Summary
Усадка зубного цемента во время отверждения смещает опорную плиту. Этот протокол минимизирует проблему, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента, который оставляет место для цементирования опорной плиты. Несколько недель спустя опорная плита может быть зацементирована в положении на этом каркасе с использованием небольшого количества нового цемента, тем самым уменьшая усадку.
Abstract
Нейробиологи используют миниатюрные микроскопы (минископы) для наблюдения активности нейронов у свободно ведущих себя животных. Команда Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) предоставляет открытые ресурсы для исследователей для создания минископов самостоятельно. Минископ V3 UCLA является одним из самых популярных минископов с открытым исходным кодом, используемых в настоящее время. Он позволяет визуализировать флуоресцентные переходные процессы, испускаемые генетически модифицированными нейронами, через объективную линзу, имплантированную в поверхностную кору (система с одной линзой), или в глубокие области мозга через комбинацию релейной линзы, имплантированной в глубокий мозг, и объектива, который предварительно отбирается в минископе для наблюдения за ретранслируемым изображением (двухлинзовая система). Даже в оптимальных условиях (когда нейроны выражают показатели флуоресценции и правильно имплантирована релейная линза) изменение объема зубного цемента между опорной пластиной и его прикреплением к черепу при отверждении цемента может вызвать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к ухудшению качества изображения. Опорная плита - это пластина, которая помогает установить минископ на череп и фиксирует рабочее расстояние между объективом и релейными линзами. Таким образом, изменения в объеме зубного цемента вокруг опорной пластины изменяют расстояние между линзами. Настоящий протокол направлен на минимизацию проблемы смещения, вызванной изменениями объема зубного цемента. Протокол уменьшает перекос, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента во время имплантации релейной линзы. Время выздоровления после имплантации достаточно для того, чтобы фундамент зубного цемента полностью отверзил опорную плиту, поэтому опорную плиту можно цементировать на этом каркасе, используя как можно меньше нового цемента. В настоящей статье мы описываем стратегии нанесения базовых покрытий у мышей, чтобы обеспечить визуализацию нейронной активности с помощью объектива, закрепленного в минископе.
Introduction
Флуоресцентные репортеры активности идеально подходят для визуализации активности нейронов, поскольку они чувствительны и имеют большие динамические диапазоны 1,2,3. Поэтому все большее число экспериментов используют флуоресцентную микроскопию для непосредственного наблюдения активности нейронов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Первый миниатюрный однофотонный флуоресцентный микроскоп (минископ) был разработан в 2011 году Марком Шнитцером и др.5. Этот минископ позволяет исследователям контролировать динамику флуоресценции мозжечковых клеток у свободно ведущих себя животных5 (т.е. без каких-либо физических ограничений, подголовника, седации или анестезии животных). В настоящее время методика может применяться для мониторинга поверхностных участков мозга, таких как кора 6,8,15,16; подкорковые области, такие как спинной гиппокамп 8,11,13,14 и полосатое тело 6,17; и глубокие области мозга, такие как вентральный гиппокамп14, миндалина 10,18 и гипоталамус 8,12.
В последние годы было разработано несколько минископов с открытым исходным кодом.4,5,6,7,11,13,17,19. Минископ может быть экономически собран исследователями, если они следуют пошаговым рекомендациям, предоставленным командой Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA).4,7,11,13. Потому что оптический мониторинг нейронной активности ограничен ограничениями светопропускания7 Для и из интересующей нейронной популяции был разработан минископ, который требует, чтобы объектив с градиентным показателем преломления (GRIN) (или объектив) был предварительно отобран в нижней части минископа для увеличения поля зрения, которое передается из релейной линзы GRIN (или релейной линзы)6,7,8,10,16,17. Эта релейная линза имплантируется в целевую область мозга таким образом, что флуоресцентная активность целевой области мозга передается на поверхность релейной линзы.6,7,8,10,16,17. Приблизительно 1/4 полного синусоидального периода света проходит через объектив GRIN (~ 0,25 шага) (Рисунок 1A1), что приводит к увеличенному флуоресцентному изображению6,7. Объектив не всегда фиксируется в нижней части минископа, и не требуется имплантация релейной линзы6,7,11,13,15. В частности, существует две конфигурации: одна с фиксированным объективом в минископе и релейная линза, имплантированная в мозг.8,10,12,14,16 (Рисунок 1B1) и еще один со съемным объективом6,7,11,13,15 (Рисунок 1B2). В конструкции, основанной на комбинации неподвижного объектива и имплантированной релейной линзы, флуоресцентные сигналы от мозга доводятся до верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A1)7,8,10,12,14,16. Впоследствии объектив может увеличивать и передавать поле зрения с верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A2). С другой стороны, конструкция съемной объектива GRIN более гибкая, что означает, что предварительная имплантация релейной линзы в мозг не является обязательной (Рисунок 1B2)6,7,11,13,15. При использовании минископа, основанного на конструкции съемной объективной линзы, исследователям все еще необходимо имплантировать линзу в целевую область мозга, но они могут либо имплантировать объективную линзу.6,7,11,13,15 или релейная линза в головном мозге6,7. Выбор объектива или релейной линзы для имплантации определяет конфигурацию минископа, которую должен использовать исследователь. Например, минископ V3 UCLA основан на съемной конструкции объектива GRIN. Исследователи могут выбрать либо прямую имплантацию объектива в интересующую область мозга, либо установить «пустой» минископ на объектив.6,7,11,13,15 (однообъективная система; Рисунок 1B2) или имплантировать релейную линзу в мозг и установить минископ, который предварительно отобран с объективом6,7 (двухобъективная система; Рисунок 1B1). Затем минископ работает как флуоресцентная камера для захвата прямых трансляций изображений флуоресценции нейронов, создаваемой генетически закодированным индикатором кальция.1,2,3. После подключения минископа к компьютеру эти флуоресцентные изображения могут быть переданы на компьютер и сохранены в виде видеоклипов. Исследователи могут изучать активность нейронов, анализируя относительные изменения флуоресценции с помощью некоторых пакетов анализа.20,21 или написать свои коды для будущего анализа.
Минископ V3 UCLA обеспечивает гибкость для пользователей, чтобы определить, следует ли отображать активность нейронов с помощью системы7 с одной или двумя линзами. Выбор системы записи основывается на глубине и размере целевой области мозга. Короче говоря, система с одним объективом может отображать только область, которая является поверхностной (менее примерно 2,5 мм глубиной) и относительно большой (больше, чем примерно 1,8 x 1,8мм2), потому что производители производят только определенный размер объектива. Напротив, двухлинзовая система может быть применена к любой целевой области мозга. Однако зубной цемент для склеивания опорной плиты имеет тенденцию вызывать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к плохому качеству изображения. Если используется система с двумя объективами, для достижения оптимального качества изображения необходимо точно указать два рабочих расстояния (рисунок 1A). Эти два критических рабочих расстояния находятся между нейронами и нижней поверхностью релейной линзы, а также между верхней поверхностью релейной линзы и нижней поверхностью объектива (рисунок 1A1). Любое смещение или неправильное расположение объектива за пределами рабочего расстояния приводит к сбою изображения (рисунок 1C2). Напротив, система с одним объективом требует только одного точного рабочего расстояния. Однако размер объектива ограничивает его применение для мониторинга глубоких областей мозга (объектив, который подходит для минископа, составляет примерно 1,8 ~ 2,0 мм 6,11,13,15). Поэтому имплантация объектива ограничена для наблюдения за поверхностью и относительно большими областями мозга, такими как кора 6,15 и спинной cornu ammonis 1 (CA1) у мышей11,13. Кроме того, большая область коры должна быть аспирирована для нацеливания на спинную часть CA111,13. Из-за ограничения конфигурации с одной линзой, которая предотвращает визуализацию глубоких областей мозга, коммерческие системы минископов предлагают только комбинированную конструкцию объектива / релейной линзы (двухлинз). С другой стороны, минископ V3 UCLA может быть модифицирован в однообъективную или двухобъективную систему, потому что его объектив съемный 6,11,13,15. Другими словами, пользователи минископа V3 UCLA могут воспользоваться съемным хрусталиком, имплантировав его в мозг (создав систему с одной линзой), при выполнении экспериментов с участием поверхностных наблюдений за мозгом (менее 2,5 мм в глубину) или предварительно выбрав его в минископ и имплантировав релейную линзу в мозг (создав двухлинзовую систему), при выполнении экспериментов с участием глубоких наблюдений мозга. Система с двумя линзами также может быть применена для поверхностного наблюдения за мозгом, но исследователь должен знать точные рабочие расстояния между объективом и линзой реле. Основным преимуществом системы с одним объективом является то, что существует меньшая вероятность пропуска рабочих расстояний, чем в системе с двумя объективами, учитывая, что существует два рабочих расстояния, которые должны быть точно нацелены для достижения оптимального качества изображения в системе с двумя объективами (рисунок 1A). Поэтому мы рекомендуем использовать однолинзовую систему для поверхностных наблюдений за мозгом. Однако, если эксперимент требует визуализации в глубокой области мозга, исследователь должен научиться избегать смещения двух линз.
Базовый протокол двухлинзовой конфигурации минископов для экспериментов включает имплантацию линз и покрытиеоснований 8,10,16,17. Опорное покрытие - это наклеивание опорной пластины на голову животного, так что минископ может быть в конечном итоге установлен поверх животного и видеозапись флуоресцентных сигналов нейронов (рисунок 1B). Эта процедура включает в себя использование зубного цемента для приклеивания опорной пластины на череп (рисунок 1C), но усадка зубного цемента может вызвать неприемлемые изменения расстояния между имплантированной релейной линзой и объективом 8,17. Если смещенное расстояние между двумя линзами слишком велико, клетки не могут быть сфокусированы.
Подробные протоколы экспериментов по глубокой визуализации кальция мозга с использованием минископов уже опубликованы8,10,16,17. Авторы этих протоколов использовали систему Inscopix8,10,16 или другие индивидуальные проекты17 и описали экспериментальные процедуры вирусного отбора, хирургии и прикрепления опорной пластины. Однако их протоколы не могут быть точно применены к другим системам с открытым исходным кодом, таким как система V3 UCLA Miniscope, NINscope.6и финчскоп19. Смещение двух линз может произойти во время записи в конфигурации с двумя линзами с минископом UCLA из-за типа зубного цемента, который используется для цементирования опорной пластины к черепу8,17 (Рисунок 1C). Настоящий протокол необходим, поскольку расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом склонно к смещению из-за нежелательной усадки зубного цемента во время процедуры нанесения опорного покрытия. Во время нанесения опорного покрытия оптимальное рабочее расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом должно быть найдено путем регулировки расстояния между минископом и верхней частью релейной линзы, а затем опорная пластина должна быть приклеена в этом идеальном месте. После установки правильного расстояния между объективом и имплантированной релейной линзой можно получить продольные измерения с клеточным разрешением (Рисунок 1B; in vivo запись). Так как оптимальный диапазон рабочих расстояний релейной линзы невелик (50 - 350 мкм)4,8, чрезмерная усадка цемента во время отверждения может затруднить удержание объектива и имплантированной релейной линзы в соответствующем диапазоне. Общая цель этого отчета состоит в том, чтобы предоставить протокол для уменьшения проблем усадки8,17 которые происходят во время процедуры опорного покрытия и для увеличения успешности минископических записей флуоресцентных сигналов в конфигурации с двумя линзами. Успешная запись минископа определяется как запись прямой трансляции заметных относительных изменений флуоресценции отдельных нейронов у свободно ведущего себя животного. Хотя разные марки стоматологического цемента имеют разную скорость усадки, исследователи могут выбрать бренд, который был ранее протестирован.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Тем не менее, не каждый бренд легко получить в некоторых странах / регионах из-за правил импорта медицинских материалов. Поэтому мы разработали методы для проверки скорости усадки доступных зубных цементов и, что важно, предоставляем альтернативный протокол, который минимизирует проблему усадки. Преимуществом по сравнению с настоящим протоколом нанесения фундамента является увеличение успешности визуализации кальция с помощью инструментов и цемента, которые можно легко получить в лабораториях. В качестве примера используется минископ UCLA, но протокол также применим к другим минископам. В этом отчете мы описываем оптимизированную процедуру нанесения опорных покрытий, а также рекомендуем некоторые стратегии установки системы минископа UCLA с двумя линзами (Рисунок 2А). Представлены как примеры успешной имплантации (n= 3 мыши), так и примеры неудачной имплантации (n=2 мыши) для двухлинзовой конфигурации с минископом UCLA вместе с обсуждениями причин успехов и неудач.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были одобрены Национальным комитетом по уходу и использованию животных Тайваньского университета (номер одобрения: NTU-109-EL-00029 и NTU-108-EL-00158).
1. Оценка изменения объема зубного цемента
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в объеме зубного цемента происходят в процессе отверждения. Проверьте изменения объема зубного цемента перед имплантацией и нанесением фундамента. Исследователи могут протестировать любую марку зубного цемента и использовать бренд с наименьшим изменением объема для цементирования опорной плиты. Пример показан на рисунке 3.
- Взвесьте 0,5 г каждого порошка зубного цемента и смешайте его с соответствующим раствором (1 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое соотношение порошок/жидкость в инструкциях по зубному цементу составляет 0,5 г порошка на 0,25 мл раствора для получения твердой формы. Данный протокол испытаний разбавляет соотношение до 0,5 г/мл таким образом, чтобы смесь можно было аспирировать в жидкой форме для измерения изменения объема наконечников пипеток. - Используйте 0,1-10 мкл наконечников пипетки, чтобы удалить 2,5 мкл зубной цементной смеси, а затем запечатайте наконечник пипетки легким отверждающим клеем.
- Поместите наконечники на стойку, отметьте самые верхние уровни зубной цементной смеси и измерьте уровень зубной цементной смеси через 40 минут (Дополнительное видео S1).
- В дополнение к мониторингу изменений уровня во время отверждения зубного цемента в наконечниках, измерьте оставшуюся плотность сухого зубного цемента. Чтобы рассчитать плотность, измерьте вес зубного цемента и измерьте объем по принципу Архимеда.
- Короче говоря, поместите оставшийся сухой зубной цемент в чашку, наполненную водой, и взвесьте воду, которая переполняется.
- Используйте зубной цемент с наименьшей усадкой для всех протоколов, описанных ниже.
2. Анестезия, хирургическая имплантация, вирусные инъекции и фиктивное покрытие фундамента
- Анестезия
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий доклад направлен на оптимизацию процедуры хирургии и нанесения фундамента для минископа UCLA; поэтому предполагалось, что известен оптимальный вирусный титр для заражения целевых областей мозга. Методы поиска оптимального вирусного титра можно найти на этапах с 1 по 5 Resendez et al.8. После того, как вирусное разведение было оптимизировано, может быть начата хирургическая имплантация.- Поместите мышь в индукционный контейнер и обеспечьте кислород (100% при скорости воздушного потока 0,2 л/мин). Преоксигенировать мышь в течение 5-10 мин.
- Вводят 5% изофлурана, смешанного со 100% кислородом (скорость воздушного потока: 0,2 л / мин), пока мышь не начнет терять равновесие и в конечном итоге не будет обезболена.
- Выводят мышь из индукционной камеры и вводят атропин (0,04 мг/кг; подкожная инъекция), чтобы предотвратить накопление слюны и бупренорфина (0,03 мг/кг; подкожная инъекция) в качестве анальгетика.
- Побрить голову мыши.
- Наденьте маску, стерильный халат и перчатки. Подготовьте стерильное пространство и стерильные хирургические инструменты к операции. Стабилизируйте голову мыши (поддерживайте анестезию от 3 до 2,5% изофлурана во время этого шага) на стереотаксическом аппарате. После обезболивающих и обезболивающих процедур убедитесь, что ушные вкладыши надежно стабилизируют голову. Обеспечьте тепловую поддержку.
- Убедитесь, что голова поставлена в прямое положение, стерилизуйте бритую голову бетадином, а затем опрыскивайте голову ксилокаином (10%), местным анальгетиком.
- Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте офтальмологическую мазь для защиты глаз во время всех анестезиологических мероприятий, чтобы предотвратить травму глаза. - Проверьте глубокий болевой рефлекс животного, зажав его заднюю лапу. Как только животное не проявит рефлекса отвода лапы, приступайте к хирургическим процедурам.
- Сделайте небольшой разрез вдоль средней сагиттальной плоскости черепа (начиная примерно от 2 мм спереди до брегмы и заканчивая примерно 6 мм сзади от брегмы). Затем очистите соединительную ткань на черепе и закрепите три винта из нержавеющей стали на левой лобной и межтеменной костях.
- В этот момент уменьшают изофлуран до 1-2%. Следите за частотой дыхания в течение всей хирургической процедуры. Если частота дыхания слишком медленная (примерно 1/с, в зависимости от животного), уменьшите концентрацию изофлурана.
- Выполните трепанацию черепа для имплантации релейной линзы под хирургическим микроскопом или стереомикроскопом с помощью сверла с диаметром наконечника 0,7 мм. Используйте микро-сверло, чтобы захватить буровое долото и нарисовать контур предполагаемой области круга (полную толщину кальвария не нужно пробивать).
ПРИМЕЧАНИЕ: Релейная линза, используемая в настоящем протоколе, имела диаметр 1,0 мм, длину ~ 9,0 мм и шаг 1 и диапазон рабочего расстояния ~100 мкм - 300 мкм; поэтому трепанация черепа имела диаметр 1,2 мм.- Аккуратно углубите контур до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не обнажится.
- Приготовьте 3 мл стерильного физиологического раствора в шприце объемом 3 мл и охладите его в ведре со льдом. Часто промывайте открытую область 0,1 мл физиологического раствора из шприца, чтобы охладить область и предотвратить тепловое повреждение и кровоизлияние.
- Слегка соберите и снимите твердую мозговую оболочку с помощью иглы 27G.
- Нанесите маркировку на тупую иглу 27 G на расстоянии 1 мм от кончика и используйте ее для тщательного аспирации коры головного мозга, чтобы создать окно для имплантации хрусталика 8,11,13,17 (рисунок 2B1). При необходимости сделайте тупую иглу, отшлифовав кончик инъекционной иглы весом 27 г наждачной бумагой. Затем подключите иглу к шприцу, подключите шприц к трубке и подключите трубку к источнику всасывания, чтобы создать вакуум.
ПРИМЕЧАНИЕ: Релейная линза тупая и будет сжимать ткань мозга, когда она помещается в глубокую область мозга. Таким образом, аспирация коры уменьшает повреждение тканей за счет имплантации релейной линзы. Толщина коры головного мозга у мышей составляет около 1 мм, но ее трудно визуализировать под стереомикроскопом. Метка создает ориентир, позволяющий определить глубину иглы более точно, чем с помощью одного только стереомикроскопа. Кроме того, можно определить, была ли достигнута или передана область коры в зависимости от сопротивления; верхняя часть коры кажется относительно мягкой, в то время как подкорковая область чувствует себя плотной. Поэтому, как только текстура начинает ощущаться плотнее, остановите аспирацию (рисунок 2B3). - Приготовьте 3 мл стерильного физиологического раствора в шприце объемом 3 мл и охладите его в ведре со льдом. Промыть область физиологическим раствором, чтобы остановить кровотечение и уменьшить возможность отека мозга.
- Инъекции аденоассоциированного вируса (AAV)
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем эксперименте использовался AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE. jGCaMP7s является генетически закодированным индикатором кальция, который излучает зеленую флуоресценцию3. Поскольку в настоящем исследовании в качестве субъекта использовалась мышь дикого типа, вирусный вектор был необходим для трансфекции нейронов с помощью гена индикатора зеленого флуоресцентного кальция и обеспечения экспрессии. Исследователи, использующие трансгенных мышей, экспрессирующих индикатор зеленого флуоресцентного кальция в качестве своих субъектов, могут пропустить протокол 2.2.- Установите внутреннюю иглу внутривенного (т.е.в.) катетера 20 Г на стереотаксическую руку и медленно проколите (~100 - 200 мкм/мин) мозг в соответствующих координатах (те же координаты, которые используются при имплантации релейной линзы) (рисунок 2B3).
- Опустите микроинъекционную иглу со скоростью 100-200 мкм/мин в вентральный CA1 и вливайте (~ 25 нл/мин) 200 нЛ вирусного вектора в целевую область (-3,16 мм AP, 3,25 мм ML и -3,50 мм DV из брегмы).
- Подождите 10 минут, чтобы вирус диффундировал и свел к минимуму обратный поток.
- Извлеките (~100-200 мкм/мин) микроинъекционную иглу.
- Имплантация релейной линзы
- Продезинфицируйте релейную линзу 75% спиртом10,16, а затем промойте безпирогеновым физиологическим раствором. Замочите хрусталик в холодном физиологическом растворе без пирогена до имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Холодная линза минимизирует отек мозга при помещении в мозг. - Удерживайте релейную линзу с помощью микробульдожьего зажима (рисунок 2B3), зубы которого покрыты термоусадочной трубкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим бульдога может прочно удерживать линзу, не повреждая ее. Обратитесь к Resendez et al.8 для получения способа изготовления зажима бульдога, покрытого трубками. - Медленно поместите (~100 - 200 мкм/мин) релейную линзу поверх целевой области (-3,16 мм AP, 3,50 мм ML и -3,50 мм DV от брегмы) и стабилизируйте ее зубным цементом.
- Продезинфицируйте релейную линзу 75% спиртом10,16, а затем промойте безпирогеновым физиологическим раствором. Замочите хрусталик в холодном физиологическом растворе без пирогена до имплантации.
- Фиктивное основание
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью «фиктивного покрытия» во время операции по имплантации является создание зубной цементной основы, чтобы уменьшить количество зубного цемента, которое необходимо нанести во время реальной процедуры нанесения фундамента через несколько недель. Таким образом, риск изменения объема зубного цемента сводится к минимуму.- Закрепите объектив на нижней части минископа и соберите опорную пластину на минископ (на этом этапе сборка анкерного объектива, опорной пластины и минископа еще не была размещена над черепом мыши).
- Оберните 10 см парафиновой пленки вокруг внешней стороны опорной плиты (рисунок 4А).
- Удерживайте минископ с помощью стереотаксического манипуляторного зонда, используя многоразовую клейкую глину.
- Выровняйте объектив поверх релейного объектива с как можно меньшим пространством между объективами (рисунок 4B).
- Используйте зубной цемент, чтобы закрепить позиционирование опорной плиты (таким образом, чтобы цемент касался только парафиновой пленки).
- Когда зубной цемент высохнет, снимите пленку.
- Снимите опорную пластину и минископ. Зубная цементная основа полая (рисунок 4В).
- Чтобы защитить релейную линзу от повседневной деятельности и от царапин мышью, запечатайте линзу реле силиконовой резиной до тех пор, пока линза реле не будет покрыта, и покройте силиконовую резину тонким слоем зубного цемента (рисунок 4B).
- Отсоедините мышь от стереотаксических инструментов и поместите мышь в камеру восстановления.
- Вводят карпрофен (5 мг/кг; подкожная инъекция) или мелоксикам (1 мг/кг; подкожная инъекция) для обезболивания и цефтазидима (25 мг/кг; подкожная инъекция) для профилактики инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков не является альтернативой асептической технике. Периоперационные антибиотики (т.е. цефтазидим) могут быть показаны при определенных обстоятельствах, таких как длительные операции или установка хронических имплантатов. - Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
- Домашние мыши индивидуально и вводят мелоксикам (1 мг/кг; подкожная инъекция; q24h) в течение одной недели для облегчения послеоперационной боли. Проверяйте животное каждый день после операции, чтобы убедиться, что оно нормально ест, пьет и испражняется.
- Выполните нанесение фундамента через 3 или более недель.
3. Опорное покрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно процедура нанесения фундамента (рисунок 5) не может быть выполнена в течение 2-3 недель после первоначальной процедуры из-за восстановления и времени инкубации вируса. Процедуры индукции для нанесения опорных покрытий аналогичны процедурам, описанным на этапах 2.1.1-2.1.8. Однако нанесение фундамента не является инвазивной процедурой, и животному требуется только легкая седация. Поэтому достаточно 0,8-1,2% изофлурана, пока животное не может передвигаться по стереотаксической рамке. Кроме того, относительно легкая изофлурановая анестезия также может помочь облегчить экспрессию флуоресцентных переходных процессов нейронов во время мониторинга8 (Дополнительное видео S2).
- Аккуратно вырежьте тонкий слой зубной цементной кровли с помощью костного роггера и удалите силиконовую резину. Очистите поверхность релейной линзы спиртом 75%.
- Прикрепите установленный винт рядом с опорной плитой, чтобы закрепить его в нижней части минископа (рисунок 5A1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Опорная плита должна быть надежно затянута под дном минископа, поскольку разница между затянутой и слегка закрепленной опорной плитой может привести к несогласованному расстоянию. - Отрегулируйте фокусный слайд примерно на расстоянии 2,7 - 3 мм от основного корпуса (рисунок 5A2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя длина может быть дополнительно отрегулирована во время процедуры нанесения опорного покрытия, зафиксируйте ее примерно до 2,7 мм, потому что одновременная регулировка длины минископа и оптимальной длины между имплантированной релейной линзой и линзой предварительного объектива очень запутанна. - Подключите минископ к плате сбора данных и подключите его к порту USB 3.0 (или более поздней версии) на компьютере.
- Запустите программное обеспечение для сбора данных, разработанное командой UCLA.
- Отрегулируйте экспозицию до 255, коэффициент усиления до 64x, а светодиод возбуждения до 5%. Эти настройки рекомендуются для первоначального покрытия фундамента; конкретные настройки будут варьироваться в зависимости от областей мозга и уровней экспрессии генетически закодированного показателя кальция.
- Нажмите кнопку «Подключить », чтобы подключить минископ к программному обеспечению для сбора данных и посмотреть прямую трансляцию.
- Выровняйте объектив минископа с релейной линзой вручную и начните поиск флуоресцентных сигналов (рисунок 5B1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально поиск флуоресцентного сигнала вручную облегчает настройку. Поскольку для экспрессии генетически закодированного показателя кальция использовалась система AAV, как промоторный тип, так и серотип AAV влияли на эффективность трансфекции23,24. Исследователи должны проверить экспрессию индикатора кальция, найдя отдельные нейроны, которые показывают изменения в флуоресценции, прежде чем приступать к будущим экспериментам. - Сверлите зубной цемент в любом месте, где он блокирует минископ (опционально).
- Смотрите прямую трансляцию программного обеспечения для сбора данных и используйте край релейного объектива в качестве ориентира (Дополнительное видео S2). Поле линзы реле выглядит как луноподобный серый круг на мониторе (рисунок 5B1; белые стрелки).
- Как только релейная линза найдена, тщательно отрегулируйте различные углы и расстояния минископа, пока не будут найдены флуоресцентные сигналы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения нейронов белее, чем фон. Точная форма нейронов указывает на то, что нейроны идеально лежат на фокальной плоскости линзы реле. Круглые нейроны предполагают, что они находились вблизи фокальной плоскости. Форма нейронов различна по всему мозгу, здесь в качестве примера показан вентральный CA1. - Если ни один отдельный нейрон не проявляет изменений флуоресценции в зависимости от времени, повторно запечатайте основание силиконовой резиной. Флуоресценции не наблюдается, поскольку инкубационный период также зависит от свойства вируса23,24. Выполните шаги 3.1-3.12 через дополнительную неделю. (Это необязательно).
- Удерживайте минископ в оптимальном положении и переместите стереотаксическую руку многоразовой клейкой глиной к минископу (рисунок 5B2). Прикрепите минископ к стереотаксической руке с многоразовой клейкой глиной.
- Немного отрегулируйте рычаги x, y и z для поиска наилучшего вида (Дополнительное видео S2). Затем отрегулируйте угол между поверхностью объектива и релейной линзой, повернув ушную перекладину, зубную планку или многоразовую клейкую глину по оси Z. Вирусная экспрессия и имплантация хрусталика успешны, когда по меньшей мере одна клетка демонстрирует флуоресцентные переходные процессы (рисунок 6А; Дополнительное видео S2) во время покрытия основания (которое также зависит от области мозга, такой как CA1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если монитор показывает только белые ячейки, но без переходных процессов, есть другая причина (см. Рисунок 6B, C, Дополнительные видео S4,S5, раздел Результаты и раздел устранения неполадок). - Сцементируйте опорную плиту (рисунок 5B2) зубным цементом.
- Контролируйте интересующую область во время цементирования, чтобы убедиться, что оптимальное положение не меняется.
- Используйте минимально возможное количество цемента, при этом прочно приклеивая опорную плиту на зубную цементную основу (рисунок 5B2). Нанесите второй и третий слой цемента вокруг опорной плиты, но будьте осторожны, чтобы не повлиять на линзу GRIN.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение цемента на опорную плиту проще на этом этапе, так как основание опорной плиты было сформировано во время процедуры фиктивного покрытия. - Тщательно отсоедините минископ от опорной плиты при отверждении цемента. Затем прикрутите защитный колпачок.
- Переместите животное в клетку для восстановления. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
- Домашние мыши по отдельности. Убедитесь, что он ест, пьет и испражняется нормально каждый день. Подождите 5 дней, пока мышь полностью восстановится, а затем проверьте изображение кальция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует только небольшое количество зубного цемента, удерживающего опорную плиту. Поэтому, если опорная плита значительно сместилась после процедуры нанесения фундамента, удалите зубной цемент с помощью сверла, выполните процедуру нанесения опорного покрытия снова. - Обезболить (путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамин (87 мг/кг)/ксилазин (13 мг/кг)) и перфузить25 животным после проведения всех экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка изменения объема зубного цемента
Поскольку объем зубного цемента изменяется в процессе отверждения, это может значительно повлиять на качество изображения, учитывая, что рабочее расстояние линзы GRIN составляет примерно от 50 до 350 мкм 4,8. Поэтому в этом случае были протестированы два коммерчески доступных зубных цемента, Tempron и Tokuso, перед процедурой имплантации и нанесения фундамента (рисунок 5). Сначала оценивали видео, чтобы определить, сократились ли цементы, а затем сравнивали объемы цементов при полном высушивании. Одинаковую концентрацию и объемы исходных смесей зубных цементов загружали в наконечники пипеток и снимали на видео (Дополнительное видео S1). Видео S1 продемонстрировало, что оба цемента сократились в процессе сушки. Tokuso работал лучше, чем Tempron (т.е. он имел больший объем, чем Tempron, даже после сжатия): Рисунок 3B; средний объем Tempron: 0,93 ± 0,07 мл; средний объем Токусо: 1,18 ± 0,07 мл; t-тест: p = 0,048, t(6) = 2,46, предполагая, что он сократился меньше. Плотность цементов также была проверена 4 раза после полной сушки. Токусо имел более низкую среднюю плотность, чем Темпрон (средняя плотность Темпрона: 1,07 ± 0,12 г/мл; средняя плотность Токусо: 0,93 ± 0,08 г/мл; t-тест: p = 0,38, t(6) = -0,94), подразумевая, что он имел более низкую скорость усадки. Поэтому Токусо использовался для следующих этапов имплантации и нанесения опорного покрытия. Цель описания эксперимента выше состоит не в том, чтобы рекомендовать какие-либо бренды, а в том, чтобы напомнить экспериментаторам о необходимости найти зубной цемент, который не претерпевает значительных изменений объема при отверждении.
