LITers), נוצרו בהשראת מערכות קודמות שאפשרו שליטה בביטוי גנים בתאים חיים4,10,29,30 ושולבו ביציבות בקווי תאים אנושיים כדי להבטיח שליטה ארוכת טווח בביטוי הגנים.

כאן, באמצעות LITer כדוגמה, פרוטוקול מתואר ליצירת מעגלי גנים מגיבים לאור, גרימת ביטוי גנים עם מנגנון צלחת אור (LPA, חומרת אינדוקציה אופטוגנטית)31, ולנתח את התגובות של קווי התא המהונדסים, האופטוגנטיים לשליטה לגירויים אור מותאמים אישית. פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להשתמש בכלי LITer עבור כל גן פונקציונלי שהם רוצים לחקור. זה יכול להיות מותאם גם עבור מערכות אופטוגנטיות אחרות עם ארכיטקטורות מעגלים מגוונות (למשל, משוב חיובי, רגולציה שלילית, וכו ') באמצעות שילוב השיטות וציוד אופטוגנטי המתואר להלן. בדומה לפרוטוקולים אחרים של ביולוגיה סינתטית, ניתן ליישם את הקלטות הווידאו והפרוטוקולים האופטוגנטיים המתוארים כאן במחקרים חד-תאיים בתחומים מגוונים, כולל אך לא מוגבל לביולוגיה של סרטן, התפתחות עוברית ובידול רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון מעגלי גנים

  1. בחר רכיבים גנטיים לשילוב במעגל גנים/פלסמיד יחיד (לדוגמה, מוטיבים של רצף שילוב DNA של יונקים32, אלמנטים מגיבים לאור33 או גנים פונקציונליים34).
  2. באמצעות כל הנדסה גנטית ו/או תוכנה לשיבוט מולקולרי, אחסן את רצפי הדנ"א לשימוש והפניה מאוחרים יותר, הוסף ביאורים לכל רצף ובחן את כל התכונות הדרושות (לדוגמה, קודונות START, תקינה או רצפים מתורגמים)35.
  3. לפתח או לאמץ חלקים על פי העיצוב הכולל של מעגל הגנים36. לדוגמה, עבור מדכאים אופטוגנטיים כמו LITers11, למזג קידוד רצף גנים עבור תחום המסוגל השפלה בלתי ניתנת לחישה אור37,38 או השבתה של יכולת איגוד DNA של מדכא 39, בסמוך ובמסגרת של גן הדיכוי (למשל, TetR)4.
    1. עבור מפעילים אופטוגנטיים, להבטיח את נוכחותו של domain activator40 המקדם ביטוי גנים על כריכת DNA המושרה אור41. עבור רישום אוטומטי שלילי או חיובי, להבטיח את נוכחותו של אתר מחייב רגולטורי בתוך או במעלה הזרם של מקדם הגן של הרגולטור (למשל, אתרי tetO בתוך או במעלה הזרם של מקדם ביטוי TetR)42.
  4. עצבו את הפריימרים להגברת רצף הדנ"א או לרצף הפלסמיד באמצעות תוכנת השיבוט המולקולרית לכל מעגל גנים.
  5. אמת את הפריימרים באופן חישובי לבנייה פלסמידית באמצעות משתה מובנה של תוכנת שיבוט מולקולרית (למשל, יישור רצף).
  6. להזמין פריימרים oligonucleotide מהיצרן. פלסמידים שנבנו ונמצאו בשימוש בעבודה זו ניתן למצוא בחומר התומך המקורי11 יחד עם הפריימרים שתוכננו ונמצאו בשימוש.
  7. לדלל את הפריימרים לריכוז מלאי של 100 מ"מ במים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  8. לדלל את המלאי של פריימרים מניות 100 mM לריכוז 10 mM עבור PCR.
  9. הכן את תערובת ה- PCR עם 1 μL של פריימר קדמי, 1 μL של פריימר הפוך, 1 μL של DNA תבנית למסה כוללת של 0.5-500 ng עבור גנומי או 0.5 pg-5 ng עבור plasmid או DNA ויראלי, 12.5 μL של DNA פולימראז 2x תערובת מאסטר (או הנפח המספק את גורם הדילול של היצרן), ו 9.5 μL של ddH2O עבור נפח תגובה כולל של 25 μL.
  10. דגירה של תערובת PCR בתרמוציקלר בהגדרות המתאימות בהתאם לאנזים שנבחר43. מחזורי התגובה המוצעים כוללים:
    שלב 1: מחזור אחד של 30 s שלב denaturation ראשוני ב 95 °C (60 °F).
    שלב 2: 40 מחזורים של 5 s של שלב denaturation ב 98 °C (60 °F).
    שלב 3: מחזור אחד של 30 s של שלב חישול ב 65 °C (נקבע על ידי פריימרים שתוכננו קודם לכן).
    שלב 4: מחזור אחד של דקה אחת של הרחבה באורך מקטע תבנית של 72 °C (~ 1 קילו-בסיס (kb).
    שלב 5: מחזור אחד של הארכה של 2 דקות ב 72 °C (72 °F).
    החזק את התגובה ב 4 °C (65 °F) עד שהוא יכול להיבדק באמצעות אלקטרופורזה ג'ל. פרוטוקול זה ישתנה בהתאם לריגנטים המשמשים (לדוגמה, פולימראז ומאגרים).
  11. חזור על שלב 1.9 כדי להגביר את כל הקטעים שישמשו בתגובת הרכבת DNA הנדרשת לקישור מוצרי PCR ליניאריים לווקטור DNA מעגלי יחיד.
  12. הפעל את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ואחריו טיהור הרצועות של האורך הרצוי.
  13. הכן את התערובת הראשית לתגובת הרכבת DNA (טבלה 1).
    הערה: בדוגמה זו, וקטור האם מחולק לשני קטעים כדי להגביר את היעילות של שלבי ה- PCR מבלי לגרום לשינויים משמעותיים בתוצאת ההרכבה הכוללת.
  14. דגירה של תערובת אב התגובה של הרכבת ה- DNA בתרמוציקלר בטמפרטורה של 50 °C (50 °C ( 15 °C (אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול ריאגנט הרכבה DNA) ולאחסן את התגובה ב 4 °C (60 °F) כדי להשתמש במוצר התגובה עבור טרנספורמציה חיידקית.
  15. הגדר טרנספורמציה חיידקית (כימית או אלקטרופורציה) באמצעות תאי E. coli (Escherichia coli) מוסמכים ופרוטוקול טרנספורמציה חיידקית המתאים. לאחר הטרנספורמציה, השתמשו בלוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) חיידקיים המכילים את סמן בחירת החיידקים שנבחר (למשל, אמפיצילין) כדי לכסות את תערובת הטרנספורמציה. לדגור על הצלחות ב 37 °C (50 °F) לילה 44.44 ..
  16. בדוק את הצלחות למחרת. כדי לחסן את המושבות, לבחור מושבות בודדות מן הצלחות resuspend אותם במרק LB נוזלי עם סמן הבחירה החיידקי המתאים צינורות תרבות. דגירה בחממה שייקר ב 37 °C (50 °F), 300 סל"ד לילה.
  17. בצע פרוטוקול הכנת פלסמיד כדי לחלץ את ה- DNA הפלסמיד מתרבות החיידקים.
  18. אמת את המעגל בשני שלבים. ראשית, בצעו בדיקת עיכול באמצעות אנזימי הגבלה כאימות גולמי כדי לראות אם מוצר הפלסמיד המשוער הושג. שנית, אם עיכול הבדיקה מועבר / מאושר, שלח את הפלסמיד למתקן ריצוף סנגר (או תהליך באמצעות הציוד הזמין) כדי להשיג את רצף ה- DNA המדויק כדי להשוות אותו מאוחר יותר לרצף הצפוי בתוכנת העיצוב.
    1. כדי לבצע עיכול בדיקה, בחר לפחות שני אנזימי הגבלה המייצרים לפחות שני שברים, בהתבסס על תוכנת השיבוט המולקולרית המשמשת. לאחר בחירת אנזימים, להכין את דגימות הבדיקה על ידי הוספת 1 μL של כל אנזים, 5 μL של ה- DNA שנוצר, ו 13 μL של מים עם מלחים מתאימים חוצצים בהתאם אנזימים המשמשים. לדגור על התגובה ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעות, או כפי שמציע יצרן האנזים. הפעל את מוצרי העיכול הבדיקה על ג'ל 1% agarose ולקבוע אם הרצועות נכונות.
      הערה: אם הרצועות נכונות, המשך לרצף.
    2. כדי לבצע רצף, ליצור פריימרים המבוססים על ה- DNA המאוחסן בתוכנה, כך אזורי חישול של פריימרים הם כ 500 bp (זוגות בסיס) זה מזה ולכסות את שבר העניין (רכיב מעגל גנים) או plasmid המלא. לדלל את הפריימרים עם מים טהורים ללא נוקלאז (NF-H2O) לריכוז של 10 מ"מ. הכן את דגימות הרצף על ידי הוספת 1 μL של 10 ng / μL DNA, 1 μL של פריימר, ו 8 μL של NF-H2O לצינור 0.2 מ"ל. חזור על פעולה זו עבור כל פריימר.
      הערה: כאשר דגימות מוכנות, שחרר אותן במתקן הריצוף והשווה את התוצאות עם רצף פלסמיד באמצעות תוכנת שיבוט מולקולרית.
  19. בשלב זה, ליצור כ 100-1000 ng/μL של דגימת DNA לשילוב פלסמידים המכילים מעגלי גנים לתוך קו התא המתאים.

