Summary
中大脳動脈閉塞の異なるモデル(MCAo)は、実験的な脳卒中研究で使用されています。ここでは、外部頸動脈(ECA)を介した一過性MCAoの実験的ストロークモデルについて説明し、これは、自然血栓溶解または治療のために脳血管血栓が除去されるヒトの脳卒中を模倣することを目的とする。
Abstract
脳卒中は、先進国における死亡の第3の最も一般的な原因であり、成人後天障害の主な原因である。現在までに、治療の選択肢は、脳卒中後最初の1時間以内に脳卒中患者のごく一部に制限されている。新しい治療戦略は、特に治療時間を延長するために広範囲に調査されています。これらの現在の調査には、脳卒中後の重要な病態生理学的経路の研究が含まれます, 例えば脳卒中後の炎症, 血管新生, 神経可塑性, 再生.過去10年間、独立した研究グループ間での実験結果や科学的知見の再現性が悪いという懸念が高まっています。いわゆる「レプリケーション危機」を克服するためには、すべての手続きのための詳細な標準化されたモデルが緊急に必要とされます。「ImmunoStroke」研究コンソーシアム(https://immunostroke.de/)における取り組みとして、一過性中大脳動脈閉塞(MCAo)の標準化されたマウスモデルが提案されている。このモデルは、フィラメントの除去時に血流を完全に回復させ、人間の脳卒中の大部分で起こる治療的または自発的な血栓の起こりをシミュレートする。この「フィラメント」ストロークモデルの外科的処置とその機能分析のためのツールは、付随するビデオで示されています。
Introduction
脳卒中は、世界中の死亡と障害の最も一般的な原因の一つです。主に2つの異なる形態の脳卒中があり、虚血性と出血性があり、全脳卒中症例の80~85%が虚血性1である。現在、虚血性脳卒中の患者には、組換え組織プラスミノーゲン活性化剤(rtPA)または機械的血栓切れによる薬理学的治療の2つの治療法のみが利用可能です。しかし、狭い治療時間枠と複数の除外基準のために、選択された患者の数だけがこれらの特定の治療オプションの恩恵を受けることができます。過去20年間で、 前臨床およびトランスレーショナル脳卒中研究は神経保護アプローチの研究に焦点を当ててきました。しかし、臨床試験に到達したすべての化合物は、これまでのところ患者2に対する改善を示していない。
in vitroモデルでは、脳卒中の脳相互作用や病態生理学的メカニズムをすべて正確に再現できないため、動物モデルは前臨床脳卒中研究にとって非常に重要です。しかし、虚血性脳卒中は非常に複雑で不均一な疾患であるため、ヒト虚血性脳卒中のすべての側面を単一の動物モデルで模倣することは不可能である。このため、異なる虚血性脳卒中モデルが異なる種で経時開発されてきた。中大脳動脈の大脳動脈または永久遠位閉塞(MCA)の光血栓症は、新皮質3、4において小さく、局所的に定義された病変を誘導するモデルとして一般的に用いられている。これらに加えて、最も一般的に使用されるストロークモデルは、おそらくMCAの過渡的な閉塞が達成されるいわゆる「フィラメントモデル」である。このモデルは、MCAの起源に縫合フィラメントを一過性に導入し、脳血流の急激な減少と皮質下および皮質脳領域のその後の大梗塞に至る5。ほとんどのストロークモデルはMCA閉塞6を模倣するが、「フィラメントモデル」は虚血時間の正確な区切りを可能にする。フィラメント除去による再灌流は、血栓溶解(rtPAまたは機械的血栓切除術)後の脳血流回復のヒト臨床シナリオを模倣する。現在までに、この「フィラメントモデル」の異なる変更が記載されている。最も一般的なアプローチでは、最初にLongaらによって記述されます。1989年5月、シリコンコーティングされたフィラメントが、共通の頸動脈(CCA)を介してMCA 7の起源に導入される。広く使用されているアプローチですが、このモデルでは、フィラメントの除去後にCCAが永久に結紮されるため、再灌流時の血流の完全な回復はできません。
