Name: Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Apprenez à évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et à identifier leurs épitopes restreints par HLA-DR à l'aide de PBMCs et cytométrie en flux. Cette méthode permet la caractérisation fonctionnelle des sous-populations cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81930061), la Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) et Chinese Key Projet spécialisé dans les maladies infectieuses (2018ZX10723203).

Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient inclus dans l’étude. Le protocole d’étude est conforme aux directives éthiques de la Déclaration d’Helsinki de 1975, telles qu’elles se reflètent dans l’approbation a priori par le comité d’éthique médicale de l’hôpital du Sud-Ouest.
1. Conception de la matrice peptidique dérivée du VHB
<ol><li>Téléchargez les séquences d’acides aminés de l’antigène central du VHB à partir des bases de données NCBI (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Achetez des peptides dérivés de l’antigène de base du VHB (un panel de 35 peptides de 15 mer se chevauchant par 10 résidus, pureté &gt; 90%, 4 mg / peptide) auprès d’un fournisseur de services de synthèse de peptides.</li>
	<li>Mettez en place une matrice peptidique carrée 6×6 avec chaque position dans la matrice contenant seulement 1 peptide. Il y a 12 pools de peptides: 6 pools de peptides de rangée et 6 pools de peptides de colonne, 5-6 peptides dans chaque pool16. Les pools de peptides de ligne et les pools de peptides de colonne dans la matrice représentent 2 formations distinctes d’antigène central du VHB.</li>
	<li>Pour 3/4 des peptides achetés, mélanger les peptides dans la même rangée/colonne de la matrice en 12 pools de peptides distincts en les dissolvant ensemble dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (2 μg/μL pour chaque peptide). Conserver à -80 °C pour l’analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB.</li>
	<li>Dissoudre le reste des peptides séparément (10 μg/μL) et les conserver à -80 °C pour l’identification des épitopes.</li>
</ol>2. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMA)
<ol><li>Échantillonnez 5 mL de sang veineux de patients atteints d’une infection chronique par le VHB. REMARQUE: Le volume sanguin doit être approximativement estimé en fonction du nombre de pools de peptides plus 1 contrôle de fond et 1 contrôle positif. L’analyse de 1 pool peptidique nécessite 3 x10 5 PBMC. En moyenne, 1 x 106 PBMA ont pu être obtenus à partir de 1 mL de sang.</li>
	<li>Isoler les PBCC du sang en utilisant la centrifugation à gradient de densité Ficoll (800 × g, 20 min) et cryoconserver les PBMC isolés dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Utilisez une pipette Pasteur pour recueillir les granulocytes entre la couche claire de Ficoll et la couche de globules rouges. Extraire l’ADN génomique des granulocytes à l’aide d’un kit de purification de l’ADN génomique selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Envoyez l’échantillon d’ADN aux fournisseurs de services de génotypage pour déterminer le génotype HLA-DRB1.</li>
</ol>3. Expansion in vitro des PBMC à l’aide d’une matrice peptidique hbv
<ol><li>Décongeler les PBCC.<ol>
<li>RPMI 1640 chaud complété par 1:10 000 benzonase (25 U/mL) à 37 °C au bain-marie. REMARQUE: La benzonase aide à limiter l’agglutination des cellules pendant la décongélation. Chaque échantillon nécessitera 20 mL de RPMI 1640 avec benzonase. Calculer la quantité nécessaire pour décongeler tous les échantillons et préparer une aliquote distincte de milieu (37 °C) avec 1:10 000 benzonase (25 U/mL). Décongeler pas plus de 5 échantillons à la fois.</li>
		<li>Prélever des échantillons d’azote liquide et décongeler rapidement les flacons congelés au bain-marie (37 °C).</li>
