Summary
İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.
Abstract
Göz bozuklukları dünya çapında milyonlarca insanı etkiler, ancak insan dokularının sınırlı mevcudiyeti çalışmalarını engeller. Fare modelleri, insan anatomisi ve fizyolojisi ile benzerlikleri nedeniyle oküler hastalıkların patofizyolojisini anlamak için güçlü araçlardır. Morfoloji ve fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere retina pigment epitelindeki (RPE) değişiklikler, birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Bununla birlikte, birincil fare RPE hücrelerinin başarılı izolasyonu ve kültürü çok zordur. Bu makale, birincil fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için daha önce Fernandez-Godino ve arkadaşları tarafından 2016'da yayınlanan protokolün güncellenmiş bir görsel-işitsel sürümüdür. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve Transwells'te birkaç hafta boyunca sürdürülebilen yüksek polarize ve pigmentli RPE monolayerlerinin sağlam kültürleriyle sonuçlanır. Bu model, göz hastalıklarının altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaların incelenmesi için yeni yollar açmaktadır. Ayrıca, kalıtsal retina bozuklukları ve makula dejenerasyonları da dahil olmak üzere karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları olan önemli göz hastalıklarını tedavi etmek için kullanılabilecek terapötik yaklaşımları test etmek için bir platform sağlar.
Introduction
İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde fonksiyonel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare retina pigment epitel (RPE) hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntemi açıklar. RPE, nöral retina ile Bruch zarı arasında bulunan bir monolayerdir. Bu tek katman, bir petek2'yebenzeyen altıgen bir şekil sergileyen sıkı kavşaklarla birleştirilen son derece polarize ve pigmentli epitel hücrelerinden oluşur. Bu belirgin histolojik basitliğe rağmen, RPE retina ve normal görme döngüsü 2 ,3,4için kritik olan çok çeşitli işlevleri yerine getirir. RPE monolayer'ın ana işlevleri arasında ışık emilimi, fotoreceptörlerin beslenmesi ve yenilenmesi, metabolik uç ürünlerin çıkarılması, altretinal alanda iyon homeostazının kontrolü ve kan-retina bariyerinin bakımı2,3. RPE ayrıca göz 5 , 6 ,7,8,9,10,11bağışıklık sisteminin lokal modülasyonunda önemli bir role sahiptir. RPE'nin dejenerasyonu ve/veya işlev bozukluğu, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amaurosis, albinizm, diyabetik retinopati ve makula dejenerasyonu12 , 13,14,15gibi birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Ne yazık ki, insan dokularının mevcudiyeti sınırlıdır. İnsanlarla yüksek oranda korunmuş genetik homolojileri göz önüne alındığında, fare modelleri oküler bozuklukları incelemek için uygun ve yararlı bir aracı temsil eder16,17,18,19. Ayrıca, kültürlü birincil RPE hücrelerinin kullanımı, bu görme tehdit eden bozukluklar için yeni tedavilerin gelişimini hızlandırabilecek genetik manipülasyon ve ilaç testi gibi avantajlar sağlar9,11.
Fare RPE yalıtımı ve kültürü için mevcut yöntemler tekrarlanabilir bir şekilde eksiktir ve RPE özelliklerini in vivo olarak yeterli güvenilirlikle yeniden yakalamaz. Hücreler pigmentasyon, altıgen şekil ve transepithelial elektrik direncini (TER) kültürde birkaç gün içinde kaybetme eğilimindedir13,20. Bu birincil RPE hücre kültürlerini farelerden oluşturmak zor bir süreç olduğundan, bu optimize edilmiş protokol, fare gözlerini parçalamak, RPE'yi toplamak ve fareRPEhücrelerini in vitro olarak kültüre etmek içinRPE hücrelerini sıçan ve insan gözlerinden izole etmek için diğer protokollere dayanarak oluşturulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ARVO Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'nin yönergelerine uyuldu.