過去10年間、この「フィラメントモデル」を用いてマウスの脳卒中をモデル化することに関心を持つ研究グループが増えています。しかしながら、このモデルのかなりのばらつきと、手順の標準化の欠如は、これまでに報告された実験結果と科学的知見の変動性が高く、再現性が悪い理由の一部である2,8。現在の「複製危機」の潜在的な原因は、研究所間での再現性の低さに言及し、同じ実験方法論9を用いた研究グループ間の非比較的な脳卒中梗塞量である。実際、最初の前臨床無作為化対照多施設試験試験10を実施した結果、この実験ストロークモデルの十分な標準化の欠如とその後の結果パラメータが、独立した実験室間の前臨床試験における再現性の失敗の主な理由であることを確認することができました11.結果として生じる梗塞サイズの劇的な違いは、同じストロークモデルを使用しているにもかかわらず、確認研究だけでなく、堅牢で再現可能なモデルの欠如による科学的コラボレーションにも脅威を与える。
これらの課題を踏まえ、「ImmunoStroke」研究コンソーシアム(https://immunostroke.de/)における共同研究に用いられている標準化された過渡性MCAoモデルの手順を開発し、詳細に記述することを目指しました。このコンソーシアムは、脳卒中回復の機械主義の根底にある脳と免疫の相互作用を理解することを目的としています。さらに、脳卒中の結果分析のための組織学的および関連する機能法が提示される。すべての方法は、ImmunoStrokeコンソーシアムのすべての研究所で使用される確立された標準的な操作手順に基づいています。
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Protocol
このビデオで報告された実験は、実験動物の使用に関する国家ガイドラインに従って行われ、プロトコルはドイツ政府委員会(ドイツのドイツ、ミュンヘン、ドイツ)によって承認されました。10週齢の雄C57Bl/6Jマウスを使用し、制御温度(22±2°C)で収容し、12時間の明暗サイクル期間とペレット食品および水 アドリビタムへのアクセスを行った。
1. 材料と機器の準備
- 熱毛布を接続して、麻酔中の操作領域の温度とマウス体温を37°Cに保ちます。
- オートクレーブはさみおよび鉗子は、70%エタノール溶液を準備し、利用可能なデブンタンテノールの目軟膏、綿のいくつかの部分、および5-0コーティングされた編組ポリエステル縫合糸を使用する準備ができておきます。動物の切開部位を水分補給するために、0.9%の生理食塩水(針なし)で1 mLシリンジを調製します。麻酔ガス(100%O2+イソフルラン)を準備します。
- 10 μL ピペットチップ(3~5 mm)の先端を切って、レーザードップラープローブ用のホルダーを準備します。
注:すべての器具は熱いビードの殺菌器を使用して殺菌される。表面はまた、微生物消毒スプレーで手術の前後に消毒されます。手術前、マウスの頭と胸の周囲の領域は、創傷消毒スプレーで消毒されます。
2. レーザードップラーの準備
- 手術の30分前にマウスに鎮痛薬を注入する(4mg/kgカルプロフェンおよび0,1mg/kgブプレノルフィン、腹腔内)。
- 自発的な身体運動とビブリッサエの停止まで4%のイソフルラン流量で誘導室に置くことによって、マウスを麻酔します。
- 麻酔マスク内の鼻を持つ操作領域の起こりやすい位置にマウスを置きます。さらに4%のイオブルラン濃度を維持し、それを減らし、2%に保ちます。
- 37°Cでマウスの体温を維持するために関連するフィードバック制御加熱パッドを設定し、外科的処置全体の温度を監視するために直腸プローブを静かに挿入します。
- 両目にデブサンテノール眼軟膏を適用する。
- 左目と耳を取り巻く皮膚や毛髪を70%エタノールで消毒します。
- 頭皮を左耳と目(長さ1cm)の間で切り、頭蓋骨を露出させる。
- 頭蓋の下のMCAを視覚化するために、側頭筋を切断して退断します。