		<li>Transférer la suspension de cellule décongelée dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Ajouter 1 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) goutte à goutte au tube. Ajouter lentement 6 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) dans le tube de centrifugeuse, rincer cryovial avec 2 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) pour récupérer toutes les cellules. Continuez avec le reste des échantillons le plus rapidement possible. REMARQUE: La dilution lente des échantillons cryoconservés est la clé pour maintenir la viabilité des cellules décongelées.</li>
		<li>Centrifuger (400 × g, 10 min), retirer le surnageant et desserrer la pastille en tapotant le tube.</li>
		<li>Remettez délicatement la pastille dans 1 mL de benzonase RPMI 1640 chaude. Mélangez doucement et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 70 μm si nécessaire (c.-à-d. s’il existe un amas visible).</li>
		<li>Aliquote une suspension de 10 μL et diluer dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, ajouter du bleu de trypan (0,04%), charge sur un hémocytomètre, attendre 1 min et compter le nombre de cellules viables (cellules claires).</li>
		<li>Ajouter 9 mL de benzonase RPMI 1640 (37 °C) au tube, centrifuger (400 × g, 10 min), retirer le surnageant et desserrer la pastille en tapotant le tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendez les PBMC dans RPMI 1640 complétés par 25 mM d’HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 % de sérum AB humain (milieu de culture complet). Ajuster la densité cellulaire à 1,5 x 106 cellules/mL. Plaques PBCC en plaques de 96 puits (fond plat) à une densité de 3 x 105 cellules/puits.</li>
	<li>Ajouter des pools de peptides dérivés du VHB (2 μg/mL pour chaque peptide) à chaque puits. Pour les puits de contrôle de fond et de contrôle positif, ajouter la même quantité de solvant (DMSO, 1 μL/mL). Ajouter 10 U/mL IL-2 et 10 ng/mL IL-7. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Au jour 3, supplémenter le milieu de culture avec 50 U/mL d’IL-2 et 10 ng/mL d’IL-7. REMARQUE: Au cours des jours 1 à 3, aucune prolifération évidente des lymphocytes T ne sera observée. Le nombre total de cellules diminuera généralement de 1/3 à 1/2, en raison de la mort des cellules non T telles que les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et les monocytes.</li>
	<li>Au jour 7, remplacer la moitié du milieu de culture par un milieu frais contenant des peptides (4 μg/mL), de l’IL-2 (100 U/mL) et de l’IL-7 (20 ng/mL). REMARQUE: Pour éviter de perturber les cellules en bas, pipettez soigneusement environ 90 μL de milieu de culture à partir du haut du milieu. Au cours des jours 3 à 7, une prolifération robuste des lymphocytes T sera observée, et les lymphocytes T proliférants s’agrègent généralement pour former des grappes.</li>
	<li>Au jour 10, pipettez doucement la culture cellulaire dans chaque puits 7 à 9 fois pour désagréger les grappes de cellules, compter le nombre de cellules viables et transférer 2× 1010 5 cellules dans chaque puits sur une plaque de 96 puits (fond rond) pour l’analyse de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB.</li>
	<li>Continuer à cultiver le reste des cellules pour l’identification de l’épitope au jour 12, ajuster le volume du milieu de culture à 100 μL (en éliminant le milieu excessif) et compléter la culture avec 100 μL de milieu de culture complet frais contenant des peptides (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) et IL-7 (20 ng / mL). REMARQUE: Au cours du jour 7 au jour 10, les lymphocytes T continuent de proliférer vigoureusement. Remplacez le milieu de culture comme à l’étape 3.5 si le milieu jaunit. En général, le nombre de cellules dépassera 6×105 au jour 10. Chaque puits affiche généralement un nombre de cellules similaire, comptez le nombre de cellules dans 3 puits et utilisez la valeur moyenne comme estimation du nombre de cellules pour tous les puits.</li>
