Summary
Monstervoorbereiding voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is een belangrijk knelpunt in de structuurbepalingsworkflow van deze methode. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het gebruik van een eenvoudig te gebruiken, driedimensionaal geprint blok voor de bereiding van ondersteuningsfilms om monsters te stabiliseren voor transmissie-EM-studies.
Abstract
Structuurbepaling door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is het afgelopen decennium snel gegroeid; de monstervoorbereiding blijft echter een belangrijk knelpunt. Macromoleculaire monsters worden idealiter rechtstreeks uit willekeurige oriëntaties in een dunne laag glasvochtijs afgebeeld. Veel monsters zijn hier echter ongevoelig voor en eiwitdenaturatie op het lucht-water-grensvlak is een veel voorkomend probleem. Om dergelijke problemen op te lossen, kunnen ondersteuningsfilms - waaronder amorfe koolstof, grafeen en grafeenoxide - op het raster worden aangebracht om een oppervlak te bieden dat monsters kunnen bevolken, waardoor de kans kleiner wordt dat deeltjes de schadelijke effecten van de lucht-waterinterface ervaren. De toepassing van deze delicate steunen op roosters vereist echter een zorgvuldige behandeling om breuk, verontreiniging in de lucht of uitgebreide was- en reinigingsstappen te voorkomen. Een recent rapport beschrijft de ontwikkeling van een eenvoudig te gebruiken drijfblok dat de bevochtigde overdracht van steunfolies rechtstreeks naar het monster vergemakkelijkt. Het gebruik van het blok minimaliseert het aantal vereiste handmatige handelingen, waardoor de fysieke integriteit van de ondersteuningsfilm behouden blijft en de tijd waarover hydrofobe verontreiniging kan ontstaan, zodat er nog steeds een dunne film van ijs kan worden gegenereerd. Dit artikel biedt stapsgewijze protocollen voor de bereiding van koolstof-, grafeen- en grafeenoxide-ondersteuning voor EM-studies.
Introduction
In het afgelopen decennium hebben doorbraken, voornamelijk in detectortechnologie, maar ook op andere technische gebieden, een opeenvolging van aanzienlijke verhogingen van de resolutie mogelijk gemaakt waarmee biologisch relevante systemen kunnen worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)1,2. Ondanks het feit dat cryo-EM al de resolutie van structuren met hoge resolutie mogelijk maakt vanaf slechts 50 μg eiwit door middel van single-particle analysis (SPA), blijven cryo-EM-monster en roostervoorbereiding belangrijke knelpunten3,4,5. SPA-monsters bestaan uit macromoleculen die ongeveer willekeurig verdeeld zijn over een laag glasachtig ijs. Het ijs moet zo dun mogelijk zijn om het contrastverschil tussen de deeltjes en het oplosmiddel te maximaliseren. Biologische macromoleculen zijn stabieler (d.w.z. minder snel hun oorspronkelijke structuur verliezen) in dikker ijs, omdat ze beter opgelost blijven. Bovendien blijken deeltjes vaak veel beter verdeeld te zijn over het gezichtsveld in ijs dat veel dikker is dan de deeltjesgrootte6 en vaak helemaal niet te vinden zijn in gaten in de koolstoffilms.
Bovendien verminderen dikkere ijslagen de kans dat moleculen zich dicht bij de lucht-waterinterface bevinden vanwege de hoge oppervlakte-volumeverhouding, en er is geschat dat het gebruik van standaard duikbevriezingsmethoden voor cryo-EM-studies resulteert in de adsorptie van ~ 90% van de deeltjes aan de lucht-waterinterface7. Dikker ijs resulteert in ongewenst hoge achtergrond als gevolg van verhoogde verstrooiingsgebeurtenissen in het oplosmiddel en gelijktijdige demping van het signaal6,7. Het is daarom noodzakelijk om een zo dun mogelijk laag glasachtig ijs te bereiken; idealiter zou de laag slechts iets dikker zijn dan het deeltje. De uitdaging voor de onderzoeker, die moet worden overwonnen voor elk ander monster dat op een raster wordt toegepast, is om monsters voor te bereiden die dun genoeg zijn voor beeldvorming met een hoog contrast, terwijl de structurele integriteit van de deeltjes in hun monster behouden blijft. Eiwitadsorptie aan de lucht-water interface gaat gepaard met verschillende, meestal schadelijke, effecten.
