Summary
כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.
Abstract
מוות תאי אימונוגני של גידולים, הנגרם על ידי כימותרפיה או הקרנה, יכול לעורר תגובות תאי T ספציפיים לגידול על ידי שחרור דפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה וגרימת הייצור של סוג I אינטרפרון. אימונותרפיות, כולל עיכוב נקודת ביקורת, מסתמכות בעיקר על תאי T קיימים הספציפיים לגידול כדי לפתח אפקט טיפולי. לפיכך, גישות טיפוליות סינרגטיות המנצלות מוות תאי אימונוגני כחיסון אנטי-סרטני מהותי עשויות לשפר את יכולת התגובה שלהן. עם זאת, הספקטרום של גורמים אימונוגניים ששוחררו על ידי תאים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר מאופיין באופן חלקי, במיוחד לגבי שלפוחיות חוץ תאיות (EVs). רכבים חשמליים, חלקיקים מממברניים בקנה מידה ננומטרי הנפלטים כמעט מכל התאים, נחשבים כמקלים על תקשורת בין-תאית, ובסרטן, הוכחו כמתווכים בין-ראשוניים נגד אנטיגנים של גידולים. כדי להעריך את ההשפעה החיסונית של רכבים חשמליים שמקורם בגידולים בתנאים שונים, שיטות הסתגלות, מדרגיות ותקיפות מבוקשות. לכן, כאן מוצגת גישה קלה וחזקה יחסית להערכת האימונוגניות של רכבים חשמליים . הפרוטוקול מבוסס על ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי T טחול לאחר חיסון vivo של עכברים עם רכבים חשמליים, מבודד על ידי בדיקות מבוססות משקעים מתרביות תאים סרטניים תחת טיפול או מצב יציב. לדוגמה, עבודה זו מראה כי חשיפה oxaliplatin של B16-OVA מורין מלנומה תאים הביא לשחרור של רכבים חשמליים אימונוגניים שיכולים לתווך את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים תגובתי הגידול. לפיכך, הקרנה של כלי רכב חשמליים באמצעות חיסון vivo וציטומטריית זרימה מזהה תנאים שבהם כלי רכב חשמליים אימונוגניים יכולים לצאת. זיהוי תנאים של שחרור EV אימונוגני מספק תנאי הכרחי לבדיקת היעילות הטיפולית של רכבים חשמליים נגד סרטן ובחינת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים כדי לחשוף בסופו של דבר תובנות חדשות על תפקידם של כלי רכב חשמליים באימונולוגיה של סרטן.
Introduction
המערכת החיסונית ממלאת תפקיד מרכזי במאבק נגד סרטן, הן כאשר הוא מועלה על ידי עיכוב מחסום חיסוני והן על היעילות של טיפולים קונבנציונליים לסרטן. תאים סרטניים שנכנעים לטיפולים גנוטוקסיים כגון הסוכנים הכימותרפיים אוקסליפלטין ודוקסורוביצין, או טיפול קרינה מייננת יכולים לשחרר אנטיגנים ודפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) שעשויים ליזום תגובה חיסונית נוגדת גידולים הסתגלות1. ה- DAMPs הבולטים ביותר, בהקשר של מוות תאי אימונוגני, כוללים אותות find-me כגון ATP כימוטקטי, אותות eat-me כגון חשיפת calreticulin, המקדם את ספיגת תאי הגידול על ידי תאים המציגים אנטיגן, ואת שחרורו של HMGB1, המפעיל קולטני זיהוי דפוס, ובכך משפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים גידול2. יתר על כן, סוג I אינטרפרונים (IFN-I), המושרה באמצעות חומצות גרעין אימונוגניות שמקורן בגידול או גירויים אחרים, חשים על ידי תאים דנדריטיים, ומאפשרים להם ביעילות ראשונית תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול3,4. מבחינה קלינית, תאי CD8+ T פעילים ומתרבים החודרים לגידול מספקים גורם פרוגנוסטי עצמאי להישרדות ממושכת בחולי סרטן רבים. שוחרר מתאי T מופעלים כאלה, IFN-γ מתווך השפעות אנטי-פרוליפרטיביות ישירות על תאים סרטניים ומניע את הקיטוב Th1 ובידול תאי T ציטוטוקסיים, ובכך תורם לחיסון יעיל נגד סרטן5,6. Oxaliplatin הוא ממריץ מוות תאי אימונוגני בתום לב, מתווך תגובה חיסונית אדפטיבית כזו נגד סרטן7. עם זאת, שפע של אותות אימונוגניים ראשוניים שפורסמו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר להיחשף במלואו. למרות התקדמות משמעותית באימונותרפיה של סרטן, הרחבת היתרונות שלה לחלק גדול יותר של חולים נשאר אתגר. הבנה מפורטת יותר של אותות אימונוגניים היוזמים הפעלת תאי T עשויה להנחות את התפתחותם של טיפולים חדשניים.
קבוצה הטרוגנית של מבנים סגורים ממברנה, המכונה שלפוחיות חוץ תאיות (EVs), נראה לשמש התקני תקשורת בין תאיים. רכבים חשמליים הנפלטים כמעט מכל סוגי התאים נושאים חלבונים פונקציונליים, RNA, DNA ומולקולות אחרות לתא נמען או עשויים לשנות את מצבו התפקודי של התא רק על ידי קשירה לקולטנים על פני התא. המטען הפעיל ביולוגית שלהם משתנה באופן משמעותי לפי סוג ומצבו התפקודי של התא המפיק8. באימונולוגיה של סרטן, רכבים חשמליים המשתחררים מתאי הגידול נחשבו בעיקר כיריבים לאימונותרפיה מכיוון שהם בסופו של דבר מקדמים צמיחה פולשנית, נישות גרורתיות טרום-צורה9 ומדכאים את התגובה החיסונית10. לעומת זאת, מספר מחקרים הראו כי רכבים חשמליים יכולים להעביר אנטיגנים של גידולים לתאים דנדריטיים להצגה צולבת יעילה11,12. רכבים חשמליים עשויים לספק חומצות גרעין אימונוסטימולטוריות אם הם מגיחים תחת לחץ הנגרמת על ידי טיפול, מה שמקל על תגובה חיסונית נגד גידולים13,14. לאחרונה הוכח כי חישה של ליגנדים חיסוניים מולדים מסוג RNA ודנ"א במיקרו-סביבה של הגידול מווסתת את ההיענות למצור נקודת הביקורת באופן משמעותי 15,16,17. לפיכך, התפקיד האימונוגני של רכבים חשמליים ששוחררו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ טיפולי שונה צריך להיות מובהר עוד יותר. מכיוון שרכבים חשמליים מהווים תחום מחקר צעיר אך צומח, התקינה של השיטות עדיין נמשכת. לכן, שיתוף ידע חיוני כדי לשפר את רבייה המחקר על אינטראקציות בין כלי רכב חשמליים אימונולוגיה סרטן. לאור זאת, כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט להערכת ההשפעה האימונוגנית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול ב- vivo.
