Summary
Dette manuskript beskriver, hvordan man vurderer in vivo-immunogenicitet af tumorcelleafledte ekstracellulære vesikler (IV'er) ved hjælp af flowcytometri. ELBILER afledt af tumorer, der gennemgår behandlingsinduceret immunogen celledød, synes særligt relevante i tumorimmunovervågning. Denne protokol eksemplificerer vurderingen af oxaliplatin-inducerede immunstimulerende tumor-ELBILER, men kan tilpasses forskellige indstillinger.
Abstract
Immunogen celledød af tumorer, forårsaget af kemoterapi eller bestråling, kan udløse tumorspecifikke T-celleresponser ved at frigive fareassocierede molekylære mønstre og inducere produktionen af type I-interferon. Immunterapier, herunder checkpoint-hæmning, er primært afhængige af allerede eksisterende tumorspecifikke T-celler for at udfolde en terapeutisk effekt. Således kan synergistiske terapeutiske tilgange, der udnytter immunogen celledød som en iboende anti-cancervaccine, forbedre deres lydhørhed. Imidlertid forbliver spektret af immunogene faktorer, der frigives af celler under terapiinduceret stress, ufuldstændigt karakteriseret, især med hensyn til ekstracellulære vesikler (IV'er). ELBILER, nano-skala membranøse partikler udsendt fra stort set alle celler, anses for at lette intercellulær kommunikation og har i kræft vist sig at formidle cross-priming mod tumorantigener. For at vurdere den immunogene virkning af elbiler afledt af tumorer under forskellige forhold søges tilpasningsdygtige, skalerbare og gyldige metoder. Derfor præsenteres heri en relativt nem og robust tilgang til vurdering af elbilers in vivo-immunogenicitet . Protokollen er baseret på flowcytometrianalyse af milt-T-celler efter in vivo-immunisering af mus med ELBILER, isoleret ved udfældningsbaserede assays fra tumorcellekulturer under terapi eller steady-state-betingelser. For eksempel viser dette arbejde, at oxaliplatineksponering af B16-OVA murine melanomceller resulterede i frigivelse af immunogeneEV'er, der kan formidle aktiveringen af tumorreaktive cytotoksiske T-celler. Derfor identificerer screening af elbiler via in vivo-immunisering og flowcytometri betingelser, hvorunder immunogene elbiler kan dukke op. Identificering af betingelser for immunogen EV-frigivelse giver en væsentlig forudsætning for at teste EV'ers terapeutiske effekt mod kræft og udforske de underliggende molekylære mekanismer for i sidste ende at afsløre ny indsigt i EV'ers rolle i kræftimmunologi.
Introduction
Immunsystemet spiller en central rolle i kampen mod kræft, både når det anspores af immun checkpoint-hæmning og for effektiviteten af konventionelle kræftbehandlinger. Tumorceller, der bukker under for genotoksiske terapier såsom de kemoterapeutiske midler oxaliplatin og doxorubicin eller ioniserende strålebehandling, kan frigive antigener og fareassocierede molekylære mønstre (DAMP'er), der potentielt initierer et adaptivt antitumorimmunrespons1. De mest fremtrædende DAMP'er i forbindelse med immunogen celledød inkluderer find-me-signaler såsom kemotaktisk ATP, eat-me-signaler såsom eksponering af calreticulin, der fremmer tumorcelleoptagelse af antigenpræsenterende celler og frigivelse af HMGB1, der aktiverer mønstergenkendelsesreceptorer og derved forbedrer krydspræsentationen af tumorantigener2. Desuden opdages type I-interferoner (IFN-I), induceret via tumorafledte immunogene nukleinsyrer eller andre stimuli, af dendritiske celler, hvilket gør det muligt for dem effektivt at prime tumorspecifikke cytotoksiske T-celler3,4. Klinisk, aktiverede og prolifererende CD8 + T-celler, der infiltrerer tumoren, giver en uafhængig prognostisk faktor for langvarig overlevelse hos mange kræftpatienter. FRIGIVET fra sådanne aktiverede T-celler medierer IFN-γ direkte antiproliferative virkninger på kræftceller og driver Th1-polarisering og cytotoksisk T-celledifferentiering og bidrager derved til effektiv immunovervågning mod kræft5,6. Oxaliplatin er en bona fide immunogen celledødsinducer, der formidler et sådant adaptivt immunrespons mod kræft7. Imidlertid er overflod af indledende immunogene signaler frigivet af tumorceller under terapiinduceret stress stadig ikke fuldt ud afsløret. På trods af betydelige fremskridt inden for kræftimmunterapi er det stadig en udfordring at udvide fordelene til en større del af patienterne. En mere detaljeret forståelse af immunogene signaler, der initierer T-celleaktivering, kan styre udviklingen af nye terapier.