Ten eerste induceert binding van eiwitten aan deze hydrofobe interface vaak denaturatie van het eiwit, die snel verloopt en meestal onomkeerbaar is8,9. Een studie uitgevoerd met gistvetzuursynthase toonde aan dat tot 90% van de geadsorbeerde deeltjes gedenatureerd zijn10. Ten tweede toonde bewijs uit een studie waarin de oriëntatieverdeling van 80S ribosoomdatasets werd vergeleken, verzameld op amorfe koolstof11 of zonder ondersteuning12, aan dat de lucht-waterinterface ernstige voorkeursoriëntatie kan veroorzaken die de 3D-reconstructie van het volume in gevaar brengt13. Methoden om de deeltjesinteractie met de lucht-waterinterface te verminderen, omvatten suppletie van de vriesbuffer met oppervlakteactieve stoffen (zoals detergentia), het gebruik van ondersteuningsfilms, affiniteitsvangst of steigers van substraten en versnelde duiktijden. Het gebruik van oppervlakteactieve stoffen wordt geassocieerd met zijn eigen problemen, omdat sommige eiwitmonsters zich niet-ideaal kunnen gedragen in hun aanwezigheid, terwijl affiniteitsvangende en steigersubstraten over het algemeen op maat gemaakte rasteroppervlakken en afvangstrategieën vereisen. Ten slotte, hoewel er veel onderzoek is gedaan naar de ontwikkeling van snelduikende apparaten14,15,16, vereisen deze apparaten die over het algemeen niet op grote schaal beschikbaar zijn.
Hoewel het standaard TEM-raster voor biologische cryo-EM al een geperforeerde amorfe koolstoffolie17 heeft, zijn er een aantal protocollen beschikbaar voor het genereren van extra ondersteuningsfilms en hun overdracht naar TEM-roosters. Het gebruik van deze films is een reeds lang bestaande methode voor monsterstabilisatie18. Amorfe koolstofsteunen worden gegenereerd door verdamping en afzetting op kristallijne micaplaten19, van waaruit de lagen op roosters kunnen worden gedreven, met het nut van floatatiesteunen als nuttige hulpmiddelen die in eerdere rapporten zijn vastgesteld20. Grafeenoxidevlokken, meestal bereid met behulp van een aangepaste versie van de Hummers-methode21, zijn gebruikt als een voorkeursondersteunende ondersteuningsstructuur voor amorfe koolstof vanwege hun verminderde achtergrondsignaal en het vermogen om macromoleculen te immobiliseren en te stabiliseren22. Meer recentelijk is er een hernieuwde belangstelling voor het gebruik van grafeen als TEM-ondersteuningsfilm vanwege de mechanische stabiliteit, hoge geleidbaarheid, extreem lage bijdrage aan achtergrondruis23, evenals de opkomst van reproduceerbare methoden voor het genereren van macroscopisch grote gebieden van monolaag grafeen24 en het overbrengen naar TEM-rasters25 . In vergelijking met amorfe koolstof, die door stralen geïnduceerde bewegingen ondergaat die vergelijkbaar zijn met, of erger, dan ijs zonder een ondersteuningsfilm11,12,17, vertoonde grafeen een significante vermindering van de door de bundel geïnduceerde beweging van cryo-EM-beelden12.
