Summary
Här presenterar vi en metod för att expandera perifert blod naturligt dödare (PBNK), NK-celler från levervävnader och chimär antigenreceptor (CAR) -NK-celler härledda från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) eller navelsträngsblod (CB). Detta protokoll visar expansionen av NK- och CAR-NK-celler med användning av 221-mIL-21-matarceller utöver den optimerade renheten hos expanderade NK-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR)-modifierad immuncellterapi har blivit en framväxande behandling för cancer och infektionssjukdomar. NK-baserad immunterapi, särskilt CAR-NK-cell, är en av de mest lovande "off-the-shelf" -utvecklingen utan allvarlig livshotande toxicitet. Flaskhalsen för att utveckla en framgångsrik CAR-NK-terapi är dock att uppnå tillräckligt många icke-uttömmande, långlivade, "off-the-shelf" CAR-NK-celler från en tredje part. Här utvecklade vi en ny CAR-NK-expansionsmetod med hjälp av en Epstein-Barr-virus- (EBV) transformerad B-cellinje som uttrycker en genetiskt modifierad membranform av interleukin-21 (IL-21). I detta protokoll tillhandahålls steg-för-steg-procedurer för att expandera NK- och CAR-NK-celler från navelsträngsblod och perifert blod samt fasta organvävnader. Detta arbete kommer att avsevärt förbättra den kliniska utvecklingen av CAR-NK immunterapi.
Introduction
Naturliga mördarceller (NK) är en viktig delmängd av lymfocyter som uttrycker CD56 och saknar uttryck av T-cellmarkören, CD3 1,2. Konventionella NK-celler klassificeras som medfödda immunceller som ansvarar för immunövervakning av virusinfekterade celler och cancerceller. Till skillnad från T-celler känner NK-celler igen infekterade eller maligna celler med hjälp av CD16 eller andra aktiverande receptorer och kräver inte bildandet av ett komplex mellan antigenpeptider och större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I-molekyler 3,4. Nyligen genomförda kliniska undersökningar med chimära antigenreceptorer (CAR) -NK-celler för att behandla återfall eller eldfasta CD19-positiva cancerformer (icke-Hodgkins lymfom eller kronisk lymfatisk leukemi [KLL])visade de enastående säkerhetsfördelarna med CAR-NK-celler5. Till exempel är CAR-NK-cellinfusion associerad med minimal eller försumbar transplantat kontra värdsjukdom (GVHD), neurotoxicitet, kardiotoxicitet och cytokinfrisättningssyndrom (CRS)6,7,8,9,10. Konventionella metoder för att expandera mänskliga NK-celler visade dock uttömmande fenotyper med stark fratricidal dödande och telomerbrist, vilket utgör en stor utmaning för att få ett tillräckligt antal funktionella NK-celler för adoptiv immunterapi11.
För att övervinna dessa utmaningar utvecklades en metod för att expandera primära NK-celler direkt från ofraktionerade mononukleära celler i perifert blod (PBMC) eller navelsträngsblod (CB) med hjälp av en bestrålad och genetiskt konstruerad 721.221 (nedan kallad 221) cellinje, en human B-lymfoblastoid cellinje med lågt uttryck av MHC klass I-molekyler3. Tidigare studier visade betydelsen av IL-21 i NK-cellexpansion; därför utvecklades en genetiskt konstruerad membranbunden IL-21 som uttrycker en version av 721.221-cellinjen (från och med nu, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15. Resultaten visade att 221-mIL-21 matarcellexpanderade primära NK-celler expanderades till i genomsnitt >40 000-faldigt med ihållande hög NK-cellrenhet i cirka 2-3 veckor. Ytterligare information om tillämpningen av detta protokoll finns i Yang et al.16.
Detta protokoll syftar till att demonstrera steg-för-steg-proceduren för den nya expansionen av PBNK-, CBNK-, vävnadsderiverade NK och CAR-NK-celler ex vivo.
