Summary
Her presenterer vi en metode for å utvide perifert blod naturlig morder (PBNK), NK-celler fra levervev og kimær antigenreseptor (CAR) -NK-celler avledet fra perifere blodmononukleære celler (PBMC) eller ledningsblod (CB). Denne protokollen demonstrerer utvidelsen av NK- og CAR-NK-celler ved bruk av 221 mIL-21 materceller i tillegg til den optimaliserte renheten til utvidede NK-celler.
Abstract
Kimær antigenreseptor (CAR)-modifisert immuncelleterapi har blitt en fremvoksende behandling for kreft og smittsomme sykdommer. NK-basert immunterapi, spesielt CAR-NK-celle, er en av de mest lovende "hyllevare" -utviklingene uten alvorlig livstruende toksisitet. Flaskehalsen for å utvikle en vellykket CAR-NK-terapi er imidlertid å oppnå tilstrekkelig antall ikke-uttømmende, langlivede, "hyllevare" CAR-NK-celler fra en tredjepart. Her utviklet vi en ny CAR-NK ekspansjonsmetode ved hjelp av en Epstein-Barr virus- (EBV) transformert B-cellelinje som uttrykker en genmodifisert membranform av interleukin-21 (IL-21). I denne protokollen er trinnvise prosedyrer gitt for å utvide NK- og CAR-NK-celler fra navlestrengsblod og perifert blod, samt fast organvev. Dette arbeidet vil forbedre den kliniske utviklingen av CAR-NK immunterapi betydelig.
Introduction
Natural killer (NK) celler er en viktig delmengde av lymfocytter som uttrykker CD56 og mangler uttrykk for T-cellemarkøren, CD3 1,2. Konvensjonelle NK-celler er klassifisert som medfødte immunceller som er ansvarlige for immunovervåkning av virusinfiserte celler og kreftceller. I motsetning til T-celler gjenkjenner NK-celler infiserte eller ondartede celler ved bruk av CD16 eller andre aktiverende reseptorer og krever ikke dannelse av et kompleks mellom antigenpeptider og store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I-molekyler 3,4. Nylige kliniske undersøkelser ved bruk av kimær antigenreseptor (CAR) -NK-celler for å behandle tilbakefall eller ildfast CD19-positiv kreft (ikke-Hodgkins lymfom eller kronisk lymfatisk leukemi [KLL]) viste de fremragende sikkerhetsfordelene ved CAR-NK-celler5. For eksempel er CAR-NK-celleinfusjon assosiert med minimal eller ubetydelig transplantat versus vertssykdom (GVHD), nevrotoksisitet, kardiotoksisitet og cytokinfrigjøringssyndrom (CRS) 6,7,8,9,10. Konvensjonelle metoder for å utvide humane NK-celler viste imidlertid uttømmende fenotyper med sterk fratricidal killing og telomermangel, noe som gir en stor utfordring for å oppnå et tilstrekkelig antall funksjonelle NK-celler for adoptiv immunterapi11.
For å overvinne disse utfordringene ble det utviklet en metode for å utvide primære NK-celler direkte fra ufraksjonerte mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) eller ledningsblod (CB) ved hjelp av en bestrålt og genetisk konstruert 721.221 (heretter 221) cellelinje, en human B-lymfoblastoid cellelinje med lavt uttrykk for MHC klasse I-molekyler3. Tidligere studier viste betydningen av IL-21 i NK-celleutvidelse; Derfor ble en genetisk konstruert membranbundet IL-21 som uttrykker en versjon av 721.221-cellelinjen (starter nå, 221-mIL-21) utviklet 11,12,13,14,15. Resultatene viste at 221-mIL-21 feeder-celle-ekspanderte primære NK-celler ble utvidet til et gjennomsnitt på >40 000 ganger med vedvarende høy NK-cellerenhet i ca. 2-3 uker. Ytterligere informasjon om anvendelsen av denne protokollen finnes i Yang et al.16.
Denne protokollen tar sikte på å demonstrere trinn-for-trinn-prosedyren for den nye utvidelsen av PBNK-, CBNK-, vevsavledede NK- og CAR-NK-celler ex vivo.