Измерение смещения изображения
Мы смоделировали фиктивные процедуры нанесения опорных покрытий и оригинальных опорных покрытий на неподвижном объекте, чтобы выяснить, приводит ли фиктивная процедура опорного покрытия к меньшему смещению местоположения опорной плиты, чем первоначальная процедура. Для фиксации иглы шприца весом 23 г 2,5 см в центре опорной плиты с торчащим из опорной пластины 1 см использовался светоотверждающий клей (рисунок 3С). Затем моделирование фундамента имитировалось путем удержания игл рукой стереотаксического инструмента. Вместо использования лабораторных животных на стол стереотаксического инструмента была прикреплена наклейка. Шприцевая игла прокалывала наклейку, тем самым представляя первоначальное местоположение. Затем иглу подняли на 0,5 мм и начали симуляционные операции. В операции, имитирующей одноразовую процедуру нанесения базового покрытия8, зубной цемент наносили до тех пор, пока он не покрыл опорную пластину, которая находилась на 1 см выше наклейки. Затем был 2-часовой период ожидания, пока цемент отверждается, прежде чем осторожно толкнуть иглу, чтобы снова проткнуть наклейку. Поскольку светоотверждающий клей не полностью стабилизировал иглу, иглу можно было протолкнуть глубже, чтобы создать еще одно отверстие, представляющее местоположение опорной пластины после высыхания зубного цемента. Расстояние между начальным отверстием и вторым отверстием измеряли для количественной оценки смещения местоположения иглы. Результаты показали, что опорная плита на 1 см над черепом привела к смещению местоположения на 1,76 ± 0,14 мм, но фиктивное основание привело к смещению только на 0,75 ± 0,17 мм (рисунок 3D; среднее расстояние смещения одноразового базового покрытия по сравнению с фиктивным основанием; t-тест: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Кроме того, нам было любопытно, повлияет ли высота зубного цемента на сдвиг. Поэтому мы дополнительно протестировали более короткую высоту (рисунок 3E; 0,5 см выше), используя одноразовую процедуру нанесения базового покрытия. Опорная плита, которая была закреплена на 0,5 см над черепом, смещалась значительно меньше, чем опорная пластина на 1 см над черепом (рисунок 3F; среднее расстояние сдвига: 0,43 ± 0,11 против 1,76 ± 0,14 мм; t-тест: p < 0,01, t(8) = 9,73). Данные свидетельствуют о том, что высота опорной пластины над черепом и расстояние, на которое смещалась опорная плита, были положительно коррелированы. Поскольку за процедурой фиктивного опорного покрытия следует второй этап нанесения опорного покрытия, на котором используется только минимальное количество зубного цемента, эти данные также подтверждают гипотезу о том, что фиктивное покрытие помогает повысить точность процедуры опорного покрытия.
Визуализация с помощью двухлинзовой минископической системы
Следуя хирургическим протоколам для вирусной инфузии, фиктивного опорного покрытия и опорного покрытия (рисунок 2, рисунок 4, рисунок 5), мы наблюдали флуоресцентные переходные процессы отдельных нейронов у трех мышей (n = 3/5) (рисунок 6A, дополнительное видео S3) во время процедуры покрытия основания и после процедуры опорного покрытия, когда мыши свободно двигались, подтверждая, что рабочее расстояние между объективом и релейными линзами оставалось неизменным (рисунок 6A1 по сравнению с рисунком 6А3, после полного высыхания зубного цемента произошло лишь незначительное смещение положения. Здесь мы предоставляем видео о базовом покрытии одной мыши (Дополнительное видео S2; мышь No 5) и последующей визуализации кальция, когда мыши свободно двигались (Дополнительное видео S3; мышь No 3, No 4, No 5; необработанные данные). Обратите внимание, что программное обеспечение для сбора данных для V3 не содержит функций для вычитания фона, а контрастность видео может быть улучшена автономной обработкой). Для дополнительного видео S2 был выполнен ручной поиск флуоресцентных сигналов, а затем минископ был прикреплен к стереотаксическому рычагу для тонкой регулировки. Некоторые флуоресцентные переходные процессы наблюдались во время зондирования (Дополнительное видео S2; Рисунок 6А). Переходный процесс — это плавное смещение яркости в серых или белых пятнах, а не рисунок стрельбы, напоминающий мигающий свет; На фиг.6А 1-6А2 показаны изображения переходных процессов. Видео свободно ведущих себя мышей показало приемлемый пространственный сдвиг по сравнению с областью интереса во время процедуры нанесения базового покрытия (Дополнительное видео S3). Края клеток не могли быть значительно улучшены на этом этапе, потому что мы не могли регулировать расстояние между нижней частью линзы реле и активными нейронами. Примечательно, что некоторые проблемы могут часто возникать во время процедуры нанесения фундамента, включая отсутствие чего-либо, кроме однородного фона (рисунок 6B; Дополнительное видео S4) или видимость полей белых клеток без флуоресцентных переходных процессов (рисунок 6C; Дополнительное видео S5). Также приводятся два примера отрицательных результатов (n = 2/5) (Рисунок 6B,C, Дополнительные видео S4, S5). Потенциальные причины сбоев рассматриваются в разделе Обсуждение. Хирургические процедуры для этих двух мышей были выполнены без использования иглы диаметром 1 мм для очистки пути; таким образом, релейная линза была непосредственно имплантирована. Мы предполагаем, что у мыши No 2 релейная линза, возможно, сжала нейроны и потянула некоторые нейроны вниз, что привело к повреждению нейронов. Поэтому флуоресцентных переходных процессов обнаружено не было.
Рисунок 1: Механизмы минископа и дефекты, которые обычно вызывают отказ визуализации. (A) Мультяшная диаграмма релейной линзы и объектива, отображающая механизмы, необходимые для визуализации флуоресцентных клеток в двухобъективной системе. Сигнальные волны каждой линзы подчеркивают важность и механизм, участвующий в поиске рабочего расстояния для визуализации флуоресцентных клеток. (А1) Релейная линза GRIN размещается над целевыми нейронами в пределах рабочего расстояния. Поскольку шаг релейной линзы составляет 0,5 * N (где N - целое число), линза позволяет визуализировать целевые нейроны путем передачи света, принося исходные флуоресцентные сигналы в верхнюю часть линзы реле. Затем примерно 1/4 полного синусоидального периода света проходит через объективную линзу GRIN (~ 0,25 шага) и приводит к увеличению изображения. (А2) Объектив передает изображения на комплементарный датчик металл-оксид-полупроводник (КМОП), расположенный сверху (зеленая пластина на диаграмме) минископа. (B) Мультяшная диаграмма, представляющая различия в процедурах имплантации хрусталика GRIN между (B1) двухлинзовой системой и (B2) системой с одной линзой. В целом, основное различие заключается в том, что система с одной линзой непосредственно использует свою объективную линзу для изображения поверхности мозга; в результате объектив должен быть имплантирован поверх нейронов-мишеней. (C) Напротив, в двухлинзовой системе, для сравнения, дополнительная релейная линза имплантируется в мозг, а объектив предварительно отбирается в минископе. (С1) Форма опорной пластины для версии V3 минископа UCLA может привести к неравномерному смещению после полного высыхания зубного цемента. (С2) Этот сдвиг вызывает перекос или отклонение от рабочего расстояния между объективом реле и объективом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Модифицированные протоколы и подробные хирургические протоколы для повышения успешности системы минископов с двумя линзами. (А1) Модифицированный хирургический протокол для двухлинзовой системы. Показаны места проведения вирусной инъекции и имплантации линзы реле GRIN. Фиктивное опорное покрытие позволяет рабочему расстоянию точно охватить интересующие нейроны и уменьшает позиционное смещение, связанное с процедурой (A2) опорного покрытия. Следовательно, (A3) вероятность визуализации флуоресцентных клеток у свободно ведущих себя мышей увеличивается. (B) Мультяшное изображение этапов для вирусной инъекции и размещение линзы GRIN. (В1) Во-первых, отметьте аспирационную иглу ручкой примерно 1 мм (для экспериментов на мышах) от кончика, чтобы помочь в оценке глубины аспирации коры. Затем аспирируйте соединительную ткань и кору головного мозга (примерно на 1 мм глубиной у мышей) из мозга. (В2) Используйте вентральный гиппокамп в качестве целевой области для имплантации релейной линзы; Примечательно, что жесткое мозолистое тело является ориентиром для остановки аспирации корковой области. Фиброзная текстура мозолистого тела может быть видна под стереомикроскопом во время аспирации. (В3) Во-вторых, проколите интересующую точку внутренней иглой катетера 20 G (диаметром около 1 мм; диаметр аналогичен диаметру релейной линзы), чтобы очистить путь перед вирусной инфузией. Под стереомикроскопом должна быть видна вмятина (пунктирный круг на снимке), созданная иглой. Опустите микроинъекционную иглу и релейную линзу на вмятину (или всего на 250 мкм от центра вмятины). Наконец, поместите релейную линзу GRIN (в настоящем исследовании мы использовали релейную линзу диаметром 1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение изменения объема отвержденного зубного цемента. (А) Пример с отвержденным зубным цементом двух марок. Черные стрелки указывают на исходные уровни после того, как мы смешали порошок и раствор. Белые стрелки обозначают уровни после 10, 20 и 40 минут лечения. Красные стрелки указывают на нижнюю часть наконечников, которые были запечатаны светоотверждаемым клеем. (B) Средние объемы оставшихся зубных цементов после их полного высыхания. Полосы и погрешности являются средствами ± SEM. * обозначает значимость (P < 0,05), определяемую t-тестом Стьюдента. (C) Иллюстрации и фотография, объясняющая метод, используемый для измерения смещения местоположения опорной плиты. Игла была приклеена через опорную пластину и использовалась для имитации оригинальной процедуры нанесения фундамента (одноступенчатое покрытие) и процедуры фиктивного покрытия. Красные и черные стрелки представляют расположение иглы до и после отверждения зубного цемента. (D) Среднее изменение расстояния до кончика иглы (E) Иллюстрации метода, используемого для измерения соотношения между опорной пластиной выше уровня черепа и сдвигом местоположения. F) Среднее изменение расстояния до кончика иглы. Полосы и погрешности являются средствами ± SEM. ** обозначает значимость (P < 0,01), определяемую t-тестом Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подробная процедура фиктивного покрытия (выполняется сразу после имплантации релейной линзы). (A1) Трехступенчатая карикатура на сборку объектива, опорной плиты и парафиновой пленки на минископе. (А2) Фотоверсия сборки. (В1) Карикатура, показывающая процедуру фиктивного покрытия. Сначала собранный минископ выравнивается с релейной линзой. Объектив расположен как можно ближе к объективу реле. Во-вторых, зубной цемент добавляется к парапленке, окружающей опорную плиту, и наносится на череп, чтобы сделать женскую форму для будущего покрытия. Затем опорная плита удаляется, а формовочный силиконовый каучук (розовый) добавляется и покрывается зубным цементом для защиты женской плесени и релейной линзы. Затем животному дают восстановиться после анестезии. По прошествии не менее 3 недель проводится процедура нанесения базового покрытия. (В2) Фотоверсия (B1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Этапы процедуры нанесения опорных покрытий. (А1) Прикрепите опорную пластину и (A2) вручную отрегулируйте ползунок фокусировки на 2,7-3 мм. Установка от 2,7 до 3 мм (в положении, показанном на рисунке), по-видимому, является лучшим местом для начала, прежде чем вручную искать флуоресцентные ячейки. (В1) Первая мультяшная диаграмма иллюстрирует важность длины между объективом и релейной линзой для визуализации флуоресцентных ячеек (флуоресцентные ячейки обычно наблюдаются на расстоянии от 0,5 до 2 мм). Прежде чем флуоресцентная ячейка появится, исследователь должен увидеть край релейной линзы (стрелки на верхнем изображении). Полезно сначала вручную настроить объектив до оптимального положения просмотра, потому что легче сделать быструю настройку вручную. (В2) Поместите многоразовую клейкую глину на стереотаксический датчик руки, а затем стабилизируйте минископ, приклеив его к руке многоразовой клейкой глиной. На этом этапе область интереса, возможно, сместилась, но это можно легко исправить, слегка отрегулировав стереотаксическую руку и многоразовую клейкую глину. После проверки и поиска оптимальной области, представляющей интерес, добавьте небольшое количество зубного цемента (представленного красным цветом). Приклейте опорную плиту как можно меньшим количеством зубного цемента. Отделите минископ и опорную плиту после высыхания зубного цемента. Если опорная плита недостаточно стабильна, добавьте дополнительный зубной цемент. (C) Эта диаграмма иллюстрирует важность каждого шага для достижения успеха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Примеры успеха и неудачи во время процедуры нанесения фундамента. (A) Пример успешной визуализации во время процедуры нанесения фундамента. Релейная линза была нацелена на вентральный гиппокамп. Флуоресцентные переходные процессы были замечены, когда животное находилось под наркозом изофлураном (см. также Дополнительное видео S2). (А2) Контрастность была увеличена для лучшей видимости. Красные пунктирные линии указывают на кровеносные сосуды. (А3) Флуоресценция проходит через пять дней после нанесения базового покрытия, когда мышь (#5) свободно вела себя в своей домашней клетке (см. также Дополнительное видео S3; изображения мышей No 3 и No 4 также представлены в Дополнительном видео S3). Произошло лишь незначительное смещение положения. (В1) Пример сбоя. Во время нанесения фундамента были замечены только однородные белые/серые участки, которые не были похожи на клетки по форме (см. также Дополнительное видео S4). (В2) Релейная линза не попала в целевую область и была расположена над областью без инфицированных клеток. (С1) Еще один пример сбоя. У этой мыши, хотя наблюдалось много круглых клеток, во время покрытия оснований (после трех недель инкубации и пока мышь была анестезирована / седатива), не наблюдалось никаких флуоресцентных переходных процессов). Кроме того, никакие флуоресцентные переходные процессы не подавались, когда процедура нанесения фундамента была выполнена снова (на пятой неделе инкубации) или даже когда животное вело себя свободно. Изображение было получено во время нанесения фундамента на пятой неделе инкубации (см. также Дополнительное видео S5). (С2 и С3) Релейная линза пропускала пирамидальный слой вентрального гиппокампа. Синие точки представляют собой ядра, которые были окрашены DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Проблема | Возможная причина | Решение | ||
| Имел хорошую визуализацию при нанесении фундамента, но на следующий день полностью расфокусировался | Изменение объема при отверждении зубного цемента между черепом субъекта и опорной пластиной | После процедуры имплантации хрусталика, как это предлагается в настоящем докладе, приступить к "фиктивному основанию". Выбирайте зубной цемент, который имеет меньшее изменение объема. | ||
| Имеет однородные белые/серые участки без клеточной формы во время нанесения базового покрытия (см. также дополнительное видео S4) | A. Релейная линза пропустила целевую область B. Плохая экспрессия индикатора флуоресценции C. Забудьте установить объектив под минископом, где фактически выражен индикатор флуоресценции | A. Используйте фиктивные линзы для проведения операций. Проверьте координаты фиктивной линзы после практики имплантации B. Найдите оптимальный вирусный титр для экспериментов по визуализации кальция (см. Resendez et al. 2016). Если по каким-то причинам предварительное тестирование не может быть проведено, мы рекомендуем новичкам сначала попробовать более высокий титр. (См. раздел Disscusion для деталей) C. Винт на объективе GRIN (~ 0,25 шага. ex: Edmund Optics; Приклад No64-519) в нижней части минископа. | ||
| Наблюдайте за многими клетками, но без динамики флуоресценции во время нанесения базового покрытия | A. Нездоровые нейроны или мертвые нейроны B. Разреженный тип нейронов C. Состояние глубокой анестезии | О. Будьте осторожны при каждой хирургической процедуре. Используйте новую шприцевую иглу, которая похожа на диаметр вашей релейной линзы, чтобы сначала разрезать путь инфузии / имплантации, чтобы освободить давление путем имплантации линзы. Медленно вливайте вирус и медленно имплантируйте хрусталик. Б. Подождите дольше, чтобы контролировать активность нейронов или немного защемить хвост, чтобы стимулировать мышь. C. Покрытие оснований не является инвазивной процедурой, и животное нуждается только в седации. Поэтому поддержания 1,2 ~ 0,8% изофлурана достаточно, пока животное не в состоянии двигаться по стереотаксической рамке. | ||
Таблица 1: Диаграмма устранения неполадок.
Дополнительное видео S1: Тест объема зубного цемента. Разница между объемом измерялась в начале подготовки зубного цемента и объемом после высыхания цемента. Были протестированы две марки стоматологического цемента (например, Tempron и Tokuso Curefast). Чтобы проверить объем зубного цемента после его высыхания, взвешивали по 0,5 г каждого порошка зубного цемента и смешивали с соответствующим его раствором (1 мл). Затем наконечники пипеток объемом 0,1-10 мкл загружали 2,5 мкл зубной цементной смеси и герметизировали светоотверждаемым клеем. Затем наконечники размещали на стойке, маркировали поверхности зубных цементных смесей и снимали на видео в течение 40 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео S2: Демонстрация процедуры нанесения опорного покрытия. Угол между поверхностью объектива и релейной линзой регулировали путем поворота ушной перекладины, зубчатой планки или многоразовой клейкой глины по оси Z. Край линзы реле выглядел как луноподобный серый круг на мониторе. Успешная вирусная экспрессия и имплантация хрусталика должны выявить по крайней мере одну динамику флуоресценции (стрелки) во время нанесения базового покрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео S3: Демонстрации динамики флуоресценции у свободно ведущих себя мышей. Флуоресцентные переходные процессы от мышей No 3, No 4 и No 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео S4: Пример сбоя. Во время процедуры нанесения фундамента появился однородный фон. Обратите внимание, что изменение яркости произошло не из-за флуоресцентных переходных процессов отдельных клеток; это было вызвано процедурой обыска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео S5: Демонстрация другого примера сбоя. Отсутствие флуоресцентных переходных процессов произошло во время процедуры опорного покрытия, но некоторые круглые поля клеток все еще были видны. Обратите внимание, что изменение яркости не было вызвано флуоресцентными переходными процессами отдельных клеток; это было вызвано процедурой обыска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем докладе описывается подробный экспериментальный протокол для исследователей, использующих двухлинзовую систему минископа UCLA. Инструменты, разработанные в нашем протоколе, относительно доступны для любой лаборатории, которая хочет попробовать визуализацию кальция in vivo . Некоторые протоколы, такие как вирусная инъекция, имплантация хрусталика, фиктивное покрытие основания и базовое покрытие, также могут быть использованы для других версий системы минископа для повышения успешности визуализации кальция. Помимо общих проблем с вирусной инъекцией и имплантацией хрусталика, которые необходимо исправить независимо от версии минископа, структура опорной пластины UCLA может вызвать позиционное смещение, что может привести к несоответствию рабочих расстояний между объективом и релейными линзами (рисунок 1C). Был разработан модифицированный экспериментальный протокол для минимизации позиционного смещения двух линз (рис. 2, рисунок 4, рисунок 5). Успешная визуализация кальция может быть достигнута путем сочетания успешной экспрессии вируса, имплантации хрусталика и процедур нанесения базового покрытия (рисунок 5C). Использование системы с двумя линзами для наблюдения глубоких областей мозга требует высокого уровня точности в процедурах покрытия оснований, поскольку относительные положения имплантированной релейной линзы и объектива также должны быть точными. В этом отчете не только представлен протокол, который решает проблемы с опорным покрытием, но также обсуждаются некоторые советы по вирусной инъекции и имплантации хрусталика. Ниже мы сначала обсудим процедуры нанесения базового покрытия, а затем вирусную инъекцию и процедуры имплантации хрусталика, и опишем некоторые примеры неудач (рисунок 6).
Опорные покрытия
Версия V3 UCLA Miniscope в настоящее время является наиболее часто используемой конструкцией и может быть заказана онлайн. Опорная плита этого варианта состоит из двух краев без стенок (рисунок 1С1), но ее форма может вызвать неравномерное смещение (Фиг.1С1, С2) после полного высыхания зубного цемента. Процедуры фиктивного покрытия в нашем протоколе (рисунок 4) сводят к минимуму проблемы с перекосом и смещением опорной плиты, поскольку они используют парафиновую пленку для уменьшения доступного пространства для зубного цемента во время реального покрытия фундамента (рисунок 5B). Оставшегося пространства по-прежнему достаточно для нахождения оптимального положения визуализации во время реальной процедуры нанесения базового покрытия. Поэтому исследователь может склеить опорную плиту как можно меньшим количеством зубного цемента (рисунок 5B2). Кроме того, процедура фиктивного покрытия занимает относительно мало времени (примерно от 15 до 20 минут), поскольку для этого не требуется идеальное расстояние между объективом и релейным объективом. Тем не менее, фиктивное покрытие является лишь одним из ключевых факторов для успешной визуализации кальция; например, во время мониторинга флуоресцентных сигналов нейроны могут казаться размытыми, если они находятся немного вне рабочей плоскости (в зависимости от рабочего расстояния релейной линзы; часто примерно 100 ~ 300 мкм). Возможность улучшения рабочего расстояния ограничена, так как рабочее расстояние нейронов предопределено процедурой имплантации релейной линзы. Эксперимент проводился без процедуры фиктивного базового покрытия, и область интереса всегда (у четырех из четырех мышей) пропускалась после однократного нанесения базового покрытия. Поэтому эти решения были разработаны для уменьшения проблемы усадки. Некоторые легкие зубные цементы могут избежать проблемы усадки во время отверждения, потому что они отверждаются очень быстро; эти цементы могут помочь исследователям скорректировать расстояние во время процедуры нанесения фундамента. Хотя диапазон длин волн для возбуждения показателей кальция и отверждения зубного цемента отличается, фотоотбеливание во время процедуры опорного покрытия необходимо предотвратить. Чтобы предотвратить фотоотбеливание, диапазон длин волн, генерируемых источником света, должен быть довольно узким, чтобы избежать перекрестных реакций между показателями кальция и светоотверждаемым зубным цементом. Поэтому использование легкого зубного цемента не рекомендуется для процедуры нанесения фундамента. Кроме того, некоторые конкретные марки зубных цементов часто используются для склеивания опорных плит другими исследовательскими группами 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Низкоусадочные свойства этих цементов могут решить проблему, но у нас не было возможности протестировать эти марки из-за сложностей с их приобретением (импортом). Медицинские продукты могут подпадать под действие правил импорта в зависимости от страны / региона. Если исследователи испытывают трудности с доступом к цементам, упомянутым в литературе 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, наш протокол решит проблему усадки зубного цемента.
В дополнение к проблеме усадки, структурный износ может произойти в самом минископе и на опорной пластине (особенно на магнитах в опорной пластине) в ходе многих экспериментов. Любой небольшой зазор, вызванный износом, снижает стабильность расстояния между двумя объективами. Опять же, точность по всему оптическому пути является ключом к визуализации переходных процессов кальция у свободно ведущих себя мышей с использованием минископа.
Поиск и устранение неисправностей вирусных инъекций/имплантации линз
Перед введением вируса в область мозга рекомендуется установить новую иглу на стереотаксическую руку и медленно проколоть мозг в соответствующих координатах. Поскольку новая игла очень острая, этот прокол служит подготовительным этапом для очистки пути (или разрезания пути) для фактической микроинъекционной иглы и релейной линзы и сводит к минимуму повреждение тканей, которое может быть вызвано компрессией от микроинъекционной иглы или релейной линзы. Острая игла прорезает путь для тупого реле линзы; таким образом, кончик иглы должен быть опущен до тех же координат, что и релейная линза. Внутренняя игла 20 G I.V. катетера была выбрана потому, что она имела диаметр 1 мм, что было похоже на диаметр нашей релейной линзы. В зависимости от диаметра линзы реле можно использовать различный игольчатый манометр.
Хотя настоящее исследование не было сосредоточено на свойствах и титрах вирусных векторов, эти факторы по-прежнему имеют решающее значение для успешной визуализации кальция (рисунок 5C). Необходимо предварительно проверить качество экспрессии вирусного вектора. Этапы с 1 по 5 протокола Resendez et al. предоставляют подробные методы идентификации оптимального вирусного титра для экспериментов по визуализации кальция8. Если предварительное тестирование по каким-либо причинам не может быть проведено, новичкам рекомендуется сначала попробовать относительно высокий титр. Одним из недостатков использования высокого вирусного титра является ицитотоксичность8. Мертвые нейроны дают начало автофлуоресценции и видны в виде ярких белых пятен под минископом8. Тем не менее, эти мертвые нейроны являются хорошими ориентирами для начинающих, чтобы найти и практиковать процедуру покрытия фундамента. С другой стороны, хотя инфузия вируса с низким титром имеет более низкий риск уничтожения клеток, флуоресценция может быть замаскирована фоном, если клетки не показывают никаких флуоресцентных переходных процессов во время процедуры покрытия основания. Трудно точно определить причины сбоя, потому что целевые нейроны могут быть пропущены из-за имплантации релейной линзы или из-за плохой экспрессии вирусного вектора. Определение причины очень запутанно без гистологического подтверждения. Поэтому рекомендуется использовать вирусы с относительно высоким титром, если вирусные векторы не могут быть предварительно протестированы.
Resendez et al. рекомендуют вставлять микроинъекционную иглу 250 мкм латерально и вентрально к размещению хрусталика. Наши наблюдения показали, что инфузия вируса на той же глубине, что и релейная линза, также может привести к экспрессии хороших сигналов кальция. Мы предполагаем, что из-за возможности заражения и распространения, инфузия вируса на той же глубине, что и координата релейной линзы, является оптимальной для уменьшения повреждения тканей и повышения точности расстояния между инфицированными нейронами и линзой реле. Resendez et al также рекомендуют выполнять вирусную инъекцию и имплантацию хрусталика во время той же операции, учитывая узкий диапазон рабочих расстояний между клетками-мишенями и релейной линзой8. Тем не менее, некоторые исследователи следуют протоколу, в котором этап инфузии вируса и этап имплантации хрусталика проводятся с интервалом в две (или более) недели18,26. Удлинение времени между шагами сокращает индивидуальное оперативное время. Но в этом протоколе эти два шага были объединены в одну операцию, потому что в протоколе одной операции хирург может контролировать положение между микроинъекционной иглой и релейной линзой при опускании их в целевую область, что снижает вероятность неудачного нацеливания (рисунок 2B3).
Для двух мышей (мышей No 1 и No 2) использование иглы для создания пути для линзы также было опущено, а у мыши No 2 наблюдались круглые клеточные серые пятна (рисунок 6C). Однако динамики флуоресценции (Дополнительное видео S5) не наблюдалось. Изучив срез мозга в этом примере (рисунок 6C2, C3), мы постулировали, что линза реле перетаскивала некоторые клетки вниз, пока она опускалась. Эти перетащенные нейроны были нездоровыми, поэтому во время процедуры покрытия основания или во время эксперимента не было замечено никакой активности.
У нас была одна мышь с полностью однородным серым сигналом и без видимых клеточных изображений во время процедуры базового покрытия (рисунок 6B1). После жертвоприношения мыши наблюдались ее мозговые срезы. Было замечено, что линза находилась на медиальной стороне изогнутого пирамидального слоя; целевая область (рисунок 6B2) была полностью пропущена. Эти неудачные попытки были критическим опытом, который заставил нас изменить наш хирургический протокол и в конечном итоге добиться успеха с тремя мышами (Дополнительное видео S3).
Микроинъекционная игла
Мозолистое тело представляет собой жесткий фиброзный тракт, который накладывается на дорсальный гиппокамп. Из-за своей жесткости он сопротивляется проникновению микроинъекционной иглы с плоским наконечником. Поэтому мы рекомендуем использовать микроинъекционную иглу со скошенным наконечником. Этот тип иглы не только уменьшает повреждение тканей, но и уменьшает возможность неспособности влить вирус в целевую область из-за закупорки близлежащими волокнами. Мы обобщили вышеупомянутые проблемы в диаграмме устранения неполадок (таблица 1).
Временные рамки
Временные рамки для всей процедуры обобщены на рисунке 2A с днями в качестве единиц. В деталях хирургическая часть (вирусная инъекция, имплантация релейной линзы, фиктивное покрытие фундамента) может занять 3 ч для начинающих или 1,5 ч для достаточно подготовленных исследователей. Мыши имеют небольшой размер тела и быстрый метаболизм, и они более восприимчивы к проблемам со здоровьем, вызванным длительными периодами под наркозом, чем более крупные виды27. Исследователи должны стремиться к тому, чтобы время, проведенное в хирургии, составляло менее 3 часов. Реальное базовое покрытие может быть выполнено после 3-6 недель экспрессии индикатора кальция. Эта процедура может занять 1 ч. Последующее наблюдение продольной кальциевой активности может продолжаться более 1 месяца.
Выводы
Минископ UCLA представляет собой устройство визуализации кальция in vivo с открытым исходным кодом. Без готовой, предустановленной опорной плиты или модуля объектива лица, проводящие эксперименты, должны быть в состоянии точно достичь оптимального расстояния между объективом и релейной линзой во время процедуры опорного покрытия. Повышенная сложность использования двухлинзовой системы UCLA Miniscope заключается в изменении объема зубного цемента. Мы оптимизировали оригинальные протоколы и свели к минимуму дефекты, вызванные вышеупомянутыми проблемами, тем самым увеличивая успешность визуализации кальция с помощью двухобъективной системы UCLA Miniscope.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Это не отраслевое исследование. Авторы сообщают об отсутствии финансовых конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