NOT: Bu yöntemin C57BL/6J, B10 dahil olmak üzere farklı genetik geçmişlere sahip farelerde başarılı olduğu kanıtlanmıştır. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ ve albino fareler, çeşitli yaşlarda. Tercihen RPE hücreleri elde etmek için 8 ila 12 haftalık fareler kullanın. Yaşlı farelerden gelen RPE hücreleri kültürde daha az çoğalır ve genç fareler daha az ve daha küçük hücrelere sahiptir, bu da farklı hayvanlardan canlı kültürlere sahip olmak için gözlerin birikmesini gerektirir.
1. Reaktiflerin ve membran uçlarının hazırlanması
- Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın.
- HBSS-H− (Kalsiyumsuz HBSS, magnezyum tampon + 10 mM HEPES olmadan): 99 mL HBSS- (Ca/Mg olmadan) tampona 1 mL 1 M HEPES ekleyin. 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.
- HBSS-H+ (kalsiyumlu HBSS, magnezyum tampon + 10 mM HEPES ile): 99 mL HBSS+ (Ca/ Mg ile) tampona 1 mL 1 ML HEPES ekleyin. 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.
- Hyaluronidaz çözeltisi hazırlayın (1 mg/mL): 10 mL HBSS-H− içine 10 mg hyaluronidaz ekleyin ve 10 mL şırıng kullanarak 0,4 μm steril şırıng filtresi ile filtreleyin. Kullanmadan önce taze hazırlayın ve oda sıcaklığında (RT; 20-25 °C) bırakın.
- FBS çözümünü hazırlayın: %20 FBS'leri HBSS-H+ ile karıştırın. 8 mL HBSS-H+'ya 2 mL FBS ekleyin. Kullanmadan önce taze hazırlayın.
- RPE ortamını hazırlayın: N1 Orta Takviye 1/100 (v/v), glutamin 1/100 (v/v), penisilin-streptomisi 1/100 (v/v) ve gereksiz amino asit çözeltisi 1/100 (v/v), hidrokortizon (20 μg/L), taurin (250 mg/L) ve triiodo-tiroksin (0.013 μg/L) alfa MEM + %5 FBS veya FBS1,23,24olmadan. İstenirse, FBS ısı inaktive edilebilir; herhangi bir fark gözlenmemiştir. RPE yalıtımı için taze hazırlanın. Hücre kültürü bakımı için 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.
- Trypsin-EDTA'yı hazırlayın: Küçük tek kullanımlık aliquots (~8 mL) taze tripsin-EDTA (%0,25) hazırlayın ve -20 oC'de dondurun. Her kullanımdan önce RT'de çözün. Donma-çözülme döngülerinden kaçının.
- Membran uçlarını hazırlayın (örneğin, Transwell kesici uçlar).
- 6,5 mm'lik membran uçlarını RPE ortamıyla 37 °C'de en az 30 dakika, %5 CO2havalandırılmış inkübatörde dengele. RPE hücrelerini iki fare gözünden tohumlamak için bir membran kesici uç kullanın.
- Kuluçkadan sonra, alt bölmenin ortasını 700 μL PBS ile değiştirin.
- Ortamı üst bölmeden çıkarın ve membran kesici ucu 100 μL 10 μg/mL fare laminin (PBS'de) ile RT'de en az 2 saat kapla (daha kısa inkübasyonlar hücrelerin kesici uçlara zayıf bağlanmasına neden olabilir).
- TER ölçümleri için boş olarak kullanmak üzere ekstra bir membran kesici ucu kapla.
2. Fare gözlerinin diseksiyonu ve enükleasyonu
- Fareleri bir CO2 odasına yerleştirerek ve CO2'yi dakikada oda hacminin% 30-70'i oranında yavaşça serbest bırakarak CO2 boğulma ile ötenazi edin.
- Mikro-asaların açılı, tırtıklı uçlarını fare gözünün her iki tarafına yerleştirin ve göz küresini (enükleasyon) proptose etmek için hafifçe bastırın.