Protocol
Mänskliga vävnader och blodrelaterat arbete i detta protokoll följer riktlinjerna från Rutgers University Institutional Review Board (IRB)
1. NK-cellutvidgning från levervävnader (dag 0), som visas i figur 1.
OBS: Initialt cellantal och viabilitet är starkt korrelerade med tiden sedan organavlägsnande och den ursprungliga vävnadsprovmängden. Men om vävnader placeras i 30 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) och förvaras på is eller i kylen vid 4 ° C över natten, kan NK-celler fortfarande expanderas med hög renhet och livskraft upp till 24 timmar senare.
- Identifiera livskraftiga vävnadsområden för att erhålla lymfocyter från vävnader och sektioner med hjälp av steril kirurgisk utrustning.
- Placera vävnaderna i 30 ml HBSS (med kalcium eller magnesium) och håll dem på is tills de är redo att förbereda sig för isolering.
- Hacka vävnaden i <0,5 cm kuber med sterila rakblad eller saxar och pincett inuti ett biosäkerhetsskåp.
- Bered en 1x kollagenas IV-lösning (1 mg / ml) genom att späda en 10x stam i HBSS (10x kollagenas IV: 10 mg / ml eller ~ 200 U / ml).
- Placera de malet vävnadsbitarna i vävnadsdissociatorrören. Fyll rören med högst 4 g vävnad och sänk ner vävnadsbitarna i ~ 10 ml 1x kollagenas IV.
OBS: Användning av DNase I rekommenderas inte eftersom det kan minska NK-livskraften och avkastningen något. Se materialförteckningen för de specifika vävnadsdissociatorrör som används. - Placera vävnadsdissociatorrören i en vävnadsdissociator och blanda vid 37 °C för att hacka vävnaden ordentligt.
OBS: För levervävnad kan detta ta över 30 minuter. För mer spröd vävnad kan det räcka med cirka 15 minuter. Se materialförteckningen för specifika vävnadsdissociatorrör och den vävnadsdissociator som används. - Ta bort vävnadsdissociatorrören och triturera genom 40 μm nyloncellsil med baksidan av en 5 ml spruta. Samla elueringsmedlet och kassera de stora osmälta fragmenten.
- Snurra ner elueringsmedlet vid 400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelletsen i 30% polyvinylpyrrolidon (PVP) -belagd kiseldioxid för att avlägsna fettceller som annars kommer att förorena den slutliga lymfocytfraktionen.
- För att bereda 1x PVP-belagd kiseldioxid, använd 9:1 spädning av PVP-belagd kiseldioxid i 10x PBS.
OBS: Se materialförteckningen för den specifika PVP-belagda kiseldioxid som används. - För att bereda 30% PVP-belagd kiseldioxid, späd 1x PVP-belagd kiseldioxid med PBS / HBSS.
- För att bereda 1x PVP-belagd kiseldioxid, använd 9:1 spädning av PVP-belagd kiseldioxid i 10x PBS.
- Snurra ner cellpelleten vid 400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 9 ml R-10-media.
OBS: Se materialförteckningen för sammansättningen av R-10-media - Lägg försiktigt cellsuspensionen över 4 ml Ficoll- eller lymfocytseparationsmedier för att separera lymfocyter från röda blodkroppar och polymorfonukleära celler.
- Separera skikten genom centrifugering vid 400 x g i 23 min vid rumstemperatur med accelerationen och bromsarna avstängda eller vid den lägsta inställningen. Dekantera försiktigt det övre mellanskiktet och skörda de interfasinnehållande vävnadsinfiltrerande lymfocyterna.
- Skölj cellerna med 10 ml media och fortsätt till cellräkning, flödescytometri, alikvotering och frysning av celler eller primärt NK-expansionsprotokoll.
2. Primär NK-cellexpansion från PBMC (eller CB eller organvävnader) (dag 0), som visas i figur 2.
- Tina den frysta PBMC och de frysta, bestrålade matarcellerna i ett 37 °C vattenbad.
