Summary
Die Probenvorbereitung für die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist ein wesentlicher Engpass im Strukturbestimmungsworkflow dieser Methode. Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Verfügung, um einen einfach zu bedienenden, dreidimensional gedruckten Block für die Herstellung von Trägerfolien zur Stabilisierung von Proben für Transmissions-EM-Studien zu verwenden.
Abstract
Die Strukturbestimmung durch Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat in den letzten zehn Jahren rasant zugenommen; Die Probenvorbereitung bleibt jedoch ein erheblicher Engpass. Makromolekulare Proben werden idealerweise direkt aus zufälligen Orientierungen in einer dünnen Schicht Glaseis aufgenommen. Viele Proben sind jedoch feuerfest darauf, und die Proteindenaturierung an der Luft-Wasser-Grenzfläche ist ein häufiges Problem. Um solche Probleme zu überwinden, können Unterstützungsfilme - einschließlich amorphem Kohlenstoff, Graphen und Graphenoxid - auf das Gitter aufgebracht werden, um eine Oberfläche bereitzustellen, auf der sich Proben besiedeln können, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Partikel die schädlichen Auswirkungen der Luft-Wasser-Grenzfläche erfahren. Die Anwendung dieser empfindlichen Stützen auf Gitter erfordert jedoch eine sorgfältige Handhabung, um Bruch, Luftverschmutzung oder umfangreiche Wasch- und Reinigungsschritte zu vermeiden. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschreibt die Entwicklung eines einfach zu bedienenden Floatationsblocks, der den benetzten Transfer von Trägerfolien direkt auf die Probe erleichtert. Die Verwendung des Blocks minimiert die Anzahl der manuellen Handhabungsschritte, die erforderlich sind, wodurch die physikalische Integrität der Stützfolie und die Zeit, in der hydrophobe Kontaminationen auftreten können, erhalten bleiben, wodurch sichergestellt wird, dass immer noch ein dünner Eisfilm erzeugt werden kann. Dieses Papier enthält Schritt-für-Schritt-Protokolle für die Herstellung von Kohlenstoff-, Graphen- und Graphenoxidträgern für EM-Studien.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben Durchbrüche, vor allem in der Detektortechnologie, aber auch in anderen technischen Bereichen, eine Reihe von erheblichen Erhöhungen der Auflösung ermöglicht, mit der biologisch relevante Systeme durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)1,2 abgebildet werden können. Trotz der Tatsache, dass Kryo-EM bereits die Auflösung hochauflösender Strukturen von nur 50 μg Protein durch Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglicht, bleiben kryo-EM-Proben- und Gittervorbereitung große Engpässe3,4,5. SPA-Proben bestehen aus Makromolekülen, die ungefähr zufällig in einer Schicht aus Glaseis verteilt sind. Das Eis muss so dünn wie möglich sein, um den Kontrastunterschied zwischen den Partikeln und dem Lösungsmittel zu maximieren. Biologische Makromoleküle sind in dickerem Eis stabiler (d.h. es ist weniger wahrscheinlich, dass sie ihre native Struktur verlieren), weil sie besser gelöst bleiben. Darüber hinaus werden Partikel oft gefunden, um viel besser über das Sichtfeld verteilt zu sein, in Eis viel dicker als die Partikelgröße6 und häufig überhaupt nicht in Löchern in den Kohlenstofffilmen gefunden werden.
Darüber hinaus verringern dickere Eisschichten die Wahrscheinlichkeit, dass sich Moleküle aufgrund des hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses in der Nähe der Luft-Wasser-Grenzfläche befinden, und es wurde geschätzt, dass die Verwendung von Standard-Tauch-Gefrier-Methoden für Kryo-EM-Studien zur Adsorption von ~ 90% der Partikel an die Luft-Wasser-Grenzfläche führt7. Dickeres Eis führt zu einem unerwünscht hohen Hintergrund aufgrund erhöhter Streuereignisse innerhalb des Lösungsmittels und der damit einhergehenden Dämpfung des Signals6,7. Es ist daher notwendig, eine möglichst dünne Schicht Glaseis zu erreichen; Idealerweise wäre die Schicht nur geringfügig dicker als das Partikel. Die Herausforderung für den Forscher, die für jede einzelne Probe, die auf ein Gitter aufgetragen wird, überwunden werden muss, besteht darin, Proben vorzubereiten, die dünn genug für eine kontrastreiche Bildgebung sind, während die strukturelle Integrität der Partikel in ihrer Probe erhalten bleibt. Die Proteinadsorption an die Luft-Wasser-Grenzfläche wird von mehreren, meist schädlichen Effekten begleitet.