- Göz küresinin etrafına yerleştirilen kümesleri kapatın. Daha sonra, tüm gözü optik sinirle oküler kaslardan ayırmak için ileri ve geri hareket ederken hafifçe çekin ve skleraya bağlı hiçbir bağ dokusunun kalmamasını sağlayın.
- Enükle edilmiş göz küresini% 70 etanolde durulayın ve onları buz üzerinde 3 mL HBSS-H− ile altı kuyulu bir tabağa yerleştirin.
- Farenin ikinci gözünü çıkarmak için 2,2 ile 2,4 arasında olan adımları yineleyin. 30 dakika içinde sonraki adımlara geçin.
NOT: Bir deneyim elde edilene kadar aynı anda sadece iki gözün enükle edilmesi/parçalanarak parçalanmanız önerilir.
3. RPE Koleksiyonu
NOT: Laminer akış davlumbazında steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın. RPE hücre ölümüyle sonuçlanabilecek buz üzerinde uzun süreli inkübasyonları önlemek için aynı anda ikiden fazla göz toplamayın.
- Sklerada herhangi bir kesik yapmadan göz küresine bağlı kalan tüm bağ dokusunu, kanı ve kasları dikkatlice temizlemek için bir diseksiyon stereomikroskop, Dumont #5 tokmakları ve açılı makas kullanın. Gözü taze ve temiz tutmak ve RPE kültürlerinin kirlenmesini önlemek için 3 mL HBSS-H− tamponu gerektiğinde düzenli olarak değiştirin.
- Göz küresini tutmak ve korneanın ortasında keskin bir karbon-çelik #11 bıçağı ile bir delik açmak için optik siniri bir tutamak olarak kullanın.
- Yukarıda belirtilen delikten korneada üç kesi yapmak için Dumont #5 makası kullanın ve lensi çıkarmak için yeterli alan olduğundan emin olun.
- Optik siniri tutun ve lens tamamen çıkana kadar açılı makasın tabanı ile ora serrataya hafif basınç uygulayın. İnkübasyon sırasında nöral retina ve RPE'nin ayrılmasını önlemek için iris epitelini yerinde bırakın. Gözü HBSS-H-tampona yerleştirin.
- İkinci gözü parçalamak için 3.1-3.4 arası adımları tekrarlayın.
- Nöral retinayı RPE'den ayırmak için hyaluronidaz çözeltisinde lenssiz gözleri 37 °C'de 12 kuyulu bir plakada%5CO 2 havalandırılmış inkübatörde (1,5 mL/kuyu) 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her gözü yeni bir kuyuya yerleştirin ve hyaluronidaz aktivitesini durdurmak için kuyu başına 1,5 mL soğuk HBSS-H+ tampon ile 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçkayı 45 dakikadan daha uzun süre uzatmayın.
- Her gözü yıkayın ve taze HBSS-H+ tamponlu 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve korneayı 8 cm'lik Vannas makası kullanarak ora serrata ulaşana kadar orijinal kesilerden kesin. Daha sonra, iris epitelini ve korneayı çıkarmak için ora serratanın altından kesin.
- Göz kapağı kenarını/ora serratasını kavisli cımbızla tutun ve açılı mikroforcep'ler kullanarak RPE tabakasının kesilmemesini sağlamak için sinir retinasını çekin. Daha sonra, optik sinire iç bağlanmayı kesin. Bazı RPE hücreleri nöral retinaya bağlı kalırsa, kuluçka süresini uzatın, ancak toplam 45 dakikayı geçmiyor.
- Optik siniri kesin ve her göz kapağını kuyu başına 1,5 mL taze tripsin-EDTA içeren farklı bir 12 kuyu plakasına aktarın. Göz kapaklarının açık kaldığından ve tripsin'e tamamen batırıldığından emin olun. %5 CO2 inkübatörde 45 dakika boyunca 37 °C'de göz kapaklarını kuluçkaya yatırın.
- Her göz kapağını trypsin inkübasyonu sırasında ayrılan RPE levhalarla birlikte toplayın ve kuyu başına 1,5 mL FBS çözeltisi içeren 12 kuyulu bir tabağa aktarın. RPE sayfaları tripsin çözeltisinde kalırsa, FBS çözümü ile kuyuya aktarmak için bir mikropipette kullanın.