- Tvätta PBMC- och 100 gammabestrålade (Gy-bestrålade) 221-mIL-21-cellerna genom centrifugering vid 400 x g i 5 min med 10 ml R-10-media separat.
- Spara 1 x 106 celler av PBMC för flödescytometri.
OBS: Den initiala NK-cellrenheten är en viktig faktor vid beräkning av NK-cellutvidgningshastighet. - Återsuspendera cellerna i 1 ml R-10-media. Räkna cellerna med Trypan Blue.
- Blanda 5x 10 6 celler PBMC med 10 x 106 celler med 100 Gy-bestrålade 221-mIL-21-celler i en speciell 6-brunnsplatta (se Materialtabell).
- Tillsätt 30 ml R-10-media kompletterat med humant IL-2 (200 U/ml) och humant IL-15 (5 ng/ml) (se materialtabell).
- Inkubera den speciella 6-brunnsplattan vid 37 °C med 5%CO2.
- Byt ut mediet mot R-10-media kompletterat med humant IL-2 (200 U / ml) och humant IL-15 (5 ng / ml) för att upprätthålla NK-celler var 3-4: e dag.
OBS: Behåll mindre än 20 x 106 celler per brunn för ytterligare expansion vid varje mediebyte. För bästa livskraft, se till att det totala cellantalet i varje brunn inte överstiger 100 x 106 celler. - Registrera det totala cellantalet, livskraften och utför flödescytometri var 3-4: e dag för att beräkna NK-cellutvidgningshastigheten.
3. Fastsättning av 293T-celler (dag 2), som visas i figur 2.
- Dela 1,8 x 106 293T-celler i 11 ml D-10-media per behandlad 100 mm platta.
OBS: Se materialförteckningen för sammansättningen av D-10-media - Inkubera 293T-celler vid 37 °C med 5 %CO2.
4. Retrovirustransfektion (dag 3)
- Blanda 470 μl reducerat serummedium i ett 1,7 ml rör med 30 μl transfektionsreagens.
OBS: Se materialförteckningen för det specifika reducerade serummediet och transfektionsreagenset som används. - I ett separat 1,7 ml rör, tillsätt 2,5 μg pRDF-plasmid, 3,75 μg Pegpam3-plasmid och 2,5 μg CAR-konstruktion i SFG-vektor i det reducerade serummediet så att den slutliga volymen är 500 μL.
- Blanda lösningarna i steg 4.1 och 4.2 droppvis.
- Inkubera röret vid rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 1 ml av blandningen från steg 4.4 till 293T cellplatta på dag 1 på ett droppvis sätt.
- Inkubera plattan/plattorna vid 37 °C med 5 % CO2 i 48–72 timmar.
5. Retronektinplåtbeläggning (dag 3)
- Späd retronektinprotein med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 50-100 μg/ml.
- Tillsätt 500 μl av det utspädda retronektinet i varje brunn på en obehandlad 24-brunnsplatta (5 brunnar per CAR-konstruktion). Försegla plattan med parafilm och inkubera plattan vid 4 °C över natten.
6. Transduktion (dag 4)
- Centrifugera retrolektinplattan vid 2103 x g i 30 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Blockera varje brunn på 24-brunnsplattan med 1 ml R-10-medium.
- Inkubera plattan vid 37 °C med 5 %CO2 i 1 timme.
- Förvärm centrifugen till 32 °C medan retrolektinplattan blockeras.
- Samla retrovirussupernatanten genom att filtrera de transfekterade 293T-cellerna med ett 0,45 μm-filter.
- Alikvot 2 ml av den filtrerade retrovirussupernatanten i varje brunn.
- Centrifugera 24-brunnsplattan vid 2103 x g i 2 timmar vid 32 °C.
- Under plattcentrifugering, samla de expanderade PBNK-cellerna från dag 0 och räkna cellerna med Trypan Blue.