Erstens induziert die Bindung von Proteinen an diese hydrophobe Grenzfläche häufig eine Denaturierung des Proteins, die schnell vonstatten geht und typischerweise irreversibel ist8,9. Eine Studie mit Hefe-Fettsäure-Synthase zeigte, dass bis zu 90% der adsorbierten Partikel denaturiert sind10. Zweitens zeigten Beweise aus einer Studie, in der die Orientierungsverteilung von 80S-Ribosomen-Datensätzen verglichen wurde, die entweder auf amorphem Kohlenstoff11 oder ohne Unterstützung12 gesammelt wurden, dass die Luft-Wasser-Grenzfläche eine starke bevorzugte Orientierung verursachen kann, die die 3D-Rekonstruktion des Volumens beeinträchtigt13. Methoden zur Verringerung der Partikelinteraktion mit der Luft-Wasser-Grenzfläche umfassen die Ergänzung des Gefrierpuffers mit Tensiden (z. B. Reinigungsmitteln), die Verwendung von Stützfolien, die Affinitätserfassung oder das Gerüst von Substraten und beschleunigte Tauchzeiten. Die Verwendung von Tensiden ist mit ihren eigenen Problemen verbunden, da sich einige Proteinproben in ihrer Gegenwart nicht ideal verhalten können, während Affinitätseinfang- und Gerüstsubstrate im Allgemeinen maßgeschneiderte Gitteroberflächen und Erfassungsstrategien erfordern. Schließlich, obwohl es eine Menge Forschung über die Entwicklung von Schnelltauchvorrichtungen14,15,16 gibt, erfordern diese Geräte, die im Allgemeinen nicht weit verbreitet sind.
Obwohl das Standard-TEM-Gitter für biologische Kryo-EM bereits über eine perforierte amorphe Kohlenstofffolie17 verfügt, stehen eine Reihe von Protokollen für die Erzeugung zusätzlicher Trägerfolien und deren Übertragung auf TEM-Gitter zur Verfügung. Die Verwendung dieser Folien ist eine seit langem etablierte Methode zur Probenstabilisierung18. Amorphe Kohlenstoffträger werden durch Verdampfung und Ablagerung auf kristallinen Glimmerplatten19 erzeugt, von denen aus die Schichten auf Gitter geschwommen werden können, wobei der Nutzen von Flotationsstützen als nützliche Werkzeuge in früheren Berichten20 festgelegt wurde. Graphenoxidflocken, die typischerweise unter Verwendung einer modifizierten Version der Hummers-Methode21 hergestellt wurden, wurden als bevorzugte Stützstruktur für amorphen Kohlenstoff wegen ihres verminderten Hintergrundsignals sowie der Fähigkeit, Makromoleküle zu immobilisieren und zu stabilisieren22 verwendet. In jüngster Zeit ist das Interesse an der Verwendung von Graphen als TEM-Trägerfolie aufgrund seiner mechanischen Stabilität, hohen Leitfähigkeit, seines extrem geringen Beitrags zum Hintergrundrauschen23 sowie der Entstehung reproduzierbarer Methoden zur Erzeugung makroskopisch großer Flächen von Monolayer-Graphen24 und dessen Übertragung auf TEM-Gitter wieder gestiegen25 . Im Vergleich zu amorphem Kohlenstoff, der strahlinduzierte Bewegungen ähnlich oder schlimmer als Eis ohne Stützfilm erfährt11,12,17, zeigte Graphen eine signifikante Verringerung der strahlinduzierten Bewegung von Kryo-EM-Bildern12.
Während hydrophilisiertes Graphen die Fettsäuresynthase vor der Luft-Wasser-Grenzflächendenaturierung schützte, stellten die Autoren dieser Studie fest, dass das Graphen während der Probenvorbereitung kontaminiert wurde, wahrscheinlich aufgrund einer Kombination aus atmosphärischer Kohlenwasserstoffkontamination und aus dem Reagenz, das zur Hydrophilisierung der Gitter verwendet wurde10. Trotz vieler der überlegenen Eigenschaften von Graphen wird seine weit verbreitete Verwendung immer noch durch die Derivatisierung behindert, die erforderlich ist, um seine Hydrophobie zu verringern12, was letztendlich chemisch schwierig ist und spezielle Ausrüstung erfordert. Dieser Artikel berichtet über Protokolle für die Herstellung von amorphen Kohlenstoff-, Graphenoxid- und Graphenprobenträgern unter Verwendung eines dreidimensional (3D) gedruckten Probenschwimmerationsblocks27, um Stützfolien von den Substraten, auf denen sie erzeugt wurden, direkt auf TEM-Gitter zu übertragen (Abbildung 1). Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung eines solchen Geräts ist der benetzte Transfer von Filmen, wodurch die hydrophobe Kontamination der Stützen und folglich die Notwendigkeit einer weiteren Behandlung minimiert und die Anzahl potenziell schädlicher manueller Handhabungsschritte reduziert wird. Diese Ansätze sind kostengünstig zu implementieren und daher allgemein zugänglich und anwendbar für Kryo-EM-Studien, bei denen Probenunterstützungen erforderlich sind.
Protocol
1. Allgemeine Vorbereitung der TEM-Netze vor dem Transfer zur Unterstützung
- Heben und tauchen Sie TEM-Gitter mit einer sauberen, feinen Pinzette nacheinander in doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) oder Reinstwasser für 10-15 s, gefolgt von Ethylacetat für 10-15 s.
HINWEIS: Hier wurde eine Pinzette mit negativer Wirkung und schräger Spitze verwendet. - Legen Sie die Pinzette, mit Gitter noch im Griff, auf eine Seite, um sie für ~ 5 min an der Luft zu trocknen.
- Reinigen Sie die Gitter plasmaförmig, um die Oberfläche von Verunreinigungen zu befreien, die durch die Luft- oder Waschschritte entstehen.
HINWEIS: Hier wurde die Plasmareinigung für 10-15 s in Luft mit einer Hochfrequenzleistung von 25 W durchgeführt.
2. Allgemeine Herstellung von Reagenzienlösungen
- Uranylacetat (UAc) Lösung (2% w/v)
- Wickeln Sie ein 50-ml-Röhrchen in Folie, füllen Sie es mit 50 ml Reinstwasser und fügen Sie 1 g UAc-Pulver hinzu.
HINWEIS: UAc ist lichtempfindlich und fällt bei Belichtung im Laufe der Zeit aus. Da UAc radioaktiv und giftig ist, halten Sie ein hohes Maß an Sauberkeit aufrecht. Bei der schwerwiegendsten Gefahr, die sich aus dem Einatmen oder Verschlucken ergibt, sollte besonders darauf geachtet werden, dass keine feinen Partikel eingeatmet werden können. Beim Umgang oder Wiegen der Uransalze müssen immer Handschuhe getragen werden. Masken und Schutzbrillen sehr zu empfehlen. Uransalze müssen gemäß den gesetzlichen Anforderungen für radioaktive Gefahren im Staat entsorgt werden. - Lassen Sie die Lösung 1 h rühren, damit sich das gesamte UAc auflösen kann. Bei 4°C lagern.
- Vor Gebrauch 1 ml der Färbelösung mit einem 0,22 μm Filter in eine kleine Durchstechflasche filtriert, um alle verbleibenden Acetatkristalle zu entfernen.
- Wickeln Sie ein 50-ml-Röhrchen in Folie, füllen Sie es mit 50 ml Reinstwasser und fügen Sie 1 g UAc-Pulver hinzu.