2. הנדסת קו תא יציבה

  1. הזמינו קו תאי יונקים המיועד לדור מהיר של תת-קווים יציבים המבטיחים ביטוי ברמה גבוהה של חלבון העניין מווקטור ביטוי יונקים. סוג התא וקלות הנדסת קו התא יכולים להשתנות בהתאם למה שהמשתמשים מעדיפים או שואפים להשיג.
    1. לדוגמה, אם משתמשים מעדיפים הנדסת קו תא עם שלבי ביניים מינימליים, הזמן את התאים המכילים אתר אינטגרציה יציב יחיד (לדוגמה, FRT) בלוקוס גנומי פעיל בתמלול. אם עדיפות על הנדסת תאים מגוונת יותר, צור אתרי אינטגרציה במיקומים מועדפים באמצעות כלי הנדסה גנטית כגון CRISPR/Cas9.
  2. לגדל תאים ב 5% CO2 באוויר לח ב 37 °C (55 °F). התאם את תנאי הצמיחה לפי הצורך עבור סוג התא.
  3. העבר את מעגלי הגנים שתוכננו לעיל בתאים הרצויים המתקבלים מהשלבים הקודמים כדי להתחיל בתהליך ייצור יציב של קו תאים. כדי להשיג זאת, השתמש תערובת ליפוזום45 של ה- DNA מעגל הגן עם רקומבינאז מתאים (לדוגמה, Flp-recombinase עבור Recombination Flp-FRT) או באמצעות שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה.
  4. יומיים לאחר ההעברה, לפצל את התאים ל 25% מפגש.
  5. שש שעות לאחר פיצול התאים, להתחיל את בחירת האנטיביוטיקה על ידי החלפת התקשורת למדיה טרייה המכילה 50 מיקרוגרומיצין / מ"ל של אנטיביוטיקה hygromycin (או סוכן אנטיביוטי אחר המתאים לגן עמידות לאנטיביוטיקה יונקים שנבחרו במהלך בניית פלסמיד).
    הערה: ישנם מגוון גנים עמידים לאנטיביוטיקה של יונקים המשמשים בבניית מעגלי גנים, שלכל אחד מהם יש עקומת הרג שונה. לכן, לא משנה איזה גן עמידות לאנטיביוטיקה של יונקים נבחר לבניית מעגלים, יש לחקור עקומת הרג נכונה בתאי העניין. שלב זה מבטיח שתאים המכילים את מטען מעגל הגנים מועשרים בעוד תאים ללא המערכת נהרגים.
  6. אפשר לתאים לגדול במדיית בחירת האנטיביוטיקה, לעבור למדיה טרייה כל 2-3 ימים עד הצלחת או הבקבוק יש כמה עשרות מוקדים. מעבר תרבויות חסיד כאשר הם נמצאים בשלב היומן לפני שהם מגיעים למפגש.
  7. ברגע שיש מספיק מוקדים, טריפסינים התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, 0.1% EDTA בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ללא סידן, מגנזיום, ונתרן ביקרבונט במשך מספר דקות. לנטרל את הטריפסין עם מדיה טרייה ולהעביר את כל התאים לתוך מיכל טרי.
  8. ברגע שהתאים במיכל הטרי הם 80%-100% יחד, להקפיא אותם בתערובת של 45% מדיה ישנה, 45% מדיה טרייה, ו 10% DMSO. העבר את התאים הנותרים לצינור סטרילי ובצע מיון של תאים חד-תאיים כדי לבודד תאים חד שבטיים לצלחת של 96 בארות.
  9. כ 2-3 שבועות לאחר מיון חד שבטי, בארות בתוך צלחת 96-well צריך להיות foci. כאשר כ 50%-60% מפגש, לפצל את התאים לצלחת 12-well.
  10. ברגע שהצלחת של 12 בארות היא 80%-100% מפגש, לפצל לתוך תרבית רקמות מטופל T-25 בקבוקון. ברגע שהתאים בבקבוקון T-25 הם 80%-100% יחד, להקפיא את התאים ולשמור על מעבר לאפיון ובדיקה של קווי תאים חד שבטיים.
    1. לאפיין את קווי התאים המונו-שבטיים על ידי בדיקות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה כדי לדווח על פרופילי ביטוי גנים המבוססים על ייצור הכתב הפלואורסצנטי המושרה. ודאו את ייצור החלבון הפונקציונלי באמצעות תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים ובדיקת אימונופלואורסצנטיות. בדוק את האינדוקציה של ביטוי הגנים ברמת התמלול באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). אמת את הרצף הגנטי ואת דיוק האינטגרציה באמצעות ריצוף גנום מקומי ומלא של השיבוטים.