En heterogen gruppe af membranlukkede strukturer, kendt som ekstracellulære vesikler (ELBILER), synes at tjene som intercellulære kommunikationsenheder. Udsendt af stort set alle celletyper bærer ELBILER funktionelle proteiner, RNA, DNA og andre molekyler til en modtagercelle eller kan ændre en celles funktionelle tilstand bare ved at binde sig til receptorer på celleoverfladen. Deres biologisk aktive last varierer betydeligt efter typen og den funktionelle tilstand af den genererende celle8. Inden for kræftimmunologi er elbiler, der frigives fra tumorceller, overvejende blevet betragtet som modstandere af immunterapi, fordi de i sidste ende fremmer invasiv vækst, præforme metastatiske nicher9 og undertrykker immunresponset10. I modsætning hertil har nogle undersøgelser vist, at elbiler kan overføre tumorantigener til dendritiske celler for effektiv krydspræsentation11,12. ELBILER kan give immunstimulerende nukleinsyrer, hvis de opstår under terapiinduceret stress, hvilket letter et antitumorimmunrespons13,14. Sensing af sådanne RNA og DNA medfødte immunligander i tumormikromiljøet har for nylig vist sig at modulere lydhørhed over for checkpoint-blokade signifikant15,16,17. Derfor skal den immunogene rolle af elbiler frigivet af tumorceller under forskellig terapiinduceret stress belyses yderligere. Da elbiler udgør et ungt, men voksende forskningsfelt, er standardisering af metoder stadig i gang. Derfor er vidensdeling afgørende for at forbedre forskningsreproducerbarheden af interaktioner mellem elbiler og kræftimmunologi. Med dette i tankerne beskriver dette manuskript en simpel protokol til vurdering af den immunogene virkning af tumorafledte elbiler in vivo.
Denne vurdering udføres ved at generere tumorafledte elbiler, immunisere modtagermus med disse ELBILER og analysere milt-T-celler via flowcytometri. EV-generering udføres ideelt ved at så murine tumorceller i et EV-frit cellekulturmedium for en høj grad af renhed. Celler behandles med en specifik cellestressstimulus, såsom kemoterapi, for at sammenligne effekten af terapiinducerede elbiler med baseline immunogenicitet af respektive tumorafledte elbiler. Isoleringen af elbiler kan meget vel udføres ved hjælp af forskellige teknikker, der bør vælges i henhold til in vivo-anvendelighed og lokal tilgængelighed. Følgende protokol beskriver et nedbørsbaseret assay med et kommercielt sæt til rensning af elbiler. Mus immuniseres to gange med disse elbiler. Fjorten dage efter den første injektion ekstraheres T-celler fra milten og analyseres for IFN-γ produktion via flowcytometri for at evaluere et systemisk immunrespons. Med dette vurderes potentialet for tumorafledte elbiler, der opstår under forskellige terapeutiske regimer, for at inducere antitumor T-celleresponser relativt let, hurtigt og med høj gyldighed13. Derfor er denne metode egnet til en immunologisk screening af elbiler afledt af kræftceller under forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ved forsøgets begyndelse var mus mindst 6 uger gamle og blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold. Denne protokol er i overensstemmelse med de institutionelle etiske standarder og gældende lokale regler. Dyreforsøg blev godkendt af det lokale reguleringsorgan (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Mulige kønsrelaterede forstyrrelser blev ikke undersøgt i disse undersøgelser.
1. Generering og isolering af elbiler afledt af tumorceller efter kemoterapieksponering
- Dyrkning af murin B16 melanomceller, der udtrykker ovalbumin (B16-OVA) i DMEM (indeholdende 4 mM L-glutamin og 4,5 g/L D-glucose) suppleret med FCS (10 % v/v), penicillin (100 enheder/ml) og streptomycin (100 μg/ml) ved 37 °C, indtil cellerne vokser støt og er ca. 90 % sammenflydende.