- レーザードップラープローブ/ファイバーを左MCAの上に接着剤で固定して、先端の外側の部分を接着剤で固定します。次に、皮膚を接着して、先端ホルダーの周りの傷口を閉じます。2~3滴の硬化剤を塗布して、プロセスをスピードアップします。レーザードップラー繊維が接着されておらず、いつでも簡単にチップホルダーから取り外しできることを確認してください。
3. 過渡MCAoモデル(オクルージョン)
- マウスを上の位置に回します。スパウトを麻酔コーンに入れ、足をテープで固定します。
- 胸部を取り巻く皮膚や毛髪を消毒し、首に長さ2cmの中線切開を行います。
- 鉗子を使用して皮膚と顎下腺を引き離します。胸骨筋を保持し、外科分野を露出させ、左共通頸動脈(CCA)を見つけるためにリトラクターを使用してください。結合組織および周囲の神経から解放されたCCAを解剖し(迷走神経に害を与えることなく)、分岐前に一過性の結紮を行う。
- 外的頸動脈(ECA)を解剖し、最も遠位の目に見える部分で永久結び目を結ぶ。ECAの下に別の縫合線を配置し、分岐の近くに配置し、後で使用する緩い結び目を準備します。
- 内部頸動脈(ICA)を解剖し、その上に微小血管クリップを置き、分岐の上に5mm。迷走神経を傷めないようにしてください。
- タイトと緩い結紮の間のECAに小さな穴をカットします。ECA全体をカットしないように注意してください。
- フィラメントを導入し、CCAに向かって進めます。管腔の周りのECAの緩い結紮を締めて、その位置のフィラメントをすぐに固定し、微小血管クリップを取り外すときに出血を避けます。
- マイクロ血管クリップを取り外し、レーザードップラーで測定した脳血流の急激な減少(>80%)を検出することによってMCAの起源に達するまでICAを通してフィラメントを挿入します。さらに、ECAの周りの結び目を引き締めることによって、この位置のフィラメントを固定します。
注:フィラメントが適切な方向に向かうと、スムーズに進み、抵抗は見られないようにしてください。 - フィラメント挿入前と後のレーザードップラー値を記録します。
- リトラクタを取り除き、創傷を縫合する前に胸骨筋と顎下腺を再配置する。レーザードップラープローブを取り外し、37°Cの回収室に1時間(フィラメント除去まで)を入れます。
4. 過渡MCAoモデル(リパーフュージョン)
- 自発的な身体運動とビブリッサエの停止まで4%のイソフルラン流量で誘導室に置くことによって、マウスを麻酔します。
- 両目にデブサンテノール眼軟膏を適用する。
- 麻酔マスクの中に、そのスナを伴う操作領域の起こりやすい位置にマウスを置きます。さらに4%のイオブルラン濃度を維持し、それを減らし、2%に保ちます。テープで動物の足を固定します。
- レーザードップラープローブをプローブホルダーに挿入します。
- 創傷縫合糸を取り除き、皮膚と顎下腺を引き離すために鉗子を使用する。胸骨筋を優しく引っ張り、外科分野を露出させるためにレトラクターを使用してください。
- フィラメントを引き締めるECA縫合を緩め、そっとフィラメントを引っ張ります。除去中にフィラメントのシリコーンゴムコーティングを損傷しないようにしてください。
- ECA縫合糸をしっかりと結びます。
- レーザードップラー装置における脳血流の増加を確認する(再灌流前の初期値の>80%)。
- フィラメント除去の前後にレーザードップラー値を記録します。
- CCAからの分岐の前に一過性の結紮を開く。
- リトラクタを取り外し、創傷を縫合する前に胸骨筋と顎下腺を再配置する。動物を37°Cの回復室に1時間置き、麻酔から回復します。
- 回復後、マウスを温度制御された部屋のケージに戻します。
- 手術後3日目までケージの床に小さなペトリ皿にウェットフードペレットとヒドロゲルを加えることで、動物の世話をします。
- 手術後3d(4mg /kgカルプロフェンおよび0.1mg/kgブプレノルフィン)に対して12時間ごとに鎮痛を注入する。
5. シャム操作
- 上述の手順は、動脈の結紮およびフィラメントの導入を含む全ての手順を行う(ステップ1〜3.7)。
