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Immunology and Infection

ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएच, रेडॉक्स रसायन और मैक्रोपिनोसोम की डिग्रेडिव क्षमता को मापना

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

हम जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम्स में पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन पाचन को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी और जनसंख्या आधारित तकनीकों पर यह लाभ प्रदान करने पर जोर दिया जाता है।

Abstract

हाल के वर्षों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का क्षेत्र तेजी से बढ़ा है । मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक केंद्रीय तंत्र के रूप में उभरा है जिसके द्वारा जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं संगठित होमोस्टेसिस और प्रतिरक्षा को बनाए रखते हैं। साथ ही, और इसकी होम्योस्टेटिक भूमिका के विपरीत, यह कैंसर और वायरल संक्रमण सहित विभिन्न विकृतियों को भी चला सकता है। एंडोसाइटोसिस के अन्य साधनों के विपरीत, मैक्रोपिनोसोम्स की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए विकसित उपकरण अविकसित रहते हैं। यहां प्रोटोकॉल जल्दी और परिपक्व मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर रेडॉक्स वातावरण का अध्ययन करने के लिए नए विकसित उपकरणों का वर्णन करता है। पीएच का आकलन करने में अनुपातमेट्रिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के तरीके, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, और जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर डिग्रेडिव क्षमता का वर्णन किया गया है। एकल ऑर्गेनेल माप स्पिटियोटेम्परल विषमता का खुलासा करने का लाभ प्रदान करते हैं, जो अक्सर जनसंख्या आधारित दृष्टिकोणों के साथ खो जाता है। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी के बुनियादी सिद्धांतों पर जोर दिया जाता है, जिसमें जांच चयन, इंस्ट्रूमेंटेशन, अंशांकन और एकल-कोशिका बनाम जनसंख्या आधारित तरीके शामिल हैं ।

Introduction

मैक्रोपिनोसाइटोसिस झिल्ली से बंधे साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स में बड़ी मात्रा में एक्स्ट्रासेलुलर तरल पदार्थ को तेज करने को संदर्भित करता है जिसे मैक्रोपिनोसोम्स1,2 कहाजाताहै । यह एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है जो मुक्त रहने वाले एककोशिकीय जीवों द्वारा की जाती है, जैसे कि अमीबा डिक्टियोस्टेलियम स्प्प। 3, साथ ही एंथोज़ोन्स4 और मेटाज़ोन्स2. अधिकांश कोशिकाओं में, मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक प्रेरित घटना है। सेल-सरफेस रिसेप्टर्स का लिगेशन ऐक्टिन-चालित प्लाज्मा झिल्ली एक्सटेंशन के फलाव को प्रेरित करता है जिसे रफल्स के रूप में संदर्भित किया जाता है। उन रफल्स का एक अंश, कुछ खराब समझ तंत्र द्वारा, मैक्रोपिनोसोम बनाने के लिए उनके डिस्टल टिप्स पर मुहर (हालांकि इस विधियों के दायरे से बाहर, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के यांत्रिकी पर विस्तृत समीक्षा के लिए, कृपया संदर्भ1, 2,5,6,7)का उल्लेख करें। मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित करने वाला बाह्य कोशिकीय उत्तेजना अक्सर घुलनशील विकास कारक5,8है। तदनुसार, मैक्रोपिनोसाइटिक इवेंट एक्सट्रासेलुलर सामग्री के बोलस के घूस के लिए अनुमति देता है जिसमें से कोशिका विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोगी मेटाबोलाइट्स प्राप्त कर सकती है। दुर्भाग्य से, पोषक तत्व वितरण के लिए यह मार्ग पैथोलॉजी भी चला सकता है। कुछ कैंसर कोशिकाएं उत्परिवर्तनों को आश्रय देती हैं जिसके परिणामस्वरूप निरंतर या संविलियन मैक्रोपिनोसाइटोसिस होता है। पोषक तत्वों के निरंतर वितरण से कैंसर कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार को सुविधाजनक बनाया जा सकता है और इसे विशेष रूप से आक्रामक ट्यूमर 9 ,10,11,12,13से जोड़ा गया है . इसी तरह, वायरस मैक्रोपिनोसाइटोसिस को होस्ट कोशिकाओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं, जिससे वायरल पैथोलॉजी14ड्राइविंग हो सकती है।

मैक्रोपिनोसाइटोसिस रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा के रखरखाव में भी कार्य करता है। मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं कुछ जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं मैक्रोपिनोसाइटोसिस 6,15 ,16के माध्यम से बाह्य कोशिकाओं के संविलियन और आक्रामक नमूने में संलग्न हैं । मैक्रोपिनोसाइटोसिस का यह तरीका अविश्वसनीय रूप से सक्रिय है, और एक एकल डेंड्रिटिक सेल हर घंटे17अपने वजन के बराबर बाह्य तरल पदार्थ की मात्रा के साथ खुद को engorge कर सकता है। इस संविलियन नमूने के बावजूद, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में बेकाबू रूप से दोहराने नहीं देती हैं, इसके बजाय, वे अतिरिक्त स्तरीय सामग्री को इस तरह से संसाधित करने लगते हैं कि संभावित खतरों की उपस्थिति, या वास्तव में अनुपस्थिति पर सूचित करने के लिए जानकारी निकाली जा सकती है। सूचना को रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न के रूप में निकाला जाता है जिसे इंट्रासेलुलर रोगजनक मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा पढ़ा जा सकता है और ii) अमीनो एसिड के छोटे हिस्सों को अनुकूली प्रतिरक्षाप्रणाली16, 18,19की कोशिकाओं द्वारा स्क्रीनिंग के लिए प्रमुख हिस्टोकंपैटिबिलिटी अणुओं पर लोड किया जा सकता है। क्या रोगजनकों प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा सूचना प्रसंस्करण के लिए इस मार्ग विकृत वर्तमान में अस्पष्ट है ।