4. Birincil fare RPE hücrelerinin izolasyonu
- Her göz kapağını optik sinirden tutun ve RPE levhalarının tamamen kopmasından elde edilene kadar HBSS-H+ içinde% 20 FBS'nin 1,5 mL'sini içeren 12 kuyu plakasına yüzüstü sallayın.
- Herhangi bir RPE yapraklarını ve RPE kümelerini bir mikropipette ile toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Kültürleri kirletebilecek beyaz sklera veya koroid parçalarından kaçının. Aynı fareden iki gözü bir tüpte havuza al.
- Karışımı RT'de 2 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
- RPE peletini 1 mL tripsin-EDTA'da (%0,25) hafifçe yeniden hayata döndürün ve RPE levhalarını tek bir hücreye dağıtmak için karışımı 37 °C'de bir su banyosunda 1 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bir mikropipette ile 10x yukarı ve aşağı doğru hafifçe borulayın, pipetleme sırasında kabarcık oluşumunu önlayın.
- Trypsin'i seyreltmek ve devre dışı bırakmak ve karışımı RT'de 2 dakika boyunca 340 x g'da santrifüj etmek için 9 mL taze hazırlanmış RPE ortamı ekleyin.
- Bir mikropipette kullanarak 150 μL RPE ortamında hücre peletini dikkatlice yeniden ıslatın, hücrelerin homojen bir şekilde yeniden kullanılmasını sağlayın ve pipetleme sırasında kabarcık oluşumunu önleyin.
- Adım 1.2'den laminin kaplı membran kesici ucu alın, PBS'yi alt hazneden çıkarın ve 700 μL RPE ortamı ekleyin.
- Laminin'i membran kesici ucun üst odasından çıkarın ve RPE hücre süspansiyonunu damla yukarı ve düzgün bir şekilde odanın ortasına dağıtın, pipetleme sırasında kabarcık oluşumunu önleyin.
- Membran kesici ucu 37 °C'de % 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve en az 24 saat boyunca bozulmadan bırakın.
- 24 saat sonra, çoğu RPE hücresinin kesici uça bağlı olduğundan ve izdihamın en az% 50 olduğundan emin olmak için mikroskop altındaki membran kesici ucu kontrol edin (Şekil 1A). İlk 72 saat boyunca medyayı değiştirmemek çok önemlidir.
5. Polarize RPE monolayer kültürü
- Hücre bağlanmasına izin vermek için RPE ortamını yenilemeden önce yalıtılmış RPE hücrelerini kültürde en az 72 saat koruyun. Tohumlamada% 50 veya daha fazla hücre birleşmesi, uygun bir polarize RPE monolayer oluşumu için temeldir.
- Hücreler takıldıktan sonra taze ve önceden ısıtılmış RPE ortamı (adım 1.1.5) kullanarak kültür ortamını haftada iki kez değiştirin. Serum ilk 72 saat sonra kültür ortamından çıkarılabilir.
NOT: Kültürde bir hafta sonra, hücreler bir arada, altıgen, çift çekirdekli, pigmentli ve polarize olmalıdır (Şekil 1B), beklenen hücre sayıları 6,5 mm Transwell kesici uç başına yaklaşık 50.000 hücre olmalıdır. Kültürde iki hafta sonra, sağlıklı hücrelerden oluşan RPE monolayerleri gözlenir. RPE kültürleri apikal mikrovilli, bazal infoldingler ve sıkı kavşaklar görüntüler (Şekil 1C).
6. TER ölçümü
NOT: RPE monolayerinin iyi bir bütünlüğünü ve polarizasyonunu sağlamak için kültürde en az 4 gün sonra RPE hücrelerinin TER ölçümlerini gerçekleştirin.
- Voltohmmetrenin elektrotlarını% 70 etanol ile temizleyin ve dikkatlice kurulayın.
- Transvözleri inkübatörden alın ve sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle değişiklikleri önlemek için 3 dakika içinde TER ölçümü gerçekleştirin. TER'i ölçmek için voltohmmetrenin kısa elektrodunu üst hazneye ve uzun elektrodu membran kesici ucunun alt haznesine daldır. Hücre müfrezesini önlemek için RPE monolayer ile temastan kaçının.
- TER'yi hesaplamak için, boş olanın (hücresiz laminin ile kaplanmış membran kesici ucu) değerini numuneden düş. Daha sonra elde edilen değeri (ohms olarak) membran kesici ucun yüzey alanıyla (6,5 mm membran kesici uç durumunda 0,33 cm2) çarpın. Ürün kültürde 72 saatsonra en az 200 Ω x cm 2 olmalıdır. TER değerleri iki hafta sonra 400 Ω x cm2'nin üzerinde ölçülmelidir. Düşük TER değerlerine sahip RPE kültürlerini atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, RPE hücrelerini genetiği değiştirilmiş farelerden izole etmek ve kültüre etmek için kullanılmıştır1. Fare suşları veya cinsiyet arasında herhangi bir fark gözlenmemiştir. Sonuçlar, yaşlılar arasında görme kaybının en yaygın nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi oküler hastalıkların altında kalan mekanizmanın bazı önemli yönlerinin anlaşılmasına yardımcı oldu9. Bu protokolden sonra izole edilen RPE hücreleri, tohumlamadan 24 saat sonra membran kesici ucuna tamamen tutturuldu ve 72 saat1'densonra tipik RPE boyutunu, morfolojisini ve pigmentasyonunu gösterdi. Bir hafta sonra, zo-1 ifade eden sıkı kavşaklar ile birleştirilmiş iki çekirdekli altıgen pigmentli RPE hücreleri tarafından oldukça polarize bir RPE monolayer oluşturuldu (Şekil 1C, 2). İletim elektron mikrografileri apikal mikrovilli ve bazal infoldların varlığını ortaya koymaktadır (Şekil 1C). RPE monolayer'in polarizasyonu, ortalama 200 Ω x cm2'denyüksek olan ter değerleri ile doğrulandı ve bu değer zaman içinde sabit kaldı (Şekil 2).
Bu yöntemin fonksiyonel doğrulaması fagositoz tahlilleri ile gerçekleştirilmesine rağmen gerçekleştirildi. Fare RPE hücreleri membran uçları üzerinde kültürlendi ve FITC etiketli sığır POS ile beslendi. POS yutma ve sindirim floresan mikroskopi ile gösterilmiştir (Şekil 3).
Şekil 1. Farklı zaman noktalarında RPE hücreleri. (A) RPE hücrelerinin 10x brightfield mikrografileri 24 saat membran kesici uçlarda tohumlama sonrası ve (B) bir hafta sonra. (C) İletim elektron mikrografileri, iki hafta boyunca membran kesici uçlarında kültürlenmiş RPE'nin apikal mikrovilli, bazal infoldingleri ve melanin pigmentlerini (siyah noktalar) görüntüler. Ölçek çubukları: A, B: 100 μm, C: 2 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Ter zaman içinde. Membran kesici uçlardaki ~60 birincil fare RPE hücre kültürünün transepithelial elektrik direnci (TER), 0,5 (n=33), 1 (n=58), 1,5 (n=54) ve 2 (n=60) haftadan sonra ölçüldü. TER, 200 Ω x cm2'den 72 saate ulaşır ve en az iki hafta boyunca sabit kalır. Ortalama ± SD ile tek değerler olarak temsil edilen veriler.