Protocol
Menneskelig vev og blodrelatert arbeid i denne protokollen følger retningslinjene fra Rutgers University Institutional Review Board (IRB)
1. NK-celleutvidelse fra levervev (dag 0), som vist i figur 1.
MERK: Innledende cellenummer og levedyktighet er sterkt korrelert med tiden siden organfjerning og den første vevsprøvemengden. Men hvis vev plasseres i 30 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og oppbevares på is eller i kjøleskapet ved 4 °C over natten, kan NK-celler fortsatt utvides ved høy renhet og levedyktighet opptil 24 timer senere.
- Identifiser levedyktige vevsområder for å oppnå lymfocytter fra vev og seksjoner ved hjelp av sterilt kirurgisk utstyr.
- Plasser vev i 30 ml HBSS (uten kalsium eller magnesium) og hold på is til du er klar til å forberede deg på isolasjon.
- Hakk vevet i <0,5 cm terninger ved hjelp av sterile barberblader eller saks og tang inne i et biosikkerhetsskap.
- Forbered en 1x kollagenase IV-løsning (1 mg / ml) ved å fortynne en 10x lager i HBSS (10x kollagenase IV: 10 mg / ml eller ~ 200 U / ml).
- Plasser de hakkede vevsbitene i vevsdissosiatorrørene. Fyll rørene med ikke mer enn 4 g vev og senk vevsbitene i ~ 10 ml 1x kollagenase IV.
MERK: Bruk av DNase I anbefales ikke, da det kan redusere NK levedyktighet og utbytte litt. Vennligst referer til materialtabellen for de spesifikke vevsdissosiatorrørene som brukes. - Plasser vevsdissosiatorrørene i en vevsdissosiator og bland ved 37 °C for å hakke vevet grundig.
MERK: For levervev kan dette ta over 30 minutter. For mer sprøtt vev kan rundt 15 minutter være tilstrekkelig. Vennligst referer til materialtabellen for spesifikke vevsdissosiatorrør og vevsdissosiatoren som brukes. - Fjern vevsdissosiatorrørene og triturere gjennom 40 μm nyloncellesil ved hjelp av baksiden av en 5 ml sprøyte. Samle eluenten og kast de store ufordøyd fragmentene.
- Spinn ned eluenten ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepellets i 30% polyvinylpyrrolidon (PVP) -belagt silika for å fjerne fettceller som ellers vil forurense den endelige lymfocyttfraksjonen.
- For å forberede 1x PVP-belagt silika, bruk 9: 1 fortynning av PVP-belagt silika i 10x PBS.
MERK: Se materialtabellen for den spesifikke PVP-belagte silikaen som brukes. - For å forberede 30% PVP-belagt silika, fortynn 1x PVP-belagt silika med PBS / HBSS.
- For å forberede 1x PVP-belagt silika, bruk 9: 1 fortynning av PVP-belagt silika i 10x PBS.
- Spinn ned cellepelleten ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepelleten i 9 ml R-10 media.
MERK: Se materialtabellen for sammensetningen av R-10-medier - Legg cellesuspensjonen forsiktig over 4 ml Ficoll eller lymfocyttseparasjonsmedier for å skille lymfocytter fra røde blodlegemer og polymorfonukleære celler.
- Skill lagene ved sentrifugering ved 400 x g i 23 minutter ved romtemperatur med akselerasjon og bremser av eller ved laveste innstilling. Dekanter forsiktig det øvre mediumlaget og høst interfasen som inneholder vevsinfiltrerende lymfocytter.
- Skyll cellene med 10 ml media og fortsett til celletelling, flowcytometri, aliquoting og frysing av celler, eller primær NK-ekspansjonsprotokoll.
2. Primær NK-celleutvidelse fra PBMCs (eller CB eller organvev) (dag 0), som vist i figur 2.
- Tine den frosne PBMC og de frosne, bestrålte matercellene i et 37 °C vannbad.