- Graphenoxid (GrOx) Suspension
- 2,5 μL GrOx in ein 1,5 ml Röhrchen (1% Endkonzentration) pipettieren. 2,5 μL 10% (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM)-Reinigungsmittel in das GrOx pipettieren und vorsichtig mischen (0,1% (w/v) Endkonzentration).
- 245 μL Reinstwasser in die GrOx-DDM-Mischung geben und sofort 5 min lang kräftig wirbeln. GrOx-Suspension innerhalb von 1 h nach der Zubereitung verwenden, mindestens 1 min vor der sofortigen Anwendung kräftig wirbeln.
- Eisen(III)-chlorid (FeCl3)-Lösung (10% w/v)
- Wiegen Sie vorsichtig 5 g FeCl3 in einem Wiegeboot. Überführung in einen 100 mL Messzylinder mit 35 mL ddH2O und einem Magnetrührstab.
- Auf eine magnetische Rührplatte legen und FeCl3 auflösen und ddH2O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Die FeCl3-Lösung wird durch einen 0,8 μm Spritzenfilter zur Lagerung in eine saubere Flasche filtriert.
HINWEIS: FeCl3 ist ätzend und reizend; Waschen Sie Hände und andere exponierte Bereiche mit milder Wasser und Seife vor dem Essen, Trinken oder Rauchen und beim Verlassen der Arbeit. Sorgen Sie für eine gute Belüftung im Prozessbereich, um Dampfbildung zu verhindern. Atmen Sie keinen Nebel, Dämpfe, Spray. Beim Umgang oder Wiegen des Salzes müssen immer Handschuhe getragen werden. Masken und Schutzbrillen werden bei Gebrauch dringend empfohlen.
3. Pufferaustausch für Kohlenstoffträgerfolien auf Glimmer zur Herstellung negativ gefärbter Proben mit dem Stützschwimmerblock
- Waschen und plasmareinigte TEM-Gitter.
HINWEIS: Hier wurden 300-Mesh-Loch-Kohlenstoff-Kupfergitter verwendet, wie oben in Abschnitt 1 beschrieben. - 10-12 μL Probe in die Pufferaustauschmulde (mit den kleinen Kanälen) des Floatationsblocks und 10-12 μL 2%ige UAc-Lösung (siehe Abschnitt 2.1) zur negativen Färbung in die benachbarte Nichtpufferaustauschbohrung pipettieren.
HINWEIS: Der Brunnen hat ein Volumen von 10 μL; Stellen Sie jedoch das Probenvolumen so ein, dass an der Oberfläche der Flüssigkeit ein konvexer Meniskus gebildet wird, um eine ordnungsgemäße Filmschwimmung zu ermöglichen. Ein geringes Probenvolumen kann zu Filmbruch führen. - Schneiden Sie vorsichtig zwei kleine Glimmerstücke mit voreingestelltem Kohlefilm darauf. Stellen Sie sicher, dass die Glimmerfragmente breit genug sind, um in den Brunnen zu passen (3,4 mm Breite) und länger als die Bohrlochlänge (3,45 mm), so dass das Fragment auf dem Brunnen sitzt, während Kohlenstoff schwimmt, und es genügend Platz gibt, um das Fragment mit der Pinzette zu handhaben.
HINWEIS: Um mit dem Kohlenstoff umzugehen, verwenden Sie eine flache Pinzette mit negativer Wirkung mit langer Spitze. Schneiden Sie beim Schneiden der Glimmerfragmente mit einzelnen Bewegungen, um die Integrität des Kohlenstofffilms zu erhalten. - Tauchen Sie den Glimmer mit einem ungefähren Winkel von 45 ° in den Brunnen ein, bis der Glimmer auf der Rampe des Bohrlochs sitzt und eine Kohlenstoffschicht an der Oberfläche der flüssigen Probe beobachtet wird.
- Nach der anfänglichen Inkubation an der Probe (typischerweise 20 s bis 20 min abhängig von der Probenadhärenz; optimieren Sie diesen Zeitraum basierend auf experimentellen Bedürfnissen), ziehen Sie die Glimmerplatte sehr langsam heraus, um den Kohlenstofffilm zurückzugewinnen und die verbleibende viskose Probenretention zu minimieren.
- Tupfen Sie den Glimmer vorsichtig ab, indem Sie die untere Oberfläche (kohlenstofffreie Seite) mit Filterpapier klopfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und tauschen Sie anschließend den Kohlenstoff, der die Probe trägt, durch Auftragen auf die gegenüberliegende Vertiefung (dh tauchen Sie den Glimmer wie in Schritt 3.4 ein), der die 2% ige UAc-Lösung enthält, in eine negative Färbung aus.
HINWEIS: An dieser Stelle sollte eine Kohlenstoffschicht auf der Oberseite der Färbelösung beobachtet werden. - Gewinnen Sie die schwimmende Kohlenstoffschicht mit der löchrigen kohlenstoffbedeckten Seite eines gewaschenen und plasmagereinigten EM-Gitters zurück. Lassen Sie die Gitter an der Luft trocknen, bis sie auf einem TEM abgebildet werden. Idealerweise decken Sie die Gitter während des Trocknungsprozesses ab, um eine Kontamination durch die Luft zu vermeiden.
4. Anwendung des Stützschwimmerblocks zur Herstellung von Graphenoxid-beschichteten TEM-Gittern
- Waschen und plasmareinigte TEM-Gitter mit 300-Mesh-Loch-Carbon-Kupfergittern, wie oben beschrieben (Abschnitt 1).
- 10-12 μL GrOx-Suspension (siehe Abschnitt 2.2) werden in die 4 Nichtpufferaustauschtöpfe entlang des Flotationsblocks pipettiert. 10-12 μL ddH2O oder Reinstwasser in die restlichen 4 Pufferaustauschtöpfe des Blocks pipettieren.
HINWEIS: Diese Wassermenge sollte ausreichen, um einen leichten konvexen Meniskus zu bilden, der sich über die Höhe des Blocks erhebt. - Lassen Sie 4 Gitter vorsichtig für 1 Minute auf die GrOx-Suspension jedes Bohrlochs fallen, um sicherzustellen, dass die löchrige, mit Kohlenstoff bedeckte Seite mit der Lösung in Kontakt kommt. Nach 1 Minute erholen Sie jedes Gitter vorsichtig, indem Sie die Pinzette in die Pinzettenrille jedes Nicht-Pufferaustauschschachts schieben.
- Berühren Sie sehr sanft und kurz die kupferne, kohlenstofffreie Seite jedes Gitters mit dem ddH2O im angrenzenden Brunnen. Halten Sie dann vorsichtig und vorsichtig das Gitter mit der Wassertropfenseite nach unten gegen ein Blatt Filterpapier.
HINWEIS: Das Abtupfen des Wassers zieht die GrOx-Suspension durch Kapillarwirkung durch das Gitter. Es ist wichtig, das Eintauchen des Netzes in das ddH2O zu vermeiden, daher sollte der Kontakt sehr kurz sein. Wenn das Gitter angehoben wird, sollte ein Wassertropfen an der Unterseite des Gitters halten. Achten Sie darauf, das Gitter auf dem Filterpapier nicht zu bewegen, da dies das Absetzen der GrOx-Flocken stören könnte. - Lassen Sie die Gitter in der Pinzette bis zur Zubereitung mit Probe an der Luft trocknen. Idealerweise decken Sie die Gitter während des Trocknungsprozesses ab, um eine Kontamination durch die Luft zu vermeiden.
5. Anwendung des Stützschwimmerblocks zur Vorbereitung von Proben auf Monolayer-Graphen-Filmen
- Waschen Sie die TEM-Gitter wie oben beschrieben (Abschnitt 1), aber lassen Sie die Plasmareinigung aus.
HINWEIS: Hier wurden 300 Mesh Holey-Carbon-Goldgitter verwendet, aber auch andere Nicht-Kupfer-Gitter oder Kupferlegierungsgitter sind praktikabel. - Um Gitter mit Graphen abzuscheiden, wird direkt von Graphen, das auf Kupfersubstraten (Cu-Graphen) gezüchtet wurde, auf Kryo-EM-Gitter übertragen, wie zuvor beschrieben25.
- Legen Sie vier gewaschene Gitter auf eine Cu-Graphen-Platte (10 mm × 10 mm), die auf einem Glasobjektträger abgeschieden ist, und bedecken Sie jedes Gitter mit einem Tropfen Isopropanol (5-10 μL), um einen engen Kontakt zwischen dem Monolayer-Graphen und dem Gitter zu ermöglichen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die löchrige, mit Kohlenstoff bedeckte Seite der Gitter in Kontakt mit dem Graphenblatt bringen. - Wenn das Isopropanol vollständig verdampft ist (typischerweise 2 h), die Cu-Graphen-Platte mit Gittern auf 10% (w/v) FeCl3-Lösung (siehe Abschnitt 2.3) in einer Glas-Petrischale schwimmen lassen und über Nacht bei Raumtemperatur ätzen lassen. Decken Sie die Schüssel ab, um eine Kontamination durch die Luft zu vermeiden.
HINWEIS: Nach Abschluss des Ätzens bleibt nur die Graphen-Monoschicht auf der FeCl3-Lösung schwebend - dies sollte mit dem Auge bei geeigneter Beleuchtung sichtbar sein. - Verwenden Sie eine Schlaufe mit einem Durchmesser, der größer als die TEM-Gittergröße ist, um die auf der Graphen-Monoschicht schwimmenden Gitter zu fischen, und übertragen Sie sie vorsichtig in eine Glas-Petrischale, die ddH2O enthält, um sie zu waschen.
HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig beim Angeln der Gitter, um zu vermeiden, dass sie auf die Wände der Petrischale treffen, was zu Bruch oder Biegung des Graphenfilms führen kann. - Waschen Sie zwei weitere Male im Wasser, indem Sie Gitter fischen und in eine saubere Petrischale mit ddH2O geben, um alle Reste von FeCl3 zu entfernen. Schließlich werden die Gitter in eine Petrischale mit Probenpuffer überführt, bis die Probenvorbereitung vorbereitet und eingefroren wird.
HINWEIS: Die mit Graphen bedeckte Seite der Gitter muss jederzeit benetzt gehalten werden, um eine Exposition gegenüber Luftschadstoffen zu vermeiden.
- Legen Sie vier gewaschene Gitter auf eine Cu-Graphen-Platte (10 mm × 10 mm), die auf einem Glasobjektträger abgeschieden ist, und bedecken Sie jedes Gitter mit einem Tropfen Isopropanol (5-10 μL), um einen engen Kontakt zwischen dem Monolayer-Graphen und dem Gitter zu ermöglichen.
- Pipettieren Sie die Probe (10-12 μL) in eine Pufferaustauschmulde des Flotationsblocks. Wenn die Probe im Block fertig ist, wählen Sie mit einer sauberen Pinzette ein mit Graphen beschichtetes Gitter aus der Pufferlösung und legen Sie es auf die Oberfläche der probenhaltigen Vertiefung.
- Nach einer angemessenen Inkubationszeit (1-5 min je nach Probe; optimierung nach experimentellen Bedürfnissen) das Gitter mit einer sauberen Gefrierpinzette pflücken und mit dem Blottieren und Vitrifizieren fortfahren.
Representative Results
TEM-Gitter, die mit amorphen Kohlenstoffstützen hergestellt wurden, sind typischerweise über die gesamte Gitteroberfläche bedeckt. Obwohl der Bruch des Kohlenstofffilms in einigen Fällen zusammen mit einigen Rüschen auftritt (Abbildung 2A), ist eine große Anzahl von Gitterquadraten makellos und daher für negative Färbezwecke weithin anwendbar. Der Hauptfaktor, der die Integrität des Trägers beeinflusst, ist die Kohlenstoffdicke, die während der Kohlenstoffverdampfung bestimmt wird. In ähnlicher Weise wird mit diesem GrOx-Protokoll routinemäßig eine gute Abdeckung über das gesamte Netz erreicht (Abbildung 2B). Eine einmalige Anwendung der GrOx-Suspension für 1 min reicht aus, um wenige Bereiche mit mehreren Schichten zu gewährleisten, die aufgrund von Flockenkanten gut zu sehen sind. GrOx-Gitter können schnell aus Rohstoffen hergestellt werden und schützen die Probe in hohem Maße. Flockenkanten, unvollständige Abdeckung und Rüschen sind jedoch bei GrOx-Gittern aufgrund der Beschaffenheit der GrOx-Flocken häufiger sichtbar als bei den anderen Techniken.
Obwohl die Integrität des Graphenträgerfilms, wie der amorphe Kohlenstoff, vom Abscheidungsprozess abhängt, zeigen Bereiche, die gut abgedeckt sind, das charakteristische Beugungsmuster von einschichtigem Graphen. Wichtig ist, dass durch die Benetzung von Graphenträgerfolien Proben nach einer Inkubationszeit aus dem Floatationsblock gewonnen und Die Daten in einer für die Einzelpartikelanalyse geeigneten Weise gesammelt werden können. Diese Methode erfordert keine andere Behandlung des Graphens zur Benetzung, wodurch die Notwendigkeit teurer Geräte entfällt, um Graphen hydrophil zu machen, und es ist am besten, Stützfolien kurz vor der Probenvorbereitung und dem Einfrieren des Gitters herzustellen (Abbildung 2C).
Abbildung 1: Entwurf und Anwendung von Probenschwimmerblöcken während der Vorbereitung des Stützfilms. (A) Schematische Darstellung der Oberen, des Bohrlochs und der Seitenansichten des Schwimmblocks, einschließlich Messungen der Form, Tiefe und Neigung. Die Rille für Pinzettenspitzen zum Ausruhen sowie Kanäle zum Einführen von Nadeln sind angegeben. (B) Amorphe Kohlenstoffschichten können leicht auf die Oberfläche des Puffers geschwommen werden, der in den Vertiefungen des Schwimmblocks unter Verwendung der Rampe enthalten ist, d.h. während der Herstellung von negativ gefärbten TEM-Gittern. (C) Die Breite der Bohrlöcher ist für die Aufnahme eines TEM-Gitters geeignet, während die Pinzettenrillen die Notwendigkeit reduzieren, Gitter während der Vorbereitungsschritte unnötig freizugeben und aufzunehmen, bieten jedoch einen definierten Weg zur Rückgewinnung von Gittern ohne Biegegefahr, wenn Gitter freigesetzt werden. Bilder in B werden von 27 geändert. Abkürzung: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Typische Beispiele für Probenträgerfolien, die mit dem Floatationsblock hergestellt wurden. Gitterquadrat- (links) und Bildansichten (rechts) werden für (A) amorphen Kohlenstoff, (B) Graphenoxid und (C) Graphenunterstützungsfilme gezeigt, die mit dem Floatationsblock hergestellt wurden. Der amorphe Kohlenstoffträger wurde bei der Herstellung von 70S-Ribosomen für die negative Färbung verwendet, während die Graphenoxid- und Graphenträger bei der Herstellung von 70S-Ribosomen für Kryo-EM verwendet wurden. Bilder in A und C werden von 27 modifiziert. Maßstabsleiste für A-Rasterquadrat = 10 μm; Maßstabsbalken für B- und C-Gitterquadrate = 5 μm; Maßstabsbalken für A-C-Bildansichten = 50 nm. Abkürzung: Kryo-EM = Kryo-Elektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieser Beitrag stellt Protokolle für die Handhabung von amorphen Kohlenstoff- und Graphenfilmen für die Kryo-EM-Probenvorbereitung unter Verwendung eines Probenschwimmerationsblocks vor27. Eine STL-Datei für den Stützblock ist im öffentlichen Thingiverse-Repository [www.thingiverse.com/thing:3440684] frei verfügbar und kann mit jedem geeigneten Stereolithographie-Drucker aus einem geeigneten Harz in 3D gedruckt werden. Die Verwendung von Kohlenstofffolien, die ein TEM-Gitter bedecken, beinhaltet in der Regel die Kohlenabtriebsbewegung auf die Probe28. Dieser Ansatz zur Herstellung negativer Fleckengitter minimiert die Luftexposition während der Handhabung des Trägers und reduziert so die Kontamination und Proteindenaturierung. Die Herstellung von Gittern mit schwimmendem Kohlenstoff in kleinen Brunnen ist vorteilhaft für das Schwimmen einer größeren Oberfläche, d.h. in einem Wasserbad oder einer Petrischale, in diesem Fall erfolgt die mechanische Scherung des Kohlenstoffs viel leichter.
UAc kann aufgrund der aktuellen Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften zum Zeitpunkt der Veröffentlichung schwierig zu erwerben sein. Viele andere häufig verwendete, nicht radioaktive, negativ färbende Reagenzien sind verfügbar, und Protokolle für ihre Herstellung wurden bereits beschrieben29. Obwohl mit diesem Stütz-Floatationsblock keine alternativen Flecken verwendet wurden, ist es unwahrscheinlich, dass es außer der Optimierung der Inkubationszeit mit Der Probe (Schritt 3.5), die bereits von Natur aus probenabhängig ist, Unterschiede in diesen Protokollen geben würde. Der wichtigste Schritt in diesem GrOx-Support-Vorbereitungsprotokoll ist Schritt 4.4, der durch den Hinweis hervorgehoben wird, um zu verhindern, dass das Wasser und die GrOx-Lösung kontaktieren, um den Gitterrand herum. Eine unsachgemäße Vermischung des Wassers und der GrOx-Lösungen verhindert das unidirektionale Absetzen der GrOx-Flocken durch Kapillarwirkung. GrOx-Flocken auf beiden Seiten der Kohlenstofffolie führen zu dicken Schichten, wodurch die Vorteile der Verwendung von GrOx als nahezu einlagiger Träger sowie das Auffangen von Wasser zwischen den Flocken zunichte gemacht werden, was zu einer Kontamination der nutzbaren Bereiche mit zusätzlichen Eisschichten führt. Graphenoxid-Stützpräparation ist relativ einfach mit Hilfe von Lösungströpfchen auf flexiblem Polyolefinfilm zu erreichen. Wenn es jedoch auf diese Weise durchgeführt wird, ist es einfacher, die Kupferseite des Gitters versehentlich durch falsche Handhabungsfehler zu kontaminieren. Die Verwendung des Floatationsblocks verringert die Wahrscheinlichkeit dieser Eventualität.
Schließlich stellt dieses Papier ein Protokoll zur Vorbereitung von Graphen-bedeckten Gittern vor, das jede Art von Graphenvorbehandlung vermeidet, um es hydrophil zu machen, wodurch seine Kosten gesenkt und seine Zugänglichkeit erhöht werden. Die Aufrechterhaltung eines benetzten Films während der Probenvorbereitung und das Auftragen der Probe in situ im Block kurz vor dem Einfrieren reicht aus, um die Erzeugung geeigneter Eisschichten für Kryo-EM mit einer homogenen Probenverteilung zu ermöglichen. Insgesamt minimieren die hier vorgestellten Protokolle den Probenkontakt mit der Luft-Wasser-Grenzfläche, wodurch die Probendenaturierung reduziert und die Kontamination unterstützt wird. Für die drei trägerfilme, die in diesen Ansätzen verwendet werden, konnten homogene Probenverteilungen über die Gitter hinweg sowie die Abbildung intakter, gut erhaltener Einzelpartikel erreicht werden.
Disclosures
Den Autoren sind keine Interessenkonflikte in Bezug auf dieses Werk bekannt.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitgliedern der Sektion für Strukturelle und Synthetische Biologie am Imperial College London, die geholfen haben, diese Techniken zu testen, sowie Harry Barnett am Imperial College Advanced Hackspace und Paul Simpson am Centre for Structural Biology. CHSA wird durch ein Sir Henry Dale Fellowship unterstützt, das gemeinsam vom Wellcome Trust und der Royal Society (206212/Z/17/Z) finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