- フィラメントを挿入した直後に取り外します。その後、動物を1時間回収室に入れます。
- 再度操作領域に動物を置き、完全な脳血流回復を確実にするためにCCAの一過性の結紮を除去する。
- 創傷を縫合し、麻酔から回復するために1時間37°Cの回収室に動物を入れた。回復後、マウスを温度制御された部屋のケージに戻します。
- 手術後3日目までケージの床に小さなペトリ皿にウェットフードペレットとヒドロゲルを加えることで、動物の世話をします。
- 手術後3d(4mg /kgカルプロフェンおよび0.1mg/kgブプレノルフィン)に対して12時間ごとに鎮痛を注入する。
6. ニューロスコア
- ニューロスコアは常に同じ時間帯に実行し、個々の外科医の間で「中立的な臭い」を維持するために外科服を使用します。
- マウスは、テストの前に「開いた」ケージで部屋の中で30分間休ませます。
- 表 1と表 2の各項目を 30 s で観察します。
7. 心臓内灌流
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)-ヘパリン(2 U/mL)を含む20mLシリンジを準備し、重力駆動灌流を容易にするためにベンチの上に1m置きます。(任意:4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて、PBS、pH7.4で4%PFAを含む20mLシリンジを用いて心臓内灌流を行う。
- ケタミンとキシラジン(それぞれ120と16mg/kgの体重)のイントルペリトン100 μLを注入します。5分待って、自発的な身体運動とビブリッサエの停止を確認します。
- 動物を圧出位置に固定し、70%エタノールで腹部体表面を消毒する。
- 腹部に3cmの切開を行います;ダイヤフラム、肋骨、胸骨を切って心臓を完全に視覚化する。
- 右心房に小さな切開を行い、左心室に輸血カニューレを挿入します。
- PBS-ヘパリン20 mLを使用したパーフューズ。
- 灌流後、動物の首を切り落とし、脳を取り除きます。
- 粉末ドライアイスで脳を凍らせ、さらに使用するまで-80°Cで保存します。
8. 梗塞容積測定
- 凍結切断には、クライオスタットを使用して、脳を400μmごとに20μmの厚さのセクションに切断します。セクションをスライドに置き、使用するまで-80 °Cでスライドを保管してください。
- クレシルバイオレット(CV)染色
- 500mLのH2OでCVアセテートを溶解するまで撹拌・加熱(60°C)0.5gで染色液を調製します。溶液が冷めた後、暗いボトルに保管してください。60°Cに再加熱し、すべての使用前にフィルター。
- スライドを室温で30分間乾燥させます。95%エタノールに15分間、70%エタノールで1分間、50%エタノールで1分間浸します。
- 2分間蒸留水にスライドを浸します。蒸留水をリフレッシュし、スライドを水に1分間入れます。その後、スライドを60°Cで10分間予熱染色液に浸します。 スライドを蒸留水で2回1分間洗います。
- スライドを95%エタノールに2分間浸漬します。5分間、100%エタノールに入れる。100%エタノールをリフレッシュし、2分間エタノールにスライドを再び入れる。その後、スライドを取り付け媒体で覆います。
- 分析 (図 4C)
- スライドをスキャンし、スワンソン法12 で間接梗塞の体積を分析し、次の式を使用して浮腫を補正します。
(虚血領域)=(虚血領域)((イプシアテラミカル半球)-(対角半球))
- スライドをスキャンし、スワンソン法12 で間接梗塞の体積を分析し、次の式を使用して浮腫を補正します。
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Representative Results
