Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lille plasmamembranpræparat til analyse af Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel præsenterer en lille plasmamembran isolation protokol for karakterisering af Candida albicans ABC (ATP-bindende kassette) protein Cdr1, overekspresseret i Saccharomyces cerevisiae. En protease-cleavable C-terminal mGFPHis dobbelt tag med en 16-rest linker mellem Cdr1 og mærket var designet til at lette rensning og vaskemiddel-screening af Cdr1.

Abstract

Den vellykkede biokemiske og biofysiske karakterisering af ABC-transportører afhænger i høj grad af valget af det heterologe ekspressionssystem. I løbet af de sidste to årtier har vi udviklet en gærmembranproteinekspressionsplatform, der er blevet brugt til at studere mange vigtige svampemembranproteiner. Udtrykket vært Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ slettes i syv store endogene ABC transportører, og den indeholder transskription faktor Pdr1-3 med en gain-of-function mutation, der muliggør konstituerende overekspression af heterologe membran protein gener stabilt integreret som enkelt kopier på genomisk PDR5 græshoppe. Oprettelsen af alsidige plasmid vektorer og optimering af et-trins kloning strategier muliggør hurtig og præcis kloning, mutagenese, og udtryk for heterologe ABC transportører. Her beskriver vi udviklingen og brugen af en ny protease-cleavable mGFPHis dobbelt tag (dvs. monomerisk gær forbedret grøn fluorescerende protein yEGFP3 smeltet til en seks-histidin affinitet rensning tag), der var designet til at undgå mulig indblanding af tag med protein af interesse og til at øge den bindende effektivitet af hans tag til nikkel-affinitet harpikser. Sammensmeltningen af mGFPHis til membranproteinet ORF (åben læseramme) muliggør nem kvantificering af proteinet ved inspektion af polyacrylamidgeler og påvisning af nedbrydningsprodukter, der bevarer mGFPHis-mærket. Vi demonstrerer, hvordan denne funktion letter rengøringsscreening for membranproteinslubilisering. En protokol for effektiv, hurtig og pålidelig isolering af de små plasmamembranpræparater af de C-terminalt mærkede Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overekspresseret i S. cerevisiae ADΔΔ, præsenteres. Denne lille plasmamembranisolation protokol genererer høj kvalitet plasmamembraner inden for en enkelt arbejdsdag. Plasmamembranpræparaterne kan bruges til at bestemme enzymeaktiviteterne i Cdr1- og Cdr1 mutantvarianter.

Introduction

Ekstraktionen af integrerede membranproteiner fra deres oprindelige lipidmiljø kan dramatisk påvirke deres struktur og funktion1,2,3,4. Den komplekse lipidsammensætning af biologiske membraner5 sikrer, at kritisk vigtige protein-lipidinteraktioner kan forekomme6. Lipider opretholder membraneproteinernes strukturelle integritet, hvilket gør det muligt for dem at fungere korrekt i deres membranrumsdestination(r) 7,8. Derfor er et kritisk første skridt i membranproteinrensningen udvindingen af proteinet fra dets oprindelige miljø uden at påvirke dets struktur og / eller funktion.

Der er mange hindringer for at karakterisere strukturen af membranproteiner, hvoraf de fleste er relateret til deres hydrofobiske natur, og vanskelighederne ved at udtrykke korrekt foldede og funktionelle membranproteiner i de mængder, der kræves til røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Der findes tre typer membranproteinudtrykssystemer: homologe9, heterologe13,14,15og in vitro-ekspressionssystemer 16,17. De ofte lave udtryksniveauer, eller de uoverkommelige omkostninger, af mange udtrykssystemer efterlader kun få værter som den foretrukne mulighed for at producere membranproteiner. De omfatter bakteriel vært, Escherichia coli, gær S. cerevisiae og Pichia pastoris, og højere eukaryoter såsom Sf9 insektceller eller pattedyr cellelinjer18. Alle membranproteinekspressionsteknologier har fordele og ulemper; men S. cerevisiae er måske den bedst studerede eukaryote model organisme egnet til membranproteinproduktion. Det er meget alsidigt med anvendelser inden for genteknologi, lægemiddelopdagelse, syntetisk biologi og ekspression af eukaryotemembranproteiner14,19,20,21.

I denne undersøgelse blev der anvendt en patenteret S. cerevisiae membranproteinudtryksteknologi21 med S. cerevisiae ADΔ14 og ADΔΔ22 som de foretrukne værter (Figur 1A) til at overekspressere og studere de store C. albicans multid effruglux pumpe Cdr1. Begge S. cerevisiae stammer er derivater af AD1-8u- 23, der har enten ura3 (ADΔ) eller både ura3 og his1 (ADΔΔ) gener slettet for at fjerne eventuelle falske positive uracil eller histidin prototroph transformanter som følge af uønsket integration på URA3 eller HIS1 genomisk loci. Sletningen af de 7 store multidrug efflux pumper23, angivet i figur 1A, gør ADΔΔ udsøgt følsomme over for de fleste xenobiotika. Gain-of-function mutant transskription faktor Pdr1-3 forårsager konstituerende overekspression af heterologe membran proteiner såsom Cdr1 (røde ottekanter i figur 1A) efter integration af heterolog-ORF-holdige transformation kassette (Figur 1A) på genomiske PDR5 græshoppe (blå rektangel i figur 1A) via to homologe rekombination begivenheder. Korrekt plasmamembran lokalisering af C-terminalt mGFPHis mærkede proteiner kan bekræftes af konfokal mikroskopi (Figur 1A), og hans tag kan bruges til nikkel-affinitet rensning af det mærkede protein. Kloning nogle svampe ABC transportører (f.eks Candida krusei ABC1) i pABC3-afledte plasmider var dog ikke muligt, fordi de ikke kunne formeres i Escherichia coli på grund af celletoksicitet. Dette førte til udviklingen af et-trins kloning af membranproteiner14,24 mærket på enten deres N- eller C-endestation med forskellige affinitet, epitope eller reporter tags direkte ind i S. cerevisiae ADΔΔ (Figur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammer, der overekspresserer forskellige CDR1-mutanter, kan også skabes effektivt på denne måde ved at bruge op til fem individuelle PCR-fragmenter, der overlapper med 25 bp (Figur 1C). Ved at anvende denne protokol kan mange ORF'er af interesse klones, udtrykkes og karakteriseres til lave omkostninger og med høj effektivitet inden for meget kort tid. Transformationseffektiviteten reducerer kun ~ 2 gange med hvert ekstra PCR-fragment.

Hvis det ønskes, kan udtryksniveauer også let manipuleres af primerdesign til forudsigeligt at justere udtryksniveauer ned til et sted mellem 0,1%-50% af de normalt høje, konstituerende udtryksniveauer25. Den optimerede, multifunktionelle, pABC314 derivatkloningsvektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) indeholder et HRV-3C protease kavalergangssted (X; LEVLFQ| GP), en protease, der klarer sig bedre ved 4 °C end den ofte anvendte tEV-protease (Tobacco ætsinfektionsvirus)27. L er en fem aminosyre (GSGGS) linker, mGFP er en monomerisk mutant (A206K)28,29 version af gær forbedret grøn fluorescens protein variant yEGFP330, og Hans er en tre aminosyre linker (GGS) efterfulgt af seks-histidin (HHHHHH) nikkel-affinitet protein tag.

Denne ekspressionsteknologi er med succes blevet brugt i lægemiddelopdagelse og studiet af membranproteiner. Den første struktur for en svampe azol stof mål, S. cerevisiae Erg1131, blev løst ved hjælp af denne teknologi. Det gjorde det også muligt detaljeret karakterisering af C. albicans Cdr132,33,34 og oprettelsen af en cysteine-mangelfuld Cdr1molekyle 35 egnet til cystein-crosslinking undersøgelser for at kontrollere enhver fremtidig høj opløsning struktur. Mange andre ABC-transportører fra store menneskelige svampepatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei og Fusarium solani artskompleks) er også blevet undersøgt i detaljer ved hjælp af denne udtryksplatform24,36,37,38,39. Dette har gjort det muligt for generering af et panel af S. cerevisiae stammer overekspressere efflux pumper, der er blevet brugt i high-throughput skærme til at opdage den nye fluorescerende efflux pumpe substrat Nile rød40 og specifikke41 og bredspektret14,33,42,43,44 efflux pumpe hæmmere. Brugen af dette system også gjort det muligt at opdage clorgyline som den første af sin art bredspektret svampe multidrug efflux pumpe hæmmer42.

Fuldstændig opløselighed af membranproteiner og oprettelsen af et homogent membranproteinmikrollerpræparat uden endogene lipider kræver høje vaskemiddelkoncentrationer45. Men desværre inaktiverer dette også ofte membranproteinet5,8,45,46. Egenskaberne af vaskemiddelmonomerer og deres sammenlægning i opløsning påvirkes af den hydrofobiske hales fysiske egenskaber, længden og forgrening af alkylkæden, tilstedeværelsen af en aromatisk kerne eller fluorokylal sidekæde eller antallet af polyoxyethylenenheder. Derfor er vaskemiddelscreening et vigtigt første skridt til at bestemme det mest egnede vaskemiddel til membranproteinslubilisering og rensning.

C. albicans er et stort humant svampepatogen af immunkompromitterede individer, der kan forårsage alvorlige, livstruende invasive infektioner47, og det kan blive resistent over for azol svampedræbende lægemidler48,49. En af de vigtigste mekanismer i C. albicans multidrug modstand er overekspression af Cdr150, som er en type II ATP-bindende kassette (ABC) transporter51 af ABCG subfamily placeret i plasmamembranen. Fuld størrelse svampe ABCG transportører (bestående af to nukleotid bindende domæner [NBDs] og to transmembrane domæner [TMDs]) er mere almindeligt kendt som pleiotropisk lægemiddelresistens (PDR) transportører og er kendetegnet ved deres unikke omvendt domæne topologi [NBD-TMD]2. PDR transportører findes kun i planter52,53 og svampe54. På trods af deres betydning er der ingen strukturer for PDR-transportører, selv om strukturer til menneskelige halv størrelse ABCG transportører for nylig er blevet løst, som hjalp med at skabe den første foreløbige model for Cdr133. Vores seneste eksperimentelle beviser tyder imidlertid på, at denne model er fejlbehæftet muligvis fordi svampe PDR transportører har karakteristiske asymmetriske NBDs resulterer muligvis i en unik transportmekanisme. En høj opløsning struktur Cdr1 er derfor nødvendig for både rationelt design af nye efflux pumpe hæmmere, der kan hjælpe med at overvinde efflux-medieret lægemiddelresistens, og at give indsigt i virkningsmekanismen af denne vigtige ABC transporter familie.

Formålet med denne undersøgelse var at udvikle pålidelige protokoller for udtryk, opløselighed og rensning af Cdr1 i den genetisk modificerede S. cerevisiae udtryk vært, med det endelige formål at opnå en høj opløsning struktur for Cdr1. Som en del af denne proces, en protease-cleavable mGFPHis dobbelt tag (Figur 1B) blev designet med en 16-rest linker adskille tag fra C-endestation af Cdr1, som forbedret binding af vedlagte 6x Hans affinitet tag til nikkel-affinitet harpiks og muliggjorde overvågning af Cdr1 udtryksniveauer i levende celler og under hele rensningsprocessen. En reproducerbar protokol for små gærplasmamembranproteinpræparater, der indeholder ca. 10% C. albicans Cdr1 (som anslået af Coomassie farvning efter SDS-PAGE) blev også udviklet, som kunne bruges til biokemisk karakterisering af Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af friske eller frosne lagre af transformationskomne ADΔ- og ADΔΔ-celler

  1. Pod 25 mL af 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) peptone, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (komplet supplementblanding)]35 medium med en enkelt gærkoloni og inkubere natten over (o/n) i 16 timer ved 30 °C med rysten ved 200 omdrejninger pr. minut (rpm).
  2. Pod 225 mL 2x YPCD medium med 25 mL o/n-kulturen, og kontroller den optiske celletæthed ved 600 nm (OD600); OD600 er normalt ~ 0,5-1,0.
    BEMÆRK: På dette stadium skal du sørge for, at alle materialer, der kræves til følgende transformationseksperiment, er let tilgængelige.
  3. Dyrk kulturen ved 30 °C i yderligere ~6-8 timer med rystelser ved 200 omdr./min,indtil celletætheden når en OD600 på ~6-8.
    BEMÆRK: Følgende trin udføres ved stuetemperatur (RT), medmindre andet er angivet.
  4. Høst disse logaritmiske fase celler ved centrifugering ved 3.000 x g i 3 min.
  5. Brug cellerne igen og vask dem to gange med sterilt dobbeltdestilleret vand (ddH2O; dvs. 200 mL og derefter 20 mL).
  6. Høst cellerne ved 3.000 x g i 3 min.
  7. Langsomt (dvs. tilsættes 30 lige store aliquots af frossen kompetent celleopløsning (FCC) hvert minut i 30 min) cell pellet i X mL af FCC [5% (w/v) glycerol, 10% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO)] på is (hvor X = OD600; f.eks. hvis OD600 = 6 resuspend i 6 mL, eller hvis OD600 = 3 resuspend i 3 mL).
    BEMÆRK: Den korrekte FCC-sammensætning er afgørende for transformationssuccesen.
  8. Hold cellerne på is i 2 timer før transformation eller opbevar aliquots ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: ADΔ- og ADΔΔ-celler er meget følsomme over for frysning. Cellerne skal således afkøles langsomt til -80 °C: Læg iskolde mikrocentrifugrør, der indeholder 50-600 μL-celle aliquots, i en plastopbevaringskasse (RT). Placer kassen i en større polystyrenbeholder (RT), og luk beholderen med et passende polystyrenlåg. Sæt derefter beholderen i fryseren på -80 °C.
    FORSIGTIG: Langsom frysning er afgørende for cellens overlevelse.

2. Transformation af ADΔ og ADΔΔ med CaCDR1-XLmGFPHis og bekræftelse af korrekte transformanter ved koloni PCR og DNA sekventering

BEMÆRK: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis blev oprettet ved hjælp af konventionelle kloningsstrategier beskrevet i detaljer i Lamping et al., 201055 og er illustreret i figur 1B. Wild-type C. albicans CDR1 blev isoleret som en PacI /Ikkejeg fragment fra plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 og klonet til pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR forstærker hele CDR1-transformationskassetten med en high-fidelity DNA-polymerase og primerpar PDR5-pro/PDR5-ter35 ved hjælp af 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis som en DNA-skabelon eller alternativt fordøje 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis til færdiggørelse med 10 U-begrænsningsenzym AscI ved 37 °C (Figur 1A, B).
    BEMÆRK: CDR1-transformationskassetten (Figur 1A) består af PDR5-promotoren - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 terminator - URA3 selection marker - PDR5 downstream region.
  2. Udfør agarose gel elektroforese og gel udtrække ~ 8 kb transformation kassette.
    BEMÆRK: Gelrensning af ~8 kb CaCDR1 transformationskassetten fjerner enhver mulig ufordøjet plasmid-DNA, hvilket kan føre til forkerte transformanter, der har hele plasmiden, snarere end den lineære transformationskassette, integreret på det genomiske PDR5-græshoppe.
  3. Denaturere den nødvendige mængde laksesædsbærer-DNA (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) i 10 min. i et kogende vandbad og hold på is. Brug skrue-capped rør til kogende laks sperm DNA for at undgå åbning af låget.
  4. Bland 50 μL denatureret laksesæds DNA med 14 μL af transformationskassetten (500-2.000 ng), og opbevar DNA-blandingen på 64 μL på isen indtil videre.
    BEMÆRK: Brug 10 ng af en E. coli-gær shuttle plasmid (f.eks. pYES2) som en positiv transformationskontrol (figur 2B).
  5. Friske eller frosne kompetente celler, der hurtigt optøes i 5 min i et 30 °C-vandbad, og de opdeles i 50 μL aliquots i 1,5 mL mikrocentrifugerør.
  6. Høst celler ved centrifugering i 1 min i en mikrofuge ved maksimal hastighed (18.000 x g).
  7. Fjern supernatanten, og hold cellepillen på RT.
  8. For hver transformation blandes 296 μL-kombinationer (RT) på 260 μL på 50 % (w/v) polyethylenglycol (PEG 3350) og 36 μL 1 M lithiumacetat (LiAc) ved gentagne rørføring med de relevante 64 μL iskolde DNA-blandinger.
  9. Den relevante blanding tilsættes straks til en 50 μL kompetent celle pellet aliquot.
  10. Resuspend cellepillen i 360 μL PEG-LiAc-DNA-blandingen ved grundigt at hvirvle i ca. 30 s.
  11. Celleblandingen inkuberes i et 30 °C vandbad i 1 time.
    BEMÆRK: ADΔ- og ADΔΔ-celler omdannes bedre ved 30 °C end ved 42 °C35.
  12. Høst cellerne ved 18.000 x g i 10 s. Supernatanten kasseres, og cell pelleten genbruges i 80 μL ddH2O.
  13. Spred cellerne på en CSM-URA agarplade35 [dvs. 0,67% (w/v) gær nitrogenbase uden aminosyrer, 0,077% (w/v) CSM minus uracil, 2% (w/v) glukose og 2% (w/v) agar].
  14. Pladerne inkuberes i 2-3 dage ved 30 °C, indtil uracil prototroph transformanter er tydeligt synlige.
    BEMÆRK: Forvent ~ 100 transformanter pr μg af den lineære ~ 8 kb CaCDR1 transformation kassette og ~ 4 x 104 transformanter pr μg pYES2.
  15. Vælg fem uafhængige transformanter og spred dem på en frisk CSM-URA plade for at adskille uracil prototroph transformanter fra rester af ikke-transformerede værtsceller.
  16. Fjern eventuelle petite mutanter ved at dyrke transformanterne på YPG-agar plader [1% (w /v) gær ekstrakt, 2% (w /v) peptone, 2% (v/v) glycerol og 2% (w/v) agar] (Figur 2D).
    BEMÆRK: Petite mutanter har defekt mitokondrier og kan derfor ikke vokse på ikke-fermenterbare kulstofkilder. De er ret almindelige i S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ og ADΔΔ er særligt tilbøjelige til at erhverve den petite fænotype.
  17. Udfør gærkoloni PCR og bekræfte mindst tre uafhængige transformanter, der skal korrekt integreret i genomisk PDR5 græshoppe (Figur 1C) ved at forstærke hele ~ 8 kb CaCDR1 transformation kassette med en bestemt DNA polymerase, der er optimeret til at forstærke PCR-produkter fra urene DNA skabelon kilder. Brug et sæt primere, der binder lige uden for integrationsstedet, og 1 μL aliquots af celleaffjedring (i ddH2O), der er afledt af enkelte kolonier som DNA-skabeloner.
    BEMÆRK: Denne særlige DNA polymerase forstærker pålideligt ~ 8 kb PCR-fragmenter fra intakte gærceller. For pålidelig forstærkning kræves der dog 45 PCR-cyklusser, og gærcellerne skal suspenderes ved OD600 1-10 i ddH2O.
  18. Bekræft det korrekte ~8 kb PCR-forstærkningsprodukt ved HJÆLP-agarosegelelektroforese af en 1 μL-del af PCR-reaktionen.
  19. Fjern overskydende forstærkningsgrundere fra en 10 μL-del af PCR-reaktionen med en enzymblanding af en DNA-exonuclease med en enkeltstrenget og en fosfatase efter fabrikantens anvisninger, før hele ORF sekventeres ved hjælp af dele af den behandlede DNA-prøve med passende primere.

3. Lille gær plasma membran isolation protokol

  1. Voksende gærceller
    1. Pre-kultur en enkelt gær koloni i 10 mL af YPD ved 30 ° C for ~ 7-8 timer med rysten ved 200 rpm.
    2. Pod 40 mL YPD-medium med 10 mL-prækulturen og inkuberes cellerne ved 30 °C o/n (~16 h) med rystelser ved 200 o/min, indtil celletætheden når en OD600 på 1-3.
  2. Høst af gærceller
    1. Høst 40 OD-enheder (ODU; f.eks. 1 mL ved en OD600 på 1 = 1 ODU) af logaritmisk fase celler ved 4.200 x g i 5 min ved 4 °C.
    2. Resuspend og vask celler to gange med iskold steril ddH2O (dvs. 40 mL og derefter 1 mL; høstceller i mellem trin ved centrifugering ved 4.200 x g i 5 min ved 4 °C).
    3. Brug pelleten i 1 mL iskold steril ddH2O og overfør celleaffjedringen til et forkølet (på is) 1,5 mL mikrocentrifugrør.
    4. Høstceller ved 3.300 x g i 3 min ved 4 °C.
    5. Aspirere supernatanten.
    6. Cell pelleten genbruges i 0,5 mL homogeniseringsbuffer [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glycerol; pH 7,5] frisk suppleret med 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF).
      BEMÆRK: Tilsæt altid PMSF frisk, fordi PMSF aktiveres hurtigt ved udsættelse for vand.
      FORSIGTIG: PMSF er en serin proteasehæmmer, som er ekstremt ætsende og ødelæggende for væv. Det kan forårsage uoprettelig øjenskade.
    7. Celleaffjedringen opbevares ved -80 °C, eller brug den med det samme.
  3. Isolering af plasmamembraner
    1. Hvis frosset, optø cellerne på is i ~ 1 time.
    2. Tilsæt iskolde silicaperler med en diameter på 0,5 mm til celleaffjedringen på 0,5 mL for at nå et samlet volumen på 1 mL.
    3. Bryd celler med 6 cyklusser af hvirvler ved maksimal rysteintensitet i 1 min afbrudt med 3 min afkøling perioder på is.
    4. Lav et tyndt hul i bunden af røret med en opvarmet skalpelblad.
    5. Den ødelagte celle homogenat gennem bunden af røret monteret i en anden iskold 1,5 mL mikrocentrifuge rør med en 10 s lav hastighed (~ 200 rpm) spin.
      BEMÆRK: Dette sikrer, at silicaperlerne forbliver i det originale rør.
    6. Centrifuge cellen homogenisere ved 5.156 x g i 5 min ved 4 °C for at fjerne cellerester, ubrudte celler og kerner.
    7. Overfør 450 μL supernatant til et iskoldt 1,5 mL mikrocentrifugerør, og der tilsættes yderligere 1 mL iskold HB suppleret med frisk PMSF (1 mM).
      BEMÆRK: Dette fortyndingstrin er afgørende for plasmamembranproteingendannelse af høj kvalitet.
    8. Høst plasmamembraner ved 17.968 x g i 1 time ved 4 °C, og genbrug plasmamembranpillen ved gentagne rørføringer i 100 μL HB, der er frisk suppleret med 1 mM PMSF. Løsn cellepillen for korrekt plasmamembran homogenisering ved at omrøre cellepillen med 100 μL pipettespidsen, før hb's 100 μL frigives og op og ned.
    9. Mål proteinkoncentrationen af plasmamembranpræparatet med et proteinanalysesæt, der er kompatibelt med buffere, der indeholder reducerende middel og vaskemiddel.
    10. Plasmamembranerne opbevares ved -80 °C, eller opbevar den på is til øjeblikkelig brug.

4. Natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)

  1. Saml apparatet til fremstilling af polyacrylamidgeler.
  2. For to adskillende geler (7% polyacrylamid) blandes 2,1 mL 40% acrylamid/bis-acrylamid 3 mL 4x separerende buffer (1,5 M Tris, 0,4% natrium dodecyl sulfat [SDS] (w/v); pH 8.8) og 6,9 mL ddH2O. Tilsæt 8 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) og 60 μL på 10% ammoniumpersulfat (APS) til påbegyndelse af polymerisering af acrylamid.
    FORSIGTIG: Acrylamid/bis-acrylamid er meget giftigt. Det forårsager hudirritation, perifer neuropati og er kræftfremkaldende. TEMED er skadeligt, hvis det sluges eller indåndes. APS er skadeligt, hvis det sluges. Det forårsager alvorlige øjen- og hudirritationer.
  3. Hæld ~ 4-5 mL af denne blanding i det samlede gelapparat, op til ~ 2 cm fra toppen.
  4. Forsigtigt lag ~ 1-2 mL af 0,1% SDS på toppen for at skabe en planar menisk.
  5. Lad polyacrylamid indstilles til ~ 60 min på RT.
  6. Der fremstilles en stablingsgelblanding til to geler ved at blande 0,5 mL 40% acrylamid/bis-acrylamid, 1 mL 4x stablingsbuffer (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) og 6,9 mL ddH2O. Tilsæt 2 μL TEMED og 30 μL på 10% APS for at indlede polymerisering af acrylamid.
  7. Fjern 0,1% SDS-laget fra den polymeriserede adskillegel og skyl med ddH2O for at fjerne spor af SDS.
  8. Hæld stabling gel mix på adskillelse gel.
  9. Placer en kam i stabling gel og fjerne eventuelle luftbobler fra omkring kammen.
  10. Lad stablingsgelen indstilles til ~ 60 min på RT.
  11. Fjern kammen og skyl gelåbningerne med vand. Sæt gelen i geltanken og fyld geltanken til toppen med 1x løbebuffer (24,8 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1% SDS).
    BEMÆRK: Forbered 1x løbebuffer fra en 10x bufferlager (248 mM Tris, 1,9 M glycin, 1% SDS (w/v) i ddH2O), der er gemt hos RT.
  12. Bland 5-10 μL plasmamembranprøver (dvs. 10-20 μg protein) med lige store mængder 2x proteinbelastningsfarve [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glycerol, 0,02% bromophenolblå, 4% SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] og læs straks i individuelle gel slots nedsænket i løbebuffer.
    FORSIGTIG: DTT er skadeligt, hvis det sluges. Det forårsager alvorlige øjen- og hudirritationer.
    BEMÆRK: Lav en 10 mL lager af 2x protein lastning farvestof, aliquot og opbevares på -20 °C. Opvarm ikke de blandede prøver, men læg dem straks i individuelle gelåbninger, så GFP-mærket ikke denatureres, og fluorescenssignalerne kan detekteres.
  13. Læg protein molekylvægt markører (10-245 kDa rækkevidde) i en separat slot for at muliggøre størrelsen estimering af individuelle proteinfragmenter.
  14. Udfør gelelektroforese ved 200 V, indtil det blå læssefarve når bunden af gelen (normalt 45-55 min).
  15. Undersøg gelen for in-gel GFP-fluorescens med en gel imaging system (excitation og emission bølgelængder er 475-485 nm og 520 nm, henholdsvis).
  16. Efter in-gel fluorescens billeddannelse, fastsætte proteiner ved blid agitation af gelen i ~ 10-20 ml Protein Gel Fixing Solution (40% ethanol, 10% eddikesyre) i 15 min på RT.
  17. Skyl gelen to gange i 10 min med 10 mL ddH2O og visualiser proteinbånd ved at placere gelen i 10 mL kolloid Coomassie pletopløsning med blid rystelser for ~ 1 time på RT.
  18. For forbedret visualisering af proteinbånd, de-plette gelen en eller to gange i ~ 20 mL af ddH2O for ~ 1 time før optagelse af billeder med gel imaging system.

5. Bestemmelse af Cdr1 ATPase Aktiviteter 57

  1. Fortyndede plasmamembranprøver >2,2 mg/mL til 1-2 mg/mL i HB.
  2. Ekvilibrere ATPase-analysens cocktail (75 mM MES-Tris, 75 mM kaliumnitrat, 0,3 mM ammonium molybdate, 7,5 mM natrium azid; pH 7,5) og Mg-ATP (28,8 mM ATP disodiumsalt, 28,8 m MgM MgCl2; pH 7,0) til 30 °C i en inkubator på 30 °C.
    FORSIGTIG: Natriumhyrde er meget giftigt.
    BEMÆRK: Sørg for, at alle bufferlagre og flasker er fosfatfri; dvs. vaskes glas med 1% (vol/vol) HCl og skylles flere gange med ddH2O. Også holde det adskilt fra andre glasvarer, der sandsynligvis indeholder spor af fosfat almindeligt til stede i rengøringsmidler, der anvendes til at vaske glasvarer.
  3. Der tilsættes 90 μL assaycocktail med eller uden Cdr1-ATPase-hæmmer (20 μM oligomycin) i individuelle brønde af en 96-brønds mikrotiterplade.
    BEMÆRK: Analysen udføres i tredotel.
  4. Der tilsættes 5 μL af de isolerede plasmamembraner (~5-10 μg protein) eller fosfatstandarder (0-100 nmoles Pi) i mikrotiterpladens passende brønde.
    BEMÆRK: Behold den første og sidste kolonne for to separate sæt fosfatstandarder.
  5. Analysen startes ved at tilsætte 25 μL for forvarmede 28,8 mM Mg-ATP (6 mM endelig koncentration) med en multikanalpipette i individuelle brønde og inkuberes ved 30 °C i 30 min.
  6. Stop reaktionen ved at tilsætte 130 μL udviklingsreagens (1,6% natrium L-ascorbat, 1% SDS, 12% ammonium molybdate i 6 M svovlsyre).
    FORSIGTIG: Koncentreret svovlsyre reagerer voldsomt med vand. Det er ætsende og kan forårsage hud- og lungeskader.
  7. Inkuber på RT i 10 min.
  8. Læs absorbansen af mikrotiterpladen brønde ved 750 nm med en microtiter pladelæser.
    BEMÆRK: At holde sig til 10 minutters inkubationstid for udvikling af blåt farvestof (dvs. et reduceret fosfor-molybdænkompleks) er afgørende for analysens nøjagtighed, fordi udviklingen af det blå farvestof fortsætter med tiden.
  9. Opnå den Cdr1-specifikke ATPase-aktivitet (dvs. den oligomycinfølsomme ATPase-aktivitet) ved at trække ATPase-aktiviteten i nærværelse af oligomæcin fra den samlede ATPase-aktivitet i mangel af oligomycin.

6. Lille skala vaskemiddel skærm

  1. Mejetærsmamembranpræparaterne (dvs. 2,5 mg plasmamembranprotein) af celler, der overekspresserer Cdr1-mGFPHis, med GTED-20 buffer [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glycerol; pH 7,5; frisk suppleret med 1 mM PMSF] indeholdende 5 mg af testvaskemidlet for at nå et samlet volumen på 0,5 mL suppleret med 1 % (w/v) vaskemiddel.
  2. Blandingen roteres ved 4-8 °C i 2 timer med en rotationsanordning.
  3. Centrifuge blandingen ved 141.000 x g ved 4 °C i 1 time.
  4. Overfør supernatanten, der indeholder opløseligt materiale, til et friskt mikrocentrifugrør.
  5. Der tilsættes 0,5 mL GTED-20 buffer suppleret med 2 % (w/v) SDS til den uopløselige pillefraktion, og inkuberes ved 30 °C o/n i en rystende inkubator for at udtrække alt vaskemiddel-uopløseligt membranprotein.
  6. Analysere og sammenligne supernatant og opløses pellet brøker af SDS-PAGE.
  7. Foto geler, der indeholder GFP-mærkede proteiner til in-gel GFP-fluorescens før Coomassie farvning og kvantificere udtryksniveauer med billedbehandlingssystemet.
  8. Brug den opløselige membranproteinfraktion til downstream-applikationer såsom ekskl. fluorescensstørrelses eksklusionskromatografi (FSEC)58 til at identificere egnede vaskemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En høj frekvens af transformation af S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) blev opnået med pYES2 (Figur 2B). Som forventet gav no DNA (dvs. kun ddH2O) kontrol ingen transformanter, og 1 μg af den lineære CDR1-mGFPHis transformationskassette (Figur 1A) gav ~ 50 transformanter (Figur 2C) med den optimerede ADΔΔ transformationsprotokol. CDR1-mGFPHis transformanter blev også testet for deres evne til at vokse på en ikke-fermenterbar kulstofkilde for at eliminere eventuelle petite mutanter med defekt mitokondrier. Tre (gule cirkler; Figur 2D) af de 25 uracil-prototroph transformanter, der blev testet, ikke kunne vokse på YPG-agarplader og blev kasseret fra yderligere undersøgelser. Cdr1-mGFPHis udtrykt ved den nyoprettede stamme ADΔΔ-CDR1-mGFPHis er korrekt lokaliseret i plasmamembranen (Figur 1A) og blev udtrykt på tilstrækkelige niveauer til strukturel og funktionel karakterisering af Cdr1 (Figur 3). Designet af den optimerede dobbelt tag (Figur 1B) gør det også muligt at fjerne mGFPHis dobbelt tag efter Nickel-affinitet rensning af Cdr1-mGFPHis at forhindre mulig interferens fra tag i downstream applikationer. Foreløbige resultater har imidlertid vist, at 3 aminosyre linker mellem Cdr1 og HRV-3C protease kavalergang site kan være nødt til at udvides for at opnå hurtigere, mere effektiv, kavalergang. Lignende observationer blev for nylig rapporteret for N-terminalt mærkede nucleoside transporter Escherichia coli NupC, som krævede en 15 snarere end den oprindeligt designede 3 aminosyre linker for effektiv kavalergang af vaskemiddel (DDM) opløses NupC bundet til Nikkel-affinitet harpiks59. Den 5 aminosyre linker C-terminal af HRV-3C kavalergangsstedet forhindrer sterisk interferens af mGFPHans dobbelt tag med vedlagte protein af interesse, som vi tidligere har observeret for C. utilis ABC transporter Cdr139. YEGFP3-A206K-mutationen blev oprettet for at forhindre kunstig GFP-dimerisering ved høje proteinkoncentrationer28, og den ekstra 3 aminosyreforbindelse mellem mGFP og Hans Nikkel-affinitets tag sikrer korrekt overfladeeksponering af Hans tag for at maksimere bindingseffektiviteten af det mærkede protein til nikkel affinitetsharpiksen (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: En gærmembranproteinudtryksplatform til effektiv kloning og ekspression af svampeplasmamembrantransportører. (A) En transformationskassette bestående af PDR5-promotoren (blå), CDR1 (rød) C-terminalt mærket med XLmGFPHis (grøn), PGK1 terminator (orange), URA3-udvælgelsesmarkøren (lyseblå) og et stykke PDR5 downstream-region (blå) bruges til at omdanne udtrykket vært S.cer evisiae ADΔΔ ved integration på det genomiske PDR5 locus. Gain-of-function mutant transskription faktor Pdr1-3 forårsager konstituerende overekspression af Cdr1 (røde oktagoner) i plasmamembranen (se konfokal mikroskopi billede nedenunder). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, som kan bruges i en traditionel kloning strategi eller som en PCR skabelon til at generere en transformation kassette. Forbedringer af plasmid pABC3-XLmGFPHis over pABC3-GFP14 er opført under plasmidkortet. (C) En alternativ mere effektiv et-trins kloning strategi for at integrere transformation kassette på genomisk PDR5 græshoppe af ADΔΔ. En ORF (rød) kan pcr forstærkes ved hjælp af primere (pile), der skaber overlapninger med venstre arm (blå; PDR5 promotor) og højre arm (grøn; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 nedstrøms) fragmenter. Mutationer (sorte linjer) kan indføres i ORF ved primer design, hvis det er nødvendigt. Homologe rekombinationshændelser, der styrer den korrekte integration på PDR5-locus, angives af de krydsede stiplede linjer. (D) Hele celle assays, der kan bruges til funktionel karakterisering af svampe multidrug efflux pumper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Transformation af ADΔΔ med CDR1-mGFPHis transformation kassette og eliminering af petite ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformanter. Uracil prototroph transformanter blev udvalgt ved inkubation af transformerede ADΔΔ-celler på CSM-URA plader ved 30 °C i 3 dage. (A) Negativ kontrol (intet DNA). (B) Positiv kontrol (10 ng af pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformanter (1 μg DNA). (D) Test ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformanter til en petite fænotype på YPG agar plader. Petite transformanter, der ikke kunne vokse på YPG agar plader på grund af defekte mitokondrier er omgivet af gul. Klik her for at se en større version af dette tal.

GFP-fluorescensen er en pålidelig foranstaltning for Cdr1-udtryksniveauer, da der var en lineær sammenhæng mellem mængden af Cdr1-mGFPHis (trin 3.3.9) og in-gel fluorescenssignaler (Figur 3A). I dette projekt blev der udviklet en reproducerbar optimeret arbejdsgang til hurtig generering af små plasmamembranpræparater af høj kvalitet til biokemisk karakterisering af plasmamembranproteiner. Det var muligt at generere næsten 0,5 mg plasmamembranprotein (figur 3C; venstre graf), der viser den højeste Cdr1 ATPase-aktivitet ( ̃400 nmol/min/mg; Figur 3C; højre graf) ved brud på 40 ODU af logaritmisk fase (OD600nm af 1-3) celler (ophængt i 0,5 mL HB) med samme volumen (dvs. 0,5 mL) silicaperler og 6 cyklusser af hvirvlende i 1 min ved maksimal rysteintensitet efterfulgt af 3 min afkølingsperioder på is. Yderligere stigning i antallet af brudcyklusser (trin 3.3.3) reducerede kvaliteten af det isolerede plasmamembranpræparat (Cdr1 ATPase-aktiviteten faldt fra 170 nmol/min/mg til ~60 nmol/min/mg; data, der ikke er vist). Selv om der kun var mindre forskelle i SDS-PAGE-proteinmønstrene i plasmamembranprøverne isoleret fra celler, der var brudt med et større antal brudcyklusser (data, der ikke er vist), er det sandsynligt, at de næsten 3 gange reducerede Cdr1 ATPase-aktiviteter efter 10 eller flere brudcyklusser skyldtes enten: i) delvis denaturering af Cdr1 på grund af eksponering for forhøjet temperatur; ii) postoversættelsesmæssige ændringer såsom fosforylering eller dephosphorylation; eller med iii) øget krydskontaminering af de isolerede plasmamembran vesikler med membranfraktioner af andre organeller. Brud på 40 ODU celler i 0,5 mL HB gav den højeste kvalitet af plasmamembraner (dvs. den mest Cdr1 pr. 10 μg plasmamembranprotein; Figur 3B) med højeste Cdr1 ATPase-aktivitet(figur 3C; højre graf). Højere (> 40 ODU/0,5 mL HB) eller lavere (20 ODU/0,5 mL HB) celletæthed reducerede ATPase-aktiviteten i de isolerede plasmamembraner (figur 3C; højre graf), selv om deres udbytte steg i forhold til stigende celletæthed(figur 3C; venstre graf). Således var 40 ODU/0,5 mL HB den optimale celletæthed til isolering af plasmamembranernes højeste kvalitet. Så ved hjælp af den optimerede protokol til den lille isolation af plasmamembranpræparater førte til 2-3 gange højere Cdr1 specifikke ATPase-aktiviteter (~ 300 nmol / min / mg; Figur 3C; graf) sammenlignet med de Cdr1-specifikke ATPase-aktiviteter, der oprindeligt blev opnået (~100 nmol/min/mg; data, der ikke blev vist). Disse ATPase-aktiviteter var også betydeligt højere35 end nogen tidligere rapporterede Cdr1 ATPase-aktiviteter (100-200 nmol/min/mg), der var opnået med en mere arbejdskrævende og tidskrævende storskala plasmamembranpræparat protokol14,41,60.

Den mest almindelige metode til at udtrække membranproteiner fra biologiske membraner er opløselighed med vaskemiddel. Udfordringen er imidlertid at finde et egnet vaskemiddel, der har den mindst skadelige virkning på proteinstabiliteten og/eller foldeegenskaberne. Mærkning af proteinet med mGFPHis letter screeningen for at vælge det eller de bedste vaskemidler til proteinudvinding. I alt blev 31 vaskemidler, der er opført i materialetabellen, med forskellige egenskaber testet for deres evne til at opløse Cdr1 fra rå plasmamembraner af S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis celler. Resultaterne for et repræsentativt sæt på 16 rengøringsmidler (A-Q) er vist i figur 3D. Vognbane T, P og S indeholder 10 μL aliquots af det samlede (T) plasmamembranprotein umiddelbart efter rengøringsmidlets opløselighed (trin 6.2) og den vasksmiddelløse pellet (P; forstærket o/n i 0,5 mL GTED-20, 2% SDS; trin 6,5) og det vaskemiddelopløselige supernatant (S; trin 6,4) fraktioner efter adskillelse ved ultracentrifugering ved 141.000 x g. Det ønskede vaskemiddel skal opløse så meget Cdr1-mGFPHis som muligt uden at ændre dets struktur og/eller funktion. De rå plasmamembranproteiner (5 mg/mL) blev opløset i 2 timer med 1 % (w/v) vaskemiddel (T) og aliquots af de opløselige (S) og uopløselige (P) fraktioner blev analyseret af SDS-PAGE (Figur 3D) og senere også ved fluorescens-detektion størrelsesudelukkelseskromatografi (FSEC)58 (figur 4). Vi fastslog, at et minimum vaskemiddel til protein forholdet mellem 2:1 (w / w) var påkrævet for effektiv solubilisering af Cdr1. Faktisk blev den kritiske micellekoncentration af vaskemidlet (x CMC) og forholdet mellem vaskemiddel/membranprotein (w/w) undersøgt for at bestemme den optimale koncentration af vaskemiddel (DDM) og forholdet mellem vaskemiddel/membranprotein (w/w). Store forskelle i solubiliseringseffektiviteten af Cdr1-mGFPHis blev observeret ved brug af faste koncentrationer på 10x eller 80x CMC af DDM. Opløselighedseffektiviteten varierede mellem 40% og 80% eller 60% og 90% afhængigt af mængden af rå plasmamembraner, der blev brugt i de forskellige opløselighedsforsøg. Men at vælge forholdet mellem vaskemiddel og protein på ≥2 (w/w) gav reproduceribibly gode resultater, idet >85% af Cdr1-mGFPHis blev solubiliseret, uanset mængden af plasmamembranprotein, der blev anvendt. Så hvis du bruger den mere almindelige tilgang til blot at vælge 1% eller 2% (w / v) vaskemiddel til solubilisering af membranproteiner som Cdr1-mGFPHis, er det vigtigt at holde vaskemiddel til protein-forholdet over 2 (w / w) [dvs. holde plasmamembranproteinkoncentrationen under 5 mg / mL, når du bruger 1% (dvs. 10 mg / mL) vaskemiddel].

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af Cdr1-mGFPHis udtryksniveauer, optimering af en mindre plasmamembranisolationsprotokol og vaskemiddelskærm til Cdr1-mGFPHis. (A) Kvantificering af Cdr1-mGFPHis med in-gel fluorescens; Coomassie farvede og in-gel fluorescens SDS-PAGE billeder af samme 0,7% polyacrylamid gel er vist til venstre. Bane 1 til 6 blev lastet med 0,75, 1,5, 3, 6, 12 og 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plasmamembranprotein. Cdr1-mGFPHis er angivet med en rød pil. M = Precision Plus proteinmarkør. mGFP fluorescensintensiteterne (vist til højre) var lineære over hele det testede koncentrationsområde, og der var minimal baggrundslysstofcens. (B) Virkningen af celletæthed ved brud på kvaliteten af isolerede plasmamembraner. Coomassie farvede polyacrylamid gel (7%) af plasmamembran proteinprøver (10 μg) og grønne fluorescens signaler af Cdr1-mGFPHans af samme gel før Coomassie farvning. M = Precision Plus proteinmarkør. Bane 1, 3, 5 og 7 er plasmamembranproteiner i ADΔΔ og vognbane 2, 4, 6 og 8 er plasmamembranproteiner af ADΔΔ-CDR1-mGFPHis isoleret fra henholdsvis 20, 40, 60 og 80 ODU af celler. Cdr1-mGFPHis er angivet med en rød pil. De relative procentdele af de grønne fluorescerende signaler er angivet nedenunder. (C) Virkningen af celletæthed ved brud på udbyttet af isolerede plasmamembraner og ATPase-aktiviteten af Cdr1-mGFPHis. Til venstre, effekten af celletæthed (ODU/0,5 mL HB) på mængden af plasmamembran protein isoleret fra ADΔΔ og ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) celler. Til højre, effekten af celletætheden på Cdr1 ATPase aktivitet plasma membraner isoleret fra ADΔΔ-CDR1-mGFPHis celler. (D) Eksemplarisk SDS-PAGE på 10 μL aliquots af opløselighedsblandingen (T; 0,5 mL), pellet efter solubilisering (P; 0,5 mL) og de opløselige (supernatante) fraktioner (S; 0,5 mL) af vaskemiddelaslubiliserede rå plasmamembranproteiner af ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (top) og in-gel fluorescens af Cdr1-mGFPHis før Coomassie farvning af samme gel (nederst). M = bred MW pre-farvede protein stige (245, 180, 135, 100, 75, 63 og 48 kDa bands; 180 kDa og 75 kDa bands er angivet med røde og grønne pile, henholdsvis). Vognbane A til L og N til Q er T-, S- og P-brøker for DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-cholin-13 (P) og SDS (Q). Forkortelser er defineret i materialetabellen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Baseret på vaskemiddelscreeningsresultater (Figur 3D)syntes DDM (B og C) og Fos-cholin-13 (P) at være de bedste vaskemidler til solubilisering af Cdr1-mGFPHis. Men brugen af Fos-cholin-13 syntes at forårsage delvis proteolyse af Cdr1-mGFPHis (P i figur 3D). LMNG (E), PCC-α-M (ikke vist) og muligvis også DM (A) var de næstbedste vaskemidler. Vaskemiddelskærmen viste også, at glucosider OGNG (F) og OG (G), CHAPS (L), NM (N) og Anzergents (ikke vist) var dårlige valg for solubilisering af Cdr1-mGFPHis som betydelige mængder af proteinet blev fundet i de uopløselige pellet fraktioner (Figur 3D). SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, hvilket er grunden til ingen grønne fluorescenssignaler er synlige i Q baner (Figur 3D).

Egnetheden af et vaskemiddel til solubilisering af korrekt foldede indfødte Cdr1-mGFPHis partikler blev også vurderet af FSEC af vaskemiddelaslubiliseret plasmamembranprotein (trin 6.4 supernatant). Eksempler på kromatogrammer, der er opnået for 100 μL rå plasmamembranprotein fra ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/mL) opløses med 1 % vaskemiddel, er vist i figur 4. Toppen ved 9 mL elution volumen repræsenterer for det meste aggregerede Cdr1-mGFPHis, der elutes i tomrum volumen, mens korrekt solubilized og korrekt foldet Cdr1-mGFPHis partikler er repræsenteret ved gaussisk-formet peak på 15,5 mL elution volumen. Den brede skulder mellem 12 og 14 mL elution volumen muligvis indeholder mindre veldefinerede Cdr1-mGFPHans micelle partikler og / eller indikerer delvis fejlfoldning eller protein aggregater. Kromatrammer af maltosider og LMNG ekstraheret proteiner viste det meste af Cdr1-mGFPHis eluting som en pænt formet Gaussian peak på 15,5 mL med en lille skulder eluting lidt tidligere på 14 mL (Figur 4A). Disse prøver havde ingen Cdr1-mGFPHis eluting i tomrum volumen. Den tomme prøve er bufferen plus DDM-kontrol, der ikke gav noget mGFP-signal. Kromatogrammerne i figur 4B fremhæver betydningen af sukkerhovedgruppen for kvaliteten af de vaskemiddelsopgjorte Cdr1-mGFPHis-partikler. Glukoseholdige vaskemidler (OG, NG, OGNG) klarede sig dårligere end saccharoseholdige vaskemidler (DDS), som igen klarede sig dårligere end maltoseholdige vaskemidler (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHans opløses med glukoseholdige rengøringsmidler eluted som en aggregeret (OG) eller bred aggregeret top (NG, OGNG), hvilket kunne forventes fra den store andel af Cdr1-mGFPHans bundfald i pellet fraktioner for OGNG (F) og OG (G) observeret i figur 3D. Selv om DMNG kromatogram (grøn; Figur 4B) var kvalitativt ligner DDM kromatogram (blå; Figur 4B), viser de højere toppe for DDM, at en stor del af DMNG-opløses Cdr1-mGFPHis faktisk kan denatureres. Figur 4C viser FSEC-kromatogrammet for de zwitterioniske Fos-cholines (Fos-cholin-8, Fos-cholin-10, Fos-cholin-13) og to ikke-ioniske rengøringsmidler (digitonin, Triton-X100) og figur 4D viser, hvordan lastning dobbelt så meget (200 μL-vaskemiddel) solubiliseret protein ikke havde nogen mærkbar effekt på kvaliteten af kromatogrammet for Fos-choline-8, -10 og -13 og DDM. Kun digitonin (orange; Figur 4C) gav et lignende kromatogram til DDM (blå; Figur 4C) og selv om Fos-cholin-13 gav en symmetrisk skarp formet top, det igen eluted med en betydeligt lavere elution volumen (14 mL) end for DDM (15,5 mL). Samlet set var der en klar tendens til bedre opløselighed ved rengøringsmidler med længere alifatiske sidekæder på 12 eller 13 kulstofrester; F.eks. DDM > DM > NM (12, 10 eller 9 carbons), Fos-cholin-13 > 10 > 8 (13, 10 eller 8 carbons) og LMNG > DMNG > OGNG (henholdsvis 12, 10 eller 8 carbons). Vaskemidler med hydrofobiske haler på under 12 carbons var således langt mindre egnede rengøringsmidler til solubilisering af Cdr1-mGFPHans end rengøringsmidler med længere hydrofobiske haler på 12 eller 13 carbons, og ikke-ioniske rengøringsmidler (DDM, LMNG) syntes generelt mere egnede til solubilisering af Cdr1-mGFPHis end zwitterioniske rengøringsmidler (Figur 3D, Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Vaskemiddel screening for Cdr1-mGFPHis solubilisering ved hjælp af FSEC. Kromatrammer på 100 μL solubiliseret ADΔΔ-CDR1-mGFPHis rå plasmamembran (2 mg/mL) med 1% af de rengøringsmidler, der er angivet og adskilt ved hjælp af en Superose 6-increase 10/300 GL størrelse eksklusion kolonne. Kromatogrammerne skildrer de relative mGFP fluorescensenheder (FU) af et kolonnevolumen (CV; 25 mL) af indsamlet elutionbuffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På trods af de seneste fremskridt i den strukturelle analyse af membranproteiner er der i øjeblikket ingen 3D-struktur til Cdr1 eller nogen anden PDR-transportør. Så at få kendskab til Cdr1-strukturen og dens biokemiske funktioner er vigtigt, da dette ikke kun vil give indsigt i rationelt design af nye lægemidler til at overvinde efflux-medieret lægemiddelresistens, men også i funktionsmekanismen for en vigtig underfamilie af ABC-proteiner.

Et af de vigtigste krav til strukturel karakterisering af membranproteiner er udtrykket af korrekt foldet og intakt membranprotein i mængder, der kræves til røntgenkrystallografi eller kryo-EM. Vigtige kriterier ved valg af et udtrykssystem er brugervenlighed, vækstrater og omkostninger, og også evnen til at udtrykke proteiner med post-translationelle ændringer, der kan være afgørende for funktionen og / eller stabiliteten af et protein61,62.

I løbet af de sidste to årtier er en S. cerevisiae membranproteinudtryksteknologi60 blevet optimeret14 for at lette kloning af membranproteiner af interesse24 mærket ved enten deres N- eller C-endestation med forskellige affinitets-, epitop- eller reportertags og om ønsket deres udtryksniveauer forudsigeligt undertrykt til et sted mellem 50% til så lavt som 0,1% af det maksimale udtryksniveau25. Denne alsidige plasmamembranproteinudtryksplatform gør det muligt for forskere at karakterisere svampe efflux pumper i detaljer. Udviklingen og optimeringen af hele celleanalyser af pumpefunktion muliggjorde en vellykket karakterisering af substratet specificitet24 og inhibitor følsomheden af en række store svampe multidrug efflux pumper, og de blev ansat i high-throughput drug skærme til at identificere nye42,43,44, eller bekræfte eksisterende14,33,36, bredspektret efflux pumpe hæmmere eller til at udvikle nye efflux pumpehæmmere, der er specifikke forCdr1 41.

Selv om den eksisterende udtryksplatform med succes er blevet brugt til at udtrykke svampe ABC-transportører fra en række svampe, herunder Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 filamentøse svampe som P. marneffei (Abc1)37 og mange Saccharomycotina arter (f.eks. S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 og Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 og Abc12 og C. albicans Cdr1 og Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 der har været mindre succes med at udtrykke høje niveauer af korrekt foldede menneskelige ABC transportører64. Foreløbige resultater tyder på, at dette skyldes den specifikke lipid miljø, at disse transportører kræver for korrekt udtryk og funktion i gær. Noget tyder på, at dette også kan være tilfældet for abc-transportører, selv om dette endnu ikke er bekræftet eksperimentelt.

Hovedårsagerne til de betydeligt højere Cdr1 ATPase-specifikke aktiviteter (dvs. præparater med mindre forurenende membraner), der er opnået med den optimerede lille plasmamembranisolation protokol, er dobbelt: i) den blidere manuelle brud på celler sammenlignet med at bruge en perle-tæppebanker til større plasmamembranpræparater; og ii) høst af celler i midten af log fase, som reducerer mulig mitokondrie forurening på grund af glukose undertrykkelse af mitokondrie enzymer. Køleperioderne på 3 min mellem hver af de seks brudcyklusser kan forlænges uden nogen mærkbar effekt på plasmamembranernes kvalitet. Gentag fryse-optøningscyklusser skal dog undgås, fordi Cdr1 ATPase-aktiviteterne i de isolerede plasmamembraner reduceres med ~ 10% med hver yderligere fryse-optøningscyklus. Derfor anbefales det at opdele plasmamembranprøverne i mindre aliquots for at reducere behovet for flere fryse-optøningscyklusser. mGFPHis dobbelt tag forbedrer rensning udbyttet og giver mulighed for effektiv et-trins vaskemiddel screening. Ved at bruge denne konstruktion, korrekt lokalisering, korrekt foldning / menneskehandel og termosikkerhed kan let påvises; og dobbelt tag kan fjernes, hvis det er nødvendigt, ved kavalergang med en kommercielt tilgængelig protease, selv om de 3 aminosyre-linker mellem protein af interesse og tag kan være nødvendigt at udvide for effektiv fjernelse af tag.

Kombinationen af flere funktioner i disse protokoller, nemlig brugen af en DNA-polymerase specielt designet til kolonien PCR forstærkning af 8 kb transformationskassette; den optimerede højeffektive gærtransformationsmetode; evnen til at skabe frosne kompetente gærlagre og den optimerede lille plasmamembran forberedelse protokol demonstrere oprettelsen af en optimeret membran protein udtryk platform modtagelige for high-throughput kloning, udtryk, og karakterisering af svampe ABC efflux pumper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender taknemmeligt finansiering fra New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) og et bloktilskud fra Det Medicinske Fakultet, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De vil gerne takke Otago Universitet for at give G. Madani et ph.d.-stipendium. Forfatterne ønsker også at udtrykke deres taknemmelighed over for professor Stefan Raunser og hans kolleger, Dr. Amir Apelbaum, og Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, for deres støtte og tilsyn under et 6-måneders besøg af G. Madani på Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Forfatterne takker også den tyske Academic Exchange Service (DAAD) for at give G. Madani et forskningstilskud (57381332) til at besøge MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biologi udgave 172
Lille plasmamembranpræparat til analyse af <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter