Summary
B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.
Abstract
CD4 T 세포는 만성 B형 간염의 병인에 있는 중요한 역할을 합니다. 다목적 세포 집단으로서, CD4 T 세포는 분비한 사이토카인에 기초한 뚜렷한 기능성 하위 집합으로 분류되었습니다: 예를 들어, CD4 T 도우미 1 세포를 위한 IFN-γ, CD4 T 도우미 2 세포에 대한 IL-4 및 IL-13, CD4 T 여포 도우미 세포를 위한 IL-21 및 CD4 T 헬퍼 셀용 IL-17. HBV 유래 펩티드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한 B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD4 T 세포의 분석은 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기뿐만 아니라 HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능적 서브세트에 대한 정보를 제공할 수 있었다. 전사학 및 메타볼로믹스 분석과 같은 새로운 접근법은 HBV 특이적 CD4 T 세포에 대한 보다 상세한 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법은 일반적으로 펩타이드-주요 조직적합성 복합-II 멀티머를 기반으로 실행 가능한 HBV 특이적 CD4 T 세포의 격리가 필요하며, 현재 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프에 대한 정보는 제한적이다. HBV 유래 펩타이드 매트릭스를 기반으로, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 만성 HBV 감염 환자로부터 말초 혈액 단핵세포 샘플을 사용하여 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이 개발되었다.
Introduction
현재 항원 특이적 T 세포를 분석하는 3가지 주요 접근법이 있다. 첫 번째 접근법은 T 세포 수용체와 펩타이드 (epitope)사이의 상호 작용에 기초한다. 항원 특이적 T 세포는 펩티드-주요 조직적합성 복합체(MHC) 다중머로 직접 염색될 수 있다. 이 방법의 장점은 다운스트림 전사학/메타볼로믹스 분석에 적합한 실행 가능한 항원 특이적 T 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법의 한계는 특정 항원에 대한 전체 T 세포 반응에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것입니다, 특정 항원에 대한 확인된 에피토프의 수가 현재 제한되어 있는 동안 검증된 에피토프 펩티드가 필요하기 때문이다. B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD8 T 세포 에피토프에 비해, HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프가1,2로확인되어현재 HBV 특이CD4 T 세포의 분석에 덜 적용할 수 있게 되었다.
두 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극3후 일련의 활성화 유도 마커의 업레조절에 기초한다. 일반적으로 사용되는 마커는 CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4를포함한다. 이 방법은 현재 예방접종대상자5,6,인간 면역결핍 바이러스 감염 환자7,중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2감염환자8,9에서항원 특이적 T세포 반응을 분석하는 데 사용되어 왔다. 펩타이드-MHC 멀티머 기반 분석과 는 달리, 이 방법은 검증된 전형체에 의해 제한되지 않으며 다운스트림 분석을 위한 실행 가능한 세포를 얻을 수 있었다. 이 방법의 한계는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것이다. 또한, 일부 활성화된 항원 특이적 세포에 의한 이러한 활성화 유도 마커의 발현은 분석에서 배경 신호에 기여할 수 있으며, 이는 특히 표적 항원 특이적 T 세포가 드물 때 문제가 될 수 있다. 현재, HBV 특이CD4 T 셀4에대한 이 방법의 제한된 적용이 있다. 이 방법이 HBV 특이적 CD4 T 세포를 신뢰할 수 있는 방식으로 분석하기 위해 활용할 수 있는지 여부는 추가 조사가 필요합니다.