Hoewel hydrogefiliseerd grafeen vetzuursynthase beschermde tegen interfaciale denaturatie in lucht en water, merkten de auteurs van deze studie op dat het grafeen besmet raakte tijdens de bereiding van het monster, waarschijnlijk als gevolg van een combinatie van atmosferische koolwaterstofverontreiniging en van het reagens dat wordt gebruikt om de roosters te hydrofiltreren10. Inderdaad, ondanks veel van de superieure kwaliteiten van grafeen, wordt het wijdverspreide gebruik ervan nog steeds belemmerd door de derivatisatie die nodig is om de hydrofobiciteit12 te verminderen, wat uiteindelijk chemisch moeilijk is en gespecialiseerde apparatuur vereist. Dit artikel rapporteert protocollen voor de bereiding van amorfe koolstof, grafeenoxide en grafeenmonstersteunen met behulp van een driedimensionaal (3D) geprint monster floatatieblok27 om ondersteuningsfilms van de substraten waarop ze werden gegenereerd rechtstreeks over te brengen naar TEM-rasters (figuur 1). Een belangrijk voordeel van het gebruik van een dergelijk apparaat is de bevochtigde overdracht van films, het minimaliseren van hydrofobe verontreiniging van de steunen en bijgevolg de noodzaak van verdere behandeling, en het verminderen van het aantal potentieel schadelijke handmatige handelingen. Deze benaderingen zijn goedkoop te implementeren en daarom breed toegankelijk en toepasbaar voor cryo-EM-studies waar monsterondersteuning nodig is.
Protocol
1. Algemene voorbereiding van TEM-netten pre-support overdracht
- Met behulp van een schoon, fijn pincet, til en dompel TEM-roosters sequentieel onder in dubbel gedestilleerd water (ddH2O) of ultrapuur water gedurende 10-15 s, gevolgd door ethylacetaat, gedurende 10-15 s.
OPMERKING: Hier werden een pincet met negatieve actie en schuine punt gebruikt. - Plaats het pincet, met rooster nog in grip, aan één kant om ~5 min aan de lucht te drogen.
- Plasma-reinig de roosters om het oppervlak te ontdoen van eventuele verontreinigingen die via de lucht of wasstappen zijn ontstaan.
OPMERKING: Hier werd plasma-reiniging uitgevoerd voor 10-15 s in lucht met een radiofrequentievermogen van 25 W.
2. Algemene bereiding van reagensoplossingen
- Uranylacetaat (UAc) oplossing (2% w/v)
- Wikkel een buis van 50 ml in folie, vul met 50 ml ultrapuur water en voeg 1 g UAc-poeder toe.
OPMERKING: UAc is lichtgevoelig en slaat na verloop van tijd neer bij blootstelling. Aangezien UAc radioactief en giftig is, moet u een hoog niveau van reinheid handhaven. Bij het ernstigste gevaar als gevolg van inademing of inname moet extra aandacht worden besteed aan het voorkomen van de mogelijkheid om fijne deeltjes in te ademen. Handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het hanteren of wegen van de uraniumzouten. Maskers en brillen sterk aanbevolen. Uraniumzouten moeten worden verwijderd volgens de wettelijke vereisten die zijn vastgesteld voor radioactieve gevaren binnen de staat. - Laat de oplossing 1 uur roeren om alle UAc te laten oplossen. Bewaren bij 4°C.
- Filtreer voor gebruik 1 ml van de vlekoplossing in een kleine injectieflacon met behulp van een filter van 0,22 μm om eventuele resterende acetaatkristallen te verwijderen.
- Wikkel een buis van 50 ml in folie, vul met 50 ml ultrapuur water en voeg 1 g UAc-poeder toe.
- Suspensie van grafeenoxide (GrOx)
- Pipetteer 2,5 μL GrOx in een buis van 1,5 ml (1% eindconcentratie). Pipetteer 2,5 μL van 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) reinigingsmiddel in het GrOx en meng voorzichtig (0,1% (w/v) eindconcentratie).
- Voeg 245 μL ultrapuur water toe aan het GrOx-DDM-mengsel en vortex onmiddellijk krachtig gedurende 5 min. Gebruik GrOx-suspensie binnen 1 uur na bereiding, vortex krachtig gedurende ten minste 1 minuut voor onmiddellijk gebruik.
- IJzer(III)chloride (FeCl3)-oplossing (10% m/v)
- Weeg voorzichtig 5 g FeCl3 in een weegboot. Breng over op een maatcilinder van 100 ml met 35 ml ddH2O en een magneetroerder.
- Plaats op een magnetische roerplaat en los FeCl3 op, voeg ddH2O toe aan een eindvolume van 50 ml. Filtreer de FeCl3-oplossing door een spuitfilter van 0,8 μm in een schone fles voor opslag.