OBS: Fortsätt att expandera PBNK-celler genom att lägga till R-10-media kompletterat med IL-2 (200 U / ml) och IL-15 (5 ng / ml). - Späd de expanderade PBNK-cellerna med R-10-media kompletterat med IL-2 (200 U / ml) och IL-15 (5 ng / ml) till 2,5 x 10 5-5 x 10 5 celler / ml (0,5 x 10 6-1 x 106 celler per brunn).
OBS: Registrera det totala cellantalet, livskraften och spara 5 x 105 expanderade PBNK-celler för flödescytometri eftersom dessa värden är viktiga för att bestämma NK-cellutvidgningshastigheten. - Efter centrifugering, aspirera delvis retrovirus supernatanten från varje brunn.
OBS: Aspirera inte helt, dvs lämna cirka 100 μL retrovirus supernatant per brunn, eftersom detta kommer att minska transduktionseffektiviteten. - Alikvot 2 ml av de utspädda expanderade PBNK-cellerna från steg 6.8 till varje brunn.
- Centrifugera plattan vid 600 x g i 10 minuter vid 32 °C. Inkubera plattan vid 37 °C med 5 % CO2 i 48–72 timmar.
OBS: Parafilma inte plattan.
7. Insamling av CAR-NK-celler (dag 6 eller 7), som visas i figur 2.
- Samla försiktigt upp cellerna från 24-brunnsplattan och överför cellerna till ett 50 ml centrifugrör
OBS: Försök att inte generera bubblor, eftersom detta kommer att resultera i en minskning av cellviabiliteten. - Centrifugera röret vid 400 x g i 5 minuter.
- Återsuspendera pelleten med 1 ml R-10-media och räkna cellerna med Trypan Blue.
OBS: Spara 5 x 105 celler för flödescytometri för att bestämma transduktionseffektiviteten. - Överför de återsuspenderade cellerna till en speciell 6-brunnsplatta innehållande 30 ml R-10-media kompletterat med IL-2 (200 U / ml) och IL-15 (5 ng / ml).
- Inkubera den speciella 6-brunnsplattan vid 37 °C med 5%CO2.
- Byt ut R-10-media kompletterat med IL-2 (200 U / ml) och IL-15 (5 ng / ml) för att upprätthålla NK-celler var 3-4: e dag.
OBS: Behåll mindre än 20 x 106 celler per brunn för ytterligare expansion vid varje förändring. För bästa livskraft, se till att det totala cellantalet i varje brunn inte överstiger 100 x 106 celler. - Registrera det totala cellantalet, livskraften och utför flödescytometri var 3-4: e dag för att beräkna NK-cellutvidgningshastigheten.
- Använd cellerna för lämpliga in vitro - eller in vivo-tester .
OBS: De ex vivo expanderade PBNK- och CAR-NK-cellerna kan odlas i en 37 °C inkubator i cirka 4 veckor. - Undersök NK-cellnummer och renhet vid dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 och dag 21 med flödescytometri.
Representative Results
Ett schematiskt arbetsflöde för vävnadsinfiltrerande NK-cellisolering och PBNK-cellexpansion med hjälp av 221-mIL-21-matarcellmetoden visas i figur 1 och figur 2. Expanderade PBNK-celler samlades in var 3: e eller 4: e dag för flödescytometri för att bestämma NK-cellrenheten genom färgning av celler med anti-human CD56 och anti-human CD3. Experimentet upprepades med hjälp av två olika givare för att visa expansionssystemets reproducerbarhet (figur 3). PBNK-celler expanderade med 221-mIL-21 visade sig expandera nästan 5 × 104 veck (figur 3A). Dessutom bibehölls NK-cellrenheten kraftigt, cirka 85% under hela 21-dagars expansionen (figur 3B). Med hjälp av 221-mIL-21 matarcellutvidgningssystemet varierade NK-cellrenheten konsekvent mellan 85% -95%, oberoende av givarna (data visas inte). För att demonstrera robustheten hos expansionssystemet 221-mIL-21 färgades PBMC för anti-CD56 och anti-CD3 före expansionen, vilket visade en cellrenhet på 7,09% för NK-celler och en hög andel T-celler (Figur 4A). PBMC odlades med 221-mIL-21 för att expandera NK-celler; NK-renheten kontrollerades före CAR-NK-transduktion dag 4 (figur 4A). CAR-NK-celler samlades in och färgades för anti-CD56, anti-CD3 och anti-hIgG(H+L) F(ab')2, som visade en hög NK-cellpopulation (86,9 % på dag 7) och en hög CAR-transduktionseffektivitet på cirka 70% (Figur 4). Högre transduktionseffektivitet (upp till 95 %) observerades också med hjälp av retrovirusförpackningssystemet. Sammantaget visar dessa data att 221-mIL-21-matarcellerna framgångsrikt kunde expandera NK-celler och bevara NK-cellens renhet ex vivo.