3. בדיקות אינדוקציה של מנגנון צלחת אור

  1. בנה התקן LPA31,46 שישמש לגיוס אור של תאים מהונדסים. בקצרה, מספר שלבים רחבים חיוניים ליצירת LPA לשימוש לשליטה בביטוי גנים. אלה כוללים הדפסה תלת-ממדית של רכיבי מסגרת LPA, בניית מעגלים, תכנות המעגל באמצעות מתכנת מיקרו-בקר, הרכבת הרכיבים ל- LPA סופי, תכנות כרטיס הזיכרון באמצעות תוכנת IRIS וכיול ההתקן המוגמר. לקבלת הסבר מעמיק יותר, עיין בהפניות לעיל.
    1. הדפס את החלקים התלת-ממדיים כמפורט ב-Gerhardt ואח' (2016 ו-2019)31,46.
    2. להרכיב את המעגל כפי שמתואר גרהרדט ואח ' (2016 ו 2019)31,46.
    3. הוסף את הקושחה למעגל LPA המורכב באמצעות מתכנת מיקרו-בקר כפי שמתואר ב- Gerhardt et al. (2016 ו-2019)31,46.
    4. שלבו חלקים מודפסים בתלת-ממד ואת לוח המעגלים המורכב כמפורט ב-Gerhardt et al. (2016 ו-2019)31,46. זה כולל לקיחת לוח ההרכבה, לוח המעגלים, מרווח LED (דיודות פולטות אור), מתאם הלוחות, צלחת של 24 בארות, מכסה צלחת, ברגי הרכבה ואגוזי כנף ורכיבי ערימה כפי שמוצג בסרטון המצולם ובאיור 2.
    5. עבור תכנות וכיול של כרטיס זיכרון של ההתקן, בצע את השלבים המתוארים להלן.
  2. השתמש בתוכנת IRIS הזמינה באתר מעבדת תבור47 כדי לתכנת כרטיס SD עבור מנגנון צלחת האור (LPA)31 ולחקור את תנאי האור המתאימים הדרושים כדי להתחיל בניסוי אופטוגנטי.
    הערה: תוכנת IRIS היא יישום מבוסס אינטרנט לתכנות החומרה האלקטרונית האופטוגנטית, המכונה LPA, שפותחה על ידי מעבדת תבור. התוכנה מאפשרת תכנות של ערכי IRIS יחסיים השולטים בדיודות פולטות האור הבודדות (נורות LED) בכל באר של חומרת LPA.
  3. בחר באפשרות הנפתחת LPA (4 x 6), ולאחר מכן לחץ על גישת התאורה המתאימה (מצב יציב, דינמי, מתקדם).
    הערה: עבור כתב יד זה, כל הבדיקות יתמקדו בדוגמאות של מדינה יציבה. עם זאת, ניתן להשתמש בדוגמאות ההגדרה המתקדמות עבור משכי דופק ומשטרי מחזור עבודה.
  4. בחר אם נורות ה-LED העליונות או התחתונות יאירו על-ידי הזנת ערכים בתאים המתאימים לבארות הלוח. עבור LPAs בשימוש בעבודה זו, נוריות כחולות להציב במיקום העליון שימשו בכל הניסויים. כל נורית LED, לאחר שתתוכנתה, יכולה לספק חשיפה רציפה לאור בעוצמה קבועה של אור. תוכנת IRIS מאפשרת רמות עוצמה של 4096 שניתן לתכנת.
  5. לאחר בחירת מיקומי ה- LED, הזן ערכי עוצמה עבור קווי המתאר הניסיוניים הרצויים. לדוגמה, הזן 8 עוצמות אור שונות (או משכי דופק או מחזורי עבודה) עם שלושה שכפולים טכניים לכל צלחת (טבלה 2). G.s. מתייחס ליחידות בגווני אפור - ערכי מדידת רמת עוצמת האור המשמשים לתכנות LPA בתוכנת IRIS.
    1. בעת עיצוב קבצים ניסיוניים של IRIS, יש לזכור השפעות קצה מבארות סמוכות במכשיר LPA, רעילות אור מעוצמות הולכות וגדלות של חשיפה לאור כחול, וקביעת סוג תגובת המינון הרצויה (למשל, מונוטונית לעומת לא מונוטונית).
    2. אם משתמשים מתכנתים תאים ב- LPA בסדר עולה/יורד של פרמטר אור מסוים (לדוגמה, עוצמה), בארות עשויות ליצור השפעות קצה של דיבור צולב אור או אפילו חום שיכול להשפיע על בארות סמוכות. זה יכול להשפיע בשוגג על התוצאה של תפוקות נמדדות כאשר הניסויים הושלמו. כדי להקל על כך, משתמשים יכולים ליישם מטריצת אקראיזציה בתוכנת IRIS כדי לטרוף מיקומים טובים, תוך מזעור אפקטי קצה. דוגמה מתוארת בתוצאות הייצוגיות שלהלן (איור 4A-B).
    3. בנוסף, נמצאו עוצמות גבוהות יותר של אור כחול כמפריעות לצמיחה התאית וליכולת הקיום48. לכן, כדי למתן את רעילות האור, חשוב לייצר עוצמת אור, משך הדופק, או עקומת תגובה מחזור החובה בהתאם למודל הנחקר.
      1. לדוגמה, תוכנית 8 ערכי עוצמת אור עם שלושה עותקים משוכפלים לכל צלחת 24-well, עם טווח מ ללא אור לעוצמה מקסימלית של LPA. לאחר מכן, הפעל דגימות אלה על cytometer זרימה עם שער SSC-FSC או כתם חי כגון יודיד propidium כדי לכמת את הישרדות תאי האוכלוסייה (תאים חיים לעומת סך האירועים כולל תאים מתים / פסולת תאית) בכל ערך אור.
      2. לאחר מכן, לקבוע את הכמות האידיאלית של הישרדות האוכלוסייה עבור ההתקנה הניסיונית, שכן כל גירוי עלול להשפיע לרעה על התפשטות, ביטוי גנים, או הישרדות (למשל, הגדרת 80% הישרדות תאים כהחלפה מתאימה). לדוגמה, בעבודה זו, לאחר כיול, העוצמה לא עלתה על 3000 g.s. יחידות (~ 3/4 העוצמה המרבית של התקן LPA). דוגמה לכך מתוארת בתוצאות הייצוגיות שלהלן.
    4. בנוסף להגבלת ערכי האור בגלל רעילות, משתמשים עשויים לרצות להגביל את ערכי האור כדי לאפיין חלק מסוים של תגובת המינון, כגון טווח התגובה המונוטונית.
      1. כדי להשיג זאת, בתחילה לסרוק מגוון רחב של עוצמות אור, משכי דופק או מחזורי חובה בהתאם למודאליות המנותחת בעת קביעת תגובת המינון הרצויה (טבלה 2) כדי לצמצם על משטר האור של עניין, למשל, שבו ביטוי גנים בקורלציה חיובית עם הגדלת ערכי האור עבור מינון-תגובה מונוטונית.
      2. כדי לקבוע את טווח האור של עניין, תוכנית LPA יחיד עם עד 24 בארות של עוצמה שונה / משך דופק / מחזור החובה / וכו 'או יותר בארות (למשל, 48, 72, 96, וכו ') בהתאם אם LPAs מרובים מכוילים כדי לספק כמויות אור שוות ערך ולהמשיך עם העבודה תרבית התא או בדיקות המפורטות להלן. לכן, התחל אפיון של מערכת אופטוגנטית עם מגוון רחב של גירויים קלים כדי לקבוע את מרווח הטווח שנותן את ביטוי הגנים הרצוי ולאחר מכן לבצע ניסויים בטווח המינון המעודן.
      3. לדוגמה, בעבודה זו, פעם 3000 g.s. יחידות נקבעו כסף לעוצמת אור רעיל; סף זה שימש כגבול העליון של האור עבור בדיקות המתוארות להלן (למשל, אימונופלואורסצנטיות).
        הערה: השלבים לעיל אינם תלויים בכיול האופטי של ה- LPA ומתייחסים לכיול ברמה המולקולרית עבור כל מערכת אופטוגנטית.
  6. לאחר שערכי עוצמת האור המתאימים מתוכנתים במערכת IRIS, הכנס כרטיס זיכרון עם שקע USB 3.0 ל- LPA כדי להוריד ולהעביר את הקבצים.
  7. אם הכיול של LPA הושלם31, המשך לעבודת תרבית התאים עבור ייזום של בדיקת אינדוקציה אור. אם הכיול לא נעשה, כייל את ה- LPA באמצעות שיטת ניתוח תמונה (שלבים 3.7.1-3.7.3) לאחר שה- LPA מתוכנת עם מתכנת המיקרו-בקר.
    1. לתכנת בקצרה את LPA יש את אותה רמת IRIS כפי שתואר על ידי גרהרדט ואח ' (2016)31.
      הערה: לכיול, ה- LPA תוכנת להיות בעל ערך של 2000 גרם.
    2. לאחר שההתקן מתוכנת באמצעות כרטיס הזיכרון ולחצן האיפוס (לחצן פיזי ב- LPA) נלחץ, השג תמונה של ההתקן כולו (לדוגמה, imager תחנת ג'ל, התקן סורק וכו '). לכיול, רכשו שתי תמונות כשההתקן יסתובב ב-180°.
    3. לאחר מכן, השתמש בתוכנת קוד פתוח שתוכננה על ידי גרהרדט ואח ' (2016)31 כדי להראות את השונות בעוצמת ה- LED בלוח LPA ולחשב את ערכי פיצוי ה- LED כדי להפוך את העוצמה לשוויונית בין בארות. דוגמה לכך מתוארת בתוצאות המיוצגות להלן (איור 3). לאחר כיול זה הושלם, להמשיך לעבודת תרבית התאים לייזום של בדיקת אינדוקציה אור.
  8. להשיג צלוחיות של תאים חד שבטיים מהונדסים מהסעיף הקודם כדי לחקור השפעות אור אינדוקציה על ביטוי גנים.
  9. הסר את המדיה הישנה מהבקבוקון.
  10. מוסיפים 1 מ"ל של טריפסין לתאים ודגורים במשך 5 דקות.
  11. לאחר 5 דקות, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום הנשר שונה Dulbecco (DMEM או מדיה רצויה אחרת) בתוספת הכימיקלים הדרושים (עבודה זו השתמשה 50 מיקרוגרם / מ"ל של hygromycin, 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין, 10% סרום בקר עוברי, FBS).
  12. הוסף ~ 75,000 תאים לבאר בלוח שחור של 24 באר בנפח כולל של 500 μL. מספר התאים שנזרעו עשוי להשתנות בהתאם למשך הניסוי הרצוי ולסוג התא בו נעשה שימוש.
    הערה: בנוסף, שים לב כי צפיפות זריעת התאים משפיעה על תחזוקת התרבות ועל משך הניסוי. החל ממספר נמוך יותר של תאים לבאר מבטיח משכי זמן ארוכים יותר לפני שהתרבית מגיעה למפגש. יתר על כן, סוג הרכיבים האופטוגנטיים המשולבים במעגלי הגנים מעניינים ישפיע כאשר ביטוי הגנים יגיע למצב יציב ולכן ישפיע על משך הניסויים. גורמים אחרים שעשויים להיחשב הם שיעורי גדילה ספציפיים לקו התאים, הרכב המדיה, ואפקטי גדילה מותנים (כלומר, אור).
  13. לאחר הציפוי, מניחים את התאים באינקובטור לח עם 5% CO2 כדי לאפשר להם להסתפק 2-6 שעות.
  14. לאחר הדגירה, העבירו את התאים למכסה המנוע של תרבית הרקמות, הסירו את מכסה הפלסטיק והוסיפו רצועת רדיד דבק לחלק העליון של הצלחת (איור 2D). שלב זה מאפשר העברת אור מינימלית בין בארות, שכן החלק העליון והצדדים של הבארות מצופים, והאור יכול כעת להיכנס רק מתחתית הבאר שבה ה- LED ממוקם.
  15. מניחים את הצלחת בחלקים התלת-ממדיים המותאמים של ה- LPA. לאחר מכן, כסו את הצלחת במכסה LPA המודפס בתלת-ממד, שמתאים מעל ברגי ההתקן בכל פינה.
  16. חבר את ההתקן למקור המתח ולחץ על לחצן האיפוס בהתקן LPA כדי להבטיח שהגדרות הניסוי המעודכנות של LPA יוחלו.
  17. דגירה התאים בתוך המערכת הניסיונית למשך פרק זמן מתאים, בהתאם לצפיפות הזריעה המקורית, מהירות הצמיחה הספציפית לקו התאים ותנאי הצמיחה. בדוגמה זו, קווי התא הושרו במשך 3 ימים ברציפות לביטוי גנים כדי להגיע למצב יציב. עם זאת, יש לציין כי מערכות אופטוגנטיות רבות (למשל, VVD) עשויות להגיע לביטוי גנים במצב יציב הרבה יותר מוקדם (למשל, 24 שעות), ולכן זמני אינדוקציה ניסיוניים יכולים להיות מופחתים או ממושכים לפי הצורך.
  18. בסוף ניסוי אינדוקציה אור, לנצל את הדגימות עבור כל אחד מארבע בדיקות הבאות כדי לאפיין את קווי התא מהונדסים (סעיפים 4-7).

4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים מהונדסים הנגרמים על ידי אור

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים LPA מן האינקובטור ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית רקמות.
  2. מוציאים את רצועת נייר הכסף ומניחים לצלחת לשבת 1-2 דקות. זה מונע עיבוי מלהיווצר על מכסה הפלסטיק, אם הניח מיד על הצלחת.
  3. לאחר 1-2 דקות של ישיבה, לשים את מכסה הפלסטיק המקורי בחזרה על הצלחת.
  4. דמיינו את התאים עם ניגוד הפאזה המתאים או מיקרוסקופ פלואורסצנטיות.
  5. בהתאם למכשיר, התאם את זמן החשיפה, את עוצמת מקור האור ואת הרווח להצגת תאים מהונדסים. בניסוי זה הוחלו הפרמטרים הבאים: 50 מילישניות עבור FITC/ GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) זמן חשיפה למקור אור ו-1-5 מילישניות לזמן חשיפה לניגודיות פאזה בעוצמה של 100% עבור כל אחד מהם.
    הערה: יש לציין כי זמני חשיפה אופטימליים, רמות הגבר ועוצמות מקור אור נגזרים לעתים קרובות אמפירית מניסיון עבודה זו כדי למזער את רוויית היתר בכתב הפלואורסצנטיות, למזער את הנזק התאי ולתפוס תמונות נאותות לניתוח איכותי וכמותי. בעת קביעת הרמות של כל אחד מפרמטרים אלה, ההיבטים שיש לזכור כוללים מקסום יחסי אות לרעש, מזעור פוטוטוקסיות, מזעור רוויית יתר של אותות פלואורסצנטיים, והגברת היכולת להגביר אותות פלואורסצנטיים חלשים.
    1. מטב פרמטרים אלה אד-הוק ברוטו; עם זאת, ערכים ניסיוניים קודמים (למשל, עוצמת מקור אור הגורמת להבשלת יתר של כתב פלואורסצנטי) יכולים להנחות הגדרות ניסיוניות עתידיות כאשר הדבר רלוונטי. לדוגמה, הגדרות הרווח, זמני החשיפה והערכים ההתחלתיים של עוצמת האור ממעגל אחד (LITer1.0) או ההתקנה הניסיונית (לדוגמה, עוצמת האור) יכולים לשמש כנקודת התחלה בעת מעבר למעגל גנים דומה אך שונה (LITer2.0)11 או מודאליות אור שונה (לדוגמה, מחזור חובה של אור).
  6. ייעל את הדמיית הלוחות על ידי תבנית קואורדינטות המתוכנתת לתוכנת המיקרוסקופיה ומאפשרת לכל גודל הלוח (למשל, 24 בארות) לקבל רכישת תמונה אוטומטית ממיקומי תמונה מרובים לבאר.

5. ציטומטריית זרימה של תאים מהונדסים הנגרמים על ידי אור

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  2. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת נייר כסף, ולתת את הצלחת לשבת במשך דקה או שתיים.
  3. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  4. מוסיפים 100 μL של 0.25% טריפסין לכל באר, לכסות את הצלחת במכסה פלסטיק, ולהניח אותו בחזרה באינקובטור.
  5. השאר את התאים ללא הפרעה באינקובטור במשך 5 דקות.
  6. לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו למכסה המנוע תרבית הרקמה.
  7. לנטרל כל טריפסין היטב עם 400 μL של DMEM.
  8. תווית צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון עם מסננת התא (או צינור cytometry זרימה מתאים שניתן לסנן כדי להסיר גושים גדולים של תאים לא טריפסין מלא) עם שם המתאים לכל באר.
  9. השתמש פיפטה P1000 כדי pipette התוכן של כל באר למעלה ולמטה 6-8 פעמים כדי לשבור גושי תאים וליצור דגימות חד-תאיות עבור cytometry זרימה49.
  10. העבר את כל התוכן של כל באר (~ 500 μL) לצינורות המסומנים עם המסננת.
  11. להביא תאים למכשיר ציטומטריית הזרימה המתאים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
    הערה: ציטומטר הזרימה ששימש בעבודה זו היה חלק ממתקן ליבה הממוקם בבית החולים האוניברסיטאי.
  12. צור שער פיזור קדמי וצדדי (FSC ו- SSC, בהתאמה) כדי ללכוד את התאים הבודדים בגודל ובגרגירים המתאימים כדי לא לכלול פסולת וגושים תאיים בתוכנת הציטומיה של הזרימה.
  13. ברגע שהשער מוגדר, ללכוד כ -10,000 תאים עם השער המתאים. התאם מספר זה בהתאם לכמות הנתונים הסלולריים שהמשתמשים מחפשים. חזור על הפעולה עבור כל צינור המכיל את התאים מהניסוי.
  14. לאחר השלמת הניסוי, יבא את הנתונים לתוכנת נתוני cytometry הזרימה הזמינה לניתוח.
  15. צור שער FSC-SSC (כמו קודם במהלך הרכישה) והחל אותו על כל אצווה של נתונים ניסיוניים. באר התייחסות של אוכלוסיית התאים שלא הושרה משמשת ליצירת שער זה בכתב יד זה, אך קיימים מדדים אחרים ליצירת שערים, כגון שערים מבוססי צפיפות.
  16. עם התנאים הניסיוניים מגודרים בשער FSC-SSC, להתוות את נתוני cytometry הזרימה כהיסטוגרמה או לייצג בדרכים אחרות כדי להמחיש את דפוסי הביטוי המתקבלים. בניסוי זה, הפלואורסצנטיות נלכדה על ידי ערוצי GFP / FITC או PE / TexasRed.

6. הפקת RNA ו- PCR כמותי של רכיבי מעגל גנים

  1. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  2. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת רדיד, ולתת את הצלחת לשבת במשך דקה או שתיים.
  3. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  4. המשך לחלץ RNA מהתאים באמצעות ערכת החילוץ המתאימה RNA.
  5. לאחר השלמת הפקת ה- RNA, בצע תגובת שעתוק הפוכה של כל דגימה (טבלה 3).
  6. כמו כן, בצע PCR כמותי של כל דגימה (טבלה 4). השתמש בפולימראז DNA ובפרוטוקול המשויך כדי להגדיר תגובות PCR. עבור שלב זה, להגדיר תגובה מרובת עם גן משק בית גן של עניין, או ליצור תגובות נפרדות. בדוגמה זו, GFP, KRAS, ו גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) רמות נחקרו. לאחר השלמת ניסוי qRT-PCR, המשך בניתוח באמצעות תוכנה זמינה כדי להמחיש שינוי קיפול מעגל גנים ברמת ה- RNA.

7. אימונופלואורסצנטיות של רכיבי מעגל הגנים

  1. השתמש באמבט קרח או במקפיא כדי לקרר מתנול.
  2. 24-72 שעות לאחר אינדוקציה, להסיר את התאים מן LPA באינקובטור או מן המיקרוסקופ לאחר הדמיה ומניחים אותם במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  3. אם הוסר ישירות מן LPA, להסיר את רצועת רדיד, ולתת את הצלחת לשבת במשך 1-2 דקות.
  4. שאפו את המדיה מכל באר (של כל צלחת 24-well אם כל הבארות משמשות).
  5. מוסיפים 100 μL של 0.25% טריפסין לכל באר, לכסות את הצלחת במכסה פלסטיק, ולהניח אותו בחזרה באינקובטור.
  6. השאר את התאים ללא הפרעה באינקובטור במשך 5 דקות.
  7. לאחר 5 דקות, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו למכסה המנוע תרבית הרקמה.
  8. לנטרל כל טריפסין היטב עם 400 μL של DMEM.
  9. תווית צינורות מיני צנטריפוגה עם שמות המתאימים לכל באר.
  10. השתמשו בפיפטה P1000 ופיפטה את התוכן של כל באר למעלה ולמטה 6-8 פעמים כדי לשבור את גושי התאים.
  11. העבר את כל התוכן של כל באר (~ 500 μL) לצינורות המסומנים.
  12. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  13. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  14. Resuspend התאים (להשתמש P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים) ב 750-1000 μL של 4% paraformaldehyde (מדולל מלוחים חוצצי פוספט, PBS).
  15. אפשר לתאים לשבת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
  17. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  18. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  19. Resuspend התאים (להשתמש P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים) ב 750-1000 μL של מתנול קר כקרח.
  20. אפשר לתאים לשבת במשך 30 דקות על קרח או במקפיא של -20 °C (60 °F).
  21. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
  22. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
  23. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
  24. בהתאם לסוג הנוגדנים המשמשים, שנה את הפרוטוקול מנקודה זו ואילך. בצע את אחד השלבים 7.24.1-7.24.14 או 7.24.15-7.24.22.
    1. אם משתמשים בנוגדן ראשוני ומשני, סובבו מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000/P200 ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן ראשוני. במקרה זה, דילול של 1:800 עבור נוגדני מלאי נעשה, כולל נוגדן KRAS או נוגדן ERK, והורשה לשבת במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. נוגדנים היו מדוללים במאגר דגירה עשוי 1x PBS עם 0.5 גרם של BSA.
      הערה: לקבוע את הדילול המדויק של הנוגדן אמפירית על ידי יצירת עקומה סטנדרטית של דילול נוגדנים לעומת האנטיגן של עניין.
    2. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על נוגדנים מסומנים.
    3. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    4. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    5. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
    6. resuspend התאים באמצעות P1000/P200 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן משני. במקרה זה, תאים היו resuspended ב 100 μL נוגדן משני בדילול של 1:800 עבור נוגדן KRAS או 1:2000 עבור נוגדן ERK מותר לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בדומה לנוגדנים ראשוניים, לדלל את הנוגדנים המשניים במאגר הדגירה כמתואר לעיל. לקבוע את הדילול של הנוגדנים המשניים בהתבסס על הממצאים האמפיריים של עקומה סטנדרטית.
    7. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על הנוגדנים המסומנים.
    8. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    9. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    10. כאשר הושלם, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.
    11. resuspend התאים באמצעות P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים ב 500 μL של PBS.
    12. העבר את כל התוכן של כל צינור (~ 500 μL) לצינורות המסומנים עם מסננות.
    13. להביא את התאים למכשירי ציטומטריה זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
      הערה: יש לציין כי בעל מספר פקדים חשובים להתקדמות עם מדידה וציטומיטריית זרימה וניתוח של ביטוי גנים תאים מהונדס. לדוגמה, לאחר תאים שאינם מוכתמים לחלוטין, תאים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים בלבד, ותאים מוכתמים בנוגדנים משניים בלבד יכולים להיות שימושיים להשוואת תוצאות עם אותות רקע של נוגדנים.
    14. לאחר מכן, המשך בניתוח כמתואר בסעיף 5.
    15. אם משתמשים בנוגדן ראשי בלבד, תוסיפו מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000/P200 ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור כדי לשבור גושי תאים ב 100 μL של נוגדן ראשי שכותרתו. קבעו דילול נוגדנים מתאים ודגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. קבעו את דילול הנוגדנים מהעיקול הסטנדרטי בצורה אמפירית.
    16. לאחר הוספת נוגדנים, לכסות את הצינורות בנייר כסף כדי למנוע השפעות אור על נוגדנים מסומנים.
    17. לאחר הדגירה, להוסיף 750-1000 μL של מאגר הדגירה. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים.
    18. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 400 x g.
    19. resuspend התאים באמצעות P1000 פיפטה ופיפטה למעלה ולמטה 6-8 פעמים בכל צינור לשבור גושי תאים ב 500 μL של PBS.
    20. העבר את כל התוכן של כל צינור (~ 500 μL) לצינורות מסומנים עם מסננות.
    21. להביא את התאים למכשירי ציטומטריה זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים (יכול להביא צינורות עם תאים על קרח או מחוצה לו).
      הערה: יש לציין כי בעל מספר פקדים חשובים להתקדמות עם מדידה וציטומיטריית זרימה וניתוח של ביטוי גנים תאים מהונדס. תאים ותאים שאינם מוכתמים לחלוטין בנוגדנים ראשוניים בלבד שימושיים להשוואת תוצאות עם אותות רקע של נוגדנים.
    22. מנקודה זו, המשך עם הניתוח כמתואר בסעיף 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הרכבת מעגלי גנים ויצירת קו תאים יציב במאמר זה התבססו על תאי HEK-293 מסחריים שעברו שינוי המכילים אתר FRT פעיל בתמלול ויציב יחיד (איור 1). מעגלי הגנים נבנו לתוך וקטורים שהיו להם אתרי FRT בתוך הפלסמיד, המאפשרים את שילוב Flp-FRT בגנום התא HEK-293. גישה זו אינה מוגבלת לתאי Flp-In, שכן ניתן להוסיף אתרי FRT לכל קו מעניין בכל מקום בגנום באמצעות טכנולוגיית עריכת DNA כגון CRISPR / Cas950.

