Summary
Le retrait du ciment dentaire pendant le durcissement déplace la plaque de base. Ce protocole minimise le problème en créant une fondation initiale du ciment dentaire qui laisse de l’espace pour cimenter la plaque de base. Quelques semaines plus tard, la plaque de base peut être cimentée en position sur cet échafaudage en utilisant peu de ciment neuf, réduisant ainsi le retrait.
Abstract
Les neuroscientifiques utilisent des microscopes miniatures (miniscopes) pour observer l’activité neuronale chez les animaux qui se comportent librement. L’équipe Miniscope de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA) fournit des ressources ouvertes aux chercheurs pour construire eux-mêmes des miniscopes. Le V3 UCLA Miniscope est l’un des miniscopes open-source les plus populaires actuellement utilisés. Il permet l’imagerie des transitoires de fluorescence émis par les neurones génétiquement modifiés à travers une lentille objective implantée sur le cortex superficiel (un système à une lentille), ou dans les zones profondes du cerveau grâce à une combinaison d’une lentille relais implantée dans le cerveau profond et d’une lentille objectif qui est préancrée dans le miniscope pour observer l’image relayée (un système à deux lentilles). Même dans des conditions optimales (lorsque les neurones expriment des indicateurs de fluorescence et que la lentille relais a été correctement implantée), un changement de volume du ciment dentaire entre la plaque de base et sa fixation au crâne lors du durcissement du ciment peut provoquer un désalignement avec une distance altérée entre l’objectif et les lentilles relais, entraînant une mauvaise qualité d’image. Une plaque de base est une plaque qui aide à monter le miniscope sur le crâne et fixe la distance de travail entre l’objectif et les lentilles de relais. Ainsi, les changements de volume du ciment dentaire autour de la plaque de base modifient la distance entre les lentilles. Le présent protocole vise à minimiser le problème de désalignement causé par les changements de volume dans le ciment dentaire. Le protocole réduit le désalignement en construisant une fondation initiale en ciment dentaire lors de l’implantation de lentilles relais. Le temps de convalescence après l’implantation est suffisant pour que la fondation du ciment dentaire durcisse complètement la plaque de base, de sorte que la plaque de base peut être cimentée sur cet échafaudage en utilisant le moins de ciment neuf possible. Dans le présent article, nous décrivons des stratégies de baseplatage chez la souris pour permettre l’imagerie de l’activité neuronale avec une lentille objective ancrée dans le miniscope.
Introduction
Les rapporteurs d’activité fluorescents sont idéaux pour l’imagerie de l’activité neuronale car ils sont sensibles et ont de grandes plages dynamiques 1,2,3. Par conséquent, un nombre croissant d’expériences utilisent la microscopie à fluorescence pour observer directement l’activité neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Le premier microscope à fluorescence monophotonique miniaturisé (miniscope) a été conçu en 2011 par Mark Schnitzer et al.5. Ce miniscope permet aux chercheurs de surveiller la dynamique de fluorescence des cellules cérébelleuses chez les animauxqui se comportent librement 5 (c’est-à-dire sans aucune contrainte physique, appuie-tête, sédation ou anesthésie pour les animaux). Actuellement, la technique peut être appliquée pour surveiller les zones superficielles du cerveau telles que le cortex 6,8,15,16; zones sous-corticales telles que l’hippocampe dorsal 8,11,13,14 et le striatum 6,17; et les zones profondes du cerveau telles que l’hippocampe ventral 14, l’amygdale 10,18 et l’hypothalamus 8,12.
Ces dernières années, plusieurs miniscopes open-source ont été développés4,5,6,7,11,13,17,19. Le miniscope peut être assemblé économiquement par les chercheurs s’ils suivent les directives étape par étape fournies par l’équipe Miniscope de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA).4,7,11,13. Parce que la surveillance optique de l’activité neuronale est limitée par les limites de la transmission de la lumière7 vers et depuis la population neuronale d’intérêt, un miniscope a été conçu qui nécessite qu’une lentille d’indice de réfraction de gradient objectif (GRIN) (ou lentille objectif) soit préancrée au bas du miniscope pour agrandir le champ de vision relayé par une lentille GRIN relais (ou lentille relais)6,7,8,10,16,17. Cette lentille relais est implantée dans la région cérébrale cible de sorte que l’activité de fluorescence de la région cérébrale cible est relayée sur la surface de la lentille relais6,7,8,10,16,17. Environ 1/4 d’une période sinusoïdale complète de lumière traverse la lentille GRIN objective (~ 0,25 hauteur) (Graphique 1A1), ce qui donne une image de fluorescence agrandie6,7. La lentille de l’objectif n’est pas toujours fixée au bas du miniscope et l’implantation de la lentille relais n’est pas nécessaire6,7,11,13,15. Plus précisément, il existe deux configurations: une avec une lentille d’objectif fixe dans le miniscope et une lentille relais implantée dans le cerveau8,10,12,14,16 (Graphique 1B1) et un autre avec juste une lentille d’objectif amovible6,7,11,13,15 (Figure 1B2). Dans la conception basée sur la combinaison de lentilles relais à objectif fixe et implantées, les signaux de fluorescence du cerveau sont amenés à la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A1)7,8,10,12,14,16. Par la suite, la lentille de l’objectif peut agrandir et transmettre le champ visuel à partir de la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A2). D’autre part, la conception de la lentille GRIN objectif amovible est plus flexible, ce qui signifie que la préimplantation d’une lentille relais dans le cerveau n’est pas obligatoire (Figure 1B2)6,7,11,13,15. Lors de l’utilisation d’un miniscope basé sur une conception de lentille d’objectif amovible, les chercheurs doivent toujours implanter une lentille dans la région du cerveau cible, mais ils peuvent implanter une lentille d’objectif.6,7,11,13,15 ou une lentille relais dans le cerveau6,7. Le choix d’un objectif ou d’une lentille relais pour l’implantation détermine la configuration du miniscope que le chercheur doit utiliser. Par exemple, le V3 UCLA Miniscope est basé sur une conception d’objectif amovible GRIN. Les chercheurs peuvent choisir d’implanter directement une lentille d’objectif dans la région cérébrale d’intérêt et de monter le miniscope « vide » sur la lentille de l’objectif.6,7,11,13,15 (un système à une seule lentille; Figure 1B2) ou d’implanter une lentille relais dans le cerveau et de monter un miniscope préancré avec une lentille objective6,7 (un système à deux lentilles; Graphique 1B1). Le miniscope fonctionne ensuite comme une caméra à fluorescence pour capturer des images en direct de la fluorescence neuronale produite par un indicateur de calcium génétiquement codé1,2,3. Une fois le miniscope connecté à un ordinateur, ces images de fluorescence peuvent être transférées sur l’ordinateur et enregistrées sous forme de clips vidéo. Les chercheurs peuvent étudier l’activité neuronale en analysant les changements relatifs de fluorescence avec certains progiciels d’analyse20,21 ou écrire leurs codes pour une analyse future.
Le V3 UCLA Miniscope offre aux utilisateurs la flexibilité nécessaire pour déterminer s’ils doivent imager l’activité neuronale avec un système à une ou deux lentilles7. Le choix du système d’enregistrement est basé sur la profondeur et la taille de la zone cérébrale cible. En bref, un système à objectif unique ne peut imager qu’une zone superficielle (moins de 2,5 mm de profondeur environ) et relativement grande (plus grande qu’environ 1,8 x 1,8 mm2) parce que les fabricants ne produisent qu’une certaine taille de lentille d’objectif. En revanche, un système à deux lentilles peut être appliqué à n’importe quelle zone cérébrale cible. Cependant, le ciment dentaire pour coller la plaque de base a tendance à provoquer un désalignement avec une distance altérée entre l’objectif et les lentilles relais, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’image. Si le système à deux lentilles est utilisé, deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale (Figure 1A). Ces deux distances de travail critiques se situent entre les neurones et la surface inférieure de la lentille relais, et entre la surface supérieure de la lentille relais et la surface inférieure de la lentille de l’objectif (Figure 1A1). Tout désalignement ou mauvais placement de la lentille en dehors de la distance de travail entraîne une défaillance de l’imagerie (Figure 1C2). En revanche, le système à objectif unique ne nécessite qu’une seule distance de travail précise. Cependant, la taille de la lentille de l’objectif limite son application pour la surveillance des régions profondes du cerveau (la lentille d’objectif qui s’adapte au miniscope est d’environ 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Par conséquent, l’implantation d’une lentille objective est limitée pour l’observation de la surface et de régions cérébrales relativement grandes, telles que le cortex 6,15 et le cornu ammonis dorsal 1 (CA1) chez la souris[11,13]. De plus, une grande surface du cortex doit être aspirée pour cibler le CA1 dorsal11,13. En raison de la limitation de la configuration à une lentille qui empêche l’imagerie des régions profondes du cerveau, les systèmes de miniscopes commerciaux n’offrent qu’une conception combinée objectif / lentille relais (deux lentilles). D’autre part, le miniscope V3 UCLA peut être modifié en un système à une ou deux lentilles car son objectif est amovible 6,11,13,15. En d’autres termes, les utilisateurs de miniscopes V3 UCLA peuvent tirer parti de la lentille amovible en l’implantant dans le cerveau (création d’un système à une lentille), lors d’expériences impliquant des observations cérébrales superficielles (moins de 2,5 mm de profondeur), ou en la préancrant dans le miniscope et en implantant une lentille relais dans le cerveau (création d’un système à deux lentilles), lors de la réalisation d’expériences impliquant des observations cérébrales profondes. Le système à deux lentilles peut également être appliqué pour observer superficiellement le cerveau, mais le chercheur doit connaître les distances de travail précises entre la lentille de l’objectif et la lentille relais. Le principal avantage du système à une lentille est qu’il y a moins de chances de manquer les distances de travail qu’avec un système à deux lentilles, étant donné que deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale dans le système à deux lentilles (Figure 1A). Par conséquent, nous recommandons d’utiliser un système à une lentille pour les observations superficielles du cerveau. Cependant, si l’expérience nécessite une imagerie dans la zone profonde du cerveau, le chercheur doit apprendre à éviter le désalignement des deux lentilles.
Le protocole de base pour la configuration à deux lentilles des miniscopes pour les expériences comprend l’implantation de lentilles et le placage de base 8,10,16,17. Le placage de base consiste à coller une plaque de base sur la tête d’un animal afin que le miniscope puisse éventuellement être monté sur le dessus de l’animal et filmer les signaux de fluorescence des neurones (Figure 1B). Cette procédure consiste à utiliser du ciment dentaire pour coller la plaque de base sur le crâne (Figure 1C), mais le retrait du ciment dentaire peut provoquer des changements inacceptables dans la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif 8,17. Si la distance décalée entre les deux lentilles est trop grande, les cellules ne peuvent pas être mises au point.
Des protocoles détaillés pour des expériences d’imagerie calcique cérébrale profonde utilisant des miniscopes ont déjà été publiés8,10,16,17. Les auteurs de ces protocoles ont utilisé le système Inscopix8,10,16 ou d’autres conceptions personnalisées17 et ont décrit les procédures expérimentales pour la sélection virale, la chirurgie et la fixation de la plaque de base. Cependant, leurs protocoles ne peuvent pas être appliqués avec précision à d’autres systèmes open source, tels que le système V3 UCLA Miniscope, NINscope6, et Finchscope19. Un désalignement des deux lentilles peut se produire pendant l’enregistrement dans une configuration à deux lentilles avec un miniscope UCLA en raison du type de ciment dentaire utilisé pour cimenter la plaque de base au crâne8,17 (Graphique 1C). Le protocole actuel est nécessaire parce que la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif est susceptible de se déplacer en raison du retrait indésirable du ciment dentaire pendant la procédure de baseplatage. Pendant le placage, la distance de travail optimale entre la lentille relais implantée et la lentille de l’objectif doit être trouvée en ajustant la distance entre le miniscope et le haut de la lentille relais, et la plaque de base doit ensuite être collée à cet endroit idéal. Une fois la distance correcte entre la lentille de l’objectif et la lentille relais implantée est définie, des mesures longitudinales peuvent être obtenues à la résolution cellulaire (Graphique 1B; in vivo enregistrement). Étant donné que la plage optimale de distances de travail d’une lentille relais est faible (50 - 350 μm)4,8, un retrait excessif du ciment pendant le durcissement peut rendre difficile le maintien de la lentille de l’objectif et de la lentille relais implantée dans la plage appropriée. L’objectif global de ce rapport est de fournir un protocole pour réduire les problèmes de retrait8,17 qui se produisent pendant la procédure de baseplatage et pour augmenter le taux de réussite des enregistrements miniscopiques de signaux de fluorescence dans une configuration à deux lentilles. L’enregistrement réussi d’un miniscope est défini comme l’enregistrement d’un flux en direct de changements relatifs notables dans la fluorescence de neurones individuels chez un animal qui se comporte librement. Bien que différentes marques de ciment dentaire aient des taux de retrait différents, les chercheurs peuvent sélectionner une marque qui a déjà été testée.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Cependant, toutes les marques ne sont pas faciles à obtenir dans certains pays / régions en raison des réglementations d’importation pour les matériaux médicaux. Par conséquent, nous avons développé des méthodes pour tester les taux de retrait des ciments dentaires disponibles et, surtout, fournir un protocole alternatif qui minimise le problème de retrait. L’avantage par rapport au protocole actuel de baseplatage est une augmentation du taux de réussite de l’imagerie calcique avec des outils et du ciment qui peuvent être facilement obtenus dans les laboratoires. Le miniscope UCLA est utilisé comme exemple, mais le protocole est également applicable à d’autres miniscopes. Dans ce rapport, nous décrivons une procédure de baseplacage optimisée et recommandons également certaines stratégies pour l’installation du système à deux lentilles miniscope de l’UCLA (Graphique 2A). Des exemples d’implantation réussie (n = 3 souris) et des exemples d’implantation ratée (n = 2 souris) pour la configuration à deux lentilles avec le miniscope UCLA sont présentés avec les discussions sur les raisons des succès et des échecs.
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Protocol
Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université nationale de Taïwan (numéro d’approbation : NTU-109-EL-00029 et NTU-108-EL-00158).
1. Évaluation de l’altération volumique du ciment dentaire
REMARQUE: Des changements dans le volume de ciment dentaire se produisent pendant le processus de durcissement. Testez les changements de volume du ciment dentaire avant l’implantation et le placage de base. Les chercheurs peuvent tester n’importe quelle marque de ciment dentaire et utiliser la marque avec le changement de volume le plus faible pour cimenter la plaque de base. Un exemple est présenté à la figure 3.
- Peser 0,5 g de chaque poudre de ciment dentaire et la mélanger avec sa solution appropriée (1 mL).
NOTE: Le rapport poudre/liquide recommandé dans les instructions sur le ciment dentaire est de 0,5 g de poudre pour 0,25 mL de solution pour obtenir une forme solide. Ce protocole d’essai dilue le rapport à 0,5 g/mL afin que le mélange puisse être aspiré sous forme liquide afin de mesurer le changement de volume dans les pointes des pipettes. - Utilisez des embouts de pipette de 0,1 à 10 μL pour retirer 2,5 μL du mélange de ciment dentaire, puis scellez l’embout de la pipette avec une colle à photopolymérisation.
- Placez les pointes sur une grille, marquez les niveaux les plus élevés du mélange de ciment dentaire et mesurez le niveau du mélange de ciment dentaire après 40 min (vidéo supplémentaire S1).
- En plus de surveiller les changements de niveau pendant le durcissement du ciment dentaire dans les pointes, mesurez la densité de ciment dentaire sèche restante. Pour calculer la densité, mesurez le poids du ciment dentaire et mesurez le volume avec le principe d’Archimède.
- En bref, placez le ciment dentaire sec restant dans une tasse remplie d’eau et pesez l’eau qui déborde.
- Utilisez le ciment dentaire avec le moins de retrait pour tous les protocoles détaillés ci-dessous.
2. Anesthésie, implantation chirurgicale, injection virale et baseplatage factice
- Anesthésie
NOTE: Le présent rapport vise à optimiser la procédure de chirurgie et de baseplating pour le miniscope UCLA; Par conséquent, on a supposé que le titre viral optimal pour infecter les régions cérébrales cibles était connu. Les méthodes pour trouver le titre viral optimal peuvent être trouvées dans les étapes 1 à 5 de Resendez et al.8. Une fois la dilution virale optimisée, l’implantation chirurgicale peut être initiée.- Placez la souris dans un récipient à induction et fournissez de l’oxygène (100% à un débit d’air de 0,2 L / min). Préoxygéner la souris pendant 5 à 10 min.
- Administrer 5 % d’isoflurane mélangé à 100 % d’oxygène (débit d’air : 0,2 L/min) jusqu’à ce que la souris commence à perdre l’équilibre et soit éventuellement anesthésiée.
- Retirer la souris de la chambre d’induction et injecter de l’atropine (0,04 mg/kg ; injection sous-cutanée), pour éviter l’accumulation de salive et de buprénorphine (0,03 mg/kg ; injection sous-cutanée) comme analgésique.
- Rasez la tête de la souris.
- Portez un masque, une blouse stérile et des gants. Préparez un espace stérile et des instruments chirurgicaux stériles pour la chirurgie. Stabiliser la tête de la souris (maintenir l’anesthésie avec 3 à 2,5% d’isoflurane pendant cette étape) sur l’appareil stéréotaxique. Après les procédures analgésiques et anesthésiques, assurez-vous que les barres auriculaires stabilisent solidement la tête. Fournir un support thermique.
- Assurez-vous que la tête est mise en position droite, stérilisez la tête rasée avec de la bétadine, puis vaporisez la tête avec de la xylocaïne (10%), un analgésique local.
- Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
REMARQUE: Utilisez une pommade ophtalmique pour la protection des yeux pendant tous les événements anesthésiques afin de prévenir les blessures oculaires. - Testez le réflexe douloureux profond de l’animal en pinçant sa patte postérieure. Une fois que l’animal ne montre aucun réflexe de retrait de la patte, procédez à des interventions chirurgicales.
- Faites une petite incision le long du plan médio-sagittal du crâne (à partir d’environ 2 mm avant le bregma et se terminant à environ 6 mm en arrière du bregma). Ensuite, nettoyez le tissu conjonctif sur le crâne et ancrez trois vis en acier inoxydable sur les os frontaux et interpariétaux gauches.
- À ce stade, réduisez l’isoflurane à 1-2%. Surveillez la fréquence respiratoire pendant toute la procédure chirurgicale. Si le rythme respiratoire est trop lent (environ 1/s, selon l’animal), diminuer la concentration d’isoflurane.
- Effectuer une craniotomie pour l’implantation de la lentille relais sous un microscope chirurgical ou un stéréomicroscope à l’aide d’une fraise de 0,7 mm de diamètre. Utilisez une microperceuse pour saisir le foret de bavure et dessinez un contour de la zone du cercle prévue (toute l’épaisseur du calvarium n’a pas besoin d’être pénétrée).
NOTE: La lentille relais utilisée dans le présent protocole avait un diamètre de 1,0 mm, une longueur ~ 9,0 mm un pas de 1 et une plage de distance de travail de ~100 μm - 300 μm; Par conséquent, la craniotomie avait un diamètre de 1,2 mm.- Approfondissez doucement le contour jusqu’à ce que la dure-mère soit exposée.
- Préparez 3 mL de solution saline stérile dans une seringue de 3 mL et refroidissez-la dans un seau à glace. Rincez fréquemment la zone exposée avec 0,1 mL de solution saline de la seringue pour refroidir la zone et prévenir les dommages causés par la chaleur et les hémorragies.
- Cueillez et décollez légèrement la dure-mère avec une aiguille 27G.
- Placez une marque sur une aiguille émoussée de 27 G à 1 mm de l’extrémité et utilisez-la pour aspirer soigneusement le cortex cérébral afin de créer une fenêtre pour l’implantation du cristallin 8,11,13,17 (Figure 2B1). Si nécessaire, fabriquez une aiguille émoussée en broyant la pointe d’une aiguille d’injection de 27 G avec du papier de verre. Ensuite, connectez l’aiguille à une seringue, connectez la seringue à un tube et connectez le tube à une source d’aspiration pour créer un vide.
REMARQUE: La lentille relais est émoussée et comprime le tissu cérébral lorsqu’elle est placée dans la zone profonde du cerveau. Ainsi, l’aspiration du cortex réduit les lésions tissulaires dues à l’implantation de lentilles relais. Le cortex a une épaisseur d’environ 1 mm chez la souris, mais il est difficile à visualiser au stéréomicroscope. La marque crée un repère pour permettre de déterminer la profondeur de l’aiguille plus précisément qu’avec un stéréomicroscope seul. De plus, on peut déterminer si la région du cortex a été atteinte ou passée en fonction de la résistance; La partie supérieure du cortex est relativement molle, tandis que la région sous-corticale est dense. Par conséquent, une fois que la texture commence à se sentir plus dense, arrêtez l’aspiration (Figure 2B3). - Préparez 3 mL de solution saline stérile dans une seringue de 3 mL et refroidissez-la dans un seau à glace. Rincez la zone avec une solution saline pour arrêter le saignement et diminuer la possibilité d’œdème cérébral.
- Injection de virus adéno-associé (AAV)
NOTE: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE a été utilisé dans la présente expérience. jGCaMP7s est un indicateur de calcium génétiquement codé qui émet une fluorescence verte3. Parce que la présente étude a utilisé une souris de type sauvage comme sujet, un vecteur viral était nécessaire pour transfecter les neurones avec le gène indicateur de calcium fluorescent vert et permettre l’expression. Les chercheurs utilisant des souris transgéniques exprimant l’indicateur de calcium fluorescent vert comme sujets peuvent sauter le protocole 2.2.- Montez l’aiguille interne d’un cathéter intraveineux (i.v.) de 20 G sur le bras stéréotaxique et percez lentement (~100 - 200 μm/min) le cerveau aux coordonnées appropriées (les mêmes coordonnées utilisées lors de l’implantation de la lentille relais) (Figure 2B3).
- Abaisser l’aiguille de microinjection à une vitesse de 100-200 μm/min dans le CA1 ventral et infuser (~ 25 nL/min) 200 nL du vecteur viral dans la région cible (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML et -3,50 mm DV du bregma).
- Attendez 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser et minimiser le reflux.
- Retirer (~100-200 μm/min) l’aiguille de micro-injection.
- Implantation de lentilles relais
- Désinfecter la lentille relais avec de l’alcool à 75%10,16, puis rincer avec une solution saline sans pyrogènes. Trempez la lentille dans une solution saline froide sans pyrogène jusqu’à l’implantation.
REMARQUE: Une lentille froide minimise l’œdème cérébral lorsqu’elle est placée dans le cerveau. - Tenez la lentille relais à l’aide d’une pince microbulldog (figure 2B3) dont les dents ont été recouvertes d’un tube thermorétractable.
REMARQUE: La pince bulldog peut maintenir fermement la lentille sans l’endommager. Se référer à Resendez et al.8 pour la méthode de fabrication de la pince bulldog recouverte de tubes. - Placez lentement (~100 - 200 μm/min) la lentille relais au-dessus de la région cible (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML et -3,50 mm DV à partir du bregma) et stabilisez-la avec du ciment dentaire.
- Désinfecter la lentille relais avec de l’alcool à 75%10,16, puis rincer avec une solution saline sans pyrogènes. Trempez la lentille dans une solution saline froide sans pyrogène jusqu’à l’implantation.
- Baseplatage factice
REMARQUE: Le but du « baseplatage factice » pendant la chirurgie d’implantation est de créer une base de ciment dentaire afin de réduire la quantité de ciment dentaire qui doit être appliquée pendant la procédure de baseplatage réel plusieurs semaines plus tard. De cette manière, le risque d’une modification du volume du ciment dentaire est minimisé.- Fixez la lentille de l’objectif au bas du miniscope et assemblez la plaque de base sur le miniscope (dans cette étape, l’assemblage de la lentille d’objectif ancrée, de la plaque de base et du miniscope n’a pas encore été placé sur le crâne de la souris).
- Enrouler 10 cm de pellicule de paraffine autour de l’extérieur de la plaque de base (figure 4A).
- Tenez le miniscope avec la sonde du bras stéréotaxique à l’aide d’argile adhésive réutilisable.
- Alignez l’objectif sur le dessus de la lentille relais avec le moins d’espace possible entre les lentilles (Figure 4B).
- Utilisez du ciment dentaire pour sécuriser le positionnement de la plaque de base (de sorte que le ciment ne touche que le film de paraffine).
- Lorsque le ciment dentaire a séché, retirez le film.
- Retirez la plaque de base et le miniscope. La base de ciment dentaire est creuse (figure 4B).
- Pour protéger la lentille relais des activités quotidiennes et des rayures de la souris, scellez la lentille relais avec du caoutchouc de silicone moulé jusqu’à ce que la lentille relais soit recouverte, et couvrez le caoutchouc de silicone avec une fine couche de ciment dentaire (Figure 4B).
- Dégagez la souris des instruments stéréotaxiques et placez-la dans une chambre de récupération.
- Injecter du carprofène (5 mg/kg; injection sous-cutanée) ou du méloxicam (1 mg/kg; injection sous-cutanée) pour l’analgésie et de la ceftazidime (25 mg / kg; injection sous-cutanée) pour prévenir l’infection.
NOTE: L’utilisation d’antibiotiques n’est pas une alternative à une technique aseptique. Les antibiotiques périopératoires (c.-à-d. la ceftazidime) peuvent être indiqués dans certaines circonstances, comme les chirurgies de longue durée ou la pose d’implants chroniques. - Observez l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
- Domestiquer les souris individuellement et injecter du méloxicam (1 mg / kg; injection sous-cutanée; toutes les 24h) pendant une semaine pour soulager la douleur post-chirurgicale. Vérifiez l’animal tous les jours après la chirurgie pour vous assurer qu’il mange, boit et défèque normalement.
- Effectuez le placage de base après 3 semaines ou plus.
3. Revêtement de base
REMARQUE : Habituellement, la procédure de baseplating (Figure 5) ne peut pas être effectuée dans les 2 à 3 semaines suivant la procédure initiale en raison du temps de récupération et d’incubation virale. Les procédures d’induction pour le placage de base sont semblables à celles décrites aux étapes 2.1.1 à 2.1.8. Cependant, le placage de base n’est pas une procédure invasive et l’animal ne nécessite qu’une légère sédation. Par conséquent, 0,8-1,2% d’isoflurane est suffisant, tant que l’animal ne peut pas se déplacer sur le cadre stéréotaxique. De plus, une anesthésie à l’isoflurane relativement légère peut également aider à faciliter l’expression des transitoires de fluorescence des neurones lors de la surveillance8 (vidéo supplémentaire S2).
- Coupez soigneusement la fine couche du toit en ciment dentaire avec un rongeur en os et retirez le caoutchouc de silicone. Nettoyez la surface de la lentille relais avec de l’alcool à 75 %.
- Fixez une vis à côté de la plaque de base pour la fixer au bas du miniscope (figure 5A1).
REMARQUE: La plaque de base doit être serrée solidement sous le bas du miniscope car la différence entre une plaque de base serrée et légèrement fixée peut entraîner une distance incohérente. - Réglez la lame de mise au point pour qu’elle se trouve à environ 2,7 à 3 mm du boîtier principal (Figure 5A2).
REMARQUE: Bien que la longueur puisse être ajustée davantage pendant la procédure de base, fixez-la à environ 2,7 mm, car ajuster simultanément la longueur du miniscope et la longueur optimale entre la lentille relais implantée et la lentille d’objectif préancrée est très déroutant. - Connectez le miniscope à la carte d’acquisition de données et branchez-le sur un port USB 3.0 (ou version supérieure) d’un ordinateur.
- Exécutez le logiciel d’acquisition de données développé par l’équipe UCLA.
- Ajustez l’exposition à 255, le gain à 64x et la LED d’excitation à 5%. Ces réglages sont recommandés pour le placage initial ; Les paramètres spécifiques varieront en fonction des régions du cerveau et des niveaux d’expression de l’indicateur de calcium génétiquement codé.
- Cliquez sur le bouton Connecter pour connecter le miniscope au logiciel d’acquisition de données et regarder le livestream.
- Alignez manuellement la lentille de l’objectif du miniscope sur la lentille relais et commencez à rechercher les signaux de fluorescence (Figure 5B1).
REMARQUE: Au départ, la recherche manuelle du signal de fluorescence facilite les réglages. Étant donné qu’un système AAV a été utilisé pour exprimer l’indicateur de calcium génétiquement codé, le type promoteur et le sérotype AAV ont affecté l’efficacité de la transfection23,24. Les chercheurs devraient avoir besoin de vérifier l’expression de l’indicateur de calcium en trouvant des neurones individuels qui montrent des changements de fluorescence avant de procéder à de futures expériences. - Percez le ciment dentaire à n’importe quel endroit où il bloque le miniscope (facultatif).
- Regardez le flux en direct du logiciel d’acquisition de données et utilisez la marge de la lentille relais comme point de repère (vidéo supplémentaire S2). La marge de la lentille relais apparaît sous la forme d’un cercle gris semblable à une lune sur le moniteur (Figure 5B1 ; flèches blanches).
- Une fois la lentille de relais trouvée, ajustez soigneusement les différents angles et distances du miniscope jusqu’à ce que les signaux de fluorescence soient trouvés.
REMARQUE: Les images des neurones sont plus blanches que l’arrière-plan. Une forme neuronale précise indique que les neurones se trouvent parfaitement sur le plan focal de la lentille relais. Les neurones ronds suggèrent qu’ils étaient près du plan focal. La forme neuronale est différente à travers le cerveau, ici le CA1 ventral est montré à titre d’exemple. - Si aucun neurone individuel ne présente de changements de fluorescence en fonction du temps, refermez la base avec du caoutchouc de silicone. La fluorescence n’est pas observée car la période d’incubation dépend également de la propriété du virus23,24. Effectuez les étapes 3.1 à 3.12 après une semaine supplémentaire. (Ceci est facultatif).
- Tenez le miniscope dans la position optimale et déplacez le bras stéréotaxique avec une pâte adhésive réutilisable vers le miniscope (Figure 5B2). Collez le miniscope au bras stéréotaxique avec de la pâte adhésive réutilisable.
- Ajustez légèrement les bras x, y et z pour rechercher la meilleure vue (vidéo supplémentaire S2). Ensuite, réglez l’angle entre la surface de l’objectif et la lentille relais en tournant la barre d’oreille, la barre dentaire ou l’argile adhésive réutilisable sur l’axe z. L’expression virale et l’implantation de lentilles réussissent lorsqu’au moins une cellule présente des transitoires de fluorescence (Figure 6A; Vidéo supplémentaire S2) pendant le placage de base (qui dépend également de la zone du cerveau, comme le CA1).
REMARQUE : Si le moniteur affiche uniquement des globules blancs mais pas de transitoires, il existe une autre cause (voir Figure 6B, C, Vidéos supplémentaires S4, S5, la section Résultats et la section de dépannage). - Cimenter la plaque de base (figure 5B2) avec le ciment dentaire.
- Surveillez la région d’intérêt pendant la cimentation pour vous assurer que la position optimale ne change pas.
- Utilisez la plus petite quantité possible de ciment tout en collant fermement la plaque de base sur la base de ciment dentaire (figure 5B2). Appliquez une deuxième et une troisième couche de ciment autour de la plaque de base, mais veillez à ne pas affecter la lentille GRIN.
REMARQUE: L’application de ciment sur la plaque de base est plus facile à cette étape puisque la base de la plaque de base a été formée pendant la procédure de placage factice. - Détachez soigneusement le miniscope de la plaque de base lorsque le ciment est durci. Ensuite, vissez un capuchon de protection.
- Déplacez l’animal dans une cage de récupération. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
- Souris domestiques individuellement. Assurez-vous qu’il mange, boit et défèque normalement tous les jours. Attendez 5 jours pour que la souris se rétablisse complètement, puis vérifiez l’imagerie calcique.
REMARQUE: Il n’y a qu’une petite quantité de ciment dentaire qui maintient la plaque de base. Par conséquent, si la plaque de base s’est considérablement déplacée depuis la procédure de baseplatage, retirez le ciment dentaire avec une perceuse et effectuez à nouveau la procédure de baseplatage. - Anesthésier (par injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine (87 mg/kg)/xylazine (13 mg/kg)) et perfuser25 l’animal lorsque toutes les expériences sont terminées.
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Representative Results
Évaluation de l’altération du volume du ciment dentaire
Étant donné que le volume de ciment dentaire change au cours du processus de durcissement, cela peut avoir un impact significatif sur la qualité de l’imagerie, étant donné que la distance de travail d’une lentille GRIN est d’environ 50 à 350 μm 4,8. Par conséquent, deux ciments dentaires disponibles dans le commerce ont été testés dans ce cas, Tempron et Tokuso, avant la procédure d’implantation et de placage de base (figure 5). Les vidéos ont d’abord été évaluées pour déterminer si les ciments avaient rétréci, puis les volumes de ciments ont été comparés lorsqu’ils étaient complètement séchés. La même concentration et les mêmes volumes des mélanges initiaux de ciments dentaires ont été chargés dans des pointes de pipettes et filmés (vidéo supplémentaire S1). La vidéo S1 a démontré que les deux ciments ont rétréci pendant le processus de séchage. Tokuso a obtenu de meilleurs résultats que Tempron (c’est-à-dire qu’il avait un volume plus important que Tempron même après avoir rétréci) : Figure 3B ; volume moyen de Tempron : 0,93 ± 0,07 mL; volume moyen de Tokuso : 1,18 ± 0,07 mL ; Test T: p = 0,048, t(6) = 2,46, ce qui suggère qu’il a moins diminué. Les densités des ciments ont également été testées 4 fois après séchage complet. Tokuso avait une densité moyenne inférieure à celle de Tempron (densité moyenne de Tempron: 1,07 ± 0,12 g / mL; densité moyenne de Tokuso: 0,93 ± 0,08 g / mL; test t: p = 0,38, t (6) = -0,94), ce qui implique qu’il avait un taux de retrait plus faible. Par conséquent, Tokuso a été utilisé pour les étapes d’implantation et de baseplatage suivantes. Le but de la description de l’expérience ci-dessus n’est pas de recommander des marques, mais plutôt de rappeler aux expérimentateurs de trouver un ciment dentaire qui ne subit pas un changement de volume considérable lors du durcissement.
Mesure du décalage d’image
Nous avons simulé les procédures de baseplatage factice et de baseplatage original sur un objet fixe afin de déterminer si la procédure de baseplatage factice entraîne un déplacement plus petit de l’emplacement de la plaque de base que la procédure initiale. Un adhésif photopolymérisable a été utilisé pour fixer une aiguille de seringue de 23 G 2,5 cm au centre d’une plaque de base, avec 1 cm dépassant de la plaque de base (figure 3C). Ensuite, le placage de base a été simulé en tenant les aiguilles avec le bras d’un instrument stéréotaxique. Au lieu d’utiliser des animaux de laboratoire, un autocollant a été apposé sur la table de l’instrument stéréotaxique. L’aiguille de la seringue a percé l’autocollant, représentant ainsi l’emplacement d’origine. Ensuite, l’aiguille a été surélevée de 0,5 mm et les chirurgies de simulation ont commencé. Dans une chirurgie imitant la procédure de baseplatageunique 8, du ciment dentaire a été appliqué jusqu’à ce qu’il recouvre la plaque de base, qui était à 1 cm au-dessus de l’autocollant. Ensuite, il y a eu une période d’attente de 2 heures pour que le ciment durcisse avant de pousser doucement l’aiguille pour percer à nouveau l’autocollant. Comme l’adhésif photopolymérisable ne stabilisait pas complètement l’aiguille, l’aiguille pouvait être poussée plus profondément pour créer un autre trou, représentant l’emplacement de la plaque de base après le séchage du ciment dentaire. La distance entre le trou initial et le deuxième trou a été mesurée pour quantifier le déplacement de l’emplacement de l’aiguille. Les résultats ont démontré qu’une plaque de base de 1 cm au-dessus du crâne entraînait un décalage de localisation de 1,76 ± 0,14 mm, mais que la base factice n’entraînait qu’un décalage de 0,75 ± 0,17 mm (figure 3D; distance de déplacement moyenne du baseplatage unique par rapport au baseplatage factice; test t: p < 0,01, t(8) = 6,03).
De plus, nous étions curieux de savoir si la hauteur du ciment dentaire influencerait le changement. Par conséquent, nous avons testé une hauteur plus courte (Figure 3E; 0,5 cm ci-dessus) en utilisant la procédure de baseplatage unique. La plaque de base ancrée à 0,5 cm au-dessus du crâne se déplaçait significativement moins que la plaque de base à 1 cm au-dessus du crâne (Figure 3F; distance de décalage moyenne: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; test t: p < 0,01, t(8) = 9,73). Les données suggèrent que la hauteur de la plaque de base au-dessus du crâne et la distance à laquelle la plaque de base s’est déplacée étaient positivement corrélées. Étant donné que la procédure de baseplatage factice est suivie d’une deuxième étape de baseplatage qui n’utilise qu’une quantité minimale de ciment dentaire, ces données soutiennent également l’hypothèse selon laquelle le baseplatage factice contribue à améliorer la précision de la procédure de baseplatage.
Imagerie à l’aide d’un système de miniscope à deux lentilles
En suivant les protocoles chirurgicaux pour la perfusion virale, le baseplating factice et le baseplating (Figure 2, Figure 4, Figure 5), nous avons observé des transitoires de fluorescence de neurones individuels chez trois souris (n = 3/5) (Figure 6A, vidéo supplémentaire S3) pendant la procédure de baseplating et après la procédure de baseplating alors que les souris se déplaçaient librement, confirmant que la distance de travail entre l’objectif et les lentilles relais restait la même (Figure 6A1 par rapport à la figure 6A3, seul un léger changement de position s’est produit) après que le ciment dentaire ait complètement séché. Ici, nous fournissons des vidéos de la base d’une souris (vidéo supplémentaire S2; souris #5) et de l’imagerie calcique subséquente alors que les souris se déplaçaient librement (vidéo supplémentaire S3; souris #3, #4, #5; données brutes). Veuillez noter que le logiciel d’acquisition de données pour V3 ne contient pas de fonctions pour la soustraction d’arrière-plan, et le contraste de la vidéo peut être amélioré par un traitement hors ligne). Pour la vidéo supplémentaire S2, une recherche manuelle a été effectuée pour les signaux de fluorescence, puis le miniscope a été fixé au bras stéréotaxique pour des ajustements fins. Certains transitoires de fluorescence ont été observés pendant le sondage (vidéo supplémentaire S2; Figure 6A). Un transitoire est un changement de luminosité en douceur dans les taches grises ou blanches, et non un modèle de tir ressemblant à une lumière clignotante; Les figures 6A 1 à 6A2 montrent des images de transitoires. La vidéo de souris se comportant librement a montré un décalage spatial acceptable par rapport à la région d’intérêt pendant la procédure de baseplating (vidéo supplémentaire S3). Les marges des cellules n’ont pas pu être significativement améliorées à ce stade car nous ne pouvions pas ajuster la distance entre le bas de la lentille relais et les neurones actifs. Notamment, certains problèmes peuvent fréquemment survenir pendant la procédure de baseplatage, y compris l’absence de quoi que ce soit sauf un arrière-plan uniforme (figure 6B; Vidéo supplémentaire S4) ou visibilité des marges des globules blancs sans transitoires de fluorescence (Figure 6C ; Vidéo supplémentaire S5). Deux exemples de résultats négatifs sont également fournis (n = 2/5) (Figure 6B,C, vidéos supplémentaires S4, S5). Les raisons potentielles des échecs sont examinées dans la section Discussion. Les interventions chirurgicales pour ces deux souris ont été effectuées sans utiliser d’aiguille de 1 mm de diamètre pour dégager la voie; Ainsi, la lentille relais a été directement implantée. Nous proposons que chez la souris #2, la lentille relais ait pu compresser les neurones et entraîner certains neurones vers le bas, entraînant des neurones endommagés. Par conséquent, les transitoires de fluorescence n’ont pas été trouvés.
Figure 1 : Mécanismes du miniscope et défauts qui provoquent habituellement une défaillance de l’imagerie. (A) Schéma en dessin animé de la lentille relais et de la lentille objectif montrant les mécanismes nécessaires à la visualisation des cellules fluorescentes dans un système à deux lentilles. Les ondes de signalisation de chaque lentille soulignent l’importance et le mécanisme impliqué dans la recherche d’une distance de travail pour visualiser les cellules fluorescentes. (A1) La lentille GRIN relais est placée au-dessus des neurones cibles à distance de travail. Étant donné que le pas de la lentille relais est de 0,5 * N (où N est un entier), la lentille permet de visualiser les neurones cibles en relayant la lumière, amenant les signaux de fluorescence originaux au sommet de la lentille relais. Ensuite, environ 1/4 d’une période sinusoïdale complète de lumière traverse la lentille GRIN de l’objectif (~ 0,25 hauteur) et donne une image agrandie. (A2) L’objectif transmet les images à un capteur complémentaire métal-oxyde-semi-conducteur (CMOS) situé en haut (la plaque verte sur le schéma) du miniscope. (B) Diagramme de bande dessinée présentant les différences dans les procédures d’implantation de lentilles GRIN entre un système à deux lentilles (B1) et (B2) un système à une lentille. En général, la principale différence est que le système à une lentille utilise directement sa lentille objective pour imager la surface du cerveau; En conséquence, la lentille objective doit être implantée au-dessus des neurones cibles. (C) En revanche, dans le système à deux lentilles, en comparaison, une lentille relais supplémentaire est implantée dans le cerveau et la lentille d’objectif est préancrée dans le miniscope. (C1) La forme de la plaque de base de la version V3 du Miniscope UCLA peut provoquer un décalage inégal après le séchage complet du ciment dentaire. (C2) Ce décalage provoque un désalignement ou une déviation par rapport à la distance de travail entre la lentille relais et la lentille de l’objectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Protocoles modifiés et protocoles chirurgicaux détaillés pour améliorer le taux de réussite du système miniscope à deux lentilles. (A1) Protocole chirurgical modifié pour le système à deux lentilles. Les emplacements de l’injection virale et de l’implantation de la lentille GRIN relais sont indiqués. Le baseplating factice permet à la distance de travail d’englober avec précision les neurones d’intérêt et réduit le déplacement de position associé à la procédure de baseplating (A2). Par conséquent, (A3) la probabilité d’imagerie de cellules fluorescentes chez des souris se comportant librement est augmentée. (B) Image de bande dessinée des étapes de l’injection virale et placement de l’objectif GRIN du relais. (B1) Tout d’abord, marquez l’aiguille d’aspiration avec un stylo à environ 1 mm (pour les expériences sur souris) de la pointe pour aider à l’évaluation de la profondeur d’aspiration du cortex. Ensuite, aspirez le tissu conjonctif et le cortex (environ 1 mm de profondeur chez la souris) du cerveau. (B2) Utiliser l’hippocampe ventral comme zone cible pour implanter une lentille relais; Notamment, le corps calleux dur est le point de repère pour arrêter l’aspiration de la région corticale. La texture fibreuse du corps calleux peut être vue au stéréomicroscope pendant l’aspiration. (B3) Deuxièmement, percer le point d’intérêt avec une aiguille interne d’un cathéter de 20 G (environ 1 mm de diamètre; le diamètre est similaire à celui de la lentille relais) pour dégager une voie avant la perfusion virale. Sous le stéréomicroscope, une bosse (cercle pointillé dans l’image) créée par l’aiguille doit être visible. Abaisser l’aiguille de micro-injection et la lentille relais à la bosse (ou à seulement 250 μm du centre de la bosse). Enfin, placez la lentille relais GRIN (dans la présente étude, nous avons utilisé une lentille relais de 1 mm de diamètre). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesure de la variation de volume du ciment dentaire durci. (A) Un exemple avec du ciment dentaire durci de deux marques. Les flèches noires indiquent les niveaux d’origine après avoir mélangé la poudre et la solution. Les flèches blanches indiquent les niveaux après 10, 20 et 40 minutes de durcissement. Les flèches rouges pointent vers le bas des pointes, qui ont été scellées avec de la colle à photocure. (B) Volumes moyens des ciments dentaires restants après séchage complet. Les barres et les barres d’erreur sont les moyens ± SEM. * indique la signification (P < 0,05) telle que déterminée par le test t de Student. C) Des illustrations et une photographie expliquant la méthode utilisée pour mesurer le décalage d’emplacement de la plaque de base. Une aiguille a été collée à travers la plaque de base et a été utilisée pour simuler la procédure de baseplatage originale (baseplatage en une étape) et la procédure de baseplatage factice. Les flèches rouges et noires représentent les emplacements de l’aiguille avant et après le durcissement du ciment dentaire. (D) Changements de distance moyenne de la pointe de l’aiguille (E) Illustrations de la méthode utilisée pour mesurer la relation entre la plaque de base au-dessus du niveau du crâne et le déplacement de localisation. (F) Variations de distance moyenne de la pointe de l’aiguille. Les barres et les barres d’erreur sont les moyens ± SEM. ** indique la signification (P < 0,01) déterminée par le test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Procédure détaillée de baseplatage du mannequin (exécutée immédiatement après l’implantation de la lentille relais). (A1) Dessin animé en trois étapes représentant l’objectif d’un objectif, une plaque de base et un film de paraffine sur le miniscope. (A2) Version photographique de l’assemblage. (B1) Dessin animé montrant la procédure de baseplating factice. Tout d’abord, le miniscope assemblé est aligné avec la lentille du relais. L’objectif positionné est aussi proche que possible de la lentille relais. Deuxièmement, le ciment dentaire est ajouté au parafilm entourant la plaque de base et appliqué sur le crâne pour fabriquer un moule féminin pour le placage futur. Ensuite, la plaque de base est retirée et le moulage du caoutchouc de silicium (rose) est ajouté et complété avec du ciment dentaire pour protéger le moule femelle et la lentille de relais. L’animal est ensuite autorisé à se remettre de l’anesthésie. Après au moins 3 semaines, la procédure de placage de base est effectuée. (B2) Version photographique de (B1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Étapes de la procédure de baseplatage. (A1) Fixez la plaque de base et (A2) réglez manuellement le curseur de mise au point de 2,7 à 3 mm. Un réglage de 2,7 à 3 mm (à la position indiquée sur l’image) semble être le meilleur endroit pour commencer avant de rechercher manuellement les cellules fluorescentes. (B1) Le premier schéma de bande dessinée illustre l’importance de la longueur entre la lentille de l’objectif et la lentille relais pour la visualisation des cellules fluorescentes (les cellules fluorescentes sont généralement observées à une distance comprise entre 0,5 et 2 mm). Avant que la cellule fluorescente n’émerge, le chercheur devrait voir la marge de la lentille relais (flèches dans l’image du haut). Il est utile d’ajuster d’abord manuellement l’objectif à la position de visualisation optimale, car il est plus facile de faire des réglages rapides à la main. (B2) Placez de la pâte adhésive réutilisable sur la sonde stéréotaxique du bras, puis stabilisez le miniscope en l’adhérant sur le bras avec de la pâte adhésive réutilisable. À ce stade, la région d’intérêt peut avoir changé, mais cela peut être facilement corrigé en ajustant légèrement le bras stéréotaxique et la pâte adhésive réutilisable. Après avoir vérifié et trouvé la région d’intérêt optimale, ajoutez une petite quantité de ciment dentaire (représenté en rouge). Collez la plaque de base avec le moins de ciment dentaire possible. Séparez le miniscope et la plaque de base après le séchage du ciment dentaire. Si la plaque de base n’est pas assez stable, ajoutez du ciment dentaire supplémentaire. (C) Ce diagramme illustre l’importance de chaque étape pour réussir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Exemples de succès et d’échecs au cours de la procédure de baseplatage. (A) Un exemple d’imagerie réussie pendant la procédure de baseplatage. La lentille relais ciblait l’hippocampe ventral. Des transitoires de fluorescence ont été observés lorsque l’animal était sous anesthésie à l’isoflurane (voir aussi la vidéo supplémentaire S2). (A2) Le contraste a été augmenté pour une meilleure visibilité. Les lignes pointillées rouges indiquent les vaisseaux sanguins. (A3) Transitoires de fluorescence cinq jours après le placage de base lorsque la souris # 1 se comportait librement dans sa cage familiale (voir aussi la vidéo supplémentaire S3; les images des souris #3 et #4 sont également fournies dans la vidéo supplémentaire S3). Seul un léger changement de position s’est produit. (B1) Un exemple d’échec. Au cours du placage, seules des zones blanches/grises homogènes de forme cellulaire ont été remarquées (voir aussi la vidéo supplémentaire S4). (B2) La lentille relais manquait la zone cible et était située au-dessus d’une région sans cellules infectées. (C1) Un autre exemple d’échec. Chez cette souris, bien que de nombreuses cellules rondes aient été observées, aucun transitoire de fluorescence n’a été observé pendant le placage de base (après trois semaines d’incubation et pendant que la souris était anesthésiée/sédative). De plus, aucun transitoire de fluorescence n’a été servi lorsque la procédure de placage de base a été effectuée à nouveau (au cours de la cinquième semaine d’incubation) ou même lorsque l’animal se comportait librement. L’image a été obtenue pendant le placage de base à la cinquième semaine d’incubation (voir aussi la vidéo supplémentaire S5). (C2 et C3) La lentille relais manquait la couche pyramidale de l’hippocampe ventral. Les points bleus sont des noyaux qui ont été colorés avec DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Problème | Cause possible | Solution | ||
| Avait une bonne imagerie lors du placage de base, mais complètement flou le lendemain | Changement de volume lors du durcissement du ciment dentaire entre le crâne du sujet et la plaque de base | Procéder à la « pose de base factice » après la procédure d’implantation de la lentille, comme suggéré dans le présent rapport. Choisissez un ciment dentaire qui a moins de changement de volume. | ||
| A des zones blanches/grises homogènes sans aucune forme de cellule pendant le baseplatage (voir aussi la vidéo supplémentaire S4) | Un. La lentille relais a manqué la zone cible B. Mauvaise expression de l’indicateur de fluorescence C. Oubliez d’installer une lentille d’objectif sous le miniscope où l’indicateur de fluorescence est réellement exprimé | R. Utilisez des lentilles factices pour pratiquer des chirurgies. Vérifiez les coordonnées de la lentille factice après la pratique de l’implantation B. Trouvez un titre viral optimal pour les expériences d’imagerie calcique (voir Resendez et al. 2016). Si, pour une raison quelconque, les tests préalables ne peuvent pas être effectués, nous recommandons aux débutants d’essayer d’abord un titre plus élevé. (Voir la section Disscusion pour plus de détails) C. Visser sur une lentille GRIN objective (~ 0,25 pas. ex: Edmund Optics; Stock #64-519) au bas du miniscope. | ||
| Observer de nombreuses cellules mais aucune dynamique de fluorescence pendant le placage de base | A. Neurones malsains ou neurones morts B. Type de neurones clairsemés C. État d’anesthésie profonde | R. Soyez prudent pour chaque intervention chirurgicale. Utilisez une nouvelle aiguille de seringue qui est similaire au diamètre de votre lentille relais pour couper d’abord le chemin de perfusion / implantation afin de libérer la pression par implantation de lentille. Infuser lentement le virus et implanter lentement la lentille. B. Attendez plus longtemps pour surveiller les activités des neurones ou pincez un peu la queue pour stimuler la souris. C. Le placage n’est pas une procédure invasive et l’animal n’a besoin que d’une sédation. Par conséquent, le maintien de 1,2 ~ 0,8% d’isoflurane est suffisant, tant que l’animal est incapable de se déplacer sur le cadre stéréotaxique. | ||
Tableau 1 : Tableau de dépannage.
Vidéo supplémentaire S1 : Test de volume de ciment dentaire. La différence entre le volume a été mesurée au début de la préparation du ciment dentaire et celle du volume après séchage du ciment. Deux marques de ciment dentaire (p. ex., Tempron et Tokuso Curefast) ont été testées. Pour tester le volume du ciment dentaire après séchage, 0,5 g de chaque poudre de ciment dentaire a été pesé et mélangé avec sa solution appropriée (1 mL). Ensuite, des pointes de pipette de 0,1 à 10 μL ont été chargées avec 2,5 μL du mélange de ciment dentaire et scellées avec de la colle photopolymérisable. Ensuite, les pointes ont été placées sur un support, les surfaces des mélanges de ciment dentaire ont été marquées et filmées pendant 40 minutes. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire S2 : Démonstrations de la procédure de baseplatage. L’angle entre la surface de la lentille de l’objectif et de la lentille relais a été ajusté en tournant la barre d’oreille, la barre dentaire ou l’argile adhésive réutilisable sur l’axe z. La marge de la lentille du relais est apparue comme un cercle gris semblable à la lune sur le moniteur. Une expression virale et une implantation réussie du cristallin devraient révéler au moins une dynamique de fluorescence (flèches) pendant le placage. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire S3 : Démonstrations de la dynamique de fluorescence chez des souris au comportement libre. Transitoires de fluorescence des souris #3, #4 et #5. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire S4 : Un exemple d’échec. Un fond uniforme est apparu pendant la procédure de baseplatage. Veuillez noter que l’altération de la luminosité n’était pas due aux transitoires de fluorescence des cellules individuelles; elle a été causée par la procédure de recherche. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire S5 : Démonstration d’un autre exemple de défaillance. Un manque de transitoires de fluorescence s’est produit pendant la procédure de baseplating, mais certaines marges cellulaires rondes étaient encore visibles. Veuillez noter que l’altération de la luminosité n’a pas été causée par les transitoires de fluorescence de cellules individuelles; elle a été causée par la procédure de recherche. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le présent rapport décrit un protocole expérimental détaillé pour les chercheurs utilisant le système Miniscope UCLA à deux lentilles. Les outils conçus dans notre protocole sont relativement abordables pour tout laboratoire qui souhaite essayer l’imagerie calcique in vivo . Certains protocoles, tels que l’injection virale, l’implantation de lentilles, le baseplating factice et le baseplating, pourraient également être utilisés pour d’autres versions du système miniscope afin d’améliorer le taux de réussite de l’imagerie calcique. Outre les problèmes généraux liés à l’injection virale et à l’implantation de lentilles qui doivent être corrigés quelle que soit la version du miniscope, la structure de la plaque de base UCLA peut provoquer un déplacement de position, ce qui peut entraîner des distances de travail incompatibles entre les lentilles de l’objectif et du relais (Figure 1C). Un protocole expérimental modifié a été élaboré pour minimiser le décalage de position des deux lentilles (figures 2, 4, figure 5). Une imagerie calcique réussie peut être obtenue grâce à une combinaison d’expressions virales réussies, d’implantation de lentilles et de procédures de baseplatage (Figure 5C). L’utilisation d’un système à deux lentilles pour observer les zones profondes du cerveau nécessite un haut niveau de précision dans les procédures de baseplating, car les positions relatives de la lentille relais implantée et de la lentille objectif doivent également être précises. Ce rapport présente non seulement un protocole qui résout les problèmes de baseplating, mais discute également de quelques conseils pour l’injection virale et l’implantation de lentilles. Ci-dessous, nous discutons d’abord des procédures de baseplating, suivies de l’injection virale et des procédures d’implantation de lentilles, et nous décrivons quelques exemples d’échecs (Figure 6).
Placage de base
La version V3 du UCLA Miniscope est actuellement la conception la plus couramment utilisée et peut être commandée en ligne. La plaque de base de cette version se compose de deux bords sans parois (Figure 1C1), mais sa forme peut provoquer un décalage inégal (Figure 1C1, C2) après que le ciment dentaire soit complètement sec. Les procédures de baseplatage factice de notre protocole (Figure 4) minimisent les problèmes de désalignement et de déplacement de la plaque de base, car elles utilisent un film de paraffine pour réduire l’espace disponible pour le ciment dentaire pendant le placage réel (Figure 5B). L’espace restant est encore suffisant pour trouver une position d’imagerie optimale pendant la procédure de baseplatage réelle. Par conséquent, le chercheur peut coller la plaque de base avec le moins de ciment dentaire possible (Figure 5B2). De plus, la procédure de baseplatage factice prend relativement peu de temps (environ 15 à 20 minutes) car elle ne nécessite pas une distance parfaite entre la lentille de l’objectif et la lentille relais pour être atteinte. Cependant, le placage de base factice n’est qu’un des facteurs clés du succès de l’imagerie calcique; Par exemple, lors de la surveillance des signaux de fluorescence, les neurones peuvent apparaître flous s’ils sont légèrement hors du plan de travail (en fonction de la distance de travail de la lentille relais; souvent environ 100 ~ 300 μm). La capacité d’améliorer la distance de travail est limitée, car la distance de travail des neurones est prédéterminée par la procédure d’implantation de lentilles relais. Une expérience a été réalisée sans la procédure de baseplating factice et la région d’intérêt a toujours été (chez quatre souris sur quatre) manquée après une seule baseplating. Par conséquent, ces solutions ont été conçues pour réduire le problème du retrait. Certains ciments dentaires photomérisables peuvent éviter le problème de rétrécissement pendant le durcissement, car ils durcissent très rapidement; Ces ciments peuvent aider les chercheurs à ajuster la distance pendant la procédure de baseplatage. Bien que la gamme de longueurs d’onde pour exciter les indicateurs de calcium et durcir le ciment dentaire soit différente, le photoblanchiment pendant la procédure de baseplatage doit être évité. Afin d’éviter le photoblanchiment, la gamme de longueurs d’onde générées par la source lumineuse doit être assez étroite pour éviter les réactions croisées entre les indicateurs de calcium et le ciment dentaire photopolymérisable. Par conséquent, l’utilisation de ciment dentaire photodurcissant n’est pas recommandée pour la procédure de placage de base. En outre, certaines marques spécifiques de ciments dentaires sont fréquemment utilisées pour le collage de plaques de base par d’autres équipes de recherche 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Les propriétés de faible retrait de ces ciments peuvent résoudre le problème, mais nous n’avons pas eu l’occasion de tester ces marques en raison de difficultés à les acheter (importer). Les produits de qualité médicale peuvent être soumis à des réglementations d’importation en fonction du pays / de la région. Si les chercheurs ont de la difficulté à accéder aux ciments mentionnés dans la littérature 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, notre protocole résoudra le problème du retrait du ciment dentaire.
En plus du problème de retrait, l’usure structurelle peut se produire dans le miniscope lui-même et sur la plaque de base (en particulier les aimants dans la plaque de base) au cours de nombreuses expériences. Tout petit écart causé par l’usure réduit la stabilité de la distance entre les deux lentilles. Encore une fois, la précision sur l’ensemble du chemin optique est essentielle à l’imagerie des transitoires calciques chez les souris se comportant librement à l’aide d’un miniscope.
Dépannage de l’injection virale / implantation de lentilles
Avant d’injecter le virus dans la région du cerveau, il est recommandé de monter une nouvelle aiguille sur le bras stéréotaxique et de percer lentement le cerveau aux coordonnées appropriées. Parce que la nouvelle aiguille est très tranchante, cette perforation sert d’étape de préparation pour dégager le chemin (ou couper un chemin) pour l’aiguille de microinjection et la lentille relais et minimise les dommages tissulaires, qui peuvent être causés par la compression de l’aiguille de microinjection ou de la lentille de relais. L’aiguille pointue coupe un chemin pour la lentille de relais émoussée; Ainsi, la pointe de l’aiguille doit être abaissée aux mêmes coordonnées avec la lentille du relais. L’aiguille intérieure d’un cathéter intraveineux de 20 G a été choisie parce qu’elle avait un diamètre de 1 mm, ce qui était similaire au diamètre de notre lentille de relais. Une jauge d’aiguille différente peut être utilisée en fonction du diamètre de la lentille du relais.
Bien que la présente étude ne se soit pas concentrée sur les propriétés et les titres des vecteurs viraux, ces facteurs sont toujours essentiels à la réussite de l’imagerie calcique (figure 5C). Il est nécessaire de prétester la qualité d’expression du vecteur viral. Les étapes 1 à 5 du protocole de Resendez et al. fournissent des méthodes détaillées pour l’identification d’un titre viral optimal pour les expériences d’imagerie calcique8. Si les tests préalables ne peuvent pas être effectués pour une raison quelconque, il est recommandé aux débutants d’essayer d’abord un titre relativement élevé. L’un des inconvénients de l’utilisation d’un titre viral élevé est la cytotoxicité8. Les neurones morts donnent lieu à une autofluorescence et sont visibles sous forme de taches blanches brillantes sous le miniscope8. Cependant, ces neurones morts sont de bons points de repère pour les débutants pour trouver et pratiquer la procédure de baseplating. D’autre part, bien que la perfusion d’un virus à faible titre présente un risque plus faible de tuer les cellules, la fluorescence peut être masquée par le fond si les cellules ne présentent pas de transitoires de fluorescence pendant la procédure de baseplatage. Il est difficile d’identifier les raisons de l’échec car les neurones cibles peuvent être manqués en raison de l’implantation de lentilles relais ou en raison de la mauvaise expression par le vecteur viral. Déterminer la cause est très déroutant sans confirmation histologique. Par conséquent, l’utilisation de virus à titre relativement élevé est recommandée si les vecteurs viraux ne peuvent pas être prétestés.
Resendez et al. recommandent d’insérer l’aiguille de micro-injection de 250 μm latérale et ventrale à la mise en place de la lentille. Nos observations ont démontré que l’infusion du virus à la même profondeur que la lentille relais peut également conduire à l’expression de bons signaux de calcium. Nous proposons qu’en raison de la possibilité d’infection et de propagation, l’infusion du virus à la même profondeur que la coordonnée de la lentille relais est optimale pour réduire les lésions tissulaires et augmenter la précision de la distance entre les neurones infectés et la lentille relais. Resendez et al recommandent également d’effectuer une injection virale et l’implantation de lentilles au cours de la même intervention chirurgicale étant donné la plage étroite de distances de travail entre les cellules cibles et la lentille relais8. Cependant, certains chercheurs suivent un protocole dans lequel l’étape de perfusion virale et l’étape d’implantation du cristallin sont effectuées à deux semaines (ou plus) d’intervalle18,26. L’allongement du temps entre les étapes réduit le temps opératoire individuel. Mais dans ce protocole, ces deux étapes ont été fusionnées en une seule chirurgie, car dans le protocole d’une seule chirurgie, le chirurgien peut surveiller la position entre l’aiguille de micro-injection et la lentille relais lorsqu’il les abaisse dans la zone cible, ce qui réduit le risque d’échec du ciblage (Figure 2B3).
Pour deux souris (souris #1 et #2), l’utilisation d’une aiguille pour créer un chemin pour la lentille a également été omise, et chez la souris #2, des taches grises rondes ressemblant à des cellules ont été observées (Figure 6C). Cependant, la dynamique de fluorescence (vidéo supplémentaire S5) n’a pas été observée. En examinant la tranche cérébrale de cet exemple (Figure 6C2, C3), nous avons postulé que la lentille relais a entraîné certaines cellules vers le bas pendant qu’elle était abaissée. Ces neurones traînés étaient malsains, de sorte qu’aucune activité n’a été remarquée pendant la procédure de baseplating ou pendant l’expérience.
Nous avions une souris avec un signal gris complètement homogène et aucune image visible ressemblant à une cellule pendant la procédure de baseplating (Figure 6B1). Après avoir sacrifié la souris, ses tranches de cerveau ont été observées. On a remarqué que la lentille se trouvait du côté médial de la couche pyramidale incurvée; la zone cible (figure 6B2) a été complètement manquée. Ces tentatives infructueuses ont été des expériences critiques qui nous ont amenés à modifier notre protocole de chirurgie et finalement à réussir avec trois souris (vidéo supplémentaire S3).
Aiguille de micro-injection
Le corps calleux est un tractus fibreux coriace qui recouvre l’hippocampe dorsal. En raison de sa rigidité, il résiste à la pénétration par une aiguille de micro-injection à bout plat. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser une aiguille de micro-injection avec une pointe biseautée. Ce type d’aiguille réduit non seulement les lésions tissulaires, mais réduit également la possibilité de ne pas infuser le virus dans la zone cible en raison du blocage par les fibres voisines. Nous avons résumé les problèmes mentionnés ci-dessus dans un tableau de dépannage (tableau 1).
Échéancier
Le délai pour l’ensemble de la procédure est résumé à la figure 2A, avec les jours comme unités. Dans le détail, la partie chirurgicale (injection virale, implantation de lentilles relais, baseplating factice) peut prendre 3 h pour les débutants ou 1,5 h pour les chercheurs suffisamment formés. Les souris ont une petite taille et un métabolisme rapide, et elles sont plus sensibles aux problèmes de santé causés par de longues périodes sous anesthésie que les espèces plus grandes27. Les chercheurs devraient viser à maintenir le temps passé en chirurgie en dessous de 3 heures. Le placage de base réel peut être effectué après 3 à 6 semaines d’expression de l’indicateur de calcium. Cette procédure peut prendre 1 h. L’observation longitudinale ultérieure de l’activité calcique peut être poursuivie pendant plus de 1 mois.
Conclusions
Le Miniscope UCLA est un appareil d’imagerie calcique in vivo open-source. Sans une plaque de base ou un module de lentille prêt à l’emploi et préinstallé, les personnes qui mènent des expériences doivent être en mesure d’atteindre avec précision la distance optimale entre la lentille d’objectif et la lentille relais pendant la procédure de baseplatage. La difficulté accrue d’utiliser le système UCLA Miniscope à deux lentilles réside dans le changement de volume du ciment dentaire. Nous avons optimisé les protocoles originaux et minimisé les défauts causés par les problèmes mentionnés ci-dessus, augmentant ainsi le taux de réussite de l’imagerie calcique avec le système UCLA Miniscope à deux lentilles.
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Disclosures
Il ne s’agit pas d’une étude financée par l’industrie. Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts financier.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Ministère de la science et de la technologie de Taïwan (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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