Figur 1: Diagram över NK-cellutvidgning från fasta humana organprover. Kortfattat hakas de erhållna humana leverproverna i små kuber för mekanisk matsmältning. Dissocierade celler isoleras sedan med PVP-belagd kiseldioxid och lymfocytseparationsmedier. Vidare expanderas NK-cellerna med hjälp av expansionsprotokollet som beskrivs i figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Schematiskt arbetsflöde för CAR-NK-cellgenerering från PBMC. Kortfattat bestrålades 221-mIL21-matarceller vid 100 Gy före coculturing med PBMC kompletterade med IL-2 och IL-15 på dag 0. Parallellt transfekterades 293T-celler med retrovirusförpackningssystemet för att producera CAR-retrovirus som sedan transducerades till de expanderade PBNK-cellerna i närvaro av IL-2 och IL-15. Primära CAR-NK-celler skördades dag 7 och fortsatte expansionen i 21 dagar. Denna siffra har modifierats från Yang et al.16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dynamisk tidsfördröjning av PBNK-celler. (A) Vik expansion av PBNK under en 22-dagars tidskurs. Cellerna färgades med anti-CD56 och anti-CD3 vid indikerade dagar för flödescytometri. Det totala antalet NK-celler bestämdes genom att multiplicera NK-cellrenhet till det totala antalet celler. Expansionshastighet genererades enligt följande: (Antal NK-celler)Tn/(Antal NK-celler)T0, där Antal NK-celler = (procent av NK-cellrenhet) × (totalt antal celler), T 0 är antalet NK-celler vid tid dag0 och Tn är antalet NK-celler vid tid dag n. (B) NK-cellrenhet under en 22-dagars tidskurs. NK-cellexpansionen upprepades två gånger med två olika donatorer. Felstaplar representerar ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ flödescytometrisk analys av CAR-NK-celler. (A) Representativa punktdiagram som visar den dynamiska tidsfördröjningen av NK-cellrenheten hos CAR-NK-cellerna under en 18-dagars kurs. Flödescytometrianalys utvärderades genom färgning av cellerna med anti-CD56 och anti-CD3 vid angivna tidpunkter. Dag 0 indikerar förexpansion av PBNK. Dag 4 indikerar efterexpansion av PBNK och pre-transduktion av CAR-NK-celler. Dag 7 indikerar posttransduktionen av CAR-NK-celler. B) Representativa punktdiagram som visar transduktionseffektiviteten hos CAR-NK-celler som använder retrovirusförpackningssystemet. Cellerna färgades med anti-CD56, anti-CD3 och anti-hIgG(H+L) F(ab')2 för flödescytometri. (C) Representativa punktdiagram som visar CAR-uttrycket i olika delmängder, inklusive CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ och CD56-CD3- dag 18. Cellerna färgades med anti-CD56, anti-CD3 och anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (indikerar CAR-uttryck) för flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De flesta av de nuvarande CAR-NK-produkterna i kliniska prövningar använder NK-cellinjer 17, såsom NK-92, en cellinje isolerad från en icke-Hodgkins lymfompatient18, NK-92MI, IL-2 oberoende NK-92 cellinje19 och NKL, isolerad från en stor granulär lymfocytpatient20, eftersom dessa cellinjer lätt är proliferativa för "off-the-shelf" -produkter. Dessa cellinjer, t.ex. NK-92-celler, har emellertid marginella kliniska effekter och in vivo-expansion, eftersom de kräver bestrålning före infusion, vilket begränsar deras proliferation och cytotoxicitet in vivo21. Med tanke på dessa skäl undersöks för närvarande olika strategier för att expandera primära NK-celler från flera källor, inklusive perifert blod, CB, benmärg (BM), mänskliga embryonala stamceller (HSC), inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och tumörvävnader21,22,23. Till exempel kan NK-celler expanderas ex vivo med hjälp av interleukiner inklusive IL-15, IL-18 och IL-21. Lymfoblastoida cellinjer såsom K562-celler eller Epstein-Barr-virustransformerade lymfoblastoida cellinjer såsom 721.221-celler, används också för NK-cellutvidgning16. De ovannämnda strategierna genererar emellertid ofta otillräckligt antal NK-celler för en adoptiv överföring av CAR-NK-immunterapi22,24. För att hjälpa till att lösa problemet visar studien här ett protokoll för en ex vivo NK-cellexpansion med hjälp av en genetiskt modifierad EBV-transformerad cellinje, 221-mIL-21 matarceller.
Expansionsmetoden med 221-mIL-21-matarceller som visas i detta protokoll är optimerad för att expandera NK-celler med en expansionshastighet på minst 10 till 100 gånger högre än andra leukemicellinjer, inklusive HL-60 och OCl-AML3 som uttrycker membran IL-21, K562 och K652-mIL21 som uttrycker OX40-ligand22,24,25. CAR-uttrycket utvärderas också under cirka 2 veckor ex vivo. Mer signifikant kan 221-mIL-21-matarcellutvidgningsstrategin tillämpas för att expandera NK-celler från olika källor, inklusive PBMC, CB och fasta organ som levern, utan ett initialt NK-anrikningssteg. Även om 221-mIL-21-matarsystemet inte är lika givarberoende som de ovannämnda matarcellinjerna, är det inte helt oberoende av givare. I genomsnitt kan expansionssystemet 221-mIL-21 uppnå 90% av NK-cellrenhet med ett högt NK-cellnummer, med cirka <5% av T-cellkontaminering på dag 14 efter expansion. För att eliminera möjligheterna till T-cellkontaminering är det därför nödvändigt att isolera NK-celler från erhållna prover före ex vivo-expansionen eller använda ett CD3 + -urvalssystem för att eliminera T-celler efter en ex vivo-expansion.
En av kritikerna med att använda ett NK-cellutvidgningssystem är att matarcellerna kanske inte har utrotats helt efter expansionen eller före en transfusion, vilket kan ha betydande regleringsproblem; Därför är fullständig utrotning av matarceller före en transfusion avgörande. De senaste kliniska prövningarna med CAR-NK där K562-mIL21-4-1BBL-matarceller användes för ex vivo CBNK-cellexpansionen24,25 visade dock inga oroande komplikationer. Dessutom visade våra preliminära data en gradvis minskning av den bestrålade befolkningen på 221-mIL-21 när expansionen fortskred (data visas inte). Det krävs dock mer omfattande studier för att denna expansionsmetod ska kunna implementeras i klinisk miljö. Sammantaget hjälper expansionssystemet 221-mIL-21 till att lösa utmaningen med att expandera primära CAR-NK-celler och kommer därför att bidra avsevärt till en bredare användning av CAR-NK-cellbaserad immunterapi inom en snar framtid.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Liu-laboratoriet (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang och Dr. Chih-Hsiung Chen) för deras kommentarer till manuskripten. Vi vill tacka Dr. Gianpietro Dotti för SFG-vektorerna och Dr. Eric Long för 721.221-cellerna. Detta arbete stöddes delvis från HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) och Rutgers-Health Advance Funding (NIH REACH-programmet), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti och R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) och Rutgers University-New Jersey Medical School Startup-finansiering för D. Liu Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A.
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