प्रतिरक्षा और होमोस्टेसिस के रखरखाव और एंडोसाइटोसिस के अन्य अधिक सामान्य रूप से अध्ययन किए गए तरीकों के विपरीत, मैक्रोपिनोसोस के आंतरिक (चमकदार) कामकाज के बारे में जाना जाता है। मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमिनल बायोकेमिस्ट्री का अध्ययन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और उपकरण विकसित करने से न केवल हमें उनके अद्वितीय जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी बल्कि यह अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जिसे दवा वितरण20सहित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए लीवरेज किया जा सकता है। यह विधि पांडुलिपि हाल ही में विकसित उपकरणों पर ध्यान केंद्रित करेगी, एकल ऑर्गेनेल स्तर पर, मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमिनल बायोकेमिस्ट्री के विभिन्न पहलुओं को विच्छेदन करने के लिए।

फ्लोरोफोरेस का उपयोग ऑर्गेनेल्स के विशिष्ट जैव रसायनों को मापने के लिए किया जा सकता है यदि मैं) वे ब्याज के डिब्बे में अधिमानतः विभाजन करते हैं और/या ii) वे ब्याज के पैरामीटर के जवाब में स्पेक्ट्रल परिवर्तनों से गुजरते हैं । उदाहरण के लिए, पीएच के मामले में, फ्लोरोसेंट कमजोर कुर्सियां, जैसे कि एक्रिडीन नारंगी, क्रेसिल वायलेट, और लिसोट्रैकर रंग अम्लीय ऑर्गेनेल्स में अधिमानतः जमा होते हैं। इसलिए, उनकी सापेक्ष तीव्रता एक मोटा संकेत है कि लेबल वाले ऑर्गेनेल अम्लीय हैं। अन्य पीएच-उत्तरदायी फ्लोरोफोरस, जैसे फ्लोरोसेइन, प्लरोडो और साइपहर5ई, प्रोटॉन(चित्रा 1A-सी)के लिए बाध्यकारी होने पर स्पेक्ट्रल परिवर्तनों से गुजरते हैं। पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन में परिवर्तन इसलिए पीएच का एक उपयोगी सन्निकटन प्रदान कर सकते हैं। एकल फ्लोरोफोरस का उपयोग, हालांकि, कई नुकसान प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, फोकल प्लेन में परिवर्तन, फोटोब्लैचिंग, और व्यक्तिगत ऑर्गेनेल्स की मात्रा में परिवर्तन, मैक्रोपिनोसोम्स21में एक आम घटना, एकल फ्लोरोफोरस की फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है, और इसे आसानी से22के लिए ठीक नहीं किया जा सकता है। एकल तरंगदैर्ध्य आकलन, हालांकि अम्लीय डिब्बों की कल्पना के लिए उपयोगी है, इसलिए विशुद्ध रूप से गुणात्मक हैं ।

अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण पैरामीटर-संवेदनशील फ्लोरोफोर को लक्षित करना है और साथ ही ब्याज के ऑर्गेनेल के संदर्भ फ्लोरोफोर के साथ। संदर्भ फ्लोरोफोर ऑर्गेनेल(चित्रा 1D-F)के भीतर जैव रासायनिक परिवर्तनों के प्रति आदर्श रूप से असंवेदनशील है और इसलिए इसका उपयोग फोकल प्लेन, ऑर्गेनेलर वॉल्यूम में परिवर्तनों के लिए सही करने के लिए किया जा सकता है, और कुछ हद तक, फोटोब्लैचिंग23। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, जिसे दोहरी-फ्लोरोफोर अनुपातमेट्रिक फ्लोरेसेंस कहा जाता है, संदर्भ फ्लोरोफोर के पैरामीटर-संवेदनशील फ्लोरोफोर के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात पैदा करके सुधार प्राप्त किया जा सकता है।

यहां, प्रोटोकॉल मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन क्षरण को मापने के लिए ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक इमेजिंग के सिद्धांत का उपयोग करेगा। प्रत्येक मामले में, एक फ्लोरोफोर का चयन किया जाएगा जो ब्याज के पैरामीटर और संदर्भ फ्लोरोफोर के प्रति संवेदनशील है। फ्लोरोफोरेस को विशेष रूप से मैक्रोपिनोसोम्स तक लक्षित करने के लिए, उन्हें 70 केडीए डेक्सट्रान के साथ मिलकर बनाया जाएगा, जिसे अधिमानत मैक्रोपिनोसोम्स24में शामिल किया गया है। सभी परख Raw264.7 कोशिकाओं में किया जाएगा, लेकिन अन्य सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जहां संभव हो, पूर्ण मूल्यों को हासिल करने के लिए एक संदर्भ वक्र के खिलाफ फ्लोरेसेंस अनुपात को कैलिब्रेट किया जाएगा। महत्वपूर्ण बात, सभी माप मैक्रोपिनोसोम के चमकदार वातावरण के गतिशील और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए जीवित कोशिकाओं में किया जाएगा।

पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस का चयन करते समय, कई विचारों को तौला जाना चाहिए। पहला फ्लोरोफोर का पीकेए है, जो पीएच मूल्यों की सीमा को इंगित करता है जिस पर जांच सबसे अधिक संवेदनशील होगी। यदि यह माना जाता है कि गठन के तुरंत बाद, मैक्रोपिनोसोम का पीएच बाहूश माध्यम (~ पीएच 7.2) के करीब होगा और यह उत्तरोत्तर देर से एंडोसोम्स और लाइसोसोम्स (~ पीएच 5.0) के साथ बातचीत के माध्यम से अम्लीय होगा, तो एक पीके के साथजांच की जाएगी जो उस सीमा के भीतर संवेदनशील है(चित्र 2 सी)का चयन किया जाना चाहिए। फ्लोरोफोर फ्लोरोसीन, जिसमें 6.4 का पीकेए है, उस सीमा के भीतर बेहतर रूप से संवेदनशील है। इसका उपयोग अन्य समान ऑर्गेनेल्स, जैसे फागोसोम्स को मापने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है, और इस पांडुलिपि22, 25में पसंद का फ्लोरोफोर होगा। एक संदर्भ फ्लोरोफोर के रूप में, टेट्रामेथिलरोडमाइन का उपयोग किया जाएगा, जो पीएच(चित्रा 1E)के प्रति असंवेदनशील है। अन्य फ्लोरोफोरस, जैसे कि फ्लोरोडो और सिपहर5ई को फ्लोरोसिन के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जहां फ्लोरोसीन के स्पेक्ट्रल गुण अन्य प्रयोगात्मक चरों से मेल खाते हैं। कुछ सुझाए गए संदर्भ फ्लोरोफोरस फॉर फ़्रोडो और साइपहर5ई को चित्र 1में दिखाया गया है .

दूसरा विचार वह विधि है जिसके द्वारा दो फ्लोरोफोरस को विशेष रूप से मैक्रोपिनोसोम्स के लिए लक्षित किया जाएगा । आकार 70 केडीए का डेक्सट्रान, जिसमें लगभग 7 एनएम का हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या होता है, कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से नहीं चिपकता है और इसे मैक्रोपिनोसोम्स में शामिल किया जाता है, लेकिन क्लैथ्रिन-लेपित गड्ढों या कैवियोल में शामिल नहीं किया जाता है, और इसलिए मैक्रोपिनोसोम्स(चित्रा 2 ए और चित्रा 3ए, बी)16,24,26को चिह्नित करता है। इस प्रोटोकॉल में फ्लोरोसीन-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और टेट्रामेथाइलरोडमाइन (टीएमआर) लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान का उपयोग क्रमशः पीएच-सेंसिटिव और रेफरेंस प्रोब के रूप में किया जाएगा।

जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, मैक्रोपिनोसाइटोसिस और फागोसिटोसिस अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया27की कोशिकाओं के प्रसंस्करण और बाद में प्रस्तुति के लिए एक्सोजेनस सामग्री के आंतरिककरण के लिए दो प्रमुख मार्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। फागोसोम्स और मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमेन के रेडॉक्स रसायन का सावधानीपूर्वक और समन्वित नियंत्रण बहिर्जात सामग्री के संदर्भ-विशिष्ट प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण है। शायद फागोसोम्स में ऑक्सीडेटिव घटनाओं का सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया नियामक एनएडीपीएच ऑक्सीडेस है, जो एक बड़ा बहु-उपइका परिसर है जो फागोसोम्स28के ल्यूमेन के भीतर बड़ी मात्रा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करता है। दरअसल, इसकी गतिविधि29,30के भीतर उपयुक्त एंटीजन प्रसंस्करण के लिए केंद्रीय है । फिर भी, मैक्रोपिनोसोमल झिल्ली पर एनएडीपीएच ऑक्सीडेस की गतिविधि का पता नहीं लगाया गया है।

इस प्रोटोकॉल में, एच2डीसीएफडीए एस्सिनीमिडिल एस्टर का उपयोग मैक्रोपिनोसोम के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं को मापने के लिए किया जाता है। यह फ्लोरोसेसिन (2', 7'-डाइक्लोरोहाइड्रोफ्लोफोरेसिन डायसेटेट) का एक संशोधित रूप है, जो इसके कम रूप में न्यूनतम फ्लोरोसेंट है। ऑक्सीकरण पर, इसका फ्लोरेसेंस उत्सर्जन काफी बढ़ जाता है। हालांकि, यह H2DCFDA की एक महत्वपूर्ण चेतावनी को ध्यान में रखते हुए है - क्योंकि यह फ्लोरोफोर फ्लोरोसीन पर आधारित है, इसका फ्लोरेसेंस अम्लीय डिब्बों में भी बुझाया जाता है, और प्रयोग28को डिजाइन करते समय इस चर के लिए नियंत्रण के लिए देखभाल की जानी चाहिए। पीएच को मापने के लिए दृष्टिकोण के समान, एच2डीसीएफडीए succinimidyl एस्टर को सहसंयोजक रूप से 70 केडीए डेक्सट्रान से जोड़ा जाएगा और टीएमआर-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान का उपयोग संदर्भ फ्लोरोफोर(चित्रा 3 ए)के रूप में किया जाएगा।

फ्लोरोसेंट ओवलबुमिन का उपयोग मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन क्षरण को मापने के लिए किया जाएगा। यहां इस्तेमाल होने वाले ओवलबुमिन को 4,4-डिफ्लोरो-4-बोरा-3ए, 4ए-डियाज-एस-इंडैसेन (BODIPY) FL डाई के साथ घनी लेबल किया गया है जो स्वयं-शमन है। पाचन पर, दृढ़ता से फ्लोरोसेंट डाई-लेबल पेप्टाइड्स मुक्त होते हैं। चूंकि ओवलबमिन को आसानी से 70 केडीए डेक्सट्रान में संयुग्मित नहीं किया जा सकता है, इसलिए टीएमआर-लेबल वाली कोशिकाएं 70 केडीए डेक्सट्रान और द्रव-चरण ओवलबुमिन को सह-इनक्यूबेटेड किया जाएगा। टीएमआर सिग्नल का उपयोग पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण के दौरान मैक्रोपिनोसोम मास्क उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा, और पचाए गए अंडाकारबुमिन से मुक्त सिग्नल को मास्क(चित्रा 3 बी)के भीतर मापा जाएगा।

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Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर Raw264.7 कोशिकाओं और 5% सीओ2 से 70% की घुल-मिलन आरपीएमआई में 10% गर्मी-निष्क्रिय सीरम के साथ पूरक हो जाना।
  2. परख से एक दिन पहले, एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में 5 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज Raw264.7 कोशिकाओं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से विकास माध्यम के 100 माइक्रोन शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि ९६-अच्छी तरह से थाली काले पक्षों और इमेजिंग के लिए एक गिलास नीचे है ।
    नोट: यहां, इमेजिंग के लिए ९६-अच्छी प्लेटों का इस्तेमाल किया गया । ९६-अच्छी तरह से प्लेटें बड़े इमेजिंग कक्षों के सापेक्ष कोशिकाओं और अभिकर्णों की छोटी मात्रा के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, इमेजिंग लाइव कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किए गए किसी भी कक्ष का उपयोग किया जा सकता है, और अभिकर् ती को तदनुसार बढ़ाया जा सकता है।
  3. परख के दिन, जांच करें कि क्या कुएं कम से कम 70% कॉन्फ्ल्यूंट हैं।