ここで説明するモデルは、一般的に使用される「フィラメント」ストロークモデルの改変であり、これは、MCAの起源を一時的に遮断するためにECAを介してシリコンコーティングされたフィラメントを導入することから成っている(図1)。フィラメントを除去した後、ECA内の血流のみが永久に停止し、CCAおよびICAの完全な再活性化を可能にする。これにより、ヒト患者における薬理学的血栓溶解または機械的血栓切開に成功した後に観察された状況と同様に、脳の十分な再灌流(図2)が可能になる。また、この研究は、MCAの領域上の頭蓋骨でレーザードップラープローブに接続されたカニューレを固定することによって、閉塞と再灌流の両方の手順の間に脳血流を測定する方法についても説明する。
外科的処置の全体的な死亡率は、訓練を受けた外科医によって行われる場合<5%である。MCAo後の早期時点では、動物は一般的に重度の姿勢および運動の欠損、一般的な弱さ、および体重13の喪失を示す。これらの深刻な赤字は一過性であり、動物は約1週間後に改善された活動を示しています。したがって、欠損は、焦点神経学的症状に対してより特異的である。
MCA閉塞後の行動障害は複合ニューロスコア14によって評価された;一般的および焦点的な欠損は、手術後24時間および3dを測定した。一般的なNeuroscoreは、毛皮、耳、目、姿勢、および自発的な活動の評価を含む5つの項目(表1)を統合し、最大スコアは18です。焦点ニューロスコアは、体の対称性、歩行、登り、旋回行動、前肢対称性、強制サイクリング、ウィスカー応答の評価を含む7項目(表2)から構成され、最大スコアは28である。複合スケールは、0 (赤字なし) から 46 (重度の障害) の範囲です。脳卒中動物は、複合および焦点ニューロスコアに有意な変化を示したが、一般的なニューロスコアでは、シャム動物と比較した場合(図3)。
梗塞容積は、脳卒中誘導後24時間のコロナ連続脳部のクレシルバイオレット染色を用いても行った。梗塞容積平均は61.69mm3で、罹患した脳半球の48%を表す(図4)。訓練を受けた外科医によって行われると、この打撃モデルの全体的なばらつきは低く、変動係数は<6%である。病変領域は、体性感覚と運動皮質、および線条体のような皮質下構造を含む(図4)。
図1: アクセスとイントラミラルMCAオクルージョンのスキームフィラメント(点線)は、ECAの近位縫合糸ノットと遠位縫合糸の間に挿入され、MCAの原点に達するまでICAに沿って進む(差し込み参照)。一度所定の位置に、ECAはフィラメントを固定するために縫合糸で結紮される。略語: ACA = 前大脳動脈;BA = バジラー動脈;CCA =一般的な頸動脈;ECA =外頸動脈;ICA =内頸動脈;MCA = 中大脳動脈;PCA = 後部伝達動脈;PTG = 翼頭球性動脈.この図はジャックマンらから変更されました。15.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:閉塞と再灌流の間の血流血流はフィラメント挿入前後およびフィラメント除去の前後に登録される。閉塞中の血流の減少と再灌流中の血流の回復が認められた。すべての色は1匹の動物を表します。略語: MCA = 中大脳動脈;CBF = 脳血流;A.U. = 任意の単位。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:tMCAo後の機能障害の神経スコア(A)合計、(B)焦点、および(C)tMCAoの後に24時間および3dの前に一般的な神経スコア。オープンバー:シャム;黒いバー:tMCAo。n =1 グループあたり 10。*p < 0.05.略語: tMCAo = 一過性中大脳動脈閉塞;BL = tMCAo の前。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:tMCAo後の容積梗塞解析と梗塞結果24時間後(A)代表クレシルバイオレット染色されたコロナ脳切片をtMCAo後24時間で400μmごとに示した。破線は病変領域を区切ります。(B) tMCAo後24時間の10頭脳(各ドットが1個の脳を表す)の梗塞容積の分析水平赤線は平均値(61.69 mm3)を表し、誤差範囲は標準偏差(3.78 mm3)を示します。(C)クレシルバイオレットコロナセクションからの梗塞容積計算の代表的な画像。青 = 対角半球;赤 = イプシテラショナル半球;淡い縞模様の領域 = 虚血領域。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 得点のタイムポイント | スコア | ||