- Vask PBMC og 100 Gamma-bestrålte (Gy-bestrålt) 221 mIL-21 celler ved sentrifugering ved 400 x g i 5 minutter med 10 ml R-10 media separat.
- Lagre 1 x 106 celler PBMC for flowcytometri.
MERK: Den opprinnelige NK-cellerenheten er en viktig faktor for beregning av NK-celleutvidelseshastigheten. - Resuspend cellene i 1 ml R-10 media. Tell cellene ved hjelp av Trypan Blue.
- Bland 5x 10 6 celler av PBMC med 10 x 10 6 celler med 100 Gy-bestrålte 221-mIL-21 celler i en spesiell6-brønns plate (se Materialtabell).
- Tilsett 30 ml R-10-medier supplert med human IL-2 (200 U/ml) og human IL-15 (5 ng/ml) (se materialtabell).
- Inkuber den spesielle 6-brønnsplaten ved 37 °C med 5 % CO2.
- Erstatt mediet med R-10-medier supplert med humant IL-2 (200 U/ml) og humant IL-15 (5 ng/ml) for å opprettholde NK-celler hver 3.-4.
MERK: Oppretthold mindre enn 20 x 106 celler per brønn for ytterligere utvidelse ved hvert mediebytte. For best levedyktighet, sørg for at det totale celletallet i hver brønn ikke overstiger 100 x 106 celler. - Registrer totalt celletall, levedyktighet og utfør flowcytometri hver 3-4 dag for å beregne NK-celleutvidelseshastigheten.
3. Vedlegg av 293T-celler (dag 2), som vist i figur 2.
- Del 1,8 x 106 293T-celler i 11 ml D-10-medier per behandlet 100 mm plate.
MERK: Se materialtabellen for sammensetningen av D-10-medier - Inkuber 293T-celler ved 37 °C med 5 % CO2.
4. Retrovirus transfeksjon (dag 3)
- I et 1,7 ml rør blandes 470 μL reduserte serummedier med 30 μL transfeksjonsreagens.
MERK: Se materialtabellen for spesifikke reduserte serummedier og transfeksjonsreagens som brukes. - I et separat 1,7 ml rør, tilsett 2,5 μg pRDF-plasmid, 3,75 μg Pegpam3-plasmid og 2,5 μg CAR-konstruksjon i SFG-vektor i det reduserte serummediet slik at det endelige volumet er 500 μL.
- Bland løsningene i trinn 4.1 og 4.2 dråpevis.
- Inkuber røret ved romtemperatur i 15 minutter.
- Tilsett 1 ml av blandingen fra trinn 4.4 til 293T celleplate på dag 1 på en dråpevis måte.
- Inkuber platen(e) ved 37 °C med 5 % CO2 i 48-72 timer.
5. Retronectin platebelegg (dag 3)
- Fortynn retronektinprotein med fosfatbufret saltvann (PBS) til en endelig konsentrasjon på 50-100 μg / ml.
- Tilsett 500 μL av det fortynnede retronectin i hver brønn på en ubehandlet 24-brønns plate (5 brønner per CAR-konstruksjon). Forsegl platen med parafilm og inkuber platen ved 4 °C over natten.
6. Transduksjon (dag 4)
- Sentrifuge retronectinplaten ved 2103 x g i 30 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Blokker hver brønn på 24-brønnsplaten med 1 ml R-10 medium.
- Inkuber platen ved 37 °C med 5 % CO2 i 1 time.
- Forvarm sentrifugen til 32 °C mens retronectinplaten blokkeres.
- Samle retrovirus supernatant ved å filtrere de transfiserte 293T-cellene ved hjelp av et 0,45 μm filter.
- Aliquot 2 ml av filtrert retrovirus supernatant i hver brønn.
- Sentrifuge platen med 24 brønner ved 2103 x g i 2 timer ved 32 °C.
- Under platesentrifugering, samle de utvidede PBNK-cellene fra dag 0 og telle cellene ved hjelp av Trypan Blue.
MERK: Fortsett å utvide PBNK-celler ved å legge til R-10-medier supplert med IL-2 (200 U/ml) og IL-15 (5 ng/ml). - Fortynn de utvidede PBNK-cellene med R-10-medier supplert med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml) til 2,5 x 10 5-5 x 105 celler / ml (0,5 x 106-1 x 106 celler per brønn).
MERK: Registrer totalt cellenummer, levedyktighet, og lagre 5 x 105 utvidede PBNK-celler for flowcytometri, da disse verdiene er viktige for å bestemme NK-celleutvidelseshastigheten. - Etter sentrifugering, aspirer delvis retrovirus supernatanten fra hver brønn.
MERK: Ikke aspirer helt, det vil si la ca. 100 μL retrovirus supernatant per brønn, da dette vil redusere transduksjonseffektiviteten. - Aliquot 2 ml av de fortynnede utvidede PBNK-cellene fra trinn 6,8 til hver brønn.
- Sentrifuge platen ved 600 x g i 10 min ved 32 °C. Inkuber platen ved 37 °C med 5 % CO2 i 48-72 timer.
MERK: Ikke isoler platen i parafilm.
7. CAR-NK celler samling (dag 6 eller 7), som vist i figur 2.
- Samle cellene forsiktig fra 24-brønnsplaten og overfør cellene til et 50 ml sentrifugerrør
MERK: Prøv å ikke generere bobler, da dette vil resultere i en reduksjon i cellens levedyktighet. - Sentrifuge røret ved 400 x g i 5 minutter.
- Resuspend pelleten med 1 ml R-10 media og telle cellene ved hjelp av Trypan Blue.
MERK: Spar 5 x 105 celler for flowcytometri for å bestemme transduksjonseffektiviteten. - Overfør de resuspenderte cellene til en spesiell 6-brønnsplate som inneholder 30 ml R-10-medier supplert med IL-2 (200 U/ml) og IL-15 (5 ng/ml).
- Inkuber den spesielle 6-brønnsplaten ved 37 °C med 5 % CO2.
- Bytt ut R-10-medier supplert med IL-2 (200 U / ml) og IL-15 (5 ng / ml) for å opprettholde NK-celler hver 3. - 4. dag.
MERK: Oppretthold mindre enn 20 x 106 celler per brønn for ytterligere utvidelse ved hver endring. For best levedyktighet, sørg for at det totale celletallet i hver brønn ikke overstiger 100 x 106 celler. - Registrer totalt celletall, levedyktighet, og utfør flowcytometri hver 3-4 dag for å beregne NK-celleutvidelseshastigheten.
- Bruk cellene til passende in vitro eller in vivo analyser.
MERK: Ex vivo utvidet PBNK, og CAR-NK-celler kan dyrkes i en 37 ° C inkubator i ca. 4 uker. - Undersøk NK-cellenummer og renhet på dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 og dag 21 ved flowcytometri.
Representative Results
En skjematisk arbeidsflyt for vevsinfiltrerende NK-celleisolasjon og PBNK-celleutvidelse ved bruk av 221-mIL-21-matercellemetodikken er vist i figur 1 og figur 2. Utvidede PBNK-celler ble samlet hver 3. eller 4. dag for flowcytometri for å bestemme NK-cellerenheten ved å farge celler med anti-human CD56 og anti-human CD3. Forsøket ble gjentatt med to forskjellige donorer for å vise reproduserbarheten av ekspansjonssystemet (figur 3). PBNK-celler utvidet med 221 mIL-21 ble vist å utvide nesten 5 × 104 ganger (figur 3A). Videre var NK-cellerenheten høyt vedlikeholdt, rundt 85% gjennom hele 21-dagers ekspansjonen (figur 3B). Ved hjelp av 221-mIL-21 matercelleutvidelsessystemet varierte NK-cellerenheten konsekvent mellom 85% -95%, uavhengig av giverne (data ikke vist). For å demonstrere robustheten til ekspansjonssystemet 221-mIL-21, ble PBMC-er farget for anti-CD56 og anti-CD3 før utvidelsen, som viste en cellerenhet på 7,09% for NK-celler og en høy prosentandel av T-celler (figur 4A). PBMCs ble cocultured med 221-mIL-21 for å utvide NK-celler; NK-renheten ble kontrollert før CAR-NK-transduksjon på dag 4 (figur 4A). CAR-NK-celler ble samlet og farget for anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG (H + L) F (ab') 2, som viste en høy NK-cellepopulasjon (86,9 % på dag 7) og en høy CAR-transduksjonseffektivitet på ca. 70% (figur 4). Høyere transduksjonseffektivitet (opptil 95 %) ble også observert ved bruk av retroviruspakkesystemet. Til sammen viser disse dataene at 221-mIL-21-matercellene med hell kunne utvide NK-celler og bevare NK-cellerenheten ex vivo.