Şekil 3. Fagositoz tahlilleri. FitC etiketli sığır POS (yeşil) ile beslenen ve metanol25ile sabitlenen birincil fare RPE kültürlerinin 40x floresan mikrografileri. Daha küçük parçalar hücrenin sitoplazmasının içindeki sindirilmiş POS'a karşılık gelir. Sıkı kavşakların (kırmızı) görselleştirilmesi, daha önce açıklandığı gibi anti-ZO1 antikorları ile immünostaining ile kolaylaştırıldı1,9. Çekirdekleri lekelendirmek için DAPI (mavi) kullanılmıştır. Görüntünün ortasında iki çekirdekli tipik fare RPE hücreleri gözlenebilir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare RPE hücre izolasyonu ve kültürü için çeşitli yöntemler 1 ,13,20,22,26,27' den önce geliştirilmişken, Fernandez-Godino'nun yöntemi ilk olarak RPE hücrelerinin kültürde haftalarca verimli büyümesine izin sağlayan membran kesici uçları kullandı1,9. Protokollerinde1,9'daki bir diğer önemlideğişiklik,RPE hücrelerini ayrıştırmak için mekanik peeling yerine enzymatic çözeltilerin kullanılmasıydı 1,13,20,26. Lensler korneadaki bir kesiden çıkarılarak iris epitelinin bozulmaması ve ilk kuluçka sırasında retinanın bütünlüğü korundu. RPE hücrelerinin yumuşak izolasyonu, membran uçlarının ve spesifik RPE ortam23'ün kullanımıyla birleştiğinde, hücre sağkalımının iyileştirilmesine neden olur ve kültür2'debirkaç gün içinde RPE'nin fizyolojik koşullarını taklit eden işlevsel bir bir konfüçyüs monolayer oluşumunu artırır. Tipik olarak, bu yöntemle kültürlenmiş birincil fare RPE hücreleri altıgen morfoloji, polarizasyon, pigmentasyon, bariyer özellikleri ve çoğalma görüntüler. Ayrıca, RPE, serumun yokluğunda üç günden birkaç haftaya kadar kültürlenebilir, bu da kompleman ilişkili RPE patolojilerini incelemek için önemlidir9.
Bu protokolün bir sınırlaması, membran kesici uçlarda kültürlenmiş birincil fare RPE hücrelerinin genişletilememesidir. Birincil fare RPE hücrelerini enzymatic solüsyonlarla geçirmek veya uzun süre kültlemek pigmentasyon kaybına, farklılaşmanın azalmasına ve TER'in azalmasına neden olur, böylece in vivo özelliklere benzeyen özellikleri kaybeder. Bir hayvandan elde edilen sınırlı miktardaki RPE hücresi, nispeten büyük miktarlarda başlangıç malzemesinin gerekli olduğu transkriptomik ve proteomik analizler için farklı hayvanlardan numuneleri birer bir arada tutmakla yükümlüdür. Hücre ölümü ve çok katmanlı RPE kültürlerinin daha yüksek bir yüzdesine neden olabileceğinden, daha büyük bir membran kesici uçta daha fazla göz biriktirerek RPE kültürlerini ölçeklendirmeniz önerilmez.
Protokol için de bazı kritik adımlar var. Uzun bir diseksiyon süresi hücre ölümünün daha yüksek bir yüzdesiyle sonuçlansa, bazı deneyimler elde edilene kadar aynı anda en fazla iki göz hasat edilmelidir. Optik sinir sadece tripin ile inkübasyondan önce kesilmelidir. RPE hücrelerini bozmadan göz kapağını işlemek önemlidir, ancak optik sinir tripin tarafından sindirilir ve bu da RPE kültürlerinde safsızlıklara yol açar. Oküler kasların soyulması dikkatli yapılmalıdır. Sklera delinirse ve nöral retina dışarı çıkarsa, göz atılmalıdır çünkü RPE hücreleri zarar görecek ve hayatta kalamayacaktır. Lensleri çıkarmak için minimum basınç uygulanmalıdır. Daha büyük bir kornea kesisi yapılması tercih edilir. Tüm RPE hücrelerinin çözeltiye maruz kalması için göz kapağının açık olması ve tamamen tripsin içine batırılmış olması önemlidir. RPE hücreleri, göz kapağının hafifçe sallanması yoluyla toplanmalı ve asla ortam püskürtülerek veya mekanik olarak soyulmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Massachusetts Eye and Ear'deki Oküler Genomik Enstitüsü tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