OPMERKING: FeCl3 is corrosief en irriterend; was de handen en andere blootgestelde gebieden met milde zeep en water voor het eten, drinken of roken en bij het verlaten van het werk. Zorg voor een goede ventilatie in het procesgebied om de vorming van damp te voorkomen. Adem geen mist, dampen, spray in. Handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het hanteren of wegen van het zout. Maskers en brillen worden ten zeerste aanbevolen wanneer ze in gebruik zijn.
3. Bufferuitwisseling voor koolstofondersteunende films op mica om negatief gekleurde monsters te bereiden met behulp van het ondersteuningsdrijfblok
- Tem-roosters wassen en plasma reinigen.
OPMERKING: Hier werden 300 mesh holey-carbon koperen roosters gebruikt zoals hierboven beschreven in sectie 1. - Pipetteer 10-12 μL monster in de bufferwisselput (met de kleine kanalen) van het drijfblok en 10-12 μL 2% UAc-oplossing (zie rubriek 2.1) voor negatieve kleuring in de aangrenzende niet-bufferwisselput.
OPMERKING: De put heeft een volume van 10 μL; pas het monstervolume echter zo aan dat aan het oppervlak van de vloeistof een bolle meniscus wordt gevormd om een goede filmzwering mogelijk te maken. Een laag monstervolume kan filmbreuk veroorzaken. - Snijd voorzichtig twee kleine stukjes mica met voorgepositeerde koolstoffilm erop. Zorg ervoor dat de micafragmenten breed genoeg zijn om in de put te passen (3,4 mm breedte) en langer dan de putlengte (3,45 mm), zodat het fragment op de put blijft zitten terwijl koolstof zweeft en er voldoende ruimte is om het fragment met het pincet te hanteren.
OPMERKING: Om de koolstof te hanteren, gebruikt u een pincet met platte negatieve actie met lange punt. Snijd bij het snijden van de micafragmenten met enkele bewegingen om de integriteit van de koolstoffilm te behouden. - Dompel de mica onder in de put met een hoek van ongeveer 45° totdat de mica op de helling van de put zit en een laag koolstof wordt waargenomen aan het oppervlak van het vloeibare monster.
- Na de eerste incubatie op het monster (meestal 20 s tot 20 minuten, afhankelijk van de hechting van het monster; optimaliseer deze periode op basis van experimentele behoeften), trek het mica-vel zeer langzaam terug om de koolstoffilm terug te winnen en resterende viskeuze monsterretentie te minimaliseren.
- Dep de mica voorzichtig door met filterpapier op het onderste oppervlak (niet-koolstofzijde) te tikken om overtollige vloeistof te verwijderen en wissel vervolgens de koolstof die het monster draagt uit tot een negatieve vlek door deze aan te brengen op de tegenoverliggende put (d.w.z. dompel de mica onder zoals in stap 3.4) met de 2% UAc-oplossing.
OPMERKING: Er moet een koolstoflaag worden waargenomen die op dit punt op de vlekoplossing drijft. - Herstel de zwevende koolstoflaag met de met koolstof bedekte kant van een gewassen en plasmagezuiverd EM-rooster. Laat de roosters aan de lucht drogen totdat de afbeelding op een TEM wordt weergegeven. Bedek idealiter de roosters tijdens het droogproces om verontreiniging in de lucht te voorkomen.
4. Toepassing van het steundriftblok om tem-roosters met grafeenoxidecoating voor te bereiden
- Was en plasma-schone TEM-roosters met behulp van 300 mesh holey-carbon koperen roosters zoals hierboven beschreven (sectie 1).
- Pipetteer 10-12 μL GrOx-suspensie (zie punt 2.2) in de 4 niet-bufferwisselputten langs het drijfblok. Pipetteer 10-12 μL ddH2O of ultrapuur water in de resterende 4 bufferwisselputten van het blok.
OPMERKING: Dit volume water moet voldoende zijn om een lichte bolle meniscus te vormen die boven de hoogte van het blok uitsteekt. - Laat 4 roosters gedurende 1 minuut zachtjes op de GrOx-suspensie van elke put vallen, zodat de met koolstof bedekte kant contact maakt met de oplossing. Herstel na 1 minuut elk rooster zorgvuldig door het pincet in de pincetgroef van elke niet-bufferwisselput te schuiven.