| 一般的なニューロスコア | 毛 | 0.きちんとした髪の毛と清潔 | |
| 1. 2つの身体部分(鼻と目)に局在したピロ勃起と汚れた髪 | |||
| 2. ピロ勃起と>2体の部位の汚れた髪 | |||
| 耳 (開いたベンチトップの上にマウス) | (耳は横に伸ばされ、後ろに伸ばされ、次のノイズをまっすぐにして反応します) | ||
| 1.横に伸ばされるが、後ろ(一方または両方)ではなく、ノイズに反応する | |||
| 2. 1 と同じです。ノイズに対する反応はありません。 | |||
| 目 (OBT 上のマウス) | オープン、クリーン、そして周囲の環境に素早く従う | ||
| 1. 開いて、水性粘液によって特徴付けられる。周囲の環境にゆっくりと従う | |||
| 2. 開いて、暗い粘液によって特徴付けられる | |||
| 3. 黒色粘液によって形を整え、特徴付けられる楕円体 | |||
| 4. 終了 | |||
| 姿勢 (手のひらにマウスを置き、そっと振る) | マウスは、手のひらに平行な後ろを持つ直立位置に立ちます。スイング中は、急速に立ちます。 | ||
| 1. マウスは、ザトウクジラを立たします。スイング中、体を平らにして安定を得る。 | |||
| 2. 胴体の頭や一部は手のひらの上にあります。 | |||
| 3.マウスは片側にあり、立ち上がった位置を回復するのがやっとです。 | |||
| マウスは、直立した位置を回復することができない、傾向のある位置にあります。 | |||
| スポンタネオスの活動 (OBT上のマウス) | 0.マウスは警告であり、積極的に探索します。 | ||
| 1.マウスは警戒しているように見えますが、落ち着いて低迷しています。 | |||
| 2.マウスは断続的に、そして遅く探る。 | |||
| 3.マウスはソムノレントでしびれ、その場での動きはほとんどありません。 | |||
| 自発的な動きを 4.No | |||
| 一般スコアリングの合計スコア | |||
| (ノーマル=0最大=18) | |||
表1: 一般的なニューロスコア.動物は、重症度に応じて0〜4ポイントの間で、測定された5つの一般的な赤字のそれぞれについて受け取った。異なる領域のスコアは、0から18までの範囲の合計一般的なスコアを提供するために追加されます。このテーブルはクラークら14 から変更されました。略語: OBT = オープンベンチトップ。
| 得点のタイムポイント | スコア | ||
| 焦点神経スコア | ボディシンメトリー (OBT上のマウス、ノーズテールラインを観察) | 0. ノーマル(ボディ:正常姿勢、ベンチから高い胴体、前部と後肢が体の下に傾いている。尾:ストレート) | |
| 1. わずかな非対称性(ボディ:前部と後肢が体の下に傾いている片側に傾いている。尾:わずかに曲がった) | |||
| 2. 適度な非対称性(ボディ:前部と後肢を伸ばして片側に傾く。尾:わずかに曲がった) | |||
| 3. 顕著な非対称性(ボディ:曲がった、片側にOBTにあります。尾: 曲がった) | |||
| 4.極端な非対称性(ボディ:高度に曲がった、片側に常にOBTにあります。尾:非常に曲がった) | |||
| ゲイト (OBTのマウス。妨げられない観察) | (歩行は柔軟で、対称で迅速) | ||
| 1. 硬く、柔軟性がない(ザトウクジラの歩き、通常のマウスより遅い) | |||
| 2. 非対称運動を伴うリンピング | |||
| 3. 震え、漂流、落下 | |||
| 4.自発的に歩かない(マウスを軽く押して刺激を受けると3段以上歩かない) | |||
| クライミング (45 o面上の マウス。グリップサーフェスの中央にマウスを配置します) | 0. ノーマル(マウスが素早く上昇する) | ||
| 1.緊張、四肢の弱さが存在する上昇 | |||
| 2.斜面に保持し、滑ったり登ったりしません | |||
| 3.滑り落ち、失敗を防ぐための努力に失敗 | |||
| 4. スライドはすぐに、失敗を防ぐための努力はありません | |||
| 旋回動作 (OBT上のマウス、自由観察) | 0. 周回行動がない | ||
| 1. 主に片側ターン | |||
| 2. 常にではなく、片側に円 | |||
| 3. 一方の側に絶えず円 | |||
| 4. ピボット、揺れ、または動きなし | |||
| 前肢対称( 尾部に吊り下げられたマウス) | 0. ノーマル | ||
| 1. 光非対称性:対側前肢の軽度の屈曲 | |||
| 2.マーク非対称:対側肢の屈曲をマークし、体は少し両側側に曲がる | |||
| 3. 顕著な非対称性:対側前肢が幹に付着する | |||
| 4. わずかな非対称性、身体/四肢の動きなし | |||
| 強制的な旋回 (ベンチの前肢、尾部によって吊り下げられた後肢:それは対側肢麻痺の存在を明らかにする) | 0. 不在。両前肢の正常な延長 | ||
| 1. 片側に旋回する傾向(マウスは両方前肢を伸ばすが、好ましくは片側に回り始める) | |||
| 2. 一方の側に円を描く(マウスは健康なマウスに比べて動きが遅い片側に向かう) | |||
| 3. 片側に旋回(マウスが完全な円を実行できなかった片側に向かう) | |||
| 4.前進しない(トランクの前部はベンチにあり、ゆっくりと短い動き) | |||
| ウィスカ応答 (OBT上のマウス) | 0. ノーマル | ||
| 1. 軽い非対称性(マウスは、対側で刺激されるとゆっくりと引き出す) | |||
| 2. 顕著な非対称性(対側側に刺激を与えた場合の応答なし) | |||
| 3. 反的に応答がない、刺激された場合の応答が遅い | |||
| 4. 二国間での対応がない | |||
| 焦点赤字の合計スコア | |||
| (ノーマル=0最大=28) | |||
表2: 焦点神経スコア.動物は、測定された7つの一般的な赤字のそれぞれの重症度に応じて0〜4ポイントの間で受け取った。異なる領域のスコアは、0から28までの範囲の合計焦点スコアを提供するために追加されます。このテーブルはクラークら14 から変更されました。略語: OBT = オープンベンチトップ。
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Discussion
本プロトコルは、標準化された過渡MCAoモデルを確立するためのドイツの多施設研究コンソーシアム(「ImmunoStroke」)の合意に基づく実験的ストロークモデルを記述する。ECAを介してシリコンコートフィラメントを導入してMCAの原点に導入した一過性MCAoモデルは、閉塞期間を経て動脈再灌流を達成するために最も広く使用されているストロークモデルの1つです。したがって、この手順は、翻訳上関連のストローク モデルと見なすことができます。
ビデオで提示された「フィラメントモデル」は、頭蓋骨骨組み術を必要とせず、閉塞した血管の完全な再灌流を達成するなど、以前に説明した他のストロークモデルと比較していくつかの利点があります。しかし、外科的介入の複雑さは、侵襲的な手術と気管と迷走神経に近接する異なる動脈の正確な操作を含むため、制限と考えることができる。麻酔薬の神経保護および脳卒中の結果に対する麻酔薬の影響はすでに十分に文書化されており、麻酔薬に対する動物の長期暴露も考慮すべき重要な要因となり得る。最後に、この外科的処置の複雑さにもかかわらず、訓練を受けた外科医によって行われると約20分で完了することができる。
前述の「フィラメント」ストロークプロトコル17とは対照的に、ここで説明する方法は、閉塞および再灌流相の間の脳血流の測定も可能にする。再灌流中の血流モニタリングは、血栓血管の再集水化のために薬理学的または血管内介入を受けている患者に有害な結果を引き起こすことが知られている脳卒中再灌流傷害18を防ぐための重要なパラメータとなり得る。MCAo19後の脳血流回復の結果との間の不一致にもかかわらず、脳卒中後の血流回復の変動は、脳内の病態生理学的および生化学的事象、ならびに梗塞量および脳卒中マウス20の神経学的欠損に影響を及ぼす可能性がある。したがって、このモデルでは、血流の完全な回復とその記録は、マウスの間で、特に移動性脳卒中研究において、再現性の梗塞を確保するための要件である。
外科的処置の間の全体的な死亡率は5%未満であり、主に麻酔合併症、出血、または事前定義された排除基準による犠牲によって引き起こされる。しかし、この脳卒中モデルは、脳卒中誘導後の最初の24〜48時間の中程度の死亡率を示し、脳卒中マウスの十分なコホートを達成するために実験ごとに必要な動物の数を増やす可能性がある。梗塞の体積の点では、このモデルは、半球の50%まで含む病変を伴う大きな梗塞を誘発する。また、脳浮腫を生成します, 異なる脳領域に影響を与えます, 皮質および皮質下領域を含む.
低い可変性とストロークモデルの高い再現性を達成するために、次のようないくつかの除外基準を考慮する必要があります: 1) 20分>の動作時間;2)>CCAが結紮されたときの血流減少の20%(ステップ3.3);3) 咬合中の血流の減少<最初の予時閉塞値の80%;4) 血流は、再灌流率<前再灌流値と比較して10分増加する。経験豊富で訓練を受けた外科医の場合、手術時間基準により動物は除外されません。しかし、10~15%の動物はCCAの結紮時に血流量が20%減少し、5~10%が閉塞または再灌流の間に適切な減少または増加を示さない。したがって、これらの基準に基づいて動物を除外した後の成功率は約75〜85%です。
また、動物はMCAoの後に毎日検査を受け、病気、痛み、不快感行動をコントロールします。この一般的なケアに加えて、いくつかのテストは、ロタロッド試験21、スティッキーラベルテスト21、コーナーテスト23、またはシリンダーテスト24のような感覚運動機能不全を評価するためのすべての既知のテストにもかかわらず、焦点脳虚血後の特定の行動分析のために開発された。ここで、この打撃モデルの確立のために選択された動物は、焦点及び一般的な欠損について評価された、フィラメントモデルはまた、焦点(感覚または運動)欠損とは無関係にサイトカイン病行動を誘導するので25。ここで説明する「フィラメント」ストロークモデルは、基礎的および翻訳的な脳卒中研究にとって貴重なモデルです。このモデルは、研究室間でストロークモデルを調和させるために使用される標準化されたストロークモデルとして提案されています。
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Disclosures
著者らは開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、ImmunoStrokeコンソーシアムのすべてのコラボレーションパートナーに感謝します (FOR 2879, 免疫細胞から脳卒中の回復まで) 提案と議論のために.この研究は、ドイツのドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)が、ミュンヘン・クラスター・フォー・システム・ニューロロジー(EXC 2145 SyNergy - ID 390857198)の枠組みの下でドイツの卓越性戦略の下で資金提供を受け、助成金LI-2534/7-1、LI-2534/7-1およびLL-112/1-1.1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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