לאחר שקווי תאים מתאימים נבנו ואומתו עבור ההוספה הנכונה, תוכנת LPA ו- IRIS נבחרו כפרוטוקול סטנדרטי לגיוס אור של ביטוי גנים31,51. מערכת LPA מאפשרת לתכנת 24 בארות לגיוס תאים יונקים בתנאים ניסיוניים מרובים בהתאם לעוצמת האור, משך הדופק ומחזור העבודה (איור 2). בתוך מאמר זה, עוצמת אור אחידה מרחבית, משך הדופק ומחזור החובה היו בעדיפות. עם זאת, חוקרים יכולים להשתמש בתוכנת IRIS וב- LPA לתכנות מתקדם יותר של דפוסי גלי אור זמניים.

היבט מכריע לגבי ה- LPA שיש לטפל בו לפני תחילת הניסויים הוא הכיול האופטי שניתן לבצע עבור התקנים בודדים או מרובים. שיטת ניתוח התמונה שתוארה בעבר31 המשמשת לכיול דורשת תמונה של ה- LPA כולו עם כל נורות ה- LED של עניין מופעלות, אשר ניתן לרכוש ממגוון מקורות52, כולל imager ג'ל. כאן, סורק מחשב שימש לרכישת תמונה (איור 3A). לאחר רכישת התמונה, תוכנת הקוד הפתוח שנוצרה על ידי גרהרדט ואח ' (2016)31 שימשה לחישוב ערכי פיצוי עבור כל נורית LED כדי להבטיח שכל LPA פולט את אותה עוצמה בערך גווני אפור נתון. התוכנה מחסירה את אות הרקע, מסמנת את התמונה לקטגוריה בינארית ומחשבת את עוצמת הפיקסלים (איור 3B). מהכיול נמצאה וריאציה מינימלית בין נורות ה-LED, עם קורות חיים של 0.04 בין 96 בארות (או 4 לוחות מכוילים, איור 3C). לבסוף, שימוש בתוכנת הכיול הדגים את וריאציית ה-LED לפי מיקום (איור 3D) ויצר כוונון גווני אפור (איור 3E) כך שכל נורת LED מנורמלת לאותה עוצמה.

בנוסף לכיול, היבטים חשובים אחרים של השימוש ב- LPA כוללים שילוב של מספר פקדים בצנרת הניסויית אשר יכולים למזער שגיאות מערכתיות על ידי הגבלת משתנים מבלבלים כגון השפעות רעילות אור ומגבלות עיצוב המבוססות על חומרים ניסיוניים. לדוגמה, איור 4 מדגים שתי תצורות שונות לתכנות עוצמות אור שונות בבארות LPA. התת-פאנל הראשון של איור 4A מציג ארגון עולה של עוצמת אור. זה יכול להקל על תכנות וניתוח נתונים אבל יכול לייצר אפקטי קצה שבו השורה התחתונה של LPA יש את עוצמת האור הגבוהה ביותר והוא יכול לגרום לחום לא רצוי ואינדוקציה אור של בארות סמוכות. באופן דומה, בספינת המשנה השנייה של איור 4A הוחלה מטריצת אקראיות על תוכנת IRIS, ויצרה עוצמות אור שונות במיקומים אקראיים. זה יכול למזער השפעות מערכתיות של אפקטי קצה. מטריצה מפורקת (איור 4B) נוצרת עם תוכנת IRIS, שניתן להשתמש בה כדי לקבוע את תנאי הניסוי לאחר השלמת הניסוי ובמהלך הניתוח. בדומה אקראיזציה של בארות, משתמשים צריכים גם להיות מודעים השפעות רעילות אור שעלולות להתרחש (אור כחול בתוך עבודה זו). באיור 4C, שתי עוצמות אור שונות המשמשות לגיוס מעגלי גנים מוצגות עם אותו שער FSC-SSC המבוסס על אוכלוסיית התאים המהונדסים שלא הושרו. ככזה, משתמשים צריכים לבצע תגובת מינון על המודאליות הקלה של עניין (למשל, דופק, מחזור החובה, וכו ') כדי לקבוע השפעות רעילות אור שיכולות להתרחש בקצה הגבוה של החשיפה (איור 4D). כאן, הגדלת רמות האור הכחול גרמה לפסולת תאית תלוית מינון, תאים מתים וגושים בהשוואה לתאים שאינם מגורים. ככזה, עוצמת האור המתמשכת הוגבלה לסביבות 3/4 של עוצמת LPA המרבית (~ 3000 g.s. יחידות).

לאחר שהוקם ציוד מתאים, ביטוי הגנים הושרה אז במעגלי גנים מהונדסים של LITer באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 5). תאים הושרו על משכי דופק אור שונים על LPA, אשר נתן מינון קל-תגובה של ביטוי גנים ברמת האוכלוסייה. תאים בתוך עבודה זו צולמו עבור ביטוי GFP באמצעות 50 אלפיות השנייה עבור זמן חשיפה למקור אור FITC / GFP ועבור הדמיית שדה בהירה באמצעות 1-5 אלפיות השנייה לזמן חשיפה לניגודיות פאזה. בהתחשב בחוסן של פרוטוקול הנדסת קו תא זה, כל סמן פלואורסצנטיות יכול לשמש במקום GFP. התאים יכולים להיות מושרים עם משטרי אור מרובים ולייצר מגוון גדול של תגובות (איור 5). זה האחרון מועיל בשליטה נוספת על הביטוי של גנים פונקציונליים (למשל, KRAS (G12V) oncogene בעבודה המקורית53).

מיד לאחר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תאים יכולים להיות מנותחים במגוון פרוטוקולים ניסיוניים, כולל ציטומטריית זרימה, qRT-PCR, ואימונופלואורסצנטיות. בעבודה זו בוצעה ציטומטריית זרימה כהליך אימות ראשון ובוצעה בהתאם לשיטות שתוארו לעיל (איור 6). בדומה למיקרוסקופיה, תאים הושרו בערכי אורך דופק שונים, והראו תגובת מינון של ביטוי גנים של יותר מפי ארבעה ממצבים לא מושרים ברמת האוכלוסייה (איור 6A-B). באופן דומה, ניתן להציג הפחתת רעשים של ביטוי גנים על-ידי השוואת ערכי עוצמת אור שונים (איור 6C-D) למערכת LITer לעומת מערכת ויסות חיובית (ללא משוב) כגון VVD/LightOn54. בעת השוואת LITer עם מערכת VVD, משוב שלילי משיג מעל פי חמישה הפחתת רעש ביטוי גנים. ניתן לנתח גם את אותם תאים המושרים מראש שצולמו במיקרוסקופיה באמצעות qRT-PCR (איור 7). בדומה לציטומטריית זרימה, תאי LITer מהונדסים יכולים לבטא את רמות ה- RNA באופן תגובתי במינון (מעל פי 10 אינדוקציה ממצבים שאינם מושרים), תוך התאמת תגובת המינון של רמות החלבון המכומתות על ידי ביטוי GFP על ציטומטריית זרימה. ניתן לכייל את נתוני המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית וציטומטריית הזרימה המוזכרים באמצעות תאים שאינם פלואורסצנטיים, המהווים ביטוי תאי פלואורסצנטיים, וחרוזי אימות פלואורסצנטיים בעלי 6-8 שיאים (למשל, חרוזים ירוקים בצבע ירוק מערוץ FL1, חרוזים פלואורסצנטיים). כל אחד מרכיבים אלה יכול לאפשר נורמליזציה של ביטוי גנים בניסוי אחד. עם זאת, גורמים אלה יכולים גם לאפשר נורמליזציה של מעגלים ותאים מהונדסים על פני לוחות ניסיוניים שונים, תנאי ניסוי וימים כדי לאפשר השוואה ותקינה של נתוני ביטוי גנים.

לבסוף, ניתן להנדס את מעגלי הגנים LITer כך שיבטאו גנים פונקציונליים, כגון KRAS (G12V, איור 8). הרבגוניות של צינור זה מאפשרת למשתמשים לנצל את ארכיטקטורת LITer עם הנדסת תאים עבור כל גן פונקציונלי של עניין, ואולי לשלב ארכיטקטורות נוספות כגון משוב חיובי. LITer הראה כמויות הולכות וגדלות של אור כחול שגרם רמות גבוהות יותר של תפוקת מעגל הגנים (KRAS) רמות חלבון (G12V) וכתוצאה מכך, רמות זרחן-ERK, שניהם ניתן לכמת באמצעות בדיקות immunofluorescence.

רסיס יחס גודל (bp) ריכוז משקל שבר DNA (ng/μL) ריכוז טוחנת שבר DNA (fmol/μL) עוצמת קול (μL) מסת טוחנת DNA וכתוצאה מכך (fmol)
קטע האם וקטור 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
אמא וקטור קטע 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
גן מעניין 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
סך 10.00 105.87

טבלה 1: חישוב תערובת אב לתגובה של הרכבת DNA (שלב 1.13). עמודות 2 & 3 מבוססות על גודל שברי ה- DNA שהורכבו וריכוז שברים אלה לאחר הגברת PCR ומיצוי ג'ל אגרוז (שלב 1.11). ניתן לשנות את התא התחתון של העמודה הרביעית (נפח התגובה הכוללת); עם זאת, אמצעי האחסון שצוין מומלץ. תאים ללא הצללה נוצרים באופן אוטומטי.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

טבלה 2: תכנות IRIS של עוצמות אור (g.s.) לניסוי אינדוקציה קלה בלוח של 24 בארות עם שלושה שכפולים (שלב 3.4). התפלגות של עוצמות אור הנעות בין 0 ל- 3000 g.s.g.s.g.s.s.-יחידות גווני אפור. זה יכול להיות אקראי על ידי תוכנת IRIS לפי הצורך.

דוגמה 1 דוגמה 2 דוגמה 3
הפוך תמלול אפיק מיתוב ראשי (μL) 4.00 4.00 4.00
תבנית RNA (1000 ng) נפח (μL) 2.00 3.00 4.00
נפח NF-H20 (μL) 14.00 13.00 12.00
נפח כולל (μL) 20.00 20.00 20.00

טבלה 3: חישוב תערובת תבנית בסיס לתמלול הפוך (שלב 6.5). הנפח הכולל המומלץ לתגובה הוא 20 μL, ורכיביו הם תערובת מאסטר האנזים תמלול הפוכה (כאן: 5x), תבנית RNA ומים ללא נוקלאז. בדוגמה זו, ריכוזי ה- RNA של דגימות 1, 2 ו- 3 הם 500, 333 ו- 250 ng/ μL, בהתאמה.

דוגמה 1 דוגמה 2 דוגמה 1 & 2 מולטיפלקסים
נפח בדיקה GFP (μL) 1 ----- 1
נפח בדיקה GAPDH (μL) ------ 1 1
נפח תערובת ראשי של דנ"א פולימראז (μL) 10 10 10
נפח cDNA (100 ננוגרם בנפח) (μL) 2 2 2
נפח NF-H20 (μL) 7 7 7
נפח כולל (μL) 20 20 20

טבלה 4: חישוב תערובת אב כמותי של PCR (שלב 6.6). התגובה המומלצת נפח כולל הוא 20 μL ורכיביו הם תערובת מאסטר אנזים DNA פולימראז (כאן: 2x), GFP ו / או GAPDH בדיקות, cDNA (100 ננוגרם סה"כ), ומים ללא נוקלאז (NF-H20).

Figure 1
איור 1: תכנון מעגלים והנדסת תאים. (A) כלי הנדסת תאים, כולל מעגל גנים סינטטי LITer עם אתרי אינטגרציה FRT, אנזים רקומבינאז (Flp recombinase) לשילוב מעגלים, תרופה המשמשת לבחירת שיבוטים גנטיים מתאימים, וקו תאים מעניין המשמש ליצירת קווי תאים של יונקים אופטוגנטיים רצויים. (ב) ניתן לשלב מערכות גנטיות מהונדסות באתר FRT ספציפי המכיל לוקוס בתוך הגנום האנושי. לוקים גנומיים אלה יכולים לבטא עמידות ספציפית לאנטיביוטיקה או גנים פלואורסצנטיים לבחירה של קלטות גנטיות משולבות כראוי. ניתן ליזום שילוב מעגלי גנים באמצעות רקומבינאסים המזהים אתרים ספציפיים בתוך הקלטת הגנטית המקורית. זה מציג גן בחירת עמידות לתרופות חדשני אשר יכול להבטיח דור של תאים מהונדסים כראוי עם מעגל הגנים הרצוי. בתחתית לוח B נמצאת ארכיטקטורת מעגלי הגנים עבור מערכת המשוב השלילית האופטוגנטית, LITer2.0. מעגל זה מורכב מחלבון TetR המדכא את עצמו המותך עם תחום חישת מתח-חמצן-אור (LOV2), רצף מקשר P2A המאפשר תעתיק רב-סטרוני, ו- GFP. כאשר אור כחול מוחל, רצף TIP נפתח מתחום LOV2, מעכב את חלבון TetR, ומאפשר שעתוק מוגבר, מינון מגיב של TetR וכתב GFP. חלבון TetR המעכב אינו מסוגל להיקשר ולהדחיק באתר מפעיל ה- DNA, ובכך להגדיל את שעתוק. משוב שלילי זה שומר על רעש ביטוי הגנים נמוך ומאפשר שינוי גבוה של ביטוי גנים. FRT - יעד זיהוי היפוך, HygR - עמידות היגרומיצין, LacZ - β-גלקטוזידאז, ZeoR - עמידות בפני זאוצין, T - TetR, חלבון מדכא טטרציקלין, D2ir הוא מקדם מבוסס CMV עם אתרי TwtO, LOV2 הוא תחום חישת מתח-חמצן אור, TIP הוא פפטיד מעכב טט המעכב את חלבון TetR. נתון זה שונה מגוין ובלאזי (2020)55. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תכנות ניסיוני של LPA. (א) ניתן לתכנת ניסויים באמצעות הכלים המפורטים באתר המעבדה של Tabor47 עם גמישות לתכנות LPA במצב יציב, דינמי או מתקדם31. יתר על כן, ניתן לשמור קבצים אלקטרוניים לשימוש עתידי עבור שכפולים טכניים או אינדוקציה ניסיונית של קווי תאים חלופיים. (B) התקן LPA עם רכיבים עיקריים שנצפו מלמעלה ומצד (C). (ד) תמונות של לוחות אטומים בנייר כסף כדי להתגורר ב- LPA. LPA - מנגנון צלחת אור, LED - דיודת פולטת אור. אלמנטים של נתון זה שונו מגוין (2019)11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כיול מנגנון לוח האור. (א) תמונה מייצגת של LPA עבור נורות LED מוגדרת ל- 2000 g.s בהתבסס על תוכנת IRIS. (ב) תמונה מהחלונית (A) עם רקע מופחת וסף המשמש לחישוב התמונה לחישוב עוצמת הפיקסלים של כל נורית LED. (ג) היסטוגרמה של עוצמות פיקסלים (נקבעת על-ידי ניתוח תמונה של MATLAB) של 96 נוריות LED (4 לוחות LPA) המוגדרות לאותו ערך תוכנה של IRIS (לדוגמה, 2000 g.s. ). הקו האדום מייצג עוצמה ממוצעת של פיקסל LED, ו- CV בחלונית מייצג את מקדם הווריאציה של 96 הבארות. (D) מפת חום המציגה את עוצמות ה-LED של תמונת ה-LPA בחלונית (A) מנורמלת ל-LED בעוצמה המרבית. (ה) מפת חום של ערך כיול שנקבעה לתמונת LPA בחלונית (A) ליצירת ייצור בעוצמה שווה לכל נורית LED כאשר היא מתוכנתת ל-LPA. LPA - מנגנון צלחת אור, LED - דיודה פולטת אור, קורות חיים - מקדם וריאציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אקראיזציה של השפעות LPA ורעילות אור. (A) תמונה מייצגת של שתי תצורות LPA LED ניתנות לתכנות שנקבעו מ- 25 עד 4000 g.s, בהתבסס על תוכנת IRIS. התצורה הראשונה עשויה לאפשר לשגיאות שיטתיות כגון השפעות קצה של חום ואור לחצות (לדוגמה, השורה התחתונה של LPA המשפיעה על השורה השנייה הנמוכה ביותר). התמונה השנייה מתארת באקראי את מיקום העוצמות, ולכן מזעור השגיאה השיטתית (הטיה) הנגרמת על-ידי אפקטי קצה. (ב) מטריצה המציגה מיקום אקראיות לעוצמות אור ב- LPA המוצג בחלונית (A), שניתן להשתמש בה כדי לקבוע את התוצאות התלויות בעוצמה של ניסוי נתון. (ג) נתוני ציטומטריה זורמים עבור שתי עוצמות אור שונות (1250 ו- 4000 גרם) למשך 3 ימים של אינדוקציה בתאורה רציפה. השער השחור מבוסס על תאים שלא הושרו. (D) גרף עמודות המציג נתוני ציטומטריית זרימה כגון חלונית (C) אך למגוון רחב של עוצמות אור. LPA - מכשיר צלחת אור, FSC - פיזור קדימה, SSC - פיזור צד, g.s. - ערך עוצמת אור נמדד בגווני אפור. LITer cells11 היה ירידה במינון מגיב בהישרדות התא כי היה מובהק סטטיסטית באמצעות ANOVA 1-זנב מבחן עם ערך p של 0.0022. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של קווי תאים אופטוגנטיים מהונדסים. תאים צולמו על מיקרוסקופ הפוך עם מצלמה (14 סיביות) לרכישת ניגודיות פאזה והדמיה פלואורסצנטית. תאים נחשפו עבור 5 אלפיות השנייה עבור ניגודיות פאזה (לוח A, תמונת שדה בהיר מייצגת) ו 50 אלפיות השנייה לרכישת GFP / FITC (לוח B) בעוצמה של 100% מקור אור. תאים ניתנים לתמונה בנקודות זמן שונות בהתאם לרכישה הרצויה של מצב יציב או תגובה דינמית, מה שמוביל למצב יציב. התאים כאן מייצגים טיטר משך דופק בעוצמה קבועה (1000 g.s.s.) החל מחשיפה לאור ללא חשיפה לאור ל -3 ימים של חשיפה לאור. יחידת g.s מייצגת ערך עוצמת אור הנמדד בגווני אפור. נתון זה שונה מגווין (2019)11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ציטומטריית זרימה של קווי תאים אופטוגנטיים מהונדסים. תאים נותחו על cytometer זרימה LSRFortessa BD, עם כ -10,000 תאים שנאספו בתוך SSC-FSC (פיזור צד-קדימה) שער. התאים נותחו לאחר מכן עם תוכנת FCS Express. ניתן ליצור היסטוגרמה או מזימות פיזור כדי לכמת את הביטוי של גן העניין (למשל, GFP). (א) תאים מהונדסים המותווים בצירי SSC-FSC להתאמה בתוך הקו השחור. (B) תאי LITer מייצגים המושרים עם משך משתנה של פולסים אור ב 1000 g.s. עד 72 שעות של אינדוקציה, הממחיש מינון-תגובה של ביטוי גנים. (ג) נתוני מינון-תגובה מייצגים עבור טיטר עוצמת אור המשווה את מעגל הגנים LITer (מערכת מבוססת TIP) לעומת VVD או מערכת LightOn40, שהיא מערכת ויסות חיובית ללא משוב. (D) היסטוגרמה המתאימה למערכת VVD, הממחישה הפצה רחבה יותר (ולכן רעשי ביטוי גנים גבוהים יותר) בהשוואה למערכת LITer. קורות חיים הם מקדם הווריאציה, מדד לרעש ביטוי גנים. FSC - פיזור קדימה, SSC - פיזור צד, FITC - איזוטיוצינאט פלואורסצ'ין, g.s. - ערך עוצמת האור הנמדד בגווני אפור. נתון זה שונה מגווין (2019)11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: PCR כמותי בזמן אמת של קווי תאים אופטוגנטיים מהונדסים. נתונים מייצגים המראים כי רמות ביטוי גנים מרובות ניתן להשרות ולכמת באמצעות אור כגירוי. יחידת Rq מייצגת כימות יחסי של שינוי קיפול ביטוי בהשוואה לשליטה. לתאי LITer11 הייתה עלייה בתגובת מינון בביטוי RNA שהייתה משמעותית סטטיסטית באמצעות בדיקת זנב 1 ANOVA עם ערך p של 0.0352 ו 0.0477 עבור רמות GFP ו- KRAS, בהתאמה. נתון זה שונה מגווין (2019)11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: אימונופלואורסצנטיות של קווי תאים אופטוגנטיים מהונדסים. נתונים מייצגים המציגים הערכות ברמת החלבון בהתבסס על אימונופלואורסצנטיות. (A) רמות חלבון של KRAS(G12V) ו-(B) רמות חלבון של זרחן-ERK, אשר מעגל הגנים LITer גורם על פי הגדלת כמויות האור במישרין ובעקיפין, בהתאמה. הנתונים המוצגים בסרגלים הם ערכים ממוצעים, קווי שגיאה הם סטיית תקן (n = 3). A.U. - יחידות שרירותיות, g.s. - ערך עוצמת האור נמדד בגווני אפור. תאי LITer11 היו בעלייה רספונסיבית במינון ברמות החלבון שהיה משמעותי סטטיסטית באמצעות ANOVA 1-tailed בדיקה עם ערך p של 2.79E-04 ו 0.016 עבור KRAS ורמות זרחן-ERK, בהתאמה. נתון זה שונה מגווין (2019)11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קוראי מאמר זה יכולים לקבל תובנה על השלבים החיוניים לאפיון מעגלי גנים אופטוגנטיים (כמו גם מערכות ביטוי גנים אחרות), כולל 1) תכנון מעגלי גנים, בנייה ואימות; 2) הנדסת תאים להכנסת מעגלי גנים לקווי תאים יציבים (למשל, רקומבינציה Flp-FRT); 3) אינדוקציה של התאים המהונדסים עם פלטפורמה מבוססת אור כגון LPA; 4) אפיון ראשוני של בדיקות אינדוקציה אור באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ו-5) אפיון ביטוי גנים סופי עם מגוון בדיקות, כולל ציטומטריית זרימה, PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), או בדיקות אימונופלואורסצנטיות.

בנוסף, השיטות שתוארו לעיל הן מודולריות מאוד עבור כל ארכיטקטורת מעגלי גנים המבטאת גנים של עניין, עם השינויים העיקריים בפרוטוקול הפוטנציאלי בשלב בניית המעגלים והבדיקות שנערכו. במקרה של בניית מעגלי גנים, הגמישות של שיבוט מולקולרי מאפשרת לכל גן מעניין להיות מוחלף או מבוטא במשותף עם סמן פלואורסצנטי עם שינויים קלים בעיצוב פריימר או פרוטוקולי הרכבה. בנוסף, בעוד שהנהלים המתוארים כאן מתמקדים בעיקר בעיצוב מעגל גנים NF לבקרת ביטוי גנים מדויקת (רעש נמוך), ניתן ליישם ארכיטקטורות אחרות כגון רגולציה חיובית או משוב חיובי (PF) כדי להשיג תכונות שונות כגון שינוי קיפול גבוה או רעש ביטוי גנים גבוה, בהתאמה 56,57 . שימוש במגוון ארכיטקטורות מעגלי גנים (למשל, PF, NF וכו ') יכול לאפשר לחוקרים לחקור שאלות ביולוגיות מגוונות כגון התפקידים שבהם גודל רמת החלבון ורעש משחקים בעמידות לתרופות או גרורות58. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתמקדים גם בדרכים שונות לכימות ביטוי גנים, אך ניתן להוסיף כל מספר של בדיקות תפקודיות (למשל, תנועתיות תאים, ריפוי פצעים, התפשטות וכו ') לאחר רכישת מיקרוסקופיה עם השפעה מועטה עד אפסית על השיטות הקודמות. זה רלוונטי במיוחד למחקרים של תא יחיד שבהם אופטוגנטיקה יכולה להשתמש באינדוקציה מרחבית כדי לחקור התנהגויות כגון דינמיקת ביטוי פועם59.

משלים מודולריות שיטה, פתרון בעיות הוא תכונה חשובה נוספת של כל פרוטוקול ראשי. עבור בניית מעגלים, ההבדלים העיקריים שוכנים בתכנון פריימר ספציפי למעגל המתאים, בעוד שיטות מאוחרות יותר כגון הרכבה והגברת פלסמיד באמצעות צמיחה חיידקית מתוקננות יותר וכוללות בדרך כלל נהלי פתרון בעיות נרחבים משלהם. הנדסת תאים ניתן לשנות עם עקומות titration סמים בהתאם לקו התא בשימוש. בנוסף, אם נעשה שימוש בקו תא מסחרי, ניתן לקבל מדריכים לפתרון בעיות ישירות מיצרן קו התאים. כמו כן, אפקטי אור לא מכוונים חשובים לכימות על קווי התא המהונדסים. לדוגמה, בשל ההשפעות הפוטוקסיות של אור 470 ננומטר, יש ליצור עקומת עוצמת אור כדי לחקור את אינדוקציה של מוות או נזק באוכלוסייה. לאחר בדיקת מגוון ערכי אור, משתמשים יכולים ליצור שער FSC-SSC או להשתמש בשיטה כגון כתמי יודיד propidium כדי לכמת תאים מתים / פגומים, ולכן, לשמש ככלי כדי לקבוע טווחי אור מתאימים לשימוש ניסיוני.

לפתרון בעיות LPA, נוריות LED יכולות לייצר השפעות קצה של דיבור צולב של אור וחום עם בארות סמוכות. לדוגמה, בארות בעוצמה גבוהה עלולות לגרום לגיוס מסוים בבארות סמוכות אם יש חותם לא תקין או שיפוע חום / אור גדול בין בארות. אפקטים אלה יכולים להיות מקסימליים אם ה- LPA מתוכנת בסדר מסוים (לדוגמה, עולה/יורד) של פרמטר אור. כדי להילחם בכך, תוכנת IRIS מאפשרת למשתמשים להשתמש במטריצת אקראיזציה כדי אקראי את עוצמות הבאר ולכן להפחית שגיאה שיטתית. לפתרון בעיות בהיבטים של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, זמן חשיפה, הגדרות הגבר (שליטה ברגישות המצלמה) ועוצמת מקור האור הם הפרמטרים העיקריים שניתן לכוונן. כוונון פרמטרים אלה יכול לאפשר ייצור תמונה אופטימלי ויחסי אות לרעש אידיאליים, כמו גם הימנעות מרווי יתר ופוטוקסיות.

לפתרון בעיות של ציטומטריית זרימה, מתחי צינור פוטומולטיפלייר וגינג תאי הם ההיבטים העיקריים שניתן להתאים. כוונון פרמטרים אלה יכול לאפשר השוואות אידיאליות בין תנאי ניסוי ודגימות בקרה, רכישת אותות נכונה עבור אותות פלואורסצנטיים חלשים או חזקים כאחד, והדרה של פסולת תאית או אוכלוסיות תאים לא רצויות. יש לציין כי מתחי ציטומטריית זרימה נשמרים באופן אידיאלי קבוע על פני ניסויים כדי לאפשר השוואות נאותות. בנוסף, עבור מערכות אופטוגנטיות הדורשות יציאות פלואורסצנטיות מרובות (למשל, FITC ו- PE), המשתמשים יצטרכו להיות מודעים לפיצוי פלואורסצנטי בהתחשב בשיחה צולבת בין פלואורופורים. בתרחישים כאלה, פקדים חיוניים לקביעת אותות פלואורסצנטיים נכונים. בקרות שיידרשו למשתמשים לבצע כוללות חרוזים פלואורסצנטיים, תאים מוכתמים עם סמן העניין, או תאים המבטאים את חלבון הפלואורסצנטיות שניתן להשתמש בו ליצירת מטריצת פיצוי בתוכנת ציטומטריית הזרימה של עניין. בנוסף, בין אם באמצעות סמן פלואורסצנטי אחד או יותר, כל המשתמשים צריכים למדוד באופן שגרתי אותות פלואורסצנטיים של כל סמן עבור תאים שאינם פלואורסצנטיים, אשר מניבים אותות autofluorescence / רקע. פתרון בעיות qRT-PCR כולל כמויות cDNA משתנות ועיצוב בדיקה, אשר לעתים קרובות ספציפיים לפרויקט. לבסוף, עבור פתרון בעיות immunofluorescence, ריכוזי נוגדנים הם המשתנה הגדול ביותר לכימות הבדיקה, המחייב קביעת ריכוז אופטימלית.

היבט אחד לפתרון בעיות הרלוונטי לרוב השיטות לעיל הוא אפקט הבידוד של שימוש בלוח אטום עם תאים מכוסים בנייר כסף. שיטה זו עלולה לעכב את חילופי הגז פחמן דו חמצני הדרושים לצמיחה נכונה של קווי תאים שונים. מניסיון ניסיוני קודם, זה לא היה מכשול משמעותי לצמיחה תאית לניסוי של 3-5 ימים באמצעות קווי התא המהונדסים בתוך כתב יד זה, אך עשוי להיות חשוב עבור שורות תאים אחרות או משכי זמן ניסיוניים. כדי לטפל בדאגה זו, התאמה אחת המיושמת עם הלוחות האטומים כוללת שימוש במדיה עצמאית של דו תחמוצת הפחמן, אשר לא השפיעה על הצמיחה של תאים המשמשים במחקר זה. יש לציין עבור בדיקות אחרות או קווי תאים שבהם חילוף החומרים, רמות ה- pH, וצפיפות התאים חשובים, התערבויות אחרות עשויות להיות נחוצות כגון שינוי מדיה או חומרים מזינים בתדירות גבוהה יותר.

גבולות השיטות המתוארות כאן שוכנים במעגל הגנים שבו נעשה שימוש, דיוק הטכנולוגיה האופטוגנטית וממשק LPA עם ציוד אחר כגון מיקרוסקופים פלואורסצנטיים. הטכנולוגיה המתוארת כאן היא זולה, מהירה לבנייה וקלה לאימות46 עבור אוכלוסיות של תאים מהונדסים אופטוגנטית. עם זאת, ישנן מגבלות מרחביות מסוימות, כגון חוסר היכולת לשלוט בתאים בודדים ללא שינויים בהגדרת אינדוקציה אור, כגון שימוש בהתקני מראה דיגיטליים (DMDs), עם יתרונות שהוכחו לאחרונה בתאים חיים60,61. יתר על כן, השיטות המתוארות כאן מוגבלות במעקב אחר תאים חיים במהלך גירוי אופטוגנטי, ומאפשרות רק רכישת נתונים נקודת קצה של כל קורס הזמן הניסיוני.

למרות מגבלות אלה, השיטות האופטוגנטיות המתוארות כאן משלימות את הטכנולוגיה הקיימת כגון DMDs, אשר יש את הגמישות לשלוט בתאים בודדים בזמן אמת, אך מוגבלים על ידי מספר הדגימות שניתן לעורר. יתר על כן, שיטות הנדסת קו התא היציבות שנדונו כאן מנוגדות לשיטות הביולוגיה הסינתטית הקיימות המאפיינות לעתים קרובות מערכות גנטיות מהונדסות באמצעות טרנספקטים ארעיים. גישות טרנספקטיה חולפות רועשות יותר מטבען בשל השונות הגדולה יותר של מספר העותקים במעגל הגנים בין התאים. לעומת זאת, השיטות המוצגות כאן כוללות וריאנטים של תאים חד-שבטיים, שכל אחד מהם מכיל עותק מעגל גן אחד. קווי תאים יציבים מאפשרים לחקור היבטים תאיים כגון וריאציה של ביטוי גנים, השפעות ברמת החלבון על נופים פנוטיפיים, ושיטות חד-תאיות בדיוק רב יותר, שכן קיים ביטחון גבוה יותר שכל תא זהה לשכנותיו.

העבודה כאן מדגימה פלטפורמה לתכנון כל מעגל גנים אופטוגנטי משולב גנומי, גרימת מערכות כאלה עם כלים ניסיוניים אמינים, ואפיון אותם עם מגוון של ביטוי גנים ובדיקות פונקציונליות / פנוטיפיות באופן סטנדרטי. שיפורים עתידיים של פרוטוקולים אלה עשויים לכלול שילוב של שיטות אלה עם מעקב אחר תאים חיים באמצעות טכנולוגיות אופטוגנטיות אחרות כגון DMDs, אשר יאפשר שליטה מרחבית של ביטוי גנים ויישומים פונקציונליים ברמה של תא יחיד. התקדמות כזו תאפשר ניצול אור כדי לייצר את דפוס ביטוי הגנים של עניין בתאים בודדים, לבסס דינמיקה של שעתוק/תרגום, לכמת את רמות החלבון וללמוד את תפקידם בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל נדידת תאים, התפשטות, גרורות ובידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות למעבדת Balázsi על הערות והצעות, ד"ר קרל פ גרהרדט וד"ר ג'פרי ג 'תבור על שעזרו לנו לבנות את LPA הראשון, וד"ר וילפריד וובר על שיתוף LOV2-degron plasmids. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R35 GM122561 ו- T32 GM0084444]; מרכז לאופר לביולוגיה פיזית וכמותית; ומלגת מדע והנדסה של הביטחון הלאומי (NDSEG). מימון לדמי גישה פתוחה: NIH [R35 GM122561].

תרומות מחבר: M.T.G. ו- G.B. הגה את הפרויקט. M.T.G., D.C., ו L.G., ביצע את הניסויים. M.T.G., D.C., L.G., ו- G.B ניתחו את הנתונים והכינו את כתב היד. ג.B ו-אם.טי.ג'י פיקחו על הפרויקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 173 אופטוגנטיקה בקרת ביטוי גנים ביולוגיה סינתטית משוב שלילי מעגלי גנים
הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., … More

Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter