Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Abstract

Le succès de la caractérisation biochimique et biophysique des transporteurs ABC dépend fortement du choix du système d’expression hétérologue. Au cours des deux dernières décennies, nous avons développé une plateforme d’expression des protéines membranaires de levure qui a été utilisée pour étudier de nombreuses protéines membranaires fongiques importantes. L’expression hôte Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ est supprimée dans sept principaux transporteurs ABC endogènes et contient le facteur de transcription Pdr1-3 avec une mutation de gain de fonction qui permet la surexpression constitutive de gènes protéiques membranaires hétérologues intégrés de manière stable sous forme de copies uniques au locus génomique PDR5. La création de vecteurs plasmidiques polyvalents et l’optimisation de stratégies de clonage en une seule étape permettent le clonage, la mutagénèse et l’expression rapides et précis de transporteurs ABC hétérologues. Ici, nous décrivons le développement et l’utilisation d’une nouvelle double étiquette mGFPHis clivée par la protéase (c’est-à-dire la protéine fluorescente verte améliorée par levure monomère yEGFP3 fusionnée à une étiquette de purification d’affinité à six histidines) qui a été conçue pour éviter toute interférence possible de la balise avec la protéine d’intérêt et pour augmenter l’efficacité de liaison de la balise His aux résines d’affinité nickel. La fusion de mGFPHis à la protéine membranaire ORF (cadre de lecture ouvert) permet une quantification facile de la protéine par inspection de gels de polyacrylamide et détection de produits de dégradation conservant la balise mGFPHis. Nous démontrons comment cette caractéristique facilite le criblage des détergents pour la solubilisation des protéines membranaires. Un protocole pour l’isolation efficace, rapide et fiable des préparations de membrane plasmique à petite échelle du transporteur d’efflux multimédicament Candida albicans Cdr1 surexprimant dans S. cerevisiae ADΔΔ, marqué en C-terminal, est présenté. Ce protocole d’isolation des membranes plasmiques à petite échelle génère des membranes plasmiques de haute qualité en une seule journée de travail. Les préparations de membrane plasmique peuvent être utilisées pour déterminer les activités enzymatiques des variantes mutantes Cdr1 et Cdr1.

Introduction

L’extraction des protéines membranaires intégrales de leur environnement lipidique natif peut affecter considérablement leur structure et leur fonction1,2,3,4. La composition lipidique complexe des membranes biologiques5 garantit que des interactions protéine-lipide d’importance critique peuvent se produire6. Les lipides maintiennent l’intégrité structurelle des protéines membranaires, leur permettant ainsi de fonctionner correctement dans leur(s) compartiment(s) membranaire(s) destination(s)7,8. Par conséquent, une première étape critique dans la purification de la protéine membranaire est l’extraction de la protéine de son environnement natif sans affecter sa structure et / ou sa fonction.

Il existe de nombreux obstacles à la caractérisation de la structure des protéines membranaires, dont la plupart sont liés à leur nature hydrophobe, et aux difficultés d’expression de protéines membranaires correctement repliées et fonctionnelles dans les quantités requises pour la cristallographie aux rayons X ou la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)9,10,11,12. Il existe trois types de systèmes d’expression des protéines membranaires :homologues 9, hétérologues13,14,15et systèmes d’expression in vitro 16,17. Les niveaux d’expression souvent faibles, ou les coûts prohibitifs, de nombreux systèmes d’expression ne laissent que quelques hôtes comme option préférée pour produire des protéines membranaires. Ils comprennent l’hôte bactérien, Escherichia coli, les levures S. cerevisiae et Pichia pastoris, et les eucaryotes supérieurs tels que les cellules d’insectes Sf9 ou les lignées cellulaires de mammifères18. Toutes les technologies d’expression des protéines membranaires présentent des avantages et des inconvénients; cependant, S. cerevisiae est peut-être l’organisme modèle eucaryote le mieux étudié adapté à la production de protéines membranaires. Il est très polyvalent avec des applications dans le génie génétique, la découverte de médicaments, la biologie synthétique et l’expression des protéines de la membrane eucaryote14,19,20,21.

Dans cette étude, une technologie brevetée d’expression des protéines membranaires S. cerevisiae 21 a été utilisée, avec S. cerevisiae ADΔ14 et ADΔΔ22 comme hôtes préférés(Figure 1A),pour surexprimer et étudier la principale pompe d’efflux multimédicament C. albicans Cdr1. Les deux souches de S. cerevisiae sont des dérivés de AD1-8u- 23 qui ont soit les gènes ura3 (ADΔ) ou les gènes ura3 et his1 (ADΔΔ) supprimés pour éliminer tout transformant prototrophe uracile ou histidine faussement positif résultant de l’intégration indésirable aux loci génomiques URA3 ou HIS1. La suppression des 7 principales pompes d’efflux multidrogue23, indiquée à la figure 1A, rend ADΔΔ extrêmement sensible à la plupart des xénobiotiques. Le facteur de transcription mutant de gain de fonction Pdr1-3 provoque la surexpression constitutive de protéines membranaires hétérologues telles que Cdr1 (octogones rouges dans la figure 1A)après intégration de la cassette de transformation hétérologue contenant de l’ORF(Figure 1A)au locus génomique PDR5 (rectangle bleu dans la figure 1A)via deux événements de recombinaison homologue. La localisation correcte de la membrane plasmique des protéines marquées mGFPHis C-terminale peut être confirmée par microscopie confocale(Figure 1A),et l’étiquette His peut être utilisée pour la purification par affinité nickel de la protéine marquée. Le clonage de certains transporteurs fongiques ABC (p. ex. Candida krusei ABC1)en plasmides dérivés de pABC3 n’a toutefois pas été possible car ils n’ont pas pu être propagés dans Escherichia coli en raison de la toxicité cellulaire. Cela a incité au développement du clonage en une étape des protéines membranaires14,24 marquées à leur terminus N ou C avec diverses étiquettes d’affinité, d’épitope ou de rapporteur directement dans S. cerevisiae ADΔΔ ( Figure1C). S. cerevisiae Les souches ADΔΔ surexprimant divers mutants CDR1 peuvent également être créées efficacement de cette manière en utilisant jusqu’à cinq fragments PCR individuels qui se chevauchent de 25 pb(Figure 1C). En utilisant ce protocole, de nombreux ORF d’intérêt peuvent être clonés, exprimés et caractérisés à faible coût et à haute efficacité dans un laps de temps très court. L’efficacité de la transformation ne diminue que d’environ 2 fois à chaque fragment de PCR supplémentaire.

Si vous le souhaitez, les niveaux d’expression peuvent également être facilement manipulés par la conception de l’amorce pour régler de manière prévisible les niveaux d’expression entre 0,1% et 50% des niveaux d’expression constitutifs généralement élevés25. Le vecteur de clonage dérivé optimisé et multifonctionnel pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figure 1B)contient un site de clivage de la protéase HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), une protéase qui fonctionne mieux à 4 °C que la protéase27du virus de la gravure du tabac (TEV) fréquemment utilisée. L est un linker à cinq acides aminés (GSGGS), mGFP est un mutant monomère (A206K)28,version 29 de la variante de protéine de fluorescence verte améliorée de levure yEGFP330, et His est un linker à trois acides aminés (GGS) suivi de la balise de purification de la protéine d’affinité nickel à six histidine (HHHHHH).

Cette technologie d’expression a été utilisée avec succès dans la découverte de médicaments et l’étude des protéines membranaires. La première structure d’une cible fongique de médicament azole, S. cerevisiae Erg1131, a été résolue à l’aide de cette technologie. Il a également permis la caractérisation détaillée de C. albicans Cdr132,33,34 et la création d’une molécule Cdr1 déficiente en cystéine35 adaptée aux études de réticulation de cystéine pour vérifier toute future structure à haute résolution. De nombreux autres transporteurs ABC provenant d’agents pathogènes fongiques humains majeurs (c.-à-d. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei et le complexe d’espèces Fusarium solani) ont également été étudiés en détail à l’aide de cette plate-formed’expression24,36,37,38,39. Cela a permis la génération d’un panel de souches de S. cerevisiae surexprimant les pompes d’efflux qui a été utilisé dans les écrans à haut débit pour découvrir le nouveau substrat de pompe d’efflux fluorescent Nile red40 et les inhibiteurs spécifiques de la pomped’efflux41 et à large spectre14,33,42, 43,44. L’utilisation de ce système a également permis la découverte de la clorgyline en tant que premier inhibiteur de pompe d’efflux de médicaments multimédicaments fongiques à large spectre de son genre42.

La solubilisation complète des protéines membranaires et la création d’une préparation homogène de protéines-micelles membranaires dépourvues de lipides endogènes, nécessitent des concentrations détergentes élevées45. Mais malheureusement, cela inactive aussi souvent la protéine membranaire5,8,45,46. Les propriétés des monomères détergents et leur agrégation en solution sont affectées par les propriétés physiques de la queue hydrophobe, la longueur et la ramification de la chaîne alkyle, la présence d’un noyau aromatique ou d’une chaîne latérale fluoroalkyle, ou le nombre d’unités de polyoxyéthylène. Ainsi, le criblage des détergents est une première étape importante pour déterminer le détergent le plus approprié pour la solubilisation et la purification des protéines membranaires.

C. albicans est un pathogène fongique humain majeur des personnes immunodéprimées qui peut causer des infections invasives graves et potentiellement mortelles47, et il peut devenir résistant aux médicaments antifongiques azoles48,49. L’un des principaux mécanismes de la multirésistance aux médicaments de C. albicans est la surexpression de Cdr150, qui est un transporteur de cassette de liaison à l’ATP (ABC) de type II51 de la sous-famille ABCG situé dans la membrane plasmique. Les transporteurs ABCG fongiques pleine grandeur (constitués de deux domaines de liaison aux nucléotides [ND] et de deux domaines transmembranaires [TMD]) sont plus communément appelés transporteurs pléiotropes de résistance aux médicaments (PDR) et se caractérisent par leur topologie unique de domaine inversé [NBD-TMD]2. Les transporteurs PDR ne se trouvent que dans les plantes52,53 et les champignons54. Malgré leur importance, il n’y a pas de structures pour les transporteurs PDR, bien que les structures pour les transporteurs ABCG humains de demi-taille aient récemment été résolues, ce qui a contribué à créer le premier modèle provisoire pour Cdr133. Nos preuves expérimentales récentes suggèrent, cependant, que ce modèle est défectueux peut-être parce que les transporteurs PDR fongiques ont des NBD asymétriques caractéristiques résultant très probablement en un mécanisme de transport unique. Une structure à haute résolution de Cdr1 est donc nécessaire à la fois pour la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs de pompe d’efflux qui peuvent aider à surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, et pour fournir des informations sur le mécanisme d’action de cette importante famille de transporteurs ABC.

L’objectif de cette étude était de développer des protocoles fiables pour l’expression, la solubilisation et la purification de Cdr1 dans l’hôte d’expression de S. cerevisiae génétiquement modifié, dans le but ultime d’obtenir une structure à haute résolution pour Cdr1. Dans le cadre de ce processus, une double étiquette mGFPHis clivée par la protéase(Figure 1B)a été conçue avec un liant à 16 résidus séparant l’étiquette de la terminaison C de Cdr1, ce qui a amélioré la liaison de la balise d’affinité 6x His attachée à la résine d’affinité nickel et a permis de surveiller les niveaux d’expression de Cdr1 dans les cellules vivantes et pendant tout le processus de purification. Un protocole reproductible pour les préparations de protéines de membrane plasmique de levure à petite échelle contenant environ 10% de C. albicans Cdr1 (tel qu’estimé par la coloration de Coomassie après SDS-PAGE) a également été développé, qui pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de stocks frais ou congelés de cellules ADΔ et ADΔΔ compétentes en transformation

  1. Inoculer 25 mL de 2x YPCD [c.-à-d. 2x YPD; 2% (p/v) d’extrait de levure, 2% (p/v) de peptone, 4% (p/v) de dextrose), 0,079 % (p/v) de CSM (mélange complet de supplément)]35 milieu avec une seule colonie de levure et incuber pendant la nuit (o/n) pendant 16 h à 30 °C en agitant à 200 tours par minute (tr/min).
  2. Inoculer 225 mL de milieu 2x YPCD avec la culture 25 mL o/n et vérifier la densité optique de la cellule à 600 nm (OD600); l’OD600 est généralement ~0,5-1,0.
    REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que tous les matériaux requis pour l’expérience de transformation suivante sont facilement disponibles.
  3. Cultivez la culture à 30 °C pendant environ 6 à 8 h supplémentaires en agitant à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD600 de ~6-8.
    REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante (RT), sauf indication contraire.
  4. Récolter ces cellules en phase logarithmique par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min.
  5. Resuspendez les cellules et lavez-les deux fois avec de l’eau stérile double distillée (ddH2O, c’est-à-dire 200 mL puis 20 mL).
  6. Récoltez les cellules à 3 000 x g pendant 3 min.
  7. Lentement (c.-à-d. ajouter 30 aliquotes égales de solution congelée de cellules compétentes (FCC) toutes les minutes pendant 30 min) resussuspener la pastille cellulaire dans X mL de FCC [5 % (p/v) de glycérol, 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO)] sur de la glace (où X = OD600; p. ex., si OD600 = 6 résaisir dans 6 mL, ou si OD600 = 3 resuspend dans 3 mL).
    REMARQUE: La composition correcte de la FCC est essentielle au succès de la transformation.
  8. Conserver les cellules sur la glace pendant 2 h avant la transformation ou conserver les aliquotes à -80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    REMARQUE : Les cellules ADΔ et ADΔΔ sont très sensibles à la congélation. Ainsi, les cellules doivent être refroidies lentement jusqu’à -80 °C : placer des tubes de microcentrifugation glacés contenant des aliquotes cellulaires de 50 à 600 μL dans une boîte de stockage en plastique (RT). Placez la boîte dans un récipient en polystyrène (RT) plus grand et fermez le récipient avec un couvercle en polystyrène approprié. Ensuite, mettez le récipient dans le congélateur à -80 °C.
    ATTENTION : La congélation lente est essentielle à la survie des cellules.

2. Transformation d’ADΔ et ADΔΔ avec CaCDR1-XLmGFPHis et confirmation des transformations correctes par PCR de colonie et séquençage de l’ADN

REMARQUE : Le plasmide pABC3-CDR1-mGFPHis a été créé à l’aide de stratégies de clonage conventionnelles décrites en détail dans Lamping et al., 201055 et est illustré à la figure 1B. C. albicans CDR1 de type sauvage a été isolé sous forme de fragment De PacI/NotI à partir du plasmide pABC3-CaCDR1A-GFP14 et cloné dans pABC3-XLmGFPHis26.

  1. La PCR amplifie l’ensemble de la cassette de transformation CDR1 avec une paire d’ADN polymérase haute fidélité et d’amorce PDR5-pro/PDR5-ter35 en utilisant 1 à 10 ng de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis comme modèle d’ADN ou, alternativement, digérer 2 μg de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis jusqu’à compléter avec l’enzyme de restriction 10 U AscI à 37 °C(Figure 1A,B).
    REMARQUE: La cassette de transformation CDR1 (Figure 1A) comprend le promoteur PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminateur PGK1 - marqueur de sélection URA3 - région aval PDR5.
  2. Effectuez l’électrophorèse sur gel d’agarose et extrayez la cassette de transformation d’environ 8 kb.
    REMARQUE: La purification en gel de la cassette de transformation CaCDR1 d’environ 8 kb élimine tout ADN plasmidique non digéré possible, ce qui pourrait conduire à des transformants incorrects qui ont le plasmide entier, plutôt que la cassette de transformation linéaire, intégré au locus génomique PDR5.
  3. Dénaturer la quantité requise d’ADN porteur de sperme de saumon (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) pendant 10 min dans un bain-marie bouillant et garder sur la glace. Utilisez des tubes à bouchon vissé pour faire bouillir l’ADN des spermatozoïdes de saumon afin d’éviter l’ouverture du couvercle.
  4. Mélanger 50 μL d’ADN de spermatozoïdes de saumon dénaturés avec 14 μL de la cassette de transformation (500-2 000 ng) et conserver les 64 μL de mélange d’ADN sur la glace jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Utiliser 10 ng d’un plasmide navette E. coli-levure(p. ex., pYES2) comme témoin de transformation positive(figure 2B).
  5. Remettre en caisse des cellules compétentes fraîches ou congelées rapidement décongelées pendant 5 min dans un bain-marie à 30 °C et les diviser en aliquotes de 50 μL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
  6. Récolter des cellules par centrifugation pendant 1 min dans un microfuge à vitesse maximale (18 000 x g).
  7. Retirez le surnageant et maintenez la pastille de cellule à TA.
  8. Pour chaque transformation, mélanger 296 combinaisons μL (RT) de 260 μL de polyéthylène glycol à 50 % (p/v) (PEG 3350) et 36 μL d’acétate de lithium (LiAc) de 1 M, par pipetage répété, avec les 64 μL appropriés de mélanges d’ADN glacés.
  9. Ajouter immédiatement le mélange approprié à une aliquote de granulés cellulaires compétents de 50 μL.
  10. Resuspendez la pastille cellulaire dans le mélange PEG-LiAc-ADN de 360 μL en vortexant complètement pendant environ 30 s.
  11. Incuber le mélange cellulaire dans un bain-marie à 30 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Les cellules ADΔ et ADΔΔ se transforment mieux à 30 °C qu’à 42 °C35.
  12. Récoltez les cellules à 18 000 x g pendant 10 s. Jeter le surnageant et resussuspend la pastille cellulaire dans 80 μL de ddH2O.
  13. Étaler les cellules sur une plaque d’agar CSM-URA35 [c.-à-d. 0,67 % (p/v) de base d’azote de levure sans acides aminés, 0,077 % (p/v) de MSC moins uracile, 2 % (p/v) de glucose et 2 % (p/v) de gélose].
  14. Incuber les plaques pendant 2-3 jours à 30 °C jusqu’à ce que les transformants prototrophes de l’uracile soient clairement visibles.
    REMARQUE: Attendez-vous à ~100 transformants par μg de la cassette de transformation CaCDR1 linéaire ~8 kb et ~4 x 104 transformants par μg pYES2.
  15. Choisissez cinq transformants indépendants et étalez-les sur une plaque CSM-URA fraîche pour séparer les transformants prototrophes de l’uracile des restes de cellules hôtes non transformées.
  16. Éliminez tous les petits mutants possibles en cultivant les transformants sur des plaques de gélose YPG [1 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) de peptone, 2 % (v/v) de glycérol et 2 % (p/v) d’agar](Figure 2D).
    REMARQUE: Les petits mutants ont des mitochondries défectueuses et, par conséquent, ne peuvent pas se développer sur des sources de carbone non fermentescibles. Ils sont assez fréquents chez S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ et ADΔΔ sont particulièrement enclins à acquérir le petit phénotype.
  17. Effectuez une PCR de colonie de levure et confirmez qu’au moins trois transformants indépendants sont correctement intégrés dans le locus génomique PDR5 (Figure 1C)en amplifiant la cassette de transformation CaCDR1 entière d’environ 8 kb avec une ADN polymérase spécifique optimisée pour amplifier les produits PCR à partir de sources de modèles d’ADN impures. Utilisez un ensemble d’amorces qui se lient juste à l’extérieur du site d’intégration et des aliquotes de 1 μL de suspensions cellulaires (en ddH2O) dérivées de colonies uniques comme modèles d’ADN.
    REMARQUE: Cette ADN polymérase particulière amplifie de manière fiable ~ 8 kb de fragments de PCR à partir de cellules de levure intactes. Cependant, pour une amplification fiable, 45 cycles de PCR sont nécessaires et les cellules de levure doivent être ressuspendées à OD600 1-10 en ddH2O.
  18. Confirmez le produit d’amplification PCR correct d’environ 8 kb par électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN d’une partie de 1 μL de la réaction PCR.
  19. Retirer les amorces d’amplification en excès d’une partie de 10 μL de la réaction de PCR avec un mélange enzymatique d’une exonucléase d’ADN monocaté brin et d’une phosphatase en suivant les instructions du fabricant avant de séquencer l’ensemble de l’ORF à l’aide de portions de l’échantillon d’ADN traité avec des amorces appropriées.

3. Protocole d’isolement de la membrane plasmique de levure à petite échelle

  1. Cellules de levure en croissance
    1. Pré-culture d’une seule colonie de levure dans 10 mL de YPD à 30 °C pendant ~7-8 h en agitant à 200 tr/min.
    2. Inoculer 40 mL de milieu YPD avec la pré-culture de 10 mL et incuber les cellules à 30 °C o/n (~16 h) en agitant à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD600 de 1-3.
  2. Récolte de cellules de levure
    1. Récolter 40 unités OD (ODU; par exemple, 1 mL à une OD600 de 1 = 1 ODU) de cellules en phase logarithmique à 4 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Resuspendez et lavez les cellules deux fois avec du ddH2O stérile glacé (c.-à-d. 40 mL puis 1 mL; prélèvez les cellules entre les étapes par centrifugation à 4 200 x g pendant 5 min à 4 °C).
    3. Remettre la pastille dans 1 mL de ddH2O stérile glacé et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi (sur glace) de 1,5 mL.
    4. Récolter des cellules à 3 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
    5. Aspirer le surnageant.
    6. Resuspendez la pastille cellulaire dans un tampon homogénéisant de 0,5 mL [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) de glycérol; pH 7,5] fraîchement complété par 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF).
      REMARQUE: Ajoutez toujours le PMSF frais parce que le PMSF est inactivé rapidement lors de l’exposition à l’eau.
      ATTENTION: PmSF est un inhibiteur de la sérine protéase, qui est extrêmement corrosif et destructeur pour les tissus. Il peut causer des lésions oculaires irréversibles.
    7. Conservez la suspension cellulaire à -80 °C ou utilisez-la immédiatement.
  3. Isolation des membranes plasmiques
    1. Si elles sont congelées, décongelez les cellules sur de la glace pendant environ 1 h.
    2. Ajouter des billes de silice glacées de 0,5 mm de diamètre à la suspension cellulaire de 0,5 mL pour atteindre un volume total de 1 mL.
    3. Briser les cellules avec 6 cycles de vortex à l’intensité maximale de secousse pendant 1 min entrecoupé de 3 min de périodes de refroidissement sur la glace.
    4. Faites un trou mince au fond du tube avec une lame de scalpel chauffée.
    5. Recueillir l’homogénat de cellule cassé à travers le fond du tube installé dans un autre tube de microcentrifugation glacé de 1,5 mL avec un spin à basse vitesse de 10 s (~ 200 tr / min).
      REMARQUE: Cela garantit que les billes de silice restent dans le tube d’origine.
    6. Centrifuger l’homogénat cellulaire à 5 156 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires, les cellules ininterrompues et les noyaux.
    7. Transférer 450 μL de surnageant dans un tube de microcentrifuge glacé de 1,5 mL et ajouter 1 mL supplémentaire de HB glacé complété par du PMSF frais (1 mM).
      REMARQUE: Cette étape de dilution est essentielle pour la récupération de la protéine de la membrane plasmique de haute qualité.
    8. Récolter les membranes plasmiques à 17 968 x g pendant 1 h à 4 °C et ressuspendre la pastille de membrane plasmique, par pipetage répété, dans 100 μL de HB fraîchement complété par 1 mM pmSF. Desserrer la pastille de cellule pour une homogénéisation correcte de la membrane plasmique en remuant la pastille de cellule avec la pointe de pipette de 100 μL avant de libérer les 100 μL de HB et de pipetage de haut en bas.
    9. Mesurez la concentration en protéines de la préparation de la membrane plasmique à l’l’éventreur à l’éventreur à l’cette arme à l’cette arme à l’cette arme.
    10. Conservez les membranes plasmiques à -80 °C ou conservez-les sur de la glace pour une utilisation immédiate.

4. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)

  1. Assemblez l’appareil pour la préparation de gels de polyacrylamide.
  2. Pour deux gels séparateurs (7 % de polyacrylamide), mélanger 2,1 mL de 40 % d’acrylamide/bis-acrylamide, 3 mL de tampon de séparation 4x (1,5 M tris, 0,4 % de dodécylsulfate de sodium [SDS] (p/v); pH 8,8) et 6,9 mL de ddH2O. Ajouter 8 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 60 μL de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % pour initier la polymérisation de l’acrylamide.
    ATTENTION : L’acrylamide/bis-acrylamide est très toxique. Il provoque une irritation de la peau, une neuropathie périphérique et est cancérigène. TemED est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation. L’APS est nocif s’il est avalé. Il provoque de graves irritations des yeux et de la peau.
  3. Versez ~4-5 mL de ce mélange dans l’appareil à gel assemblé, jusqu’à ~2 cm du haut.
  4. Superposez soigneusement ~ 1-2 mL de 0,1% de SDS sur le dessus pour créer un ménisque planaire.
  5. Laissez le polyacrylamide se régler pendant environ 60 min à TA.
  6. Préparer un mélange de gel empilable pour deux gels en mélangeant 0,5 mL de 40 % d’acrylamide/bis-acrylamide, 1 mL de tampon d’empilage 4x (0,5 M Tris, 0,4 % de SDS (p/v); pH 6,8) et 6,9 mL de ddH2O. Ajouter 2 μL de TEMED et 30 μL de 10 % d’APS pour initier la polymérisation de l’acrylamide.
  7. Retirez la couche de FDS à 0,1 % du gel séparateur polymérisé et rincez avec du ddH2O pour éliminer les traces de FDS.
  8. Versez le mélange de gel empilable sur le gel séparateur.
  9. Placez un peigne dans le gel empilable et retirez toutes les bulles d’air autour du peigne.
  10. Laissez le gel empilable se fixer pendant environ 60 min à RT.
  11. Retirez le peigne et rincez les fentes de gel avec de l’eau. Mettez le gel dans le réservoir de gel et remplissez le réservoir de gel jusqu’au sommet avec 1x tampon de course (24,8 mM Tris, 190 mM de glycine, 0,1% SDS).
    REMARQUE: Préparez 1x tampon de fonctionnement à partir d’un stock tampon 10x (248 mM Tris, 1,9 M de glycine, 1% SDS (w / v) dans ddH2O) stocké à RT.
  12. Mélanger des échantillons de membrane plasmique de 5 à 10 μL (c.-à-d. 10 à 20 μg de protéines) avec des volumes égaux de 2x colorant à charge protéique [120 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 20 % de glycérol, 0,02 % de bleu de bromophénol, 4 % de FDS, 200 mM de dithiothréitol (DTT)] et charger immédiatement dans des fentes de gel individuelles immergées dans le tampon de fonctionnement.
    ATTENTION : La TNT est nocive si elle est avalée. Il provoque de graves irritations des yeux et de la peau.
    REMARQUE: Faire un stock de 10 mL de 2x colorant à charge protéique, aliquote et conserver à -20 ° C. Ne chauffez pas les échantillons mélangés, mais chargez-les immédiatement dans des fentes de gel individuelles afin que l’étiquette GFP ne soit pas dénaturée et que les signaux de fluorescence dans le gel puissent être détectés.
  13. Chargez les marqueurs de poids moléculaire des protéines (plage de 10 à 245 kDa) dans un emplacement séparé pour permettre l’estimation de la taille des fragments de protéines individuels.
  14. Effectuez une électrophorèse sur gel à 200 V jusqu’à ce que le colorant à chargement bleu atteigne le fond du gel (généralement 45-55 min).
  15. Examinez le gel pour la fluorescence GFP dans le gel avec un système d’imagerie sur gel (les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement de 475 à 485 nm et de 520 nm).
  16. Après l’imagerie par fluorescence dans le gel, fixez les protéines par agitation douce du gel dans ~10-20 mL de solution fixatrice de gel protéique (40% d’éthanol, 10% d’acide acétique) pendant 15 min à RT.
  17. Rincez le gel deux fois pendant 10 min avec 10 mL de ddH2O et visualisez les bandes protéiques en plaçant le gel dans une solution colloïdale de coloration de Coomassie de 10 mL avec une secousse douce pendant environ 1 h à TA.
  18. Pour une meilleure visualisation des bandes protéiques, détachant le gel une ou deux fois dans ~20 mL de ddH2Opendant ~1 h avant d’enregistrer des images avec le système d’imagerie en gel.

5. Détermination des activités de Cdr1 ATPase 57

  1. Les échantillons de membrane plasmique dilués >2,2 mg/mL à 1-2 mg/mL dans l’HB.
  2. Équilibrer le cocktail d’essai ATPase (75 mM MES-Tris, 75 mM de nitrate de potassium, 0,3 mM de molybdate d’ammonium, 7,5 mM d’azoure de sodium; pH 7,5) et Mg-ATP (28,8 mM de sel disodique ATP, 28,8 mMMgCl2; pH 7,0) à 30 °C dans un incubateur à 30 °C.
    ATTENTION : L’azide de sodium est très toxique.
    NOTE: S’assurer que tous les stocks régulateurs et bouteilles sont exempts de phosphate; c’est-à-dire laver la verrerie avec 1% (vol/vol) de HCl et la rincer plusieurs fois avec ddH2O. En outre, gardez-le séparé des autres verreries qui contiennent probablement des traces de phosphate couramment présentes dans les détergents utilisés pour laver la verrerie.
  3. Ajouter 90 μL de cocktail d’essai avec ou sans inhibiteur de Cdr1-ATPase (20 μM d’oligomycine) dans des puits individuels d’une plaque de microtitrage de 96 puits.
    REMARQUE: Le test est effectué en trois exemplaires.
  4. Ajouter 5 μL des membranes plasmiques isolées (~5-10 μg de protéines) ou des étalons de phosphate (0-100 nmoles Pi) dans les puits appropriés de la plaque de microtitrage.
    REMARQUE : Conservez les première et dernière colonnes pour deux ensembles distincts d’étalons de phosphate.
  5. Commencez le dosage en ajoutant 25 μL de Mg-ATP pré-averti de 28,8 mM (concentration finale de 6 mM) avec une pipette multicanal dans des puits individuels et incuber à 30 °C pendant 30 min.
  6. Arrêtez la réaction en ajoutant 130 μL de réactif de développement (1,6 % de L-ascorbate de sodium, 1 % de FDS, 12 % de molybdate d’ammonium dans de l’acide sulfurique 6 M).
    ATTENTION : L’acide sulfurique concentré réagit violemment avec l’eau. Il est corrosif et peut causer des dommages à la peau et aux poumons.
  7. Incuber à RT pendant 10 min.
  8. Lisez l’absorbance des puits de plaque de microtitrage à 750 nm avec un lecteur de plaque de microtitrage.
    REMARQUE: S’en tenir au temps d’incubation de 10 minutes pour le développement du colorant bleu (c.-à-d. un complexe phosphore-molybdène réduit) est essentiel pour la précision du test, car le développement du colorant bleu se poursuit avec le temps.
  9. Obtenir l’activité de l’ATPase spécifique à la Cdr1 (c.-à-d. l’activité de l’ATPase sensible à l’oligomycine) en soustrayant l’activité de l’ATPase en présence d’oligomycine de l’activité totale de l’ATPase en l’absence d’oligomycine.

6. Écran de détergent à petite échelle

  1. Combiner les préparations membranaires plasmiques (c.-à-d. 2,5 mg de protéines de membrane plasmique) de cellules surexprimant Cdr1-mGFPHis avec un tampon GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (p/v) de glycérol; pH 7,5; fraîchement complété par 1 mM PMSF] contenant 5 mg du détergent d’essai, pour atteindre un volume total de 0,5 mL complété par 1 % (p/v) de détergent.
  2. Faire pivoter le mélange à 4-8 °C pendant 2 h, à l’l’éventrifice d’un dispositif de rotation.
  3. Centrifuger le mélange à 141 000 x g à 4 °C pendant 1 h.
  4. Transférer le surnageant contenant le matériau solubilisé dans un tube de microcentrifugation frais.
  5. Ajouter 0,5 mL de tampon GTED-20 complété par 2 % (p/v) de FDS à la fraction de granulés insolubles et incuber à 30 °C o/n dans un incubateur à agitation pour extraire toutes les protéines membranaires insolubles dans le détergent.
  6. Analyser et comparer les fractions de granulés surnageants et solubilisés par SDS-PAGE.
  7. Photographier les gels contenant des protéines marquées GFP pour la fluorescence GFP dans le gel avant la coloration de Coomassie et quantifier les niveaux d’expression avec le système d’imagerie.
  8. Utilisez la fraction protéique membranaire soluble pour des applications en aval telles que la chromatographie d’exclusion de la taille de fluorescence (FSEC)58 pour identifier le ou les détergents appropriés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Une fréquence élevée de transformation de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformants/μg) a été obtenue avec pYES2(Figure 2B). Comme prévu, le contrôle sans ADN (c’est-à-dire ddH2O uniquement) n’a donné aucun transformant, et 1 μg de la cassette de transformation linéaire CDR1-mGFPHis (Figure 1A) a donné ~ 50 transformants (Figure 2C) avec le protocole de transformation ADΔΔ optimisé. Les transformants CDR1-mGFPHis ont également été testés pour leur capacité à se développer sur une source de carbone non fermentescible afin d’éliminer tous les petits mutants possibles avec des mitochondries défectueuses. Trois (cercles jaunes; Figure 2D) des 25 transformants uracile-prototrophe testés n’ont pas pu se développer sur des plaques de gélose YPG et ont été écartés des investigations ultérieures. Le Cdr1-mGFPHis exprimé par la souche nouvellement créée ADΔΔ-CDR1-mGFPHis est correctement localisé dans la membrane plasmique (Figure 1A) et a été exprimé à des niveaux suffisants pour la caractérisation structurelle et fonctionnelle du Cdr1 (Figure 3). La conception de la double étiquette optimisée(Figure 1B)permet également de retirer la double étiquette mGFPHis après la purification par affinité nickel de Cdr1-mGFPHis afin d’éviter d’éventuelles interférences de la balise dans les applications en aval. Les résultats préliminaires, cependant, ont montré que le lien de 3 acides aminés entre Cdr1 et le site de clivage de la protéase HRV-3C pourrait devoir être étendu pour obtenir un clivage plus rapide et plus efficace. Des observations similaires ont récemment été rapportées pour le transporteur de nucléosides marqué N-terminale Escherichia coli NupC, qui nécessitait un liaison d’acides aminés 15 plutôt que le linker d’acides aminés conçu à l’origine pour un clivage efficace du détergent (DDM) solubilisé NupC lié à la résine d’affinité Nickel59. Le linker C-terminal à 5 acides aminés du site de clivage HRV-3C empêche l’interférence stérique de la double balise mGFPHis avec la protéine d’intérêt attachée, que nous avons précédemment observée pour C. utiliser le transporteur ABC Cdr139. La mutation yEGFP3-A206K a été créée pour empêcher la dimérisation artificielle du GFP à des concentrations élevées de protéines28,et le liant supplémentaire de 3 acides aminés entre le mGFP et le marqueur His Nickel-affinity assure une exposition de surface appropriée du His pour maximiser l’efficacité de liaison de la protéine marquée à la résine d’affinité nickel (données non montrées).

Figure 1
Figure 1: Une plate-forme d’expression de protéines membranaires de levure pour le clonage et l’expression efficaces de transporteurs membranaires plasmiques fongiques. (A) Une cassette de transformation comprenant le promoteur PDR5 (bleu), CDR1 (rouge) C-terminal marqué avec XLmGFPHis (vert), le terminateur PGK1 (orange), le marqueur de sélection URA3 (bleu clair) et un morceau de la région en aval PDR5 (bleu) est utilisée pour transformer l’expression hôte S.cer evisiae ADΔΔ par intégration au locus génomique PDR5. Le facteur de transcription mutant pdr1-3 à gain de fonction provoque la surexpression constitutive de Cdr1 (octogones rouges) dans la membrane plasmique (voir l’image de microscopie confocale ci-dessous). (B) Plasmide pABC3-XLmGFPHis, qui peut être utilisé dans une stratégie de clonage traditionnelle ou comme modèle pcR pour générer une cassette de transformation. Les améliorations du plasmide pABC3-XLmGFPHis par rapport au pABC3-GFP14 sont répertoriées sous la carte des plasmides. (C) Une autre stratégie de clonage en une étape plus efficace pour intégrer la cassette de transformation au locus génomique PDR5 d’ADΔΔ. Un ORF (rouge) peut être amplifié par PCR à l’aide d’amorces (flèches) qui créent des chevauchements avec le bras gauche (bleu; PDR5 promoteur) et bras droit (vert; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 en aval) fragments. Des mutations (lignes noires) peuvent être introduites dans l’ORF par conception d’amorce si nécessaire. Les événements de recombinaison homologue qui dirigent l’intégration correcte au niveau du locus PDR5 sont indiqués par les lignes pointillées croisées. (D) Essais sur cellules entières pouvant être utilisés pour la caractérisation fonctionnelle des pompes d’efflux multimédicaments fongiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Transformation d’ADΔΔ avec la cassette de transformation CDR1-mGFPHis et élimination des petits transformants ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Les transformants prototrophes de l’uracile ont été sélectionnés en incubant des cellules ADΔΔ transformées sur des plaques CSM-URA à 30 °C pendant 3 jours. (A) Contrôle négatif (pas d’ADN). (B) Contrôle positif (10 ng de pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformants (1 μg d’ADN). (D) Test des transformants ADΔΔ-CDR1-mGFPHis pour un petit phénotype sur des plaques de gélose YPG. Les petits transformants qui n’ont pas pu se développer sur les plaques d’agar YPG en raison de mitochondries défectueuses sont encerclés en jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La fluorescence GFP est une mesure fiable des niveaux d’expression de Cdr1 car il y avait une relation linéaire entre la quantité de Cdr1-mGFPHis (étape 3.3.9) et les signaux de fluorescence dans le gel(Figure 3A). Dans ce projet, un flux de travail optimisé reproductible a été développé pour la génération rapide de préparations de membranes plasmiques à petite échelle de haute qualité pour la caractérisation biochimique des protéines de la membrane plasmique. Il a été possible de générer près de 0,5 mg de protéine membranaireplasmique (Figure 3C; graphique de gauche) montrant l’activité la plus élevée de l’ATPase Cdr1 ( 400 nmol/min/mg ; Figure 3C; graphique de droite) lors de la rupture de 40 ODU de cellules en phase logarithmique (OD600nm de 1-3) (remises en service dans 0,5 mL de HB) avec le même volume (c’est-à-dire 0,5 mL) de billes de silice et 6 cycles de vortex pendant 1 min à l’intensité maximale de secousse suivis de périodes de refroidissement de 3 min sur glace. Une nouvelle augmentation du nombre de cycles de rupture (étape 3.3.3) a réduit la qualité de la préparation isolée de la membrane plasmique (l’activité de l’ATPase Cdr1 est passée de 170 nmol /min/mg à ~ 60 nmol / min / mg; données non montrées). Bien qu’il n’y ait eu que des différences mineures dans les profils protéiques SDS-PAGE des échantillons de membrane plasmique isolés à partir de cellules brisées avec un nombre plus élevé de cycles de rupture (données non montrées), il est probable que les activités de Cdr1 ATPase presque 3 fois réduites après 10 cycles de rupture ou plus ont été causées par: i) la dénaturation partielle de Cdr1 due à une exposition à une température élevée; ii) les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation ou la déphosphorylation; ou par iii) augmentation de la contamination croisée des vésicules isolées de la membrane plasmique avec des fractions membranaires d’autres organites. La rupture de 40 ODU de cellules dans 0,5 mL de HB a donné la plus haute qualité de membranes plasmiques (c.-à-d. le plus de Cdr1 pour 10 μg de protéines de membrane plasmique; Figure 3B) avec l’activité la plus élevée de Cdr1 ATPase (Figure 3C; graphique de droite). Des densités cellulaires plus élevées (> 40 ODU/0,5 mL de HB) ou inférieures (20 ODU/0,5 mL de HB) ont réduit l’activité atPase des membranes plasmiques isolées (Figure 3C; graphique de droite), bien que leur rendement ait augmenté proportionnellement à l’augmentation des densités cellulaires (Figure 3C; graphique de gauche). Ainsi, 40 ODU/0,5 mL de HB était la densité cellulaire optimale pour l’isolation de la plus haute qualité des membranes plasmiques. Ainsi, l’utilisation du protocole optimisé pour l’isolement à petite échelle des préparations de membrane plasmique a conduit à des activités ATPase spécifiques au Cdr1 2 à 3 fois plus élevées (~ 300 nmol / min / mg; Figure 3C; graphique de droite) par rapport aux activités spécifiques de Cdr1 ATPase qui ont été initialement obtenues (~100 nmol/min/mg; données non présentées). Ces activités ATPase étaient également significativement plus élevées35 que toutes les activités d’ATPase Cdr1 précédemment signalées (100-200 nmol / min / mg) qui avaient été obtenues avec un protocole de préparation de membrane plasmique à grande échelle plus laborieux et plus long14,41,60.

La méthode la plus courante pour extraire les protéines membranaires des membranes biologiques est la solubilisation avec un détergent. Le défi, cependant, est de trouver un détergent approprié qui a le moins d’effet néfaste sur la stabilité des protéines et / ou les caractéristiques de repliement. L’étiquetage de la protéine avec mGFPHis facilite le dépistage pour sélectionner le(s) meilleur(s) détergent(s) pour l’extraction des protéines. Au total, 31 détergents, énumérés dans la Table des matériaux,aux propriétés diverses, ont été testés pour leur capacité à solubiliser Cdr1 à partir de membranes plasmiques brutes de cellules S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Les résultats pour un ensemble représentatif de 16 détergents d’essai (A-Q) sont présentés à la figure 3D. Les voies T, P et S contiennent 10 μL d’aliquotes de protéine membranaire plasmique totale (T) immédiatement après la solubilisation du détergent (étape 6.2) et la pastille insoluble dans le détergent (P; solubilisée o/n dans 0,5 mL de GTED-20, 2 % de FDS; étape 6.5) et les fractions de surnageant soluble dans le détergent (S; étape 6.4) après séparation par ultracentrifugation à 141 000 x g. Le détergent souhaité doit solubiliser autant de Cdr1-mGFPHis que possible sans altérer sa structure et/ou sa fonction. Les protéines brutes de la membrane plasmique (5 mg/mL) ont été solubilisées pendant 2 h avec 1 % (p/v) de détergent (T) et les aliquotes des fractions solubles (S) et insolubles (P) ont été analysées par SDS-PAGE(Figure 3D)et plus tard aussi par chromatographie d’exclusion de taille de détection de fluorescence (FSEC)58 (Figure 4). Nous avons déterminé qu’un rapport détergent/protéines minimal de 2:1 (p/p) était nécessaire pour une solubilisation efficace du Cdr1. En fait, pour déterminer la concentration optimale de détergent (DDM) requise pour la solubilisation de Cdr1-mGFPHis, la concentration micellaire critique du détergent (x CMC) et le rapport détergent/protéine membranaire (p/p) ont été étudiés. De grandes différences dans les efficacités de solubilisation de Cdr1-mGFPHis ont été observées lors de l’utilisation de concentrations fixes de 10x ou 80x CMC de DDM. Les rendements de solubilisation variaient entre 40% et 80% ou 60% et 90% selon les quantités de membranes plasmiques brutes utilisées dans les différentes expériences de solubilisation. Cependant, le choix de rapports détergent/protéine de ≥2 (p/p) a donné de bons résultats reproductibles avec >85% de Cdr1-mGFPHis étant solubilisés, quelle que soit la quantité de protéine de membrane plasmique utilisée. Ainsi, si vous utilisez l’approche la plus courante consistant simplement à choisir un détergent à 1 % ou 2 % (p/v) pour la solubilisation de protéines membranaires telles que Cdr1-mGFPHis, il est important de maintenir le rapport détergent/protéines supérieur à 2 (p/p) [c.-à-d. maintenir la concentration de protéines de la membrane plasmique en dessous de 5 mg/mL lorsque vous utilisez un détergent à 1 % (c.-à-d. 10 mg/mL)].

Figure 3
Figure 3: Quantification des niveaux d’expression de Cdr1-mGFPHis, optimisation d’un protocole d’isolation de la membrane plasmique à petite échelle et criblage détergent pour Cdr1-mGFPHis. (A) Quantification de Cdr1-mGFPHis avec fluorescence dans le gel; les images SDS-PAGE colorées et en fluorescence dans le gel de Coomassie du même gel de polyacrylamide à 0,7% sont montrées à gauche. Les voies 1 à 6 étaient chargées de 0,75, 1,5, 3, 6, 12 et 24 μg de protéine membranaire plasmique ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Cdr1-mGFPHis est indiqué par une flèche rouge. M = Marqueur protéique Precision Plus. Les intensités de fluorescence mGFP (montrées à droite) étaient linéaires sur toute la plage de concentration testée et il y avait une fluorescence de fond minimale. (B) Effet de la densité cellulaire à la rupture sur la qualité des membranes plasmiques isolées. Gel de polyacrylamide coloré par Coomassie (7%) d’échantillons de protéines de membrane plasmique (10 μg) et signaux de fluorescence verte de Cdr1-mGFPHis du même gel avant coloration de Coomassie. M = Marqueur protéique Precision Plus. Les voies 1, 3, 5 et 7 sont des protéines membranaires plasmiques d’ADΔΔ et les voies 2, 4, 6 et 8 sont des protéines membranaires plasmiques d’ADΔΔ-CDR1-mGFPHis isolées de 20, 40, 60 et 80 ODU de cellules, respectivement. Cdr1-mGFPHis est indiqué par une flèche rouge. Les pourcentages relatifs des signaux fluorescents verts sont énumérés ci-dessous. (C) Effet de la densité cellulaire à la rupture sur le rendement des membranes plasmiques isolées et l’activité ATPase de Cdr1-mGFPHis. À gauche, effet de la densité cellulaire (ODU/0,5 mL HB) sur la quantité de protéines de la membrane plasmique isolées des cellules ADΔΔ et ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1). A droite, effet de la densité cellulaire sur l’activité de l’ATPase Cdr1 des membranes plasmiques isolées des cellules ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. (D) Exemple de FDS-PAGE de 10 μL d’aliquotes du mélange de solubilisation (T; 0,5 mL), de la pastille après solubilisation (P; 0,5 mL) et des fractions solubilisées (surnageantes) (S; 0,5 mL) de protéines de membrane plasmique brutes solubilisées de détergent ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (en haut) et en fluorescence dans le gel de Cdr1-mGFPHis avant coloration de Coomassie du même gel (en bas). M = large échelle protéique pré-colorée MW (bandes de 245, 180, 135, 100, 75, 63 et 48 kDa; les bandes de 180 kDa et 75 kDa sont indiquées par des flèches rouges et vertes, respectivement). Les voies A à L et N à Q sont les fractions T, S et P pour DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) et SDS (Q), respectivement. Les abréviations sont définies dans la Table des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

D’après les résultats du dépistage des détergents(figure 3D),le DDM (B et C) et la Fos-choline-13 (P) semblent être les meilleurs détergents pour la solubilisation du Cdr1-mGFPHis. Cependant, l’utilisation de Fos-choline-13 semblait provoquer une protéolyse partielle de Cdr1-mGFPHis (P dans la figure 3D). Le GNL (E), le PCC-α-M (non représenté) et peut-être aussi le DM (A) étaient les meilleurs détergents suivants. L’écran de détergent a également montré que les glucosides OGNG (F) et OG (G), CHAPS (L), NM (N) et Anzergents (non montrés) étaient de mauvais choix pour la solubilisation de Cdr1-mGFPHis car des quantités importantes de la protéine ont été trouvées dans les fractions de granulés insolubles(Figure 3D). SDS dénature Cdr1-XLmGFPHis, c’est pourquoi aucun signal de fluorescence vert n’est visible dans les voies Q(Figure 3D).

L’adéquation d’un détergent à la solubilisation de particules natives Cdr1-mGFPHis correctement repliées a également été évaluée par FSEC de la protéine de membrane plasmique solubilisée du détergent (surnageant de l’étape 6.4). Des exemples de chromatogrammes obtenus pour 100 μL de protéines membranaires plasmiques brutes à partir d’ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/mL) solubilisées avec 1 % de détergent sont présentés à la figure 4. Le pic à un volume d’élution de 9 mL représente principalement des Cdr1-mGFPHis agrégés qui éluent dans le volume du vide, tandis que les particules Cdr1-mGFPHis correctement solubilisées et correctement pliées sont représentées par le pic en forme de Gaussien à un volume d’élution de 15,5 mL. L’épaule large entre 12 et 14 mL de volume d’élution contient peut-être des particules de micelle Cdr1-mGFPHis moins bien définies et/ou indique un mauvais repliement partiel ou des agrégats de protéines. Les chromatogrammes des maltosides et des protéines extraites du GNLM ont montré que la plupart des Cdr1-mGFPHis éluaient sous la forme d’un pic gaussien de forme agréable à 15,5 mL avec une petite épaule éluant un peu plus tôt à 14 mL(Figure 4A). Ces échantillons n’avaient pas d’éluant Cdr1-mGFPHis dans le volume du vide. L’échantillon vide est le tampon plus le contrôle DDM qui n’a donné aucun signal mGFP. Les chromatogrammes de la figure 4B soulignent l’importance du type de groupe de tête de sucre pour la qualité des particules de Cdr1-mGFPHis solubilisées par le détergent. Les détergents contenant du glucose (OG, NG, OGNG) ont obtenu de moins bons résultats que les détergents contenant du saccharose (DDS), qui à leur tour ont donné de moins bons résultats que les détergents contenant du maltose (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis solubilisé avec des détergents contenant du glucose élués sous forme de pic agrégé (OG) ou agrégé large (NG, OGNG), ce qui était à prévoir de la grande proportion de Cdr1-mGFPHis précipité dans les fractions de granulés pour OGNG (F) et OG (G) observées à la figure 3D. Bien que le chromatogramme DMNG (vert; Figure 4B) était qualitativement similaire au chromatogramme DDM (bleu; Figure 4B), les pics les plus élevés pour le DDM indiquent qu’une grande partie du Cdr1-mGFPHis solubilisé par le DMNG peut en fait être dénaturée. La figure 4C montre les chromatogrammes FSEC pour le Fos-cholines zwitterionique (Fos-choline-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) et deux détergents non ioniques (digitonine, Triton-X100), et la figure 4D montre comment la charge de deux fois plus de protéines solubilisées de détergent (200 μL) n’a eu aucun effet notable sur la qualité du chromatogramme pour Fos-choline-8, -10 et -13 et DDM. Seulement la digitonine (orange; Figure 4C) a donné un chromatogramme similaire à DDM (bleu; Figure 4C) et, bien que fos-choline-13 ait donné un pic symétrique de forme nette, il a de nouveau élué avec un volume d’élution significativement inférieur (14 mL) à celui du DDM (15,5 mL). Dans l’ensemble, il y avait une tendance claire à une meilleure solubilisation par les détergents avec des chaînes latérales aliphatiques plus longues de 12 ou 13 résidus de carbone; Par exemple, le DDM > DM > NM (12, 10 ou 9 carbones), fos-choline-13 > 10 > 8 (13, 10 ou 8 carbones) et LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 ou 8 carbones), respectivement. Ainsi, les détergents avec des queues hydrophobes de moins de 12 carbones étaient des détergents beaucoup moins appropriés pour la solubilisation de Cdr1-mGFPHis que les détergents avec des queues hydrophobes plus longues de 12 ou 13 carbones, et les détergents non ioniques (DDM, LMNG) semblaient généralement plus appropriés pour la solubilisation de Cdr1-mGFPHis que les détergents zwitterioniques (Figure 3D, Figure 4).

Figure 4
Figure 4: Dépistage détergent de la solubilisation de Cdr1-mGFPHis à l’aide de FSEC. Chromatogrammes de 100 μL de membrane plasmique brute solubilisée ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/mL) avec 1 % des détergents indiqués et séparés à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille Superose 6-increase 10/300 GL. Les chromatogrammes représentent les unités de fluorescence mGFP (FU) relatives d’un volume de colonne (CV; 25 mL) du tampon d’élution collecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Malgré les progrès récents dans l’analyse structurale des protéines membranaires, aucune structure 3D pour Cdr1, ou tout autre transporteur PDR, n’est actuellement disponible. Il est donc important d’acquérir des connaissances sur la structure Cdr1 et ses caractéristiques biochimiques, car cela donnera non seulement un aperçu de la conception rationnelle de nouveaux médicaments pour surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, mais également du mécanisme de fonctionnement d’une importante sous-famille de protéines ABC.

L’une des principales exigences pour la caractérisation structurelle des protéines membranaires est l’expression de protéines membranaires correctement repliées et intactes en quantités requises pour la cristallographie aux rayons X ou cryo-EM. Les critères importants lors de la sélection d’un système d’expression sont la facilité d’utilisation, les taux de croissance et les coûts, ainsi que la capacité d’exprimer des protéines avec des modifications post-traductionnelles qui peuvent être critiques pour la fonction et / ou la stabilité d’une protéine61,62.

Au cours des deux dernières décennies, une technologie d’expression de la protéine membranaire S. cerevisiae 60 a été optimisée14 pour faciliter le clonage en une seule étape des protéines membranaires d’intérêt24 marquées à leur terminus N ou C avec diverses étiquettes d’affinité, d’épitope ou de rapporteur et, si vous le souhaitez, leurs niveaux d’expression sont réprimés de manière prévisible entre 50% et aussi bas que 0,1% du niveau d’expression maximal25. Cette plateforme polyvalente d’expression des protéines de la membrane plasmique permet aux chercheurs de caractériser en détail les pompes d’écoulement fongique. Le développement et l’optimisation de tests de la fonction de la pompe sur cellules entières ont permis de caractériser avec succès la spécificité du substrat24 et la sensibilité aux inhibiteurs d’un certain nombre de pompes d’efflux multimédicaments fongiques majeures, et ils ont été utilisés dans des écrans de médicaments à haut débit pour identifier de nouveaux42,43,44, ou confirmer des inhibiteurs de pompe d’efflux à large spectre existants14,33,36ou pour développer nouveaux inhibiteurs de pompe d’efflux spécifiques pour Cdr141.

Bien que la plate-forme d’expression existante ait été utilisée avec succès pour exprimer les transporteurs ABC fongiques d’un éventail de champignons, y compris Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 champignons filamenteux tels que P. marneffei (Abc1)37 et de nombreuses espèces de Saccharomycotina (par exemple, S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 et Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 et Abc12 et C. albicans Cdr1 et Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 il y a eu moins de succès exprimant des niveaux élevés de transporteurs ABC humains correctement pliés64. Les résultats préliminaires indiquent que cela est dû à l’environnement lipidique spécifique dont ces transporteurs ont besoin pour une expression et un fonctionnement appropriés chez la levure. Il semble que cela puisse également être vrai pour les transporteurs ABC des plantes, bien que cela n’ait pas encore été confirmé expérimentalement.

Les principales raisons des activités spécifiques à l’ATPase Cdr1 significativement plus élevées (c.-à-d. des préparations avec des membranes moins contaminantes) obtenues avec le protocole optimisé d’isolation de la membrane plasmique à petite échelle sont doubles: i) la rupture manuelle plus douce des cellules par rapport à l’utilisation d’un batteur de billes pour les préparations de membranes plasmiques à plus grande échelle; et ii) la récolte des cellules à mi-log, ce qui réduit la contamination mitochondriale possible due à la répression du glucose des enzymes mitochondriales. Les périodes de refroidissement de 3 minutes entre chacun des six cycles de rupture pourraient être prolongées sans effet notable sur la qualité des membranes plasmiques. Il faut toutefois éviter de répéter les cycles de gel-dégel car les activités de l’ATPase Cdr1 des membranes plasmiques isolées sont réduites d’environ 10 % à chaque cycle de gel-dégel supplémentaire. C’est pourquoi il est recommandé de diviser les échantillons de membrane plasmique en aliquotes plus petites afin de réduire le besoin de plusieurs cycles de gel-dégel. La double étiquette mGFPHis améliore le rendement de purification et permet un criblage efficace des détergents en une seule étape. En utilisant cette construction, la localisation correcte, le pliage / trafic approprié et la thermostabilité peuvent être facilement détectés; et la double étiquette peut être enlevée, si nécessaire, par clivage avec une protéase disponible dans le commerce, bien que le 3 acides aminés-linker entre la protéine d’intérêt et la balise puisse devoir être étendu pour un retrait efficace de l’étiquette.

La combinaison de plusieurs caractéristiques dans ces protocoles, à savoir, l’utilisation d’une ADN polymérase spécialement conçue pour l’amplification PCR de colonie de la cassette de transformation de 8 kb; la méthode optimisée de transformation de levure à haute efficacité; la capacité de créer des stocks de levures compétents congelés; et le protocole optimisé de préparation de la membrane plasmique à petite échelle démontrent la création d’une plate-forme d’expression de protéines membranaires optimisée adaptée au clonage, à l’expression et à la caractérisation à haut débit des pompes d’écoulement ABC fongiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le financement du New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) et une subvention globale de la Faculté de médecine de l’Université Chulalongkorn, Bangkok, Thaïlande (M. Niimi). Ils souhaitent remercier l’Université d’Otago d’avoir fourni à G. Madani une bourse de doctorat. Les auteurs souhaitent également exprimer leur gratitude au professeur Stefan Raunser et à ses collègues, le Dr Amir Apelbaum et le Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, pour leur soutien et leur supervision lors d’une visite de 6 mois de G. Madani à l’Institut Max Planck de physiologie moléculaire (MPIMP), Dortmund, Allemagne. Les auteurs remercient également le Service allemand d’échanges universitaires (DAAD) d’avoir fourni à G. Madani une subvention de recherche (57381332) pour visiter le MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biologie numéro 172
Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter