Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.

Ce protocole permet l’évaluation en temps réel de divers processus et paramètres biochimiques dans la lumière de macropinosomes individuels. Ces méthodes peuvent être utilisées pour la découverte de médicaments dans la biologie cellulaire de la macropinocytose. Ce protocole offre l’avantage de révéler l’hétérogénéité tant au niveau cellulaire qu’au niveau des organites.

Un jour avant la graine d’essai Raw264.7 cellules à une densité de cinq fois 10 à la puissance des cellules dans 100 microlitres par puits, dans une plaque de fond de verre de 96 puits avec des côtés noirs. Le jour de l’essai, vérifiez si les puits sont confluents à au moins 70%. Ensuite, lavez tous les puits avec 100 microlitres de HBSS, pré-avertis à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de HBSS contenant 0,025 milligramme par millilitre de TMR marqué 70 kilodalton dextran et 0,025 milligramme par millilitre de fluorescéine marqué 70 kilodalton dextran dans chaque puits, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois l’incubation terminée, retirez la plaque de l’incubateur et lavez les cellules six fois avec 100 microlitres de HBSS. Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de HBSS pré-avertis aux cellules, puis placez la plaque sur un microscope avec un étage et une chambre chauffés.

Après avoir ajusté les paramètres d’excitation et d’émission pour le TMR et la fluorescéine au besoin, acquérir une image de chaque puits en alternance entre les deux fluorophores entre chaque puits. Après la première acquisition, vérifiez si tous les puits sont restés au point sur toute la plaque, puis acquérez des images de chaque puits à des intervalles d’une à 15 minutes pendant la durée souhaitée. Lors de l’acquisition de l’image, ajuster le pH d’une aliquote de 50 millilitres d’une solution riche en potassium tamponnée avec 25 millimolaires HEPES à 7,5 en utilisant 10 molaires d’acide chlorhydrique, ou 10 molaires d’hydroxyde de potassium selon les besoins.

Ajustez ensuite le pH de 350 millilitres aliquotes de la solution riche en potassium tamponnée avec du MES de 25 millimolaires à pH 6,5, pH 5,5 et pH 5,0. Une fois l’acquisition de l’image terminée, retirez le HBSS de la plaque de 96 puits contenant les cellules et ajoutez la solution riche en potassium à un pH de 7,5. Ajouter ensuite la nigérine à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre.

Replacez la plaque sur le microscope et acquérez des images de chaque puits en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition que ceux démontrés précédemment. Pour mesurer les événements oxydatifs dans les macropoinosomes, ensemencez les cellules RAW264.7 dans une plaque de 96 puits un jour avant le test, comme démontré précédemment. Ensuite, le jour du test, lavez tous les puits avec 100 microlitres de HBSS pré-avertis à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de HBSS contenant 0,025 milligramme par millilitre de TMR marqué 70 kilodalton dextran et 0,025 milligramme par millilitre de H2DCFDA marqué 70 kilodalton dextran à chaque puits, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, lavez les cellules six fois avec 100 microlitres de HBSS. Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de HBSS à chaque puits et placez la plaque sur le microscope.

Après avoir ajusté les paramètres d’excitation et d’émission pour TMR et H2DCFDA au besoin, acquérez des images de chaque puits à des intervalles d’une à 15 minutes, comme démontré précédemment. Pour mesurer la digestion des protéines dans les macropoinosomes, ensemencez les cellules RAW264.7 un jour avant le test, comme démontré précédemment. Ensuite, le jour du test, lavez tous les puits avec 100 microlitres de HBSS pré-avertis à 37 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de HBSS contenant 0,025 milligramme par millilitre de TMR marqué 70 kilodalton dextran dans 0,2 milligramme par millilitre d’ovalbumine étiquetée BODIPY à chaque puits. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir retiré les cellules de l’incubateur, lavez-les six fois avec 100 microlitres de HBSS.

Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de HBSS à chaque puits, puis placez la plaque sur le microscope. Après avoir ajusté les paramètres d’excitation et d’émission pour TMR et BODIPY au besoin, acquérez des images de chaque puits à des intervalles d’une à 15 minutes, comme démontré précédemment. Lors de la mesure du pH, des événements oxydatifs ou de la dégradation des protéines dans les macropoinosomes, la dynamique de l’acidification ne peut pas être mesurée pendant une certaine période correspondant à la phase de charge du dextran, qui varie en fonction du type de cellule utilisé.

Lors de la mesure du pH des macropinosomes, le rapport fluorescéine/TMR deviendra progressivement plus petit et plafonnera dans les 15 minutes suivant l’acquisition. Ce plateau correspond à un pH d’environ cinq, ce qui correspond à peu près au pH des lysosomes. À la fin de chaque acquisition, un étalonnage in situ est effectué.

Le rapport fluorescéine/TMR devrait être le plus important dans le tampon d’étalonnage à pH 7,5 et devenir progressivement plus petit à mesure que les tampons d’étalonnage deviennent plus acides. Cela permet de génération d’une courbe d’étalonnage. Lors de la mesure des événements oxydatifs dans les macropoinosomes, le rapport entre H2DCFDA et TMR deviendra progressivement plus important et plafonnera probablement dans les 20 à 30 premières minutes dans une cellule RAW264.7 activée.

Lors de la mesure de la digestion des protéines macropinosomales, un signal de fluorescéine progressivement fort sera libéré au fur et à mesure que l’ovalbumine est digérée. Dans les cellules RAW264.7, l’augmentation de la fluorescence libérée de l’ovalbumine digérée marquée BODIPY plafonnera dans les 30 premières minutes. Avec ce rôle émergent dans l’homéostasie et sa pertinence nouvellement découverte pour la pathologie du cancer, une recherche sur la macropinocytose de la renaissance est actuellement en cours.

Ces méthodes ont fourni une boîte à outils pour explorer la contribution de la macropinocytose à ces domaines d’étude.