</ol>4. Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB par cytométrie en flux intracellulaire
<ol><li>Stimuler les PBMC avec des pools de peptides<ol>
<li>Pour les cellules transférées sur la plaque de 96 puits (fond rond), laver 3 fois dans une plaque (550 × g, 3 min). Utiliser 200 μL de milieu pour chaque lavage (RPMI 1640 pour les 2 premiers lavages, milieu de culture complet pour le dernier lavage). Jetez les surnageants. REMARQUE: L’élimination des cytokines résiduelles dans la culture par lavage répété pourrait réduire efficacement le fond dans l’analyse de cytométrie en flux intracellulaire.</li>
		<li>Pour chaque puits de cellules stimulées avec un pool peptidique spécifique, ajouter 200 μL de milieu de culture complet complété par les mêmes pools peptidiques (2 μg/mL pour chaque peptide). Pour le puits de contrôle de fond, ajouter un milieu de culture complet complété par 1 μL/mL de DMSO. Pour le puits de contrôle positif, ajouter un milieu de culture complet complété par 1 μL/mL de DMSO, 150 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 μmol/L d’ionomycine. REMARQUE: Une forte dose de DMSO bloquera la sécrétion de cytokines des lymphocytes T (plus important pour le TNF-α). Une dose de DMSO supérieure à 5 μL/mL n’est pas recommandée. Généralement, la dose de DMSO dans notre expérience ne dépasse pas 1 μL / mL.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 h.</li>
		<li>Après 1 h d’incubation, ajouter Monensin (1,37 μg/mL) à la culture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytométrie en flux<ol>
<li>Après 6 h d’incubation. Retirer le surnageant après centrifugation (550 × g, 3 min), laver les cellules une fois avec 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), les marqueurs de surface de coloration (CD3, CD4 et CD8) et le marqueur de viabilité (à l’aide d’un colorant de viabilité fixable) dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Laver une fois avec 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fixer et perméabiliser les cellules, et colorer les cytokines intracellulaires (TNF-α et IFN-γ) dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 45 min.</li>
		<li>Après le lavage final dans la coloration intracellulaire, resuspendez les cellules dans 150 μL de tampon de cytométrie en flux (DPBS + 0,5% BSA).</li>
		<li>Acquérir des données de cytométrie en flux sur un cytomètre en flux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des résultats de la cytométrie en flux<ol>
<li>Définition du puits positif : considérer un puits comme positif s’il a une fréquence de cytokines sécrétant des lymphocytes T au moins deux fois du puits de contrôle de fond (Figure 1).</li>
		<li>Selon la formule suivante, calculer le taux de réponse pour chaque cytokine analysée(Figure 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> REMARQUE: Le pool de peptides de ligne et les pools de peptides de colonne dans la matrice représentent 2 formations distinctes d’antigène de base du VHB, de sorte que le taux de réponse finale doit être divisé par 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identification des épitopes de lymphocytes T CD4 restreints HLA-DR spécifiques du VHB
<ol><li>Décongeler et maintenir les lignées cellulaires lymphoblastoïdes B allogéniques (MLCA) dans une fiole T-75 (5-20 ×106 cellules, 20 mL de milieu de culture complet). REMARQUE: Pour garantir le bon état des BLCL, cette étape doit être initiée 2 semaines avant la décongélation des PBMC des patients. Les BLCL doivent être homozygotes dans l’allèle HLA-DRB1. Selon le résultat du génotypage, les patients doivent partager le même allèle HLA-DRB1 que les MLCC.</li>
	<li>Criblage des peptides candidats pour identification (Figure 3)<ol>
<li>Selon les résultats du taux de réponse des lymphocytes T au jour 10, filtrez 2 pools de peptides avec le taux de réponse le plus élevé (1 pool de peptides de ligne et 1 pool de peptides de colonne).</li>
		<li>Définissez le peptide dans ces 2 pools comme peptide candidat si l’autre pool peptidique contenant ce peptide montre également un résultat positif dans l’analyse de la réponse des lymphocytes T. Utilisez les PBMCs étendus avec l’autre pool de peptides pour l’identification de l’épitope plus tard.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulsation de MLLC avec peptide<ol>
<li>Au jour 12, comptez le nombre de MLCC viables, transférez les cellules dans des tubes centrifuges de 15 mL, centrifugez (350 × g, 10 min) et retirez le surnageant. Resuspendez la pastille cellulaire dans un milieu de culture complet et aliquotez les MLLC dans une plaque de 96 puits (fond rond) à 4×104 cellules/puits dans un milieu de culture complet de 80 μL.</li>
		<li>Ajouter un seul peptide (10 μg/mL), incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 2 h. Set 2 contrôle de fond: pulsation peptidique avec blocage HLA-DR (prétraitement avec anti-HLA-DR (10 μg / mL) pendant 1 h); Pulsation de DMSO (1 μL/mL). Le volume final du milieu de culture complet dans chaque puits est de 100 μL.</li>
		<li>Ajouter la mitomycine C (100 μg/mL), incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h.</li>
		<li>Laver 3 fois avec 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) dans une plaque pour éliminer le peptide non pulsé et la mitomycine C. Pour le premier lavage, complétez la culture d’incubation avec 100 μL de RPMI 1640.</li>
		<li>Resuspendez les cellules dans 120 μL de milieu de culture complet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimuler les PBMC avec des BLCL pulsés peptidiques.<ol>
<li>Au jour 12, transférez les PBCC sur une plaque de 96 puits (fond rond).</li>
		<li>Retirer le surnageant après centrifugation (550 × g, 3 min) dans une plaque, laver deux fois avec 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) dans une plaque. REMARQUE: L’élimination des cytokines et des peptides résiduels dans la culture par lavage répété est l’étape clé pour diminuer le fond dans l’analyse de cytométrie en flux intracellulaire. Surtout pour les peptides résiduels, il se liera aux MLLC et augmentera considérablement le fond.</li>
		<li>Resuspendez les PBCC à chaque puits avec 210 μL de milieu de culture complet.</li>
		<li>Pour le puits des PBMC choisis pour l’identification des épitopes, mélanger l’aliquote (70 μL chacune) avec des BLCL pulsés peptidiques (3 puits, dont 2 témoins de fond). REMARQUE: Au jour 12, le nombre de pbMC élargis de pools de peptides atteindra généralement plus de 5-7×105 par puits, de sorte que le rapport PBMC / BLCL est d’environ 6/1 à 4/1.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 h.</li>
		<li>Après 1 h d’incubation, ajouter Monensin (1,37 μg/mL) à la culture. Le volume final du milieu de culture complet dans chaque puits est de 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytométrie en flux<ol>
<li>Répétez les mêmes opérations qu’à l’étape 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des résultats de la cytométrie en flux<ol>
<li>Vérifier un peptide en tant qu’épitope de lymphocytes T CD4 restreint par HLA-DR si les PBMC incubés avec ce peptide PULSÉ montrent une fréquence de cytokines sécrétant des lymphocytes T CD4 au moins deux fois des PBMC incubés avec des témoins de fond (pulsation peptidique avec préblocage HLA-DR; Pulsation DMSO) (Figure 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont énumérées comme suit : 1) suffisamment de PBCC de haute viabilité pour démarrer l’expansion des PBMC ; 2) un environnement approprié pour l’expansion des PBMC; et 3) l’élimination complète des pools de peptides résiduels dans la culture de PBMC avant l’identification de l’épitope.
Toutes les analyses de ce protocole dépendent de la prolifération robuste des lymphocytes T CD4. En général, le nombre de PBCC après une expansion de 10 jours sera d...

Actuellement, il existe 3 approches principales pour analyser les lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La première approche est basée sur l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et le peptide (épitope). Les lymphocytes T spécifiques de l’antigène pourraient être directement colorés avec des multimères du complexe d’histocompatibilité peptide-majeur (CMH). L’avantage de cette méthode est qu’elle pourrait obtenir des lymphocytes T viables spécifiques à l’antigène, adaptés à l’analyse transcriptomique/métabolomique en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pourrait pas fournir d’informations sur l’ensemble de la réponse des lymphocytes T à un antigène spécifique, car elle nécessite des peptides d’épitope validés alors que le nombre d’épitopes identifiés pour un antigène spécifique est limité pour l’instant. Par rapport aux épitopes des lymphocytes T CD8 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB), moins d’épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont été identifiés1,2, ce qui rend cette méthode moins applicable à l’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB actuellement.
La seconde approche est basée sur la régulation à la hausse d’une série de marqueurs induits par l’activation après stimulation peptidique antigénique3. Les marqueurs couramment utilisés comprennent CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Cette méthode a maintenant été utilisée pour analyser les réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les personnes vaccinées5,6,les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine7et les patients infectés par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère2 8,9. Contrairement au test basé sur les multimères peptide-CMH, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés et pourrait obtenir des cellules viables pour l’analyse en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pouvait pas fournir d’informations sur le profil des cytokines des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. En outre, l’expression de ces marqueurs induits par l’activation par certaines cellules non spécifiques de l’antigène activé pourrait contribuer aux signaux de fond dans l’analyse, ce qui pourrait être un problème, en particulier lorsque les cellules T spécifiques de l’antigène cible sont rares. Actuellement, l’application de cette méthode sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB 4 estlimité. La question de savoir si cette méthode pourrait être utilisée pour analyser de manière fiable les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB doit faire l’objet d’une étude plus approfondie.
La troisième approche est basée sur la sécrétion de cytokines après stimulation peptidique de l’antigène. Comme l’analyse basée sur des marqueurs induits par l’activation, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés. Cette méthode pourrait révéler directement le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La sensibilité de cette méthode est inférieure à la méthode basée sur des marqueurs induits par l’activation car elle repose sur la sécrétion de cytokines de lymphocytes T spécifiques de l’antigène et le nombre de cytokines testées est généralement limité. Actuellement, cette méthode est largement utilisée dans l’analyse des lymphocytes T spécifiques du VHB. Comme les lymphocytes T spécifiques du VHB sécrétant des cytokines, il était difficile de détecter par stimulation peptidique ex vivo directe10,11, le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques du VHB est généralement analysé après une expansion stimulée par peptide in vitro de 10 jours12,13,14,15,16. La disposition des pools de peptides sous forme de matrice a été utilisée pour faciliter l’identification des épitopes spécifiques de l’antigène17,18. Avec la combinaison de l’analyse de la matrice peptidique et de la sécrétion de cytokines, une méthode a été développée pour évaluer simultanément les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB16. Dans ce protocole, les détails de cette méthode sont décrits. L’antigène central du VHB est choisi comme exemple de démonstration dans ce protocole.

<table><tbody><tr><td>Albumine Bovine V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugué Anti-humain TNF-&alpha ;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Garder à l’abri de la lumière</td></tr><tr><td>Nucléase benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td> Cellules lymphoblastoïdes B <td>agglomérantes limites</td></tr><tr><td>(BLCL)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td></td> IHW09126 <td>HLA-DRB1*0803</td></tr><tr><td>Lignées cellulaires lymphoblastoïdes B homozygotes (BLCL)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td></td> IHW09121 <td>HLA-DRB1*1202 homozygote</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire (T75)</td><td>Plaque</td> de culture cellulaire <td>Corning 430641</td><td></td></tr><tr><td>(96 puits, fond plat)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à fond plat (96 puits, fond rond)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire</td> à fond rond <td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Taille des pores 70&nbsp ; &mu ; m, blanc, tube à</td></tr><tr><td>centrifuger stérile (15 mL)</td><td>Tube</td> à centrifuger <td>stérile</td><td>KIRGEN KG2611</td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>Centrifugeuse</td><td>stérile</td><td>430829</td> Corning</tr>, centrifugeuse <tr><td>réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr>, centrifugeuse <tr><td>réfrigérée</td><td>Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>, réfrigérée</td><td>Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>Préparer la solution avant utilisation</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Conserver à température ambiante pour éviter la cristallisation</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate salin</td><td></td><td></td> tamponné <td>Préparer ddH2O (1000 ml) contenant du NaCl (8000 mg), du KCl (200 mg), du KH2PO4 (200 mg) et du Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Ajustez le PH à 7,4. Stériliser par autoclave.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dépanneurs filtrants (0.5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td></td></tr><tr><td>Dépanneurs filtrants stériles (100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Embouts filtrants stériles</td></tr><tr><td>(1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>FITC Conjugué Anti-Human CD4</td><td>BioLegend</td><td>300506</td><td>Garder à l’abri de la lumière</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Garder à l’abri de</td></tr><tr><td>la lumière Inhibiteur de transport de protéines GolgiStop (contenant du monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Inhibiteur de transport de protéines</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Marque</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>HBV Core Antigen Derived Peptides</td><td>ChinaPeptides</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Sérum Humain AB</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cytomètre en Flux</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td> Tube de microcentrifugation de <td>100 ml</td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td>Stérilisation autoclavée avant utilisation</td></tr><tr><td>Agitateurs de microplaques</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR (0,2 mL)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain conjugué PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Garder à l’abri de la lumière</td></tr><tr><td>Conjugué PE Anti-humain IFN-&gamma ;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Conserver à l’abri de</td></tr><tr><td>la lumière Pénicilline Streptomycine Gibco</td><td></td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-conjugué Anti-humain CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Garder à l’abri de la lumière</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium, 100mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard ADN génomique Kit de purification</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des réponses des lymphocytes t cd4 spécifiques du vhb et identification des épitopes des lymphocytes t cd4 restreints par hla-dr sur la base d’une matrice peptidique

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la pathogenèse de l’hépatite B chronique. En tant que population cellulaire polyvalente, les lymphocytes T CD4 ont été classés comme des sous-ensembles fonctionnels distincts en fonction des cytokines qu’ils ont sécrétées : par exemple, IFN-γ pour les lymphocytes T helper 1 CD4, IL-4 et IL-13 pour les cellules CD4 T helper 2, IL-21 pour les cellules folliculaires CD4 T helper et IL-17 pour les cellules CD4 T helper 17. L’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB) basée sur la sécrétion de cytokines après la stimulation des peptides dérivés du VHB pourrait fournir des informations non seulement sur l’ampleur de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB, mais également sur les sous-ensembles fonctionnels des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. De nouvelles approches, telles que la transcriptomique et l’analyse métabolomique, pourraient fournir des informations fonctionnelles plus détaillées sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. Ces approches nécessitent généralement l’isolement de lymphocytes T CD4 viables spécifiques du VHB à partir de multimères du complexe d’histocompatibilité majeur du peptide II, alors qu’actuellement les informations sur les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sont limitées. Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du VHB, une méthode a été mise au point pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB à l’aide d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de patients atteints d’une infection chronique par le VHB.

La fréquence de sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4 est calculée comme la somme des producteurs simples et des producteurs doubles. Comme le montre la figure 1,la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par α TNF et la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par γ d’IFN dans le contrôle de fond (DMSO) sont respectivement de 0,154 % et 0,013 %. La fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α Tnf-γ sécrétant des lymphocytes T CD4 spécifiques pour le pool d...

Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du virus de l’hépatite B (VHB), les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont pu être évaluées parallèlement à l’identification des épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB.

Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

Dans une infection chronique par le VHB, les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la clairance virale et les retourneurs. Cette méthode nous permet d’évaluer simultanément les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et d’identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. La démonstration de la procédure sera faite par Jianmei Xiao, un assistant de recherche.Et Xing Wan, un technicien de Bilao. Pour commencer, isolez les cellules mononucléaires du sang périphérique, ou PBMA, du sang, en utilisant la centrifugation par gradient de densité De Ficoll à 800 fois G pendant 20 minutes. Ensuite, collectez les granulocytes entre la couche de globules rouges et les globules rouges, à l’aide d’une pipette pasteure.Transférer la suspension de cellule décongelée dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres, ajouter un millilitre de la benzonase RPMI 1640 préchauffée, goutter sage, puis ajouter lentement six autres millilitres. Rincez le flacon cryogénique avec deux millilitres de benzonase RPMI 1640 pour récupérer les cellules restantes. Ensuite, centrifugez le tube à 400 fois G pendant 10 minutes.Retirez le surnageant et desserrez la pastille en tapotant le tube. Remettez délicatement la pastille dans un millilitre de Bensenase NACE RPMI 1640 chaude. Mélangez doucement les cellules et filtrez-les à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres, si des amas de cellules sont visibles.Compter les cellules viables à l’aide du bleu de trypan et d’un hémocytomètre. Ressez suspendre les PBCC et le milieu de culture complet, contenant 10 unités par millilitre d’IL2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL7. Ajustez la densité cellulaire à 1,5x10 aux 6 cellules par millilitre.Ensuite, plaquez les cellules dans des plaques à fond plat de 96 puits à une densité de 3x10 aux cinquièmes cellules par puits. Ajoutez des pools de peptides dérivés du virus de l’hépatite B ou du VHB à chaque puits. Pour les puits de fond et de contrôle positif, ajoutez la même quantité de solvant.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le troisième jour, complétez le milieu de culture avec 50 unités par millilitre d’IL2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL7. Le septième jour, remplacez la moitié du milieu de culture par un milieu frais contenant : quatre microgrammes par millilitre de peptides, 100 unités par millilitre d’IL2 et 20 nanogrammes par millilitre d’IL7.Le jour 10, pipettez doucement les cellules dans chaque puits sept à neuf fois pour désagréger les grappes de cellules. Comptez le nombre de cellules viables et transférez 2x10 aux cinquièmes cellules dans chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits pour l’analyse de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VPH. Pour les cellules résiduelles de la plaque de fond plat de 96 puits, ajustez le volume du milieu de culture à 100 microlitres en éliminant le milieu excessif.Ensuite, complétez la culture avec 100 microlitres de milieu de culture frais et complet, contenant: quatre microgrammes par millilitre de peptides, 100 unités par millilitre IL2, et 20 nanogrammes par millilitre IL7. Continuer à cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour l’identification de l’épitope le jour 12. Lavez les cellules dans la plaque inférieure ronde de 96 puits en ajoutant 200 microlitres de RPMI 1640, en centrifugant la plaque à 550 fois G pendant trois minutes et en jetant le surnageant.Répétez le lavage deux fois en utilisant un milieu de culture complet pour le dernier lavage. Pour chaque puits de cellules stimulées avec un pool peptidique spécifique, ajouter 200 microlitres de milieu de culture complet complétés par le même pool peptidique. Pour le puits de contrôle en arrière-plan, ajoutez un milieu de culture complet, complété par un microlitre par millilitre de DMSO.Pour le puits de contrôle positif, ajoutez un milieu de culture complet complété par un microlitre par millilitre de DMSO, 150 nanogrammes par millilitre de PMA et un micromole par litre d’ionomycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après une heure d’incubation, ajouter 1,37 microgramme par millilitre de monensine à la culture.Une fois l’incubation de six heures terminée, centrifuger la plaque à 550 fois G pendant trois minutes. Retirez le surnageant et lavez les cellules une fois avec 200 microlitres de DPP, comme démontré précédemment. Tache pour les marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8, et un marqueur de viabilité.Après avoir suspendu les cellules avec un vibreur, réfrigérez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir lavé la plaque une fois avec 200 microlitres de DPBS, fixez et perméabilisez les cellules, colorez les cytokines intracellulaires, TNF Alpha et Interféron-gamma, et réfrigérez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Lavez à nouveau les cellules et ressuscez-les dans 150 microlitres de tampon de cytométrie en flux.Ensuite, acquérez les données de cytométrie en flux à l’aide d’un cytomètre en flux. Maintenir les lignées cellulaires B-lymphoblastoïdes allergènes, ou MLCA, dans une fiole T-75. Au jour 12 de l’expansion du PBMC, comptez le nombre de MLLC viables et transférez-les dans des tubes centrifuges de 15 millilitres.Centrifugez les cellules à 350 fois G pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Re-suspendez la pastille cellulaire et le milieu de culture complet. Ensuite, aliquotez les MLLC dans une plaque inférieure ronde de 96 puits à 4x10 jusqu’aux quatrièmes cellules par puits, et 80 microlitres de milieu de culture complet.Ajoutez 10 microgrammes par millilitre d’un seul peptide et définissez deux contrôles d’arrière-plan. Pulsation peptidique avec blocage HLADR et pulsation DMSO. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, pendant deux heures.Ajouter 100 microgrammes par millilitre de mitomycine C et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres de RPMI 1640 pour éliminer le peptide non expulsé et la mitomycine C, puis ressusquez les cellules dans 120 microlitres de milieu de culture complet, à l’aide d’un vibromasseur. Le jour 12 de l’expansion pbMC, transférez les PBMC sur une plaque inférieure ronde de 96 puits.Centrifugez les cellules dans la plaque, retirez le surnageant et lavez-les deux fois avec 200 microlitres de RPMI 1640, comme démontré précédemment. Re-suspendez les PBCC dans chaque puits avec 210 microlitres de milieu de culture complet. Pour les puits PBMC choisis pour l’identification des épitopes, aliquotez 70 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-les avec des MLLC pulsés peptidiques dans trois puits, y compris deux contrôles de fond.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après une heure d’incubation, ajouter 1,37 microgramme par millilitre de monensine à la culture et porter le volume final dans chaque puits à 200 microlitres avec un milieu de culture complet. Dans cet exemple représentatif, les réponses des lymphocytes T CD4 sécrérant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma pour le pool de peptides Core11 sont inférieures à deux fois les valeurs de fond, donc considérées comme négatives.Pendant ce temps, les réponses pour le pool de peptides Core09 sont supérieures à deux fois le fond et considérées comme positives. Le fond gris indique que Wells avec une réponse positive des lymphocytes T CD4 et les peptides candidats pour l’identification de l’épitope sont indiqués en rouge, Core01 a le taux de réponse le plus élevé, à en juger par les cellules CD4T sécrécrant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma dans les pools de peptides de colonne. Les peptides C1 à 15, C31 à 45, C61 à 75 et C91 à 105 dans ce pool de peptides, sont définis comme peptides candidats car la rangée de pools de peptides contenant ces peptides montre également des résultats positifs.Les PBCC élargis avec des pools de peptides Core07, 08, 09 et 10, sont utilisés pour l’identification des épitopes de ces peptides. De même, Core09 a le taux de réponse le plus élevé dans les pools de peptides de ligne. Tous les peptides de ce pool sont définis comme peptides candidats et les PBMCs élargis avec des pools de peptides: Core01, 02, 03, 04, 05 et 06 sont utilisés pour l’identification des épitopes de ces peptides.Pour les PBMC élargis Core08 du pool de peptides, après stimulation avec le peptide C31 à 45 BLCL pulsés, les fréquences des lymphocytes T CD4 sécrécrant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma sont deux fois plus élevées que les témoins de fond. Ainsi, le peptide C31 à 45 est un épitope vérifié des lymphocytes T CD4 restreints par HLADR. C’était là, d’autres PBMC élargis restant après l’identification de l’épitope.Le marquage fin des épitopes identifiés peut être effectué à l’aide d’un panel de peptides raccourcis.

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Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique

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