הערכה זו מתבצעת על ידי יצירת רכבים חשמליים שמקורם בגידול, חיסון עכברי נמענים עם רכבים חשמליים אלה, וניתוח תאי T טחול באמצעות ציטומטריית זרימה. דור EV מבוצע באופן אידיאלי על ידי זריעת תאי גידול מורין במדיום תרבית תאים ללא EV לרמה גבוהה של טוהר. תאים מטופלים עם גירוי סטרס תאי ספציפי, כגון כימותרפיה, כדי להשוות את ההשפעה של רכבים חשמליים הנגרמים על ידי טיפול נגד אימונוגניות בסיסית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול בהתאמה. בידוד של רכבים חשמליים עשוי להתבצע בהחלט על ידי טכניקות שונות שיש לבחור על פי תחולת vivo וזמינות מקומית. הפרוטוקול הבא מתאר בדיקה מבוססת משקעים עם ערכה מסחרית לטיהור EV. עכברים מחוסנים פעמיים עם הרכבים החשמליים האלה. 14 ימים לאחר הזריקה הראשונה, תאי T מופקים מהטחול ומנותחים לייצור IFN-γ באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך תגובה חיסונית מערכתית. עם זאת, הפוטנציאל של רכבים חשמליים שמקורם בגידול, המתעוררים תחת משטרים טיפוליים שונים, כדי לגרום לתגובות תאי T אנטי סרטניים מוערך בקלות יחסית, במהירות, ועם תוקף גבוה13. לכן, שיטה זו מתאימה להקרנה אימונולוגית של רכבים חשמליים שמקורם בתאים סרטניים בתנאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בתחילת הניסויים, עכברים היו לפחות 6 שבועות של גיל נשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. הפרוטוקול הנוכחי עומד בסטנדרטים האתיים המוסדיים ובתקנות המקומיות השוררות. מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הסוכנות הרגולטורית המקומית (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). הטיות אפשריות הקשורות למין לא נחקרו במחקרים אלה.
1. ייצור ובידוד של רכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול לאחר חשיפה לכימותרפיה
- תרבית מורין B16 תאי מלנומה המבטאים אובלבומין (B16-OVA) ב- DMEM (המכיל 4 מ"מ L-גלוטמין ו 4.5 גרם / L D-גלוקוז) בתוספת FCS (10% v / v), פניצילין (100 יחידות / מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 °C (37 °C ,עד התאים לגדול בהתמדה והם כ 90% קונפלציה.
הערה: בצע סעיף זה של הפרוטוקול לחלוטין בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע של תרבית התא. לניתוח של ישויות אחרות של סרטן, קווי תאים המבטאים אנטיגן חזק עדיפים להעריך תגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן, שכן הם מאפשרים רסטימולציה ספציפית של אנטיגן ex vivo . - כדי להכין את מדיה תרבית התאים הנדרשת עבור יצירת EV, לרוקן רכבים חשמליים שור בתוך FCS על ידי ultracentrifugation ב 100,000 x g עבור 24 שעות ב 4 °C (4 °F), ולאחר מכן להשליך את הכדור. לחלופין, בחר הכנה מסחרית נמוכה ברכבים חשמליים בעלי חיים מראש.
- לקצור תאי B16-OVA ולשטוף אותם פעמיים ב- PBS, ולאחר מכן זרע בריכוז של 400,000 תאים / מ"ל במדיה מדולדל EV.
הערה: התאם את ריכוז התא לדינמיקת הצמיחה של קו התא הנחקר כך שהתאים לא יגדלו יתר על המידה. - לטפל בתאי B16-OVA על ידי הוספת 30 מיקרוגרם של oxaliplatin לכל mL ודגור במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °F). השאר את תנאי הבקרה לא מטופלים. בשימוש הראשון של חומר גנוטוקסי, titrate את היעילות הציטוטוקסית הרצויה באמצעות בדיקות קיימא התא כגון הדרה כחולה טריפאן18.
הערה: בדיקה זו עשויה גם להעריך רכבים חשמליים שנוצרו בתרביות תאים המטופלים בחומרים אחרים המווסתים את מערכת החיסון או הקרנה מייננת מלבד כימותרפיה.
אזהרה: אוקסליפלטין גורם לעור וגירוי חמור בעיניים ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור ולגירוי נשימתי. אוקסליפלטין חשוד בגרימת סרטן. כאמצעי זהירות, יש להשתמש בציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי מגן, משקפי מגן, מסכות ובגדים נאותים, לפני השימוש החוזר. יש להימנע משאיפה ולשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול. הימנע שחרור לסביבה ולהיפטר oxaliplatin על פי התקנות הקיימות. השג מידע מפורט מגליון נתוני הבטיחות. - לאסוף תרבית תאים סופר-נרטיבית. צנטריפוגה תחילה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ), ולאחר מכן ב 2,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (60 °F), בכל פעם להשליך את הכדור. לבסוף, לסנן דרך קרום PVDF 220 ננומטר. השתמש צינור טרי עבור כל צעד כדי להסיר את כל פסולת התא.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את supernatant המכיל EV ב 4 °C (65 °F) ליום לפני חידוש הפרוטוקול. עם זאת, מומלץ מאוד לדבוק בלוח הזמנים המתואר עם טיהור מיידי של EV. - יש לערבב 1 מ"ל של סופר-נרטיב עם 0.5 מ"ל של ריאגנט בידוד אקסוזום ספציפי הזמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בצינור בצורת V של 1.5 מ"ל. ביסודיות פיפטה למעלה ולמטה או מערבולת כדי ליצור פתרון הומוגני. דגירה לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 60 דקות ב 4 °C (60 °F). בזהירות להשליך את supernatant. הסר את הטיפות הנותרות על ידי הקשה על צינור 1.5 מ"ל הפוך על מגבת נייר ועל ידי שאיפה דרך פיפטה עם קצה דק מבלי לגעת EV-גלולה בתחתית.
- הסר ביסודיות את כל הנוזלים כדי למנוע דילול בלתי מבוקר של כדור EV. כמו כן, לבצע משימות אלה במהירות כדי למנוע את הכדור להתייבש.
- Resuspend את הרכבים החשמליים ב PBS קר על ידי צנרת למעלה ולמטה מבלי לגרד את הכדור מקיר הצינור עם הקצה. עכשיו, להעביר את ההשעיה צעד אחר צעד מהצינור הראשון עד האחרון כדי לאגד את הרכבים החשמליים.
הערה: השתמש באמצעי אחסון של PBS השווה ל- 5 μL כפול מספר הצינורות. 5 μL של ההשעיה הסופית מכיל את EVs מבודד שוחרר מ 400,000 תאים תחת כימותרפיה או במצב יציב. - רצוי, להשתמש ברכבים חשמליים ישירות. אם זה לא אפשרי, לאחסן השעיות EV ב -80 °C (80 °F) בכלי סיליקון עד 28 ימים עד היישום.
הערה: הרכבים החשמליים המתוארים כאן ובמספר פרסומים אחרים אינם מאבדים את התפקוד הביולוגי שלהם בהתאמה כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עבור תקופה זו19. - לכמת ולאפיין מבודדי רכב חשמלי על פי הנחיות MISEV201820.
הערה: שיטות אפשריות לכימות כוללות ניתוח מעקב חלקיקים ננו-חלקיקים (NTA)21 וזיהוי חלבונים הקשורים לממברנה של EV22. גישות אפשריות לאפיון נוסף של רכבים חשמליים כוללות מיקרוסקופיה אלקטרונית23 ו-blot20 מערבית.
2. חיסון עכברים עם רכבים חשמליים
- תכנן את הניסוי in vivo עם עכברי C57BL/6 (או עכברים סינגניים אחרים המתאימים לקו התא הגידולי), כולל קבוצות טיפול המקבלות רכבים חשמליים שמקורם בתאים שטופלו, תאים לא מטופלים ו- PBS (רכב), בהתאמה.
הערה: רצוי, להשתמש בעכברים בגיל 6-8 שבועות כדי למנוע הזדקנות פיזיולוגית מהפחתת התגובה החיסונית24. - לערבב 5 μL של השעיית EV עם 55 μL PBS קר עבור כל עכבר בתוך קבוצת הטיפול המתאימה כדי לחסן אותו עם EVs מבודד מ 4.0 x 105 B16-OVA תאים.
הערה: כמות זו של רכבים חשמליים תואמת לכ-2 x 109 חלקיקים הנמדדים על-ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (נתונים אינם מוצגים). חלבון OVA מעורבב עם אדג'ובנט (למשל, LPS) יכול להיות מיושם כמו שליטה חיובית חיסון חזק.- מלא מזרקים (גודל מחט 26-30 G) עם 60 μL של רכבים חשמליים מדוללים או PBS, בהתאמה ולשים מיד על קרח.
הערה: בפרוטוקול, כמות הרכבים החשמליים המוזרקים מנורמלת למספר תאי הגידול משחררי הרכב החשמלי כדי לשקול באופן ניסיוני הן השפעות איכותיות והן השפעות כמותיות של אוקסליפלטין על תאי הגידול EV biogenesis. עבור חלק מהקוראים, נורמליזציה לריכוז מסוים של רכבים חשמליים המיוצרים עשויה להתאים טוב יותר למערך הניסיוני שלהם בהתאם לשאלה המדעית שלהם.
- מלא מזרקים (גודל מחט 26-30 G) עם 60 μL של רכבים חשמליים מדוללים או PBS, בהתאמה ולשים מיד על קרח.
- לחסן רכבים חשמליים או PBS תת עורית לתוך ההיבט המדיאלי של הירך של העכברים ולחזור על החיסון לאחר 7 ימים. 14 ימים לאחר הטיפול הראשון, להקריב עכברים, למשל, על ידי נקע צוואר הרחם כדי לנתח את התגובה החיסונית.
הערה: ניתן להשתמש בנתיבי הזרקה תת עוריים חלופיים, בהתאם לסטנדרטים המקומיים.
3. ניתוח ציטומטריה זרימה של תאי T טחול
- להכין ולקרר RPMI מלא (cRPMI), שכשהם RPMI-1640 עם FCS (10% v / v), פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), L-גלוטמין (2 מ"מ) ו- β-mercaptoethanol (50 מיקרומטר).
- חותכים את הטחול מחלל הבטן הפתוח. מועכים את הטחול עם מסננת תאים לחה של 100 מיקרומטר ובוכנה מפלסטיק של מזרק ושטפו את תאי הטחול לתוך צינור 50 מ"ל עם 5-10 מ"ל של cRPMI. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant.
הערה: שמור תאים על קרח במידת האפשר. כדי לנתח את התגובה החיסונית המקומית ולא הטחול, לכרות את בלוטות הלימפה הפופליטיות והמפשעתיות המנקזות, בהתאם לאותו פרוטוקול. במקרה זה, דלג על השלב הבא עבור תמוגה של אריתרוציטים. - כדי להסיר אריתרוציטים מהשעיית התא, resuspend את הכדור עם 2 מ"ל של מאגר תמוגה תאי דם אדומים (ראה טבלת חומרים) ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הפסק את התגובה על-ידי הוספת cRPMI. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant.
- עבור זריעה, resuspend גלולה התא ב cRPMI ולספור את התאים למקם משולשים של 200,000 תאים עם 200 μL cRPMI לתוך כל באר, באמצעות צלחת 96-well עם תחתית בצורת U. דגירה עבור 48 שעות ב 37 °C (50 °F).
הערה: כדי לטפל הספציפיות אנטיגן של תאי T מופעלים, להוסיף 1 מיקרוגרם / מ"ל מסיס אליבבומין (או אנטיגן גידול אחר המתאים לקו התא תחת חקירה) או לעזוב ללא גירוי נוסף, בהתאמה. הוספת אפיטופת הפפטיד הדומיננטית במערכת החיסון SIINFEKL, במקום אלילבומין באורך מלא, מאפשרת תקופת דגירה קצרה יותר. מלבד ציטומטריית זרימה, סרום העכברים ואת תרבית התא supernatant לאחר 48 שעות של דגירה ניתן לנתח עבור ציטוקינים שונים. - לאחר 48 שעות, כדי לשפר את הכתם התאי IFN-γ על ידי, בין היתר, חסימת הפרשת חלבונים בתיווך גולגי, להוסיף Brefeldin A (5 ng/mL), PMA (20 ng/mL) ו Ionomycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות התא