- Raak heel voorzichtig en kort de koperen, niet-koolstofbedekte kant van elk rooster aan op de ddH2O in de aangrenzende put. Houd vervolgens voorzichtig en voorzichtig het rooster, waterdruppelzijde naar beneden, tegen een stuk filterpapier.
OPMERKING: Door het water af te vegen, wordt de GrOx-suspensie door capillaire werking door het net getrokken. Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat het net in de ddH2O wordt ondergedompeld, dus het contact moet zeer kort zijn. Wanneer het rooster wordt opgetild, moet een druppel water zich aan de onderkant van het rooster houden. Zorg ervoor dat u het rooster op het filterpapier niet verplaatst, omdat dit de bezinking van de GrOx-vlokken kan verstoren. - Laat de roosters in het pincet aan de lucht drogen tot de bereiding met monster. Bedek idealiter de roosters tijdens het droogproces om verontreiniging in de lucht te voorkomen.
5. Toepassing van het steundrijfblok voor de bereiding van monsters op monolaag-grafeenfilms
- Was de TEM-roosters zoals hierboven beschreven (sectie 1), maar laat plasmareiniging achterwege.
OPMERKING: Hier werden 300 mesh holey-carbon goudroosters gebruikt, maar andere niet-koperen roosters of koperlegeringsroosters zijn ook uitvoerbaar. - Om rasters met grafeen af te zetten, gaat het rechtstreeks over van grafeen geteeld op koper (Cu-grafeen) substraten naar cryo-EM-rasters, zoals eerder beschreven25.
- Plaats vier gewassen roosters bovenop een Cu-grafeenplaat (10 mm × 10 mm) afgezet op een glazen glijbaan en bedek elk rooster met een druppel isopropanol (5-10 μL) om intiem contact tussen het monolaag grafeen en het rooster mogelijk te maken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de met koolstof bedekte kant van de roosters in contact brengt met de grafeenplaat. - Wanneer de isopropanol volledig is verdampt (meestal 2 uur), drijft u de Cu-grafeenplaat met roosters op 10% (w/v) FeCl3-oplossing (zie rubriek 2.3) in een glazen petrischaal en laat u deze 's nachts bij kamertemperatuur etsen. Dek het gerecht af om besmetting in de lucht te voorkomen.
OPMERKING: Nadat het etsen is voltooid, blijft alleen de grafeenmonolaag drijven op de FeCl3-oplossing - dit moet met het oog zichtbaar zijn met geschikte verlichting. - Gebruik een lus met een diameter groter dan de TEM-rastergrootte om de roosters te vissen die op de grafeenmonolaag drijven en breng voorzichtig over naar een glazen petrischaal met ddH2O om te wassen.
OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig bij het vissen op de roosters om te voorkomen dat u de wanden van de petrischaal raakt, wat grafeenfilmbreuk of buiging kan veroorzaken. - Was nog twee keer in water door roosters te vissen en over te brengen naar een schone petrischaal met ddH2O om alle resterende FeCl3 te verwijderen. Breng ten slotte roosters over in een petrischaal met monsterbuffer tot monstervoorbereiding en onderkoeling.
OPMERKING: De met grafeen bedekte kant van de roosters moet te allen tijde bevochtigd worden gehouden om blootstelling aan verontreinigingen in de lucht te voorkomen.
- Plaats vier gewassen roosters bovenop een Cu-grafeenplaat (10 mm × 10 mm) afgezet op een glazen glijbaan en bedek elk rooster met een druppel isopropanol (5-10 μL) om intiem contact tussen het monolaag grafeen en het rooster mogelijk te maken.
- Pipetteer het monster (10-12 μL) in een niet-bufferwisselput van het drijfblok. Wanneer het monster klaar is in het blok, kiest u een met grafeen bekleed rooster uit de bufferoplossing met behulp van een schoon pincet en plaatst u het op het oppervlak van de monsterbevattende put.
- Na een geschikte incubatietijd (1-5 min, afhankelijk van het monster; optimaliseren volgens experimentele behoeften), kiest u het rooster met een schoon vriespincet en gaat u verder met dempen en vitrificeren.