2. मैक्रोपिनोसोम पीएच को मापना

  1. धारा 1 की तरह कोशिकाओं को तैयार करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस के 100 माइक्रोन से सभी कुओं को धोएं।
  3. 5.025 मिलीग्राम/एमएल वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक को अच्छी तरह से भरें- लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और फ्लोरोसिन-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान के 0.025 मिलीग्राम/एमएल।
  4. कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
  5. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं 6x धोएं।
  6. प्रत्येक को 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस के 100 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से भरें।
  7. प्लेट को गर्म अवस्था और कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप पर रखें।
  8. आवश्यकतानुसार प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजन/उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करें।
    नोट: छवि अधिग्रहण के लिए आदर्श स्थितियां फ्लोरोफोरस और व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप सेट-अप के साथ भिन्न होंगी। यहां, चित्रों को एक Leica SP5 लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत किया गया । टीएमआर 543-लेजर लाइन से उत्साहित था और 610 एनएम से 650 एनएम तक उत्सर्जन एकत्र किया गया था। फ्लोरोसिन 488-लेजर लाइन से उत्साहित था और उत्सर्जन 500 एनएम से 550 एनएम तक एकत्र किया गया था। एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था और एक 10 μm जेड मात्रा ०.५ माइक्रोन मीटर अंतराल पर अधिग्रहीत किया गया था ।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से एक छवि प्राप्त करें, प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोफोरस के बीच बारी-बारी से।
  10. पहले अधिग्रहण के बाद, जांच करें कि क्या सभी कुएं पूरी थाली में ध्यान में रहे ।
  11. वांछित समय के लिए 1-15 मिनट अंतराल पर प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें।

3. मैक्रोपिनोसोम पीएच के सीटू अंशांकन में

  1. छवि अधिग्रहण के दौरान, पोटेशियम युक्त (K+-रिच)समाधान के 1 एल तैयार करें जिसमें 140 एमएमएम केसीएल, 1 एमएमएम एमजीसीएल2,1 एमएमएम सीएसीएल2और 5 एमएमएम ग्लूकोज शामिल हैं। 25 एम एम एचईपी (1 एम, पीएच 7.2 स्टॉक समाधान से) और 25 एमएल एमईएस (0.5 एम, पीएच 6.0 स्टॉक समाधान से) के साथ कश्मीर+-समृद्धसमाधान की एक 400 मिलीएल मात्रा को पूरक करें।
  2. जरूरत के अनुसार 10 एम एचसीएल या 10 एम कोह का उपयोग करके 25एम एचईपीई को पीएच 7.5 तक 25 एम एम एचईपी के साथ बफर किए गए K+-समृद्धसमाधान के 50 एमएल एलिकोट को समायोजित करें।
  3. जरूरत के अनुसार 10 एम एचसीएल या 10 एम कोह का उपयोग करके 25एम एमईएस से पीएच 6.5, पीएच 5.5 और पीएच 5.0 का उपयोग करके कश्मीर+-समृद्धसमाधान के तीन अलग-अलग 50 एमएल एलिकोट्स को समायोजित करें।
    नोट: एक एसीटेट-एसिटिक एसिड बफर कम पीएच समाधानों के लिए बेहतर हो सकता है।
  4. छवि अधिग्रहण के पूरा होने के बाद, कोशिकाओं युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेट से एचबीबीएस को हटा दें और इसे K+-समृद्धसमाधान के साथ बदल दें जो पीएच 7.5 पर है।
  5. 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए नाइजरिकिन जोड़ें ।
    नोट: नाइजरिकिन एक आयनोफोर है जोएच+ के लिए K+ का आदान-प्रदान करता है । साइटोसोल की के +एकाग्रता का अनुमान लगाने वाले मूल्य के लिए कश्मीर+समृद्ध समाधान की K+ एकाग्रता स्थापित करके, यह सुनिश्चित किया जा सकता है कि नाइजरिकिन मैक्रोपिनोसोम के पीएच को साइटोसोल के लिए दबादेगा, जो बदले में अंशांकन बफर के पीएच को दर्शाता है।
  6. प्लेट को माइक्रोस्कोप पर वापस रखें और ऊपर के समान अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें।
  7. प्रत्येक अंशांकन बफर के लिए चरण 3.5 और 3.6 दोहराएं।

4. मैक्रोपिनोसोम पीएच के लिए डेटा विश्लेषण

  1. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, टीएमआर और फ्लोरोसेइन चैनल दोनों से पृष्ठभूमि को घटाएं।
  2. टीएमआर चैनल पर मास्क जेनरेट करें। मास्क जेनरेट करने के लिए, एडजस्ट > थ्रेसहोल्ड > अप्लाईका चयन करके इमेज को बाइनरी इमेज में बदल दें । इसके बाद, बाइनरी इमेज को हाइलाइट करें और एडिट > सेलेक्शन का चयन करें > मास्क बनाएं।
  3. इसे टीएमआर और फ्लोरोसिन दोनों इमेज पर लगाएं। ऐसा करने के लिए, मुखौटा को हाइलाइट करें और चयन > एडिट > चयन का चयन करें। टीएमआर इमेज पर क्लिक करें और टीएमआर चैनल पर मास्क लगाने के लिए शिफ्ट + ई दबाओ। इसी तरह ओबी चैनल पर मास्क लगाने के लिए फ्लोरोसिन इमेज और प्रेस शिफ्ट + ई पर क्लिक करें।
  4. मास्क के भीतर प्रत्येक मैक्रोपिनोसोम के लिए टीएमआर और फ्लोरोसिन तीव्रता रिकॉर्ड करें।
  5. समय पाठ्यक्रम से हर बार बिंदु के लिए कदम 4.1-4.3 दोहराएं।
  6. सीटू अंशांकन में कैप्चर की गई छवियों के लिए चरण 4.1-4.3 दोहराएं।
  7. फ्लोरोसेसिन तीव्रता को टीएमआर तीव्रता से विभाजित करें फ्लोरोसेसिन उत्पन्न करने के लिए: टीएमआर अनुपात।
  8. फ्लोरोसिन के खिलाफ पीएच प्लॉट: अंशांकन छवियों के लिए टीएमआर अनुपात।
  9. अंशांकन डेटा के लिए एक वक्र फिट करें।
  10. पूर्ण पीएच मान प्राप्त करने के लिए समय पाठ्यक्रम से हर बार बिंदु के लिए डेटा को इंटरपोलेट करें।

5. मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं को मापना

  1. धारा 1 की तरह कोशिकाओं को तैयार करें।
  2. परख से एक दिन पहले, H2DCFDA succinimidyl एस्टर लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान लेबल 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान (पीएच 8.3) के 1 मिलीएल में 70 केडीए डेक्सट्रान-अमीनो के 10 मिलीग्राम को फिर से खर्च करके तैयार करें। डेक्सट्रान-अमीनो समाधान और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए H2DCFDA succinimidyl एस्टर के 1 मिलीग्राम जोड़ें । PBS के खिलाफ H2DCFDA लेबल ७० केडीए डेक्सट्रान । 1 दिन से अधिक समय तक स्टोर न करें क्योंकि एच2डीसीडीडीए-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान भंडारण पर ऑक्सीकरण करेगा।
  3. परख के दिन सभी कुओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस के 100 माइक्रोन से धो लें।
  4. 5.025 मिलीग्राम/एमएल वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक को अच्छी तरह से भरें- लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और 0.025 मिलीग्राम/
  5. कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
  6. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाएं और एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को 6x धोएं।
  7. प्रत्येक को 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस के 100 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से भरें।
  8. प्लेट को एक गर्म चरण और कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप पर रखें और आवश्यकतानुसार प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजन/उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करें।
    नोट: छवि अधिग्रहण के लिए आदर्श स्थितियां फ्लोरोफोरस और व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप सेट-अप के साथ भिन्न होंगी। यहां छवियों को एक Leica SP5 लेजर स्कैनिंग कंफोकल माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत किया गया । टीएमआर 543-लेजर लाइन से उत्साहित था, और उत्सर्जन 610 एनएम से 650 एनएम तक एकत्र किया गया था। एच2डीसीडीए 488-लेजर लाइन से उत्साहित था और 500 एनएम से 550 एनएम तक उत्सर्जन एकत्र किया गया था। एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था, और एक 10 माइक्रोन जेड मात्रा ०.५ माइक्रोन मीटर अंतराल पर अधिग्रहीत किया गया था ।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से एक छवि प्राप्त करें, प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोफोरस के बीच बारी-बारी से।
  10. पहले अधिग्रहण के बाद, जांच करें कि क्या सभी कुएं पूरी थाली में ध्यान में रहते हैं।
  11. वांछित समय के लिए 1-15 मिनट अंतराल पर प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें।

6. मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं के लिए डेटा विश्लेषण

  1. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, टीएमआर और एच 2डीसीएलडीए चैनलों दोनों से पृष्ठभूमि को घटाएं।
  2. टीएमआर चैनल पर मास्क जेनरेट करें। मास्क जेनरेट करने के लिए, एडजस्ट > थ्रेसहोल्ड > अप्लाईका चयन करके इमेज को बाइनरी इमेज में बदल दें । इसके बाद, बाइनरी इमेज को हाइलाइट करें और एडिट > सेलेक्शन का चयन करें > मास्क बनाएं।
  3. टीएमआर और एच2डीसीडीए दोनों छवियों पर मास्क लगाएं। ऐसा करने के लिए, मुखौटा को हाइलाइट करें और चयन > एडिट > चयन का चयन करें। टीएमआर इमेज पर क्लिक करें और टीएमआर चैनल पर मास्क लगाने के लिए शिफ्ट + ई दबाओ। इसी तरह एच2डीसीएलडीए इमेज और प्रेस शिफ्ट + ई पर क्लिक करें एच2डीसीएलडीए चैनल पर मास्क लगाएं।
  4. मास्क के भीतर प्रत्येक मैक्रोपिनोसोम के लिए टीएमआर और एच2डीसीडीडीए तीव्रता रिकॉर्ड करें।
  5. समय पाठ्यक्रम से हर बार बिंदु के लिए कदम 4.1-4.3 दोहराएं।
  6. एच2डीसीएफडीए तीव्रता को टीएमआर तीव्रता से विभाजित करें एच2डीसीएफडीए उत्पन्न करने के लिए: टीएमआर अनुपात।
  7. प्लॉट H2DCFDA: समय के खिलाफ TMR अनुपात ।

7. मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन पाचन मापने

  1. धारा 1 की तरह कोशिकाओं को तैयार करें।
  2. परख के दिन सभी कुओं को 100 माइक्रोन एचबीएस से 37 डिग्री सेल्सियस पर धो लें।
  3. एचबीएसएस में 4 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के लिए BODIPY-लेबल अंडाकारबुमिन को भंग करें ।
  4. टीएमआर-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान के 0.025 मिलीग्राम/एमएल वाले एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें और BODIPY-लेबल वाले ओवलबैमिन के 0.2 मिलीग्राम /एमएल।
  5. कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
  6. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाएं और एचबीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को 6x धोएं।
  7. प्रत्येक को 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस के 100 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से भरें।
  8. प्लेट को एक गर्म चरण और कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप पर रखें और आवश्यकतानुसार प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजन/उत्सर्जन मापदंडों को समायोजित करें।
    नोट: छवि अधिग्रहण के लिए आदर्श स्थितियां फ्लोरोफोरस और व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप सेट-अप के साथ भिन्न होंगी। यहां, चित्रों को एक Leica SP5 लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत किया गया । टीएमआर 543-लेजर लाइन से उत्साहित था, और उत्सर्जन 610 एनएम से 650 एनएम तक एकत्र किया गया था। BODIPY एक 488-लेजर लाइन के साथ उत्साहित था, और उत्सर्जन 500 एनएम से 550 एनएम तक एकत्र किया गया था। एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था और एक 10 μm जेड मात्रा ०.५ माइक्रोन मीटर अंतराल पर अधिग्रहीत किया गया था ।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से एक छवि प्राप्त करें, प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोफोरस के बीच बारी-बारी से।
  10. पहले अधिग्रहण के बाद, जांच करें कि क्या सभी कुएं पूरी थाली में ध्यान में रहते हैं।
  11. वांछित समय के लिए 1-15 मिनट अंतराल पर प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों को प्राप्त करें।

8. मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन पाचन के लिए डेटा विश्लेषण

  1. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, टीएमआर और बॉडीपी चैनलों दोनों से पृष्ठभूमि को घटाएं।
  2. टीएमआर चैनल पर एक मास्क उत्पन्न करें और इसे टीएमआर और बॉडीपी दोनों छवियों पर लागू करें क्योंकि चरण 6.2 और 6.3 ऊपर(चित्रा 3 B)।
  3. मास्क के भीतर प्रत्येक मैक्रोपिनोसोम के लिए टीएमआर और बॉडीपी तीव्रता रिकॉर्ड करें।
  4. समय पाठ्यक्रम से हर बार बिंदु के लिए कदम 4.1-4.3 दोहराएं।
  5. BODIPY तीव्रता से BODIPY तीव्रता विभाजित करने के लिए BODIPY उत्पन्न: TMR अनुपात।
  6. बॉडीपीवाई प्लॉट करें: समय के मुकाबले टीएमआर अनुपात।

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Representative Results

मैक्रोपिनोसोम पीएच को मापते समय, समय की अवधि होती है जिसके लिए अम्लीकरण की गतिशीलता को मापा नहीं जा सकता है। यह अवधि डेक्सट्रान लोडिंग चरण (चित्रा 2सी और चित्रा 3सी, डीमें ग्रे बॉक्स) से मेल खाती हैऔर उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होगी। लोडिंग चरण की लंबाई कोशिकाओं की मैक्रोपिनोसाइटिक गतिविधि और उपयोग किए जाने वाले उपकरण की संवेदनशीलता (ii) के साथ भिन्न होगी। प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में इस अवधि को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है ताकि फ्लोरोसिन और टीएमआर चैनलों दोनों के लिए 4:1 से अधिक का शोर अनुपात प्राप्त हो। अनुपचारित कोशिकाओं में, फ्लोरोसिन उत्सर्जन उत्तरोत्तर कमजोर हो जाना चाहिए क्योंकि मैक्रोपिनोसोम अम्लीय हो जाते हैं, और टीएमआर सिग्नल या तो स्थिर रहना चाहिए या उज्जवल हो जाना चाहिए। यदि मैक्रोपिनोसोम16,21के आकार में सिकुड़ जाते हैं तो टीएमआर संकेत उज्जवल होसकताहै . इससे अनुपात प्रभावित नहीं होगा क्योंकि फ्लोरोसीन सिग्नल ऑर्गेनेलर आकार22में समान भिन्नता के अधीन है । फ्लोरोसेइन: टीएमआर अनुपात उत्तरोत्तर छोटा हो जाएगा और अधिग्रहण के पहले 15 मिनट(चित्रा 2C)के भीतर पठार होगा। यह पठार ~ 5 के पीएच से मेल खाता है, जो मोटे तौर पर लाइसोसोम्स25के पीएच से मेल खाता है। प्रत्येक अधिग्रहण के अंत में, सीटू अंशांकन में एक किया जाता है। फ्लोरोसेइन: टीएमआर अनुपात पीएच 7.5 पर अंशांकन बफर के साथ सबसे बड़ा होना चाहिए और उत्तरोत्तर छोटा हो जाना चाहिए क्योंकि अंशांकन बफ़र्स अधिक अम्लीय हो जाते हैं। यह एक अंशांकन वक्र(चित्रा 2B)के उत्पादन के लिए अनुमति देता है । फ्लोरोसेइन: टीएमआर अनुपात को मैक्रोपिनोसोमल पीएच(चित्रा 2 सी)के लिए इंटरपोलेटेड किया जा सकता है।

मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं का उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार के साथ भी भिन्न होने की संभावना है। एच2डीसीएलडीए-डेक्सट्रान के साथ कोशिकाओं को लोड करने और सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 3 सी)के रूप में फरबोल 12-मायरिमस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) का उपयोग करके एनएडीपीएच ऑक्सीडेस को प्रोत्साहित करने की सिफारिश की जाती है। यह परख की गतिशील रेंज का एक बेहतर विचार देगा और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के समायोजन के लिए अनुमति देगा। चूंकि ऑक्सीडेटिव घटनाएं मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर होती हैं, इसलिए एच2डीसीडीडीए सिग्नल उत्तरोत्तर उज्जवल हो जाएगा। टीएमआर सिग्नल स्थिर रह सकता है या ऊपर चर्चा किए गए मैक्रोपिनोसोम के आकार के साथ भिन्न हो सकता है। H2DCFDA का अनुपात: टीएमआर उत्तरोत्तर बड़ा हो जाएगा और निष्क्रिय Raw264.7 कोशिकाओं(चित्रा 3A,सी)में पहले 20-30 मिनट के भीतर पठार की संभावना होगी ।

मैक्रोपिनोसोमल प्रोटीन पाचन को मापने पर, एक उत्तरोत्तर मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत मुक्त हो जाएगा क्योंकि अंडाकार पचा जाता है। Raw264.7 कोशिकाओं में, पचा BODIPY लेबल ovalbumin से मुक्त फ्लोरेसेंस में वृद्धि पहले 30 मिनट(चित्रा 3B,डी)के भीतर पठार होगा । पहले की तरह, टीएमआर सिग्नल स्थिर रह सकता है या मैक्रोपिनोसोम के आकार के साथ भिन्न हो सकता है। जैसे ही मैक्रोपिनोसोम बंद होने के तुरंत बाद अंडाकार का क्षरण शुरू होता है, परख की गतिशील सीमा निर्धारित करने में नकारात्मक नियंत्रण उपयोगी हो सकता है। इस उद्देश्य के लिए, मैक्रोपिनोसोम के भीतर एसिड हाइड्रोलाज को वी-एटीपैस के अवरोधक का उपयोग करके बाधित किया जा सकता है, जैसे कि कॉननामाइसिन ए (सीसीए)(चित्रा 3 डी)या बाफिलोमाइसिन ए।

Figure 1
चित्रा 1:दोहरी-फ्लोरोफोर अनुपातमेट्रिक इमेजिंग के सिद्धांत। (ए-सी)। संकेतित पीएच के बफ़र्स में निलंबित पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस के स्पेक्ट्रल स्कैन (एक्सिटेशन-फिक्स्ड, उत्सर्जन-विविध) । फ्लोरोसेइन, पीएचरोडो और cypHer5e आमतौर पर सेलुलर परख में पीएच के सेंसर के रूप में उपयोग किया जाता है। (D-F)। संकेतित पीएच के बफ़र्स में निलंबित पीएच-असंवेदनशील फ्लोरोफोरस के स्पेक्ट्रल स्कैन (एक्सटिटेशन-फिक्स्ड, उत्सर्जन-विविध) । पीएच के साथ भिन्न नहीं होने वाले रंग उपयोगी संदर्भ फ्लोरोफोरस बनाते हैं। फ्लोरोसीन, एंडोसोम्स में अनुभव किए गए अधिक अम्लीय पीएच मूल्यों पर इष्टतम रूप से संवेदनशील नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:मैक्रोपिनोसोमल पीएच के गतिशील माप। (A)Raw264.7 कोशिकाओं फ्लोरोसेइन लेबल ७० केडीए डेक्सट्रान और टीएमआर लेबल ७० केडीए डेक्सट्रान के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए लिपोपोप्लिशाक्चराइड (एलपीएस) के ५०० एनजी/एमएल की अनुपस्थिति में भरी हुई थी । उन्हें फ्लोरोसेइन-लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान और टीएमआर-लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान को डेक्सट्रान के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए नियंत्रण के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर भी इनक्यूबेटेड किया गया था। इंसेट व्यक्तिगत कोशिकाओं को दिखाते हैं (स्केल बार = 20 माइक्रोन)। (ख)फ्लोरोसिन-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और टीएमआर-लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान से भरी हुई Raw264.7 कोशिकाओं के सीटू अंशांकन में संकेतित पीएच और नाइजरिकिन मेंK+-रिचबफर का उपयोग करके 70 केडीए डेक्सट्रान। (ग)Raw264.7 कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसोम पीएच। इनसेट फ्लोरोसिन का प्रतिनिधित्व करते हैं: व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम्स में टीएमआर अनुपात। ग्रे बॉक्स उस समय का संकेत देते हैं जब कोशिकाओं को डेक्सट्रान से लोड किया जा रहा था। दो स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा प्रत्येक ८० कोशिकाओं ≥ युक्त । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन पाचन के गतिशील माप। (A)Raw264.7 कोशिकाओं को H2DCFDA-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और टीएमआर-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान 15 मिनट के लिए 37 सी पर लोड किया गया था, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट का पीछा किया गया। इनसेट व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम्स की अनुपातित छवियां (H2DCFDA/TMR) दिखाती हैं । स्केल बार = 20 माइक्रोन। (B)Raw264.7 कोशिकाओं को BODIPY-लेबल वाले ओवलबुमिन और टीएमआर-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लोड किया गया था, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट का पीछा किया गया। टीएमआर चैनल का इस्तेमाल मास्क जेनरेट करने के लिए किया जाता था, जिसे बॉडीपी चैनल पर लगाया जाता था । इनसेट अलग-अलग कोशिकाओं को दिखाते हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ग)मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमेन के भीतर एच2डीसीडीडीए ऑक्सीकरण। कोशिकाओं को भी एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीएमए के साथ उत्तेजित किया गया । ग्रे बॉक्स उस समय का संकेत देते हैं जब कोशिकाओं को डेक्सट्रान से लोड किया जा रहा था। दो स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा, प्रत्येक ८० कोशिकाओं ≥ युक्त । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व किया। हर बार प्वाइंट की तुलना पीएमए कंट्रोल से की गई। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक छात्र के टी-टेस्टका इस्तेमाल किया गया था । (घ)मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर बॉडीपी-लेबल अंडाकार गिरावट। कॉनकानामाइसिन ए (सीसीए) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था क्योंकि यह ल्यूमिनल एसिड हाइड्रोलेस की सक्रियता को रोकता है। दो स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा, प्रत्येक ८० कोशिकाओं ≥ युक्त । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व किया। हर बार प्वाइंट की तुलना सीसीए कंट्रोल से की गई। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक छात्र के टी-टेस्टका इस्तेमाल किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यद्यपि मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट और यहां तक कि डिक्टियोस्टियम स्पीप में मैक्रोपिनोसाइटिक तेज के कम और उच्च थ्रूपुट दोनों मापों के लिए कई प्रोटोकॉल हैं। 3,7,31,32,33,इन गतिशील डिब्बों की चमकदार जैव रसायन को मापने के लिए बहुत कम प्रयास किए गए हैं। यह जांच की कमी के कारण होने की संभावना है जिसे अन्य एंडोसाइटिक डिब्बों से बचते हुए मैक्रोपिनोसोमल डिब्बे को कुशलतापूर्वक लक्षित किया जा सकता है । यहां वर्णित पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन पाचन के गतिशील माप के लिए फ्लोरोसेंट जांच को लक्षित करने की तकनीकें हैं।

रेशेमेट्रिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्राथमिक तकनीक रही है जिसके द्वारा एंडोसोमल पीएच को दशकों से मापा गया है । फ्लोरोसीन का व्यापक रूप से एंडोसोमल पीएच को मापने के लिए उपयोग किया गया है और यह पसंद का फ्लोरोफोर बना हुआ है क्योंकि इसका पीकेएक एंडोसोमल पीएच मूल्यों (~ पीएच 7.2-4.5) की विशिष्ट रेंज के साथ सटीक माप के लिए अनुमति देता है। यहां, अध्ययन में फ्लोरोसीन को मैक्रोपिनोसोम-विशिष्ट पीएच मापन के लिए 70 केडीए डेक्सट्रान में संयोजित किया गया था। इस दृष्टिकोण की एक सीमा 15 मिनट डेक्सट्रान लोडिंग अवधि है जिसके दौरान मैक्रोपिनोसोमल पीएच दर्ज नहीं किया जा सकता है। इस अवधि के लिए मैक्रोपिनोसोमल डिब्बे में पर्याप्त फ्लोरोफोर लेबल डेक्सट्रान लोड करने के लिए आवश्यक है, लेकिन प्रभावी रूप से जल्दी मैक्रोपिनोसोम पीएच माप को रोकता है। हालांकि, यह बफरिंग क्षमता, सापेक्ष प्रोटोन रिसाव और वी-एटीपीई पंपिंग पावर जैसे विभिन्न चमकदार मापदंडों के निर्धारण को बाधित नहीं करता है, जो सभी मैक्रोपिनोसोमल पीएच माप से प्राप्त होते हैं। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, पीएच को मापने के लिए कई अन्य पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस का भी उपयोग किया जा सकता है, जिसमें पीएच (पीकेए = 6.8) और CypHer5e (पीकेए = 7.3) शामिल हैं। हालांकि, चूंकि उनके पास फ्लोरोसेइनकी तुलना में काफी अधिक पीके है, वे अधिक अम्लीय पीएच मूल्यों पर एंडोसोमल पीएच को मापने के लिए इष्टतम नहीं हैं।

चूंकि मैक्रोपिनोसोम अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल्स होते हैं और16, 21बनाने के तुरंत बाद महत्वपूर्ण सिकुड़न से गुजरते हैं, इसलिए दोहरी-फ्लोरोफोर अनुपात मेट्रिक फ्लोरेसेंस की आवश्यकता होती है। मैक्रोपिनोसोम्स की मात्रा में परिवर्तन के कारण फ्लोरेसेंस में परिवर्तन प्रस्तुत किए गए सभी परखों में संदर्भ फ्लोरोफोर का उपयोग करने के लिए सही किए जाते हैं।

कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव घटनाओं को नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी), ल्यूमिनॉल और एच2डीसीडीडीए सहित विभिन्न प्रकार के रेडॉक्स-सेंसिटिव प्रोब का उपयोग करके मापा गया है । ल्यूमिनॉल-आधारित दृष्टिकोण कोशिकाओं की आबादी में आरओएस उत्पादन को मापने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं, लेकिन ऑर्गेनेल-विशिष्ट मापों के अनुकूल होना मुश्किल होता है। एनबीटी ऑक्सीकरण पर formazan नामक एक आसानी से कल्पना अघुलनशील जमा बनाता है लेकिन फ्लोरोसेंट संकेतों को अस्पष्ट करता है और स्थानीयकरण के लिए गैर-सरल और मुश्किल दोनों है। H2DCFDA ऑक्सीकरण पर एक रैखिक फ्लोरोसेंट संकेत को मुक्त करता है और ऑर्गेनेल-विशिष्ट मापों के लिए डेक्सट्रान जैसे ट्रेसर्स को आसानी से संयुग्मित किया जा सकता है। एच2डीसीएफडीए को 70 केडीए डेक्सट्रान से जोड़कर, व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम(चित्रा 3 बी)के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं की कल्पना की जा सकती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए एक चेतावनी है । चूंकि एच2डीसीएफडीए फ्लोरोसेइन का एक संशोधित रूप है, इसलिए मुक्त सिग्नल पीएच संवेदनशील है। हालांकि ऑक्सीकरण पर फ्लोरेसेंस में लाभ का पता लगाने के लिए काफी बड़ा है, यह निस्संदेह मैक्रोपिनोसोम के अम्लीय ल्यूमेन द्वारा नकाबपोश है। एच2डीसीडीडीए का पीएच-असंवेदनशील संस्करण पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और बेहतर है; हालांकि, इस पांडुलिपि को तैयार करने के समय, यह उत्पाद अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं था। ROS एक महत्वपूर्ण संकेत अणु के रूप में उभर रहा है और झिल्ली रीमॉडलिंग, ऑर्गेनेलर तस्करी में फंसाया गया है, और हाल ही में एंटीजन द्वारा सामग्री के प्रसंस्करण में टी कोशिकाओं को प्रस्तुति के लिए कोशिकाओं को पेश28,30। यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग इन विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में मैक्रोपिनोसोमल आरओएस उत्पादन के योगदान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

मैक्रोपिनोसोम्स में प्रोटीन पाचन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा एंटीजन प्रस्तुति के अध्ययन के साथ-साथ कैंसर कोशिकाओं द्वारा पोषक तत्वों के अधिग्रहण के अध्ययन में रुचि रखता है। उदाहरण के लिए, डेंड्रिटिक कोशिकाओं द्वारा एंडोसोमल प्रोटीन पाचन प्रमुख हिस्टोकंपैटिबिलिटी अणुओं पर टी कोशिकाओं को प्रस्तुति के लिए उपलब्ध पेप्टाइड्स के पूल को सीमित करने के लिए माना जाता है। चूंकि मैक्रोपिनोसोम एंटीजन अधिग्रहण का एक प्रमुख मार्ग है, इसलिए मैक्रोपिनोसोमल प्रोटीन पाचन के मापन का उपयोग ठीक ट्यूनिंग एंटीजन प्रस्तुति के लिए जिम्मेदार आणविक मशीनरी की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एंडोसोमल डिब्बों में प्रोटीन पाचन को मापने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग किया जाता है। BODIPY लेबल बीएसए और अंडाकार जांच, जो पाचन पर दृढ़ता से फ्लोरोसेंट हो जाते हैं, विशेष रूप से लोकप्रिय साबित हुए हैं । वे आसानी से एंडोसाइटिक ट्रेसर्स के लिए युग्मित होते हैं और उन्हें विशिष्ट एंडोसोमल डिब्बों, जैसे फैगोसोम्स के लिए लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, जांच आसानी से डेक्सट्रान के लिए युग्मित नहीं हैं और इसलिए सह-स्थानीयकरण दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप मैक्रोपिनोसोम सहित सभी एंडोसोम डिब्बों की लोडिंग होती है, जिसमें BODIPY-लेबल अंडाकार के साथ, और मैक्रोपिनोसोम-विशिष्ट गिरावट को मापने के लिए एक मुखौटा का उपयोग किया जाता है। इस दृष्टिकोण को बेहतर संकल्प की आवश्यकता है और बड़े, अधिक उच्च थ्रूपुट विश्लेषणों के लिए आसानी से नहीं बढ़ाया जाता है । 70 केडीए डेक्सट्रान को प्रोटीन क्षरण उपकरण सहसंयोजक रूप से जोड़े जाने की तकनीक संभवतः उपयोगी साबित होगी और वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में विकसित की जा रही है।

चूंकि मैक्रोपिनोसाइटोसिस का क्षेत्र34लगातार बढ़ता जा रहा है, इसलिए पीएच, रेडॉक्स रसायन, प्रोटीन पाचन, आयन सांद्रता और लिपिड रसायन सहित मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमिनल बायोकेमिस्ट्री को गतिशील रूप से मापने के लिए उपकरण इन तेजी से विकसित ऑर्गेनेल्स के अद्वितीय जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इसके समर्थन के लिए कैलगरी विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ रॉबिन येट्स को भी अभिकर् स, उपकरण और उपयोगी चर्चाओं तक पहुंच के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

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References

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ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएच, रेडॉक्स रसायन और मैक्रोपिनोसोम की डिग्रेडिव क्षमता को मापना
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Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

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