세 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한다. 활성화 유도 마커 기반 분석과 마찬가지로 이 방법은 검증된 전형에 의해 제한되지 않습니다. 이 방법은 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일을 직접 밝힐 수 있었다. 이 방법의 감도는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 분비에 의존하기 때문에 활성화 유도 마커 기반 방법보다 낮으며 테스트된 사이토카인의 수는 일반적으로 제한적이다. 현재, 이 방법은 HBV 특이적 T 세포의 분석에 널리 사용된다. HBV 특이적 T 세포를 분비하는 사이토카인은 직접 전 생체 펩타이드자극(10,11)에의해 거의 검출될 수 없기 때문에, HBV 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일은 보통 10일 후에 시험관내 펩타이드 자극 팽창팽창,13,14,15,16을분석한다. 매트릭스 형태로 펩티드 풀의 배열은 항원 특이적에피토프(17,18)의식별을 용이하게 하기 위해 활용되고 있다. 펩타이드 매트릭스와 사이토카인 분비 분석의 조합으로 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이개발되었다 16. 이 프로토콜에서는 이 메서드의 세부 정보가 설명되어 있습니다. HBV 코어 항원은 이 프로토콜에서 데모의 예로 선택된다.
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Protocol
연구에 포함된 각 환자로부터 서면 통보 된 동의를 얻었다. 연구 프로토콜은 사우스 웨스트 병원의 의료 윤리위원회의 사전 승인에 반영된 1975 년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수합니다.
1. HBV 유래 펩타이드 매트릭스의 설계
- NCBI 데이터베이스에서 HBV 코어 항원의 아미노산 서열을 다운로드합니다(GenBank: AFY98989.1).
- HBV 코어 항원 유래 펩티드(펩티드 합성 서비스 제공업체로부터 HBV 코어 항원 유래 펩타이드(351-메르 펩타이드 35개 패널)를 10잔류, 순도 > 90%, 4 mg/펩티드로 겹친다.
- 1 펩티드만 을 포함하는 매트릭스의 각 위치와 사각형 6×6 펩티드 매트릭스를 설정합니다. 12 펩티드 풀이 있습니다 : 6 행 펩티드 풀과 6 열 펩타이드 풀, 각 풀16에서5-6 펩타이드. 행렬의 행 펩티드 풀과 컬럼 펩타이드 풀은 HBV 코어 항원 2개의 분리된 형성을 나타낸다.
- 구입한 펩타이드의 3/4의 경우, 매트릭스의 동일한 행/열에 펩타이드를 디메틸 설프리산화물(DMSO)(각 펩타이드에 대해 2μg/μL)으로 함께 용해시킴으로써 12개의 별도의 펩타이드 풀에 펩타이드를 섞는다. HBV 특이CD4 T 세포 반응의 분석을 위해 -80°C에 저장합니다.
- 나머지 펩타이드(10μg/μL)를 별도로 용해하고 -80°C에 저장하여 에피토프 식별을 위해 보관합니다.
2. 말초 혈액 단핵 세포의 분리 (PBMC)
- 만성 HBV 감염 환자로부터 정맥 혈액의 5 mL를 샘플.
참고: 혈액 부피는 펩티드 풀의 수와 1개의 배경 제어 및 1개의 긍정적인 대조군수에 따라 대략 추정되어야 합니다. 1 펩티드 풀의 분석은 3 x 105 PBMC가 필요합니다. 평균적으로 1 x 106 PBMC는 혈액 1mL에서 얻을 수 있습니다. - 나중에 사용하기 위해 Ficoll 밀도 그라데이션 원심 분리 (800 × g, 20 분)를 사용하여 혈액에서 PBMC를 분리하고 냉동 보존 절연 PBMC를 사용하여 혈액에서 분리합니다.
- 파스퇴르 파이펫을 사용하여 명확한 Ficoll 층과 적혈구 층 사이의 과립구를 수집합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 게놈 DNA 정제 키트를 사용 하 여 과립 구체에서 게놈 DNA를 추출.
- HLA-DRB1 유전자형을 결정하기 위해 유전자 검사기 서비스 제공자에게 DNA 샘플을 보냅니다.
3. HBV 펩타이드 매트릭스를 사용하여 PBMC의 생체 외 확장
- 해동 PBMC.
- 따뜻한 RPMI 1640은 수조에서 1:10,000 벤조나아제(25 U/mL)에서 37°C로 보충됩니다.
참고: 벤조나제는 해동 중에 세포 응집을 제한하는 데 도움이 됩니다. 각 샘플은 벤조나아제와 RPMI 1640의 20 mL가 필요합니다. 모든 샘플을 해동하는 데 필요한 양을 계산하고 1:10,000 벤조나아제(25 U/mL)로 별도의 미디어 알리쿼트(37°C)를 준비한다. 한 번에 5개 이하의 샘플을 해동하지 마십시오. - 액체 질소에서 샘플을 제거하고 수조 (37 °C)에서 냉동 유리병을 신속하게 해동하십시오.
- 해동 된 세포 현탁액을 15 mL 원심분리기 튜브로 옮기다. 벤조나제 RPMI 1640(37°C)의 1mL을 튜브에 드롭와이즈로 넣습니다. 벤조나제 RPMI 1640(37°C)의 6mL을 원심분리기 튜브에 천천히 추가하고, 벤조나제 RPMI 1640(37°C)의 또 다른 2mL로 냉동 극고을 헹구어 모든 세포를 회수한다. 가능한 한 빨리 샘플의 나머지 부분을 계속합니다.
참고: 냉동 보존 된 샘플의 느린 희석은 해동 된 세포의 생존력을 유지하는 열쇠입니다. - 원심분리기(400× g, 10분), 상류체를 제거하고 튜브를 눌러 펠릿을 풀어주세요.
- 따뜻한 벤조나제 RPMI 1640의 1mL에서 펠릿을 부드럽게 재연합니다. 필요한 경우 70 μm 세포 스트레이너를 통해 셀을 부드럽게 섞고 필터(즉, 눈에 보이는 덩어리가 있는 경우).
- Aliquot는 10 μL 현탁액을 제거하고 덜벡코의 인산완충식식(DPBS)에서 희석하고, 트라이판 블루(0.04%), 혈변계에 적재, 1분 기다린 후 실행 가능한 셀(클리어 셀)의 수를 계산한다.
- 벤조나제 RPMI 1640(37°C)의 9mL를 튜브에 추가하고 원심분리기(400 × g, 10분), 상설체를 제거하고 튜브를 눌러 펠릿을 풀어낸다.
- 따뜻한 RPMI 1640은 수조에서 1:10,000 벤조나아제(25 U/mL)에서 37°C로 보충됩니다.
- 25m HEPES, 2mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루바테, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄절제술, 10% 인간 AB 혈청(완전한 배양 매체)으로 보충된 RPMI 1640의 PBMC를 재차 중단합니다. 세포 밀도를 1.5 x 106 셀/mL로 조정합니다. 플레이트 PBMC 96 웰 플레이트 (평평한 바닥) 밀도3 x 105 셀 /잘.
- HBV 유래 펩타이드 풀(각 단일 펩타이드에 대해 2μg/mL)을 각 웰에 추가합니다. 배경 제어 및 양수 제어의 우물의 경우 동일한 양의 용매(DMSO, 1 μL/mL)를 추가합니다. 10 U/mL IL-2 및 10 ng/mL IL-7을 추가합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서인큐베이션.
- 3일째, IL-2의 U/mL 50및 IL-7의 10 ng/mL를 가진 보충 배양 배지.
참고: 1일에서 3일째에 명백한 T세포 증식은 관찰되지 않습니다. 총 세포 수는 일반적으로 B 세포, NK 세포, NKT 세포 및 단핵구와 같은 비 T 세포의 죽음으로 인해 1/3 에서 1/2로 감소합니다. - 7일째에는 배양 배지의 절반을 펩타이드(4 μg/mL), IL-2(100 U/mL), IL-7(20 ng/mL)을 함유한 신선한 배지로 교체한다.
참고: 하단의 세포를 방해하지 않으려면 배양 배지의 약 90 μL이 배지 의 상단에서 조심스럽게 피펫됩니다. 3일에서 7일째에, 견고한 T 세포 증식이 관찰되고, T 세포가 확산되는 것은 일반적으로 클러스터를 형성하기 위하여 집계됩니다. - 10일째에, 각 웰에서 부드럽게 파이펫 세포 배양을 7-9배씩 분해하여 세포 클러스터를 분해하고, 실행 가능한 세포의 수를 계산하고, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응 분석을 위해 각각 2×105세포를 96웰 플레이트(round bottom)로 이송한다.
- 12일째에 에피토프 식별을 위해 나머지 세포를 계속 배양하고, 배양 배지의 부피를 100 μL(과도한 배지 폐기)로 조정하고, 펩티드(4μg/mL), IL-2(100 U/mL), IL-7(20ng/mL)을 함유한 신선한 완전 배양 배지 100μL로 배양배양을 조절한다.
참고: 7일에서 10일째, T 세포는 활발하게 확산됩니다. 배지가 노란색으로 변하면 3.5단계에서와 같이 배양 매체를 교체합니다. 일반적으로 세포 수는 10일째에6×105를 초과합니다. 각 웰은 일반적으로 유사한 세포 수를 보여주고, 3 개의 우물에서 세포 수를 계산하고 모든 우물에 대한 세포 수의 추정으로 평균 값을 사용합니다.
4. 세포 내 흐름 세포측정에 의한 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응 분석
- 펩타이드 풀로 PBMC를 자극
- 96웰 플레이트(원형 바닥)로 이송된 셀의 경우, 접시에서 3회 세척(550 × g, 3분). 각 세척에 200 μL의 배지를 사용하십시오(처음 2개의 세척을 위한 RPMI 1640, 마지막 세척을 위한 완전한 배양 배지). 초월체를 폐기합니다.
참고: 반복세척에 의한 배양에서 잔류 사이토카인을 제거하면 세포내 유동 세포 분석의 배경을 효과적으로 감소시킬 수 있다. - 특정 펩티드 풀로 자극된 각 셀의 각 웰에 대해 동일한 펩티드 풀(각 단일 펩타이드당 2 μg/mL)으로 보충된 완전한 배양 배지200 μL을 추가합니다. 배경 제어의 웰에 대 한, DMSO의 1 μL/mL보충 완전 한 배양 매체를 추가 합니다. 양수 조절의 웰을 위해 DMSO 1 μL/mL, 150 ng/mL의 phorbol 12-myristate 13-아세테이트(PMA), 요오노마이신 1μmol/L로 보충된 완전한 배양 배지를 추가합니다.
참고 : DMSO의 고용량은 T 세포의 사이토카인 분비를 차단합니다 (TNF-α 가장 중요합니다). 5 μL/mL보다 높은 DMSO의 용량은 권장되지 않습니다. 일반적으로, 우리의 실험에서 DMSO의 복용량은 1 μL/mL을 초과하지 않습니다. - 6h에 대해 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다.
- 1h의 인큐베이션 후, 모넨신(1.37 μg/mL)을 배양에 추가합니다.
- 96웰 플레이트(원형 바닥)로 이송된 셀의 경우, 접시에서 3회 세척(550 × g, 3분). 각 세척에 200 μL의 배지를 사용하십시오(처음 2개의 세척을 위한 RPMI 1640, 마지막 세척을 위한 완전한 배양 배지). 초월체를 폐기합니다.
- 유동 세포측정
- 6 h의 인큐베이션 후. 원심분리(550×g, 3분), DPBS 200 μL(550×g, 3분), 스테인 표면 마커(CD3, CD4, CD8) 및 생존성 마커(고정 가능한 생존 성 염료 사용)를 30분 동안 4°C 냉장고에서 한 번 씻어낸 후 상신체를 제거합니다.
- DPBS 200 μL(550 × μg, 3분)으로 한 번 씻으시다. 세포를 고정하고 퍼메아빌화하고, 4°C 냉장고에서 세포내 사이토카인(TNF-α 및 IFN-γ)을 45분 동안 고정및 투과한다.
- 세포 내 염색에서 최종 세척 후, 유동 세포 측정 버퍼 (DPBS + 0.5 % BSA)의 150 μL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 유동 세포계에서 유동 세포측정 데이터를 획득합니다.
- 유동 세포측정 결과 분석
- 양성선의 정의: 배경 컨트롤의 2배 이상 분비하는 사이토카인의 주파수가 있는 경우양성(도 1)을고려한다.
- 다음 수식에 따르면 분석된 각 사이토카인에 대한 응답률을 계산합니다(그림2):
참고: 행렬 펩티드 풀과 매트릭스의 컬럼 펩티드 풀은 HBV 코어 항원2개의 뚜렷한 형성을 나타내므로 최종 응답 속도를 2로 나누어야 한다.
5. HBV 특정 HLA-DR 제한 CD4 T 세포 에피토프의 식별
- T-75 플라스크에서 동종 B 림프구성 세포주(BLCLs)를 해동 및 유지한다(5-20 ×106세포, 완전한 배양 배지20mL).
참고: BLCL의 좋은 상태를 보장하기 위하여는, 이 단계는 환자의 PBMC의 해동 하기 2 주 전에 시작되어야 합니다. 지평 결과에 따르면, 환자는 BLCLs와 같은 HLA-DRB1 동계를 공유해야합니다. - 신원 확인을 위한 후보 펩티드 의 선별(도 3)
- 10일 T세포 응답률 결과에 따르면, 가장 높은 응답률(1열 펩타이드 풀 및 1열 펩타이드 풀)을 가진 2개의 펩타이드 풀을 선별한다.
- 이러한 펩티드를 함유하는 다른 펩티드 풀이 T 세포 반응 분석에서 긍정적인 결과를 나타낸다면 이들 2풀에서 펩티드를 후보 펩티드로 설정한다. 나중에 에피토프 식별을 위해 다른 펩티드 풀과 함께 확장된 PBMC를 사용합니다.
- 펩타이드를 곁들인 펄스 BLCLs
- 12일째에, 실행 가능한 BLCLs의 수를 계산하고, 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기(350 × g, 10분)를 제거하고 상신수를 제거한다. 완전한 배양 배지에서 세포 펠릿을 재연하고, 80 μL 완전 배양 배지에서 4×104 세포/웰에서 96웰 플레이트(round bottom)로 aliquot BLCLs를 다시 한다.
- 단일 펩타이드(10 μg/mL), 인큐베이션 37°C, 2h에 5%CO2를 추가합니다. 설정 2 배경 제어: HLA-DR 차단을 통해 펩타이드 맥동(1h용 항 HLA-DR(10 μg/mL)을 위한 전처리); DMSO(1 μL/mL) 맥동. 각 우물의 완전한 배양 매체의 최종 부피는 100 μL입니다.
- 미토마이신 C(100 μg/mL), 인큐베이션 37°C, 1h5% CO2를 추가합니다.
- RPMI 1640(550 × g, 3분)의 200 μL로 3회 세척하여 펄스가 없는 펩타이드와 미토마이신 C를 제거합니다. 첫 번째 세척을 위해, RPMI 1640의 100 μL로 인큐베이션 배양을 보완하십시오.
- 완전한 배양 배지의 120 μL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 펩타이드 펄스 BLC로 PBMC를 자극합니다.
- 12일, PBMC를 96웰 플레이트(라운드 하단)로 옮기.
- 접시에 원심분리(550 × g, 3분) 후 상체를 제거하고, 접시에 RPMI 1640(550 × g, 3분)의 200μL로 두 번 세척합니다.
참고: 반복세척에 의한 배양에서 잔류 사이토카인및 펩티드의 제거는 세포내 유동 세포측정 분석에서 배경을 감소시키기 위한 핵심 단계이다. 특히 잔류 펩티드의 경우 BLCLs에 결합하여 배경을 크게 증가시게 됩니다. - 완전한 배양 배지의 210 μL로 각 우물에서 PBMC를 다시 중단합니다.
- 에피토프 식별을 위해 선택된 PBMC의 웰을 위해, 알리쿼트(각각 70μL)를 펩타이드 펄스 BLCL(2개의 배경 컨트롤 포함 3개 우물)과 섞는다.
참고: 12일째에 확장된 펩타이드 풀의 수는 보통 우물당 5-7×105 이상으로 도달하므로 PBMC/BLCL의 비율은 약 6/1 ~ 4/1입니다. - 6h에 대해 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다.
- 1h의 인큐베이션 후, 모넨신(1.37 μg/mL)을 배양에 추가합니다. 각 우물의 완전한 배양 매체의 최종 부피는 200 μL입니다.
- 유동 세포측정
- 4.2 단계에서와 동일한 작업을 반복합니다.
- 유동 세포측정 결과 분석
- HLA-DR 제한 CD4 T 세포 에피토프로서 펩티드를 검증하는 경우 이 펩티드 펄스 BLCLs로 배양한 PBMC들이 배경 컨트롤로 배양된 PBMC의 적어도 2배 이상 CD4 T 세포를 분비하는 주파수를 나타낸다(HLA-DR 사전 차단을 이용한 펩타이드 맥동; DMSO 맥동)(그림 4).
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Representative Results
CD4 T 세포를 분비하는 사이토카인의 빈도는 단일 생산자와 이중 생산자 모두의 합으로 계산됩니다. 도 1에서입증된 바와 같이, TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 배경 제어(DMSO)에서 CD4 T 세포를 분비하는 IFN-γ 의 주파수는 각각 0.154% 및 0.013%이다. TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 펩타이드 풀 코어11에 특정 된 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 0.206 및 0.017, 그래서 TNF-α 분비 CD4 T 셀 응답 및 IFN γ 분비 CD4 T 셀 응답이 펩 티 드 풀에 대 한 부정적인 것으로 간주 됩니다. TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 펩타이드 풀 코어09에 특정 된 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 2.715 % 및 0.973 %이므로 TNF-α 분비 CD4 T 셀 응답 및 IFN-γ 비밀 CD4 T 셀 응답이 펩 타이드 풀에 대한 긍정적 인 것으로 간주됩니다.
도 2에서설명한 바와 같이, 양수 웰은 회색 배경으로 표시됩니다. HBV 코어별 TNF-α 분비 CD4 T-셀 응답 속도를 계산할 때 펩타이드 풀 코어01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 및 Core10의 데이터가 포함되어야 합니다. HBV 코어별 IFN-γ 분비 CD4 T-셀 응답 속도를 계산할 때 펩타이드 풀 코어01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core07, Core07, Core08, Core09 및 Core10의 데이터가 포함됩니다.
도 3에서입증된 바와 같이, 에피토프 식별을 위한 후보 펩티드는 빨간색으로 표시됩니다. Core01은 TNF-α 분비 CD4 T 세포와 IFN-γ 분비 CD4 T 세포를 컬럼 펩타이드 풀에서 가장 높은 응답률을 갖는다. 펩타이드 C1-15, C31-45, C61-75 및 C91-105는 이러한 펩티드 풀을 포함하는 행 펩티드 풀로서 후보 펩티드로 설정되어 또한 T 세포 반응에서 긍정적인 결과를 나타낸다. 펩타이드 풀코어07, 코어08, 코어09, Core10을 통해 확장된 PBMC는 펩타이드 C1-15, C31-45, C61-75 및 C91-105의 에피토프 식별에 각각 사용된다. Core09은 TNF-α 분비 CD4 T 세포와 IFN-γ 연속 펩티드 풀에서 CD4 T 세포를 분비하는 모두에서 가장 높은 반응률을 갖는다. 펩타이드 C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 및 C86-100이 펩티드 풀에서 이러한 펩티드를 함유한 열 펩티드 풀은 또한 T 세포 반응에 긍정적인 결과를 나타낸다. 펩타이드 풀 코어01, 코어02, 코어04, 코어05, 코어06을 통해 확장된 PBMC는 펩타이드 C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C86-95 및 C86-1000의 에피토프 식별에 사용됩니다.
도 4에서입증된 바와 같이, 펩타이드 풀 코어08 확장 PBMC에 대해, 펩타이드 C31-45 펄스 BLCLs를 이용한 자극 후, TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 0.995% 및 0.131%로 배경 컨트롤(펩타이드 C31-45 펄스 BLC)보다 2배 이상 높은 HLA-DRA-차단 DMSO 펄스 BLCLs). 따라서, 펩타이드 C31-45는 HLA-DR 제한 CD4 T 세포 에피토프로서 검증된다. 펩타이드 풀 코어10 확장 PBMC의 경우, 펩타이드 C91-105 펄스 BLCLs로 자극한 후, TNF-α 분비 CD4 T 세포의 주파수와 IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수는 각각 0.221% 및 0.000%이며, 이는 배경 제어의 2 배를 초과하지 않는 (HLA-DR 사전 차단, DMSO 펄스 BLCL을 가진 펩티드 C91-45 펄스 BLCL), 그래서 펩티드 C91-105HLA-DR 제한 CD4 T 셀 에피토프로 확인되지 않습니다.
그림 1: 펩타이드 풀에서 CD4 T 세포를 분비하는 TNF-α/IFN-γ 분비되는 흐름 세포 측정 데모는 각각의 펩티드 풀로 자극된 후 PBMC를 확장하였다.
그림 2: 분석 HBV 코어 별 TNF-α/IFN-γ 분비 CD4 T 셀의 데모. TNF/DMSO 및 IFN-Ƴ/DMSO는 TNF-α/IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수의 비율을 나타내며, 펩타이드 풀의 각 웰에서 CD4 T 세포를 분비하는 것은 TNF-α/IFN-γ 분비CD4 T 세포의 주파수로 나눈다. 회색 배경은 배경 제어와 비교하여 판단된 양수 CD4 T 셀 응답으로 우물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 에피토프 식별을 위한 후보 펩티드의 선별 시연. TNF/DMSO 및 IFN-Ƴ/DMSO는 TNF-α/IFN-γ 분비 CD4 T 세포의 주파수의 비율을 나타내며, 펩타이드 풀의 각 웰에서 CD4 T 세포를 분비하는 것은 TNF-α/IFN-γ 분비CD4 T 세포의 주파수로 나눈다. 회색 배경은 배경 제어와 비교하여 판단된 양수 CD4 T 셀 응답으로 우물을 나타냅니다. 적색의 펩타이드는 선별 기준에 따라 후보 펩티드를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 에피토프 식별 결과의 흐름 세포측정 데모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같이 나열됩니다: 1) PBMC 확장을 시작할 가능성이 높은 충분한 PBMC; 2) PBMC 확장에 적합한 환경; 및 3) 에피토프 식별 전에 PBMC 배양에서 잔류 펩티드 풀을 완전히 제거합니다.
이 프로토콜의 모든 분석은 CD4 T 셀의 강력한 증식에 따라 달라집니다. 일반적으로 10일 확장 후 PBMC 수는 초기 수의 2~3배입니다. 세포 수와 PBMC의 생존 가능성은 PBMC 확장의 2가지 주요 요소입니다. 목적은 에피토프 식별없이 HBV 특정 CD4 T 세포를 분석하는 경우, 혈액 샘플의 양이 제한되는 경우에 특히 초기 PBMC 수를 줄이는 것이 합리적이다. 우리의 경험에 따르면, PBMC의 시작 수는 1.5×105 셀 / 웰 미만인 경우 성공적인 PBMC 확장을 거의 얻을 수 없습니다. 확장에 신선한 PBMC를 사용할 때 셀 생존도 문제가 되지 않습니다. 확장에 극저온 보존 된 PBMC를 사용하는 동안, PBMC의 냉동 보존 및 해동은 PBMC의 생존가능성을 유지하기 위해 매우 신중하게 수행되어야한다.
HBV 특이적 T 세포의 기능적 분석에서 IL-12는 일반적으로 CD8 T 세포의 기능을 향상시키기 위해 PBMC 확장에 사용됩니다. IL-12가 CD4 T 여포 도우미 세포를 향해 CD4 T 세포의 분화를 유도할 수 있기 때문에, 이 사이토카인은 HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능적 분석에서 피해야 한다. 우리의 프로토콜에서, 만 IL-2 (T 세포 확장을 위해) 및 IL-7 (T 세포 생존을 위해) 가능한 한 그대로 확장하는 동안 HBV 특정 CD4 T 세포의 기능적 프로파일을 유지하기 위해 보충된다. 우리는 HBV 특정 CD4 T 세포의 기능 분석을 위해 5 개의 사이토카인을 테스트했습니다 : TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 및 IL-21. 분석된 샘플에서 TNF-α 및 IFN-γ HBV 특이CD4 T세포(16)에의해 분비되는 2개의 주요 사이토카인이다. HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능성 프로파일을 분석할 때, 상세한 기능성 프로파일 정보를 얻기 위해 가능한 한 많은 사이토카인을 테스트하는 것이 좋습니다. 에피토프 식별에 있는 동안, 그것은 단지 TNF-α 및 IFN-γ 분석 하는 것이 좋습니다., 경제적 고려.
충분한 HBV 특이적 CD4 T 세포는 성공적인 에피토프 식별에 필수적이므로, 에피토프 식별은 B형 간염 플레어 환자(강력한 HBV 특이적 TNF-α 분비 CD4 T 세포 반응) 및 바이러스 성 클리어런스(강력한 HBV-γ CD4 T 세포반응)와 같은 높은 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 가진 환자에서 고려해야 합니다. . 펩타이드 풀에서 잔류 펩티드를 제거하는 것이 매우 중요하며, 에피토프 식별을 위해 이러한 세포를 BLCL로 배양하기 전에 반복세척을 통해 PBMC를 확장한다. 잔류 펩티드는 DMSO 펄스 BLCLs에 결합하고 펩타이드 특이CD4 T 세포를 활성화하여 배경을 크게 증가시게 된다.
일부 HBV 항원들은 다른 HBV 유전자형(예를 들어, HBV 표면 항원)에서 가변 서열을 갖는다. 용액은 환자에서 특정 HBV 유전자형을 미리 결정하고 다른 HBV 유전자형을 가진 환자를 위한 HBV 유전자형 특이적 펩타이드 풀을 설계하는 것이다. HBV 유전자형은 HBV 바이러스 부하가 낮은 환자에서 측정할 수 없는 반면(예를 들어, 정기적인 항바이러스 치료를 가진 HBeAg 음성 환자), 이 시나리오에서, 용액은 이전연구에서와마찬가지로 다른 HBV 유전자형으로부터 펩티드를 동일한 펩티드 풀로 혼합하는 것이다. 이러한 혼합물 전략의 단점은 에피토프가 펩티드 쌍으로 식별될 수 있지만 단일 펩타이드는 아닌 단일 펩티드로 식별될 수 있으며, 펩티드 매트릭스의 일부 위치는 항원의 동일한 단편에서 펩티드 쌍을 함유하고 있다.
이 방법의 주요 단점은 시간이 많이 걸리는 10일 PBMC 확장입니다. 현재, 세포비동 분비의 전 생체 분석은 신뢰할 수 있는 방법으로 HBV 특이적 CD4 T 세포를 검출할 수 없었다. 펩티드 펄스 동종 BLL을 자극기로 사용하면 일반적으로 펩타이드 에서 더 많은 펩티드 특이적 CD4 T 세포를 검출하여펩티드(16)를자극하는 것에 비하면 더 많은 펩티드 특이적 CD4 T 세포를 검출하였다. 펩티드 펄스 자가 B 세포를 항원 프리젠 테이션 세포로 사용하여 HBV 특이적 CD4 T 세포를 안정적으로 검출하는 데 도움이 될 수 있는지 여부를 조사 할 가치가 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81930061), 충칭자연과학재단(cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxxX0004), 중국키에 의해 지원되었습니다.
전염병 전문 프로젝트 (2018ZXX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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