Figur 1: Diagram over NK-celleutvidelse fra faste humane organprøver. Kort fortalt blir de oppnådde humane leverprøvene hakket i små terninger for mekanisk fordøyelse. Dissosierte celler isoleres deretter ved hjelp av PVP-belagt silika og lymfocyttseparasjonsmedier. Videre utvides NK-cellene ved hjelp av ekspansjonsprotokollen beskrevet i figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk arbeidsflyt for CAR-NK-cellegenerering fra PBMCs. Kort fortalt ble 221 mIL21 materceller bestrålt ved 100 Gy før coculturing med PBMC supplert med IL-2 og IL-15 på dag 0. Parallelt ble 293T-celler transfisert med retrovirusemballasjesystemet for å produsere CAR-retrovirus som deretter ble transdusert til de utvidede PBNK-cellene i nærvær av IL-2 og IL-15. Primære CAR-NK-celler ble høstet på dag 7 og fortsatte ekspansjon i 21 dager. Dette tallet er modifisert fra Yang et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dynamisk tidsforløpt utvidelse av PBNK-celler. (A) Fold utvidelse av PBNK i løpet av et 22- dagers kurs. Cellene ble farget med anti-CD56 og anti-CD3 på indikerte dager for flowcytometri. Det totale antallet NK-celler ble bestemt ved å multiplisere NK-cellerenhet til det totale antall celler. Ekspansjonshastigheten ble generert som følger: (Antall NK-celler)Tn/(Antall NK-celler)T0, hvor Antall NK-celler = (prosentandel av NK-cellerenhet) × (totalt antall celler), T 0 er antall NK-celler på tidspunkt dag0, og Tn er antall NK-celler på tidspunkt dag n. (B) NK-cellerenhet i løpet av et 22-dagers kurs. NK-celleutvidelsen ble gjentatt to ganger med to forskjellige donorer. Feilfelt representerer ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ flowcytometrisk analyse av CAR-NK-celler. (A) Representative punktplott som viser den dynamiske time-lapse av NK-cellerenheten til CAR-NK-cellene i løpet av et 18-dagers kurs. Flowcytometrianalysen ble vurdert ved å farge cellene med anti-CD56 og anti-CD3 ved angitte tidspunkter. Dag 0 indikerer pre-utvidelse av PBNK. Dag 4 indikerer etter utvidelse av PBNK og pre-transduksjon av CAR-NK-celler. Dag 7 indikerer posttransduksjon av CAR-NK-celler. (B) Representative punktplott som viser transduksjonseffektiviteten til CAR-NK-celler ved bruk av retroviruspakkesystemet. Cellene ble farget med anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG(H+L) F(ab')2 for flowcytometri. (C) Representative punktplott som viser CAR-uttrykket i forskjellige delmengder, inkludert CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ og CD56-CD3- på dag 18. Cellene ble farget med anti-CD56, anti-CD3 og anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (indikerer CAR-uttrykk) for flowcytometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
De fleste av de nåværende CAR-NK-produktene i kliniske studier bruker NK-cellelinjer 17, for eksempel NK-92, en cellelinje isolert fra en ikke-Hodgkins lymfompasient18, NK-92MI, IL-2 uavhengig NK-92 cellelinje19 og NKL, isolert fra en stor granulær lymfocyttpasient20, da disse cellelinjene lett sprer seg for "hyllevare" -produkter. Imidlertid har disse cellelinjene, f.eks. NK-92-celler, marginal klinisk effekt og in vivo-ekspansjon, da de krever bestråling før infusjon, og dermed begrenser deres proliferasjon og cytotoksisitet in vivo21. Gitt disse grunnene, blir ulike strategier for tiden utforsket for å utvide primære NK-celler fra flere kilder, inkludert perifert blod, CB, benmarg (BM), humane embryonale stamceller (HSC), induserte pluripotente stamceller (iPSCs) og tumorvev21,22,23. For eksempel kan NK-celler utvides ex vivo ved hjelp av interleukiner, inkludert IL-15, IL-18 og IL-21. Lymfoblastoide cellelinjer som K562-celler eller Epstein-Barr-virus-transformerte lymfoblastoidcellelinjer som 721.221-celler, brukes også til NK-celleutvidelse16. Imidlertid genererer de nevnte strategiene ofte utilstrekkelig antall NK-celler for en adoptivoverføring av CAR-NK immunterapi22,24. For å bidra til å løse problemet viser studien her en protokoll for en ex vivo NK-celleutvidelse ved hjelp av en genetisk modifisert EBV-transformert cellelinje, 221-mIL-21 materceller.