BEMÆRK: Udfør dette afsnit af protokollen helt under sterile forhold ved hjælp af en cellekulturhætte. Til analyse af andre kræftenheder foretrækkes cellelinjer, der udtrykker et potent antigen, til at vurdere antigenspecifikke T-celleresponser, da de muliggør specifik ex vivo-antigenrestimulering . - For at forberede de cellekulturmedier, der kræves til EV-produktion, skal du udtømme kvæg-EV'er i FCS ved ultracentrifugering ved 100.000 x g i 24 timer ved 4 ° C og derefter kassere pelleten. Alternativt kan du vælge et kommercielt præparat med lavt niveau af dyre-elbiler på forhånd.
- Høst B16-OVA-celler og vask dem to gange i PBS, og frø derefter i en koncentration på 400.000 celler / ml i EV-udtømte medier.
BEMÆRK: Tilpas cellekoncentrationen til vækstdynamikken i den undersøgte cellelinje, så cellerne ikke vokser over. - B16-OVA-celler behandles ved at tilsætte 30 μg oxaliplatin pr. ml og inkuberes i 24 timer ved 37 °C. Lad kontrolforholdene være ubehandlede. Ved første anvendelse af et genotoksisk stof titreres den ønskede cytotoksiske virkning ved hjælp af cellelevedygtighedsassays såsom trypanblå udelukkelse18.
BEMÆRK: Dette assay kan også evaluere elbiler genereret i cellekulturer behandlet med andre immunmodulerende stoffer eller ioniserende bestråling ud over kemoterapeutika.
FORSIGTIG: Oxaliplatin forårsager hud- og alvorlig øjenirritation og kan forårsage allergisk hudreaktion og irritation af luftvejene. Oxaliplatin mistænkes for at forårsage kræft. Som en sikkerhedsforanstaltning skal du bruge personlige værnemidler, herunder passende handsker, beskyttelsesbriller, masker og tøj, der rengøres inden genbrug. Undgå indånding og vask hænderne grundigt efter håndtering. Undgå frigivelse i miljøet og bortskaf oxaliplatin i henhold til gældende regler. Få detaljerede oplysninger fra sikkerhedsdatabladet. - Saml cellekultur supernatant. Centrifuge først ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og derefter ved 2.000 x g i 30 minutter ved 4 °C, hver gang pillen kasseres. Til sidst filtreres gennem en 220 nm PVDF-membran. Brug et nyt rør til hvert trin for at fjerne celleaffald.
BEMÆRK: På dette stadium kan den EV-holdige supernatant opbevares ved 4 °C i en dag, før protokollen genoptages. Det anbefales dog kraftigt at overholde den beskrevne tidsplan med øjeblikkelig EV-rensning. - Bland 1 ml supernatant med 0,5 ml af et specifikt kommercielt tilgængeligt exosomisoleringsreagens (se materialetabel) i et V-formet 1,5 ml rør. Grundigt pipette op og ned eller hvirvel for at skabe en homogen opløsning. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Centrifuge ved 10.000 x g i 60 min ved 4 °C. Kassér forsigtigt supernatanten. Fjern de resterende dråber ved at banke på 1,5 ml røret på hovedet på et køkkenrulle og ved aspiration gennem en pipette med en fin spids uden at røre VED EV-pillen i bunden.
- Fjern alle væsker grundigt for at forhindre ukontrolleret fortynding af EV-pelleten. Udfør også disse opgaver hurtigt for at forhindre, at pillen tørrer ud.
- Resuspend elbilerne i kold PBS ved at pipettere op og ned uden at ridse pillen fra rørets væg med spidsen. Overfør nu affjedringen trin for trin fra det første til det sidste rør for at samle elbilerne.
BEMÆRK: Brug et volumen PBS, der er lig med 5 μL ganget med antallet af rør. 5 μL af den endelige suspension indeholder de isolerede elbiler, der frigives fra 400.000 celler under kemoterapi eller i stabil tilstand. - Brug helst elbiler direkte. Hvis dette ikke er muligt, skal ev-ophæng opbevares ved -80 °C i silikoniserede beholdere i op til 28 dage, indtil de påføres.
BEMÆRK: De elbiler, der er beskrevet her og i flere andre publikationer, mister ikke deres respektive biologiske funktion, når de opbevares ved -80 °C i den pågældende periode19. - Kvantificering og karakterisering af EV-isolater i henhold til MISEV2018-retningslinjerne20.
BEMÆRK: Mulige metoder til kvantificering omfatter nanopartikelsporingsanalyse (NTA)21 og påvisning af EV's membranbundne proteiner22. Mulige tilgange til yderligere at karakterisere elbiler omfatter elektronmikroskopi23 og western blot20.
2. Immunisering af mus med elbiler
- Planlæg in vivo-eksperimentet med C57BL/6-mus (eller andre syngeneiske mus svarende til tumorcellelinjen), herunder behandlingsgrupper, der modtager EV'er afledt af henholdsvis behandlede celler, ubehandlede celler og PBS (køretøj).
BEMÆRK: Brug fortrinsvis mus i en alder af 6-8 uger for at forhindre fysiologisk ældning i at mindske immunresponsen24. - Bland 5 μL EV-suspension med 55 μL kold PBS for hver mus inden for den respektive behandlingsgruppe for at immunisere den med EV'er isoleret fra 4,0 x 105 B16-OVA-celler.
BEMÆRK: Denne mængde elbiler svarer til ca. 2 x 109 partikler målt ved nanopartikelsporingsanalyse (data ikke vist). OVA-protein blandet med en adjuvans (f.eks. LPS) kan anvendes som en potent vaccinepositiv kontrol.- Fyld sprøjter (nålestørrelse 26-30 G) med henholdsvis 60 μL af de fortyndede elbiler eller PBS og læg straks på is.
BEMÆRK: I protokollen normaliseres mængden af injicerede EV'er til antallet af EV-frigivende tumorceller for eksperimentelt at overveje både kvalitative og kvantitative virkninger af oxaliplatin på tumorcelle EV-biogenese. For nogle læsere kan normalisering til en bestemt koncentration af producerede elbiler bedre passe til deres eksperimentelle opsætning afhængigt af deres videnskabelige spørgsmål.
- Fyld sprøjter (nålestørrelse 26-30 G) med henholdsvis 60 μL af de fortyndede elbiler eller PBS og læg straks på is.
- Inokulerev'er eller PBS subkutant i det mediale aspekt af musenes lår og gentag immuniseringen efter 7 dage. Fjorten dage efter den første behandling ofrer mus, f.eks. ved cervikal dislokation for at analysere immunresponsen.
BEMÆRK: Alternative subkutane injektionsveje kan anvendes i henhold til de lokale standarder.
3. Flowcytometrianalyse af milt-T-celler
- Forbered og afkøl komplet RPMI (cRPMI), supplere RPMI-1640 med FCS (10% v / v), penicillin (100 enheder / ml), streptomycin (100 μg / ml), L-glutamin (2 mM) og β-mercaptoethanol (50 μM).
- Resekter milten fra det åbne bughule. Mos milten med en fugtet 100 μm cellesil og plaststemplet på en sprøjte og skyl miltcellerne i et 50 ml rør med 5-10 ml cRPMI. Centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og kassere supernatanten.
BEMÆRK: Opbevar celler på is, når det er muligt. For at analysere det lokale snarere end det miltimmunrespons skal du resektere de drænende popliteale og inguinale lymfeknuder efter samme protokol. I dette tilfælde skal du springe over det næste trin for lysis af erytrocytter. - For at fjerne erytrocytter fra cellesuspensionen skal pillen resuspenderes med 2 ml lysisbuffer for røde blodlegemer (se materialetabel) og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur. Stop derefter reaktionen ved at tilføje cRPMI. Centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og kassere supernatanten.
- Til såning skal du genbruge cellepillen i cRPMI og tælle cellerne for at placere triplikater på 200.000 celler med 200 μL cRPMI i hver brønd ved hjælp af en 96-brønds plade med en U-formet bund. Inkuber i 48 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: For at behandle antigenseksefikaliteten af aktiverede T-celler tilsættes henholdsvis 1 μg/ml opløseligt ovalbumin (eller et andet tumorantigen svarende til cellelinjen under undersøgelse) eller efterlades uden yderligere stimulus. Tilsætning af den immundominerende peptidepitop SIINFEKL, i stedet for ovalbumin i fuld længde, giver mulighed for en kortere inkubationsperiode. Udover flowcytometri kan musenes serum og cellekultursupernatanten efter 48 timers inkubation analyseres for forskellige cytokiner. - Efter 48 timer tilsættes Brefeldin A (5 ng/ml), PMA (20 ng/ml) og Ionomycin (1 μg/ml) til cellekulturen for at forbedre intracellulær IFN-γ farvning ved bl.a. at blokere den Golgi-medierede sekretion af proteiner. Inkuber i 4 timer ved 37 °C.
- Før farvning af overfladebiomarkører overføres splenocytter til en 96-brønds plade med en V-formet bund og vaskes to gange med PBS. Derefter tilsættes fluorescerende antistoffer, der er kompatible med det lokalt tilgængelige flowcytometer, rettet mod overfladebiomarkører, CD3, CD8 og CD4 (se materialetabel), fortyndet 1:400 plus et fixerbart levedygtighedsfarvestof, fortyndet 1: 1.000 i PBS. Resuspend pelleterede splenocytter i farvningsopløsningen og inkuber i 30 minutter ved 4 °C, beskyttet mod lys.
- Til fiksering og permeabilisering af splenocytter vaskes to gange i FACS-buffer (PBS plus 3% v/v FCS) og derefter gensuspenderes i 100 μL fikserings-/permeabiliseringsbuffer (se materialetabel) pr. brønd. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C, beskyttet mod lys.
- Til farvning af intracellulære IFN-γ vaskes splenocytter i fikserings-/permeabiliseringsbuffer og resuspenderes med fluorescerende antistoffer mod IFN-γ, fortyndet 1:200 i bufferen. Inkuberes i mindst 1 time (op til højst 12 timer) ved 4 °C, beskyttet mod lys.
- Før prøveudtagningerne måles ved flowcytometri, vaskes splenocytter to gange i fikserings-/permeabiliseringsbuffer og resuspend i FACS-buffer. Analyser aktiveringen af cytotoksiske T-celler i henhold til gating-strategien vist i figur 2.
- For det første, for at detektere enkeltceller, blot FSC-H mod FSC-A. Derefter, for at detektere lymfoide celler, blotte SSC mod FSC-A. Derefter skal du vælge levende CD3 +, CD4-, CD8 + - celler og bestemme deres IFN-γ-producerende delmængde for at kvantificere aktiveringen af cytotoksiske T-celler i milten.
BEMÆRK: Inkluder en Fluorescens-minus-en (FMO) plet med alle fluorokromer undtagen fluorokrom rettet mod IFN-γ som negativ teknisk kontrol.
- For det første, for at detektere enkeltceller, blot FSC-H mod FSC-A. Derefter, for at detektere lymfoide celler, blotte SSC mod FSC-A. Derefter skal du vælge levende CD3 +, CD4-, CD8 + - celler og bestemme deres IFN-γ-producerende delmængde for at kvantificere aktiveringen af cytotoksiske T-celler i milten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol har til formål at lette en enkel og let reproducerbar vurdering af immunogeniciteten af tumorafledte elbiler. Herved podes mus med elbiler afledt af in vitro-kulturer af tumorceller, der udtrykker modelantigenet chicken ovalbumin (OVA). Det efterfølgende immunrespons analyseres i milt-T-celler via flowcytometri.
Figur 1 giver et overblik over de praktiske trin i hele protokollen. Da arbejdet fokuserer på immunogen celledød, krydspræsentation og EV-induceret antitumorimmunitet, er denne protokol begrænset til funktionen af CD8 + cytotoksiske T-celler. Som vist i figur 2 blev celler gated som enkeltceller, lymfocytundersæt (efter størrelse og granularitet), levedygtige celler (eksklusive en liv / død markør) og CD3 + CD4- CD8 + cytotoksiske T-celler. Intracellulær akkumulering af IFN-γ blev vurderet som en surrogatmarkør for aktivering. Mulige yderligere markører vedrørende T-celledifferentiering og udmattelse diskuteres nedenfor.
Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, blev mus immuniseret med EV'er afledt af OVA-ekspressorceller dyrket enten under steady-state (ubehandlet) eller genotoksiske stressbetingelser (oxaliplatinbehandlet). Kun mus injiceret med elbiler afledt af tumorceller under genotoksiske stressbetingelser inducerede potent aktivering af miltcytotoksiske T-celler hos recipientdyr (figur 3A). Injektion af elbiler afledt af tumorer under steady-state-betingelser resulterede i en vis T-celleaktivering, men det var ikke signifikant forskelligt fra T-celleaktivering hos mus injiceret med PBS-køretøjet. Disse data viser, at tumorceller under genotoksisk stress kan frigive potent immunogene elbiler. Produktionen af IFN-γ blev især øget, når splenocytter af tumor EV-behandlede dyr blev ex vivo restimuleret med modellen tumorantigen OVA før analyse (figur 3B). Disse data tyder på, at tumorafledte elbiler kan inducere tumorantigenspecifikke immunresponser. Interessant nok påvises IFN-γ-produktion - selvom det i langt mindre grad - også i fravær af antigenspecifik restimulering. Muligvis kan andre melanom-associerede antigener, såsom differentieringsantigenet TRP225, målrettes mod en del af det EV-inducerede T-cellerespons.
Figur 1: Piktografisk oversigt over protokollen. (A) Isolationsprocedure for elbiler genereret i tumorcellekulturer, der ligner kemoterapi. (B) Tidsplan for immunisering af mus med elbiler. (C) Farvningsprotokol til flowcytometrianalyse af cytotoksiske T-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowcytometri gating strategi til analyse af cytotoksisk T-celleaktivering i milten. Tallene repræsenterer procentdelen af den respektive forældrepopulation. FSC-A: fremadrettet spredningsområde; FSC-H: fremadgående spredningshøjde; SSC: sidelæns spredning; levende/død: celledødsmarkør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ELBILER afledt af tumorceller under genotoksisk stress kan fremkalde antigenspecifikke T-celleresponser hos modtagerdyr. (A) Mus blev immuniseret med elbiler afledt af tumorceller dyrket enten under steady-state (ubehandlet) eller genotoksiske stressbetingelser (oxaliplatinbehandlet). Køretøjsindsprøjtninger (PBS) blev brugt som en negativ kontrol. IFN-γ produktion af cytotoksiske T-celler i milten ved EV-immunisering blev bestemt. Med dette blev miltcellesuspensioner restimuleret med ovalbumin ex vivo før analyse. (B) Mus blev behandlet med elbiler afledt af tumorceller under genotoksiske stresstilstande som beskrevet ovenfor. Splenic T-celleaktivering blev bestemt efter ex vivo-restimulering enten i nærvær eller fravær af ovalbumin. Søjler viser gennemsnittet pr. Gruppe og whiskers sin standardfejl. Envejsanalysen af varianstest (ANOVA) med Bonferroni posttest blev brugt til flere statistiske sammenligninger af et datasæt. Signifikansniveauet blev sat til P < 0,05, P < 0,01 og P < 0,001 og er her angivet med stjerner (*, **, og ***). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en immunologisk in vivo-vurdering af elbiler afledt af melanomceller under kemoterapi-induceret stress, mens de tilpasser sig elbiler, der udsendes fra forskellige kræftformer under forskellige behandlinger. Immunisering af mus med ELBILER afledt af oxaliplatinbehandlede B16-OVA-celler udvider for eksempel IFN-γ-producerende CD8 + T-celler i milten, som yderligere stimuleres af ex vivo-inkubation med ovalbumin, hvilket indikerer et tumorspecifikt immunrespons. Påvisning af immunogene elbiler ved screening gennem denne protokol letter således en mere omfattende forståelse af konventionelle kræftterapier og muliggør en fokuseret undersøgelse af elbilernes rolle i kræftimmunologi.
Det skal bemærkes, at eksperimenter med elbiler kræver nogle særlige overvejelser. I denne protokol normaliseres elbiler semi-kvantitativt til antallet af tumorceller, der frigives inden for 24 timer. Denne tilgang afspejler målet om at identificere øget immunogenicitet, uanset om den skyldes ændringer i kvaliteten eller kvantiteten af frigivne elbiler. Derfor er reproducerbare in vivo-resultater afhængige af elbilernes konstante isolationseffekt. Med henblik herpå er det et afgørende skridt at sikre, at EL-pellets geninspenderes helt og hurtigt for at undgå udtørring.
Derudover skal elbiler kvantificeres og karakteriseres, f.eks. ved nanopartikelsporingsanalyse og western blot af kanonisk transmembran, luminal og mindst én negativ EV-markør20. Kvantificering og karakterisering af elbiler styrer for ukonstant isolering og adresserer kvantitative forskelle i elbiler eller EV-delmængder. Denne type EV-karakterisering udgør en del af de minimale oplysninger, der skal rapporteres i undersøgelser om ekstracellulære vesikler, ifølge International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) retningslinjer. Forskellige karakteriseringsmetoder er imidlertid lige legitime og bør vælges vedrørende lokal tilgængelighed og det enkelte forskningsspørgsmål. Navnlig udgør definition af dosering af et stof af interesse eller ioniserende bestråling et andet kritisk trin i protokollen, som kan kræve eksperimentel validering for at opnå et passende niveau af celledød.
Generelt skal potentiel forurening af isolerede elbiler med behandlingsstoffet, opløselige proteiner og lipoproteiner overvejes. En strategi i denne henseende består i at reproducere forsøget med komplementære EV-isolationsteknikker, som den samme type forurening20 ikke må kompromittere. Immunoaffinitet isolerer f.eks. elbiler med et lavere udbytte, men højere specificitet end rent nedbørsbaserede metoder og kan give en passende kontrol i denne henseende26. En alternativ tilgang er at sammenligne vildtypecelleafledte elbiler med isolationer fra genetisk manipulerede celler med en specifik deletion af gener, der er involveret i EV-biogenese, eller anvende stoffer, der reducerer emissionen af elbiler20.
Resultaterne fra denne protokol bør suppleres med en mere omfattende karakterisering af det EV-medierede immunrespons. Især klassificeringen af CD8 + T-celler i effektor- og effektorhukommelsesceller gennem CD4427 samt antigennaive og centrale hukommelsesceller gennem CD62L28 kan formidle dybere indsigt. Desuden kan analysen af T-hjælperceller, regulatoriske T-celler og NK-celler være af interesse. Til test af EV'ers antitumoreffekt kan mus blive udfordret med de tilsvarende kræftceller efter at have modtaget EV-immunisering eller behandlet med EV'er mod en forudbestemt kræft og derved tilpasse retningslinjerne for påvisning af immunogen celledød2,29 til dette cellefrie tumorderivat. Konklusionerne fra alle disse eksperimentelle opsætninger er imidlertid begrænset af, at kræftceller i en petriskål potentielt genererer funktionelt forskellige elbiler end kræftceller indlejret i et dynamisk tumormikromiljø30, der ofte undertrykker anti-cancer immunitet. Således kan vurdering af elbiler afledt af tumor / fibroblastkokulturer eller ex vivo tumorvæv bedre afspejle den faktiske situation. I et næste translationelt skridt mod klinisk virkelighed kan elbiler fra patientmateriale analyseres for immunogenicitet før og under behandlingen for at vurdere deres anvendelighed som biomarkører.
Da kræftafledte elbiler for nylig viste sig - under visse omstændigheder - at modulere immunsystemet, er rejsen med at udforske deres kliniske potentiale kun lige begyndt31. For en dybdegående analyse af de immunmekanismer, der er co-valgt af immunogene EV'er, omfatter nyttige værktøjer fluorescensmikroskopi, der visualiserer EV-optagelsen af specifikke celler, implementering af mus med genetiske mangler for specifikke immunveje og screeningsmetoder til molekylære ændringer i EV-indholdet. I sidste ende vil identifikation af immunogene tumorafledte elbiler med screeningsmetoder beskrevet heri muliggøre en bedre forståelse af de underliggende mekanismer bag EV-medieret immunitet og udgør derfor et afgørende skridt i retning af at udnytte deres potentiale mod kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 og Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (til H.P.), et Mechtild Harf Research Grant fra DKMS Foundation for Giving Life (til H.P.) en Young Investigator Award af Melanoma Research Alliance (til S.H.), et stipendium fra Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (til F.S.), en frøfond fra det tekniske universitet I München (til S.H.) og et forskningsstipendium fra Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, til S.H.). H. P. er støttet af EMBO Young Investigator Program.
FORFATTER BIDRAG:
F.S., H.P. og S.H. designede forskningen, analyserede og fortolkede resultaterne. F.S. og S.H. skrev manuskriptet. H.P. og S.H. styrede undersøgelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