Representative Results
TEM-roosters bereid met amorfe koolstofsteunen zijn meestal bedekt over het hele rasteroppervlak. Hoewel breuk van de koolstoffilm in sommige gevallen samen met wat ruches optreedt (figuur 2A), is een groot aantal rastervierkanten ongerept en dus breed toepasbaar voor negatieve kleuringsdoeleinden. De belangrijkste factor die de integriteit van de ondersteuning beïnvloedt, is de koolstofdikte, die wordt bepaald tijdens koolstofverdamping. Op dezelfde manier wordt met dit GrOx-protocol routinematig een goede dekking over het hele net bereikt (figuur 2B). Een enkele toepassing van GrOx-suspensie gedurende 1 minuut is voldoende om te zorgen voor weinig gebieden met meerdere lagen, die gemakkelijk te zien zijn vanwege schilferranden. GrOx-roosters kunnen snel worden bereid uit grondstoffen en zijn zeer beschermend voor het monster. Vlokkenranden, onvolledige dekking en ruches zijn echter vaker zichtbaar bij GrOx-roosters dan bij de andere technieken vanwege de aard van de GrOx-vlokken.
Hoewel de integriteit van de grafeenondersteunende film, zoals de amorfe koolstof, afhankelijk is van het afzettingsproces, vertonen gebieden die goed bedekt zijn het karakteristieke diffractiepatroon van enkellaags grafeen. Belangrijk is dat door grafeenondersteunende films bevochtigd te houden, monsters na een incubatieperiode uit het drijfblok kunnen worden hersteld en gegevens kunnen worden verzameld op een manier die geschikt is voor analyse met één deeltje. Deze methode vereist geen andere behandeling van het grafeen voor bevochtiging, waardoor de noodzaak voor dure apparatuur om grafeen hydrofiel te maken wordt geëlimineerd, en het is het beste om ondersteuningsfilms kort voor de monstervoorbereiding en roosterbevriezing te bereiden (figuur 2C).
Figuur 1: Ontwerp en toepassing van het drijfblok tijdens de voorbereiding van de ondersteuningsfilm. (A) Schema van de boven-, put- en zijaanzichten van het drijfblok, inclusief metingen van de vorm, diepte en helling. De groef voor pincettips om te rusten, evenals kanalen om naalden in te brengen, zijn aangegeven. (B) Amorfe koolstoflagen kunnen gemakkelijk op het oppervlak van de buffer in de putten van het drijfblok worden gedrijven met behulp van de hellingbaan, d.w.z. tijdens de voorbereiding van negatief gekleurde TEM-roosters. (C) De breedte van de putten is geschikt voor één TEM-rooster, terwijl de pincetgroeven de noodzaak verminderen om roosters onnodig los te laten en op te pakken tijdens voorbereidingsstappen, maar een gedefinieerd pad bieden om roosters terug te winnen zonder risico op buiging als roosters worden vrijgegeven. Afbeeldingen in B zijn aangepast van 27. Afkorting: TEM = transmissie elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Typische voorbeelden van monsterondersteuningsfilms die zijn bereid met behulp van het drijfblok. Rastervierkant (links) en afbeeldingsweergaven (rechts) worden weergegeven voor (A) amorfe koolstof, (B) grafeenoxide en (C) grafeenondersteuningsfilms die zijn bereid met behulp van het drijfblok. De amorfe koolstofondersteuning werd gebruikt bij de bereiding van 70S-ribosomen voor negatieve kleuring, terwijl de grafeenoxide- en grafeensteunen werden gebruikt bij de bereiding van 70S-ribosomen voor cryo-EM. Afbeeldingen in A en C zijn aangepast van 27. Schaalbalk voor A-rastervierkant = 10 μm; schaalbalken voor B- en C-rastervierkanten = 5 μm; schaalbalken voor A-C-beeldweergaven = 50 nm. Afkorting: cryo-EM = cryo-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit artikel presenteert protocollen voor de behandeling van zowel amorfe koolstof- als grafeenfilms voor cryo-EM-monstervoorbereiding met behulp van een monster floatatieblok27. Een STL-bestand voor het ondersteuningsblok is vrij beschikbaar in de openbare Thingiverse-repository [www.thingiverse.com/thing:3440684] en kan worden 3D-geprint met elke geschikte stereolithografieprinter van een geschikte hars. Het gebruik van koolstoffilms die een TEM-raster bedekken, omvat meestal de koolstofdrift op het monster28. Deze aanpak voor het voorbereiden van negatieve vlekkenroosters minimaliseert de blootstelling aan lucht tijdens het hanteren van ondersteuning, waardoor verontreiniging en eiwitdenaturatie worden verminderd. De voorbereiding van roosters met behulp van drijvende koolstof in kleine putten is voordelig voor het drijven van een groter oppervlak, d.w.z. in een waterbad of petrischaal, in welk geval mechanische afschuiving van de koolstof veel gemakkelijker plaatsvindt.
UAc kan moeilijk te kopen zijn vanwege de huidige gezondheids- en veiligheidsvoorschriften op het moment van publicatie. Veel andere veelgebruikte, niet-radioactieve, negatieve kleuringsreagentia zijn beschikbaar en protocollen voor hun bereiding zijn eerder beschreven29. Hoewel er geen alternatieve vlekken zijn gebruikt met dit ondersteuningsdrijfblok, is het niet waarschijnlijk dat er verschillen in deze protocollen zouden zijn naast de optimalisatie van de incubatietijd met monster (stap 3.5), die al inherent monsterafhankelijk is. De belangrijkste stap in dit GrOx-ondersteuningsvoorbereidingsprotocol is stap 4.4, gemarkeerd door de opmerking om te voorkomen dat het water en de GrOx-oplossing contact maken rond de netrand. Onjuiste menging van het water en de GrOx-oplossingen voorkomt unidirectionele bezinking van de GrOx-vlokken door capillaire werking. Het hebben van GrOx-vlokken aan beide zijden van de koolstoffolie resulteert in dikke lagen, waardoor de voordelen van het gebruik van GrOx als een bijna eenlaagse ondersteuning teniet worden gedaan, evenals het vangen van water tussen de vlokken, wat verontreiniging van bruikbare gebieden met extra ijslagen veroorzaakt. Grafeenoxide ondersteuningsvoorbereiding is relatief eenvoudig te bereiken met behulp van druppels oplossing op flexibele polyolefinefilm. Wanneer het echter op die manier wordt uitgevoerd, is het gemakkelijker om per ongeluk de koperen kant van het net te verontreinigen door fouten in de verkeerde behandeling; het gebruik van het drijfblok verkleint de kans op deze mogelijkheid.
Ten slotte presenteert dit artikel een protocol om met grafeen bedekte rasters voor te bereiden dat elke vorm van grafeenvoorbehandeling vermijdt om het hydrofiel te maken, waardoor de kosten worden verlaagd en de toegankelijkheid ervan wordt vergroot. Het handhaven van een bevochtigde film tijdens de monstervoorbereiding en het aanbrengen van het monster in situ in het blok vlak voor het invriezen is voldoende om geschikte ijslagen voor cryo-EM met een homogene monsterverdeling te kunnen genereren. Over het algemeen minimaliseren de hier gepresenteerde protocollen het contact van het monster met de lucht-waterinterface, waardoor de denaturatie van het monster wordt verminderd en verontreiniging wordt ondersteund. Voor de drie ondersteuningsfilms die in deze benaderingen worden gebruikt, kunnen homogene monsterverdelingen over de rasters worden bereikt, samen met beeldvorming van intacte, goed bewaarde afzonderlijke deeltjes.
Disclosures
De auteurs zijn niet op de hoogte van belangenconflicten met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle leden van de sectie voor structurele en synthetische biologie aan het Imperial College London bedanken die hebben geholpen bij het testen van deze technieken, evenals Harry Barnett aan het Imperial College Advanced Hackspace en Paul Simpson aan het Centre for Structural Biology. CHSA wordt ondersteund door een Sir Henry Dale Fellowship die gezamenlijk wordt gefinancierd door de Wellcome Trust en de Royal Society (206212 / Z / 17 / Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