Ekspansjonsmetoden ved bruk av 221 mIL-21 materceller vist i denne protokollen er optimalisert for å utvide NK-celler med en ekspansjonshastighet på minst 10 til 100 ganger høyere enn andre leukemicellelinjer, inkludert HL-60 og OCl-AML3 som uttrykker membran IL-21, K562 og K652-mIL21 som uttrykker OX40 ligand22,24,25. CAR-uttrykket evalueres også i ca. 2 uker ex vivo. Mer signifikant kan 221-mIL-21 feedercelleutvidelsesstrategien brukes til å utvide NK-celler fra forskjellige kilder, inkludert PBMCs, CB og faste organer som leveren, uten et innledende NK-anrikningstrinn. Selv om matersystemet 221-mIL-21 ikke er like donoravhengig som de nevnte matercellelinjene, er det ikke helt uavhengig av donorer. I gjennomsnitt kan ekspansjonssystemet 221 mIL-21 oppnå 90 % av NK-cellerenheten med et høyt NK-celletall, med ca. <5 % av T-cellekontaminering på dag 14 etter utvidelse. Derfor, for å eliminere mulighetene for T-cellekontaminering, er det nødvendig å isolere NK-celler fra oppnådde prøver før ex vivo-utvidelsen eller bruke et CD3 + seleksjonssystem for å eliminere T-celler etter en ex vivo-utvidelse.
En av kritikkene ved bruk av et NK-celleutvidelsessystem er at matercellene kanskje ikke har blitt fullstendig utryddet etter utvidelsen eller før en transfusjon, noe som kan ha betydelige regulatoriske bekymringer; Derfor er fullstendig utryddelse av materceller før en transfusjon avgjørende. Nylige kliniske CAR-NK-studier der K562-mIL21-4-1BBL-materceller ble brukt til ex vivo CBNK-celleutvidelse24,25 viste imidlertid ingen angående komplikasjoner. Videre viste våre foreløpige data en gradvis reduksjon av den bestrålte 221-mIL-21-populasjonen etter hvert som ekspansjonen utviklet seg (data ikke vist). Imidlertid er det nødvendig med mer omfattende studier for at denne ekspansjonsmetoden skal implementeres i en klinisk setting. Samlet bidrar ekspansjonssystemet 221-mIL-21 til å løse utfordringen med å utvide primære CAR-NK-celler, og vil derfor bidra betydelig til bredere bruk av CAR-NK-cellebasert immunterapi i nær fremtid.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmene av Liu-laboratoriet (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang og Dr. Chih-Hsiung Chen) for deres kommentarer til manuskriptene. Vi vil gjerne takke Dr. Gianpietro Dotti for SFG-vektorene og Dr. Eric Long for 721.221-cellene. Dette arbeidet ble delvis støttet fra HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) og Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH-programmet), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti og R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) og Rutgers University-New Jersey Medical School Startup-finansiering for D. Liu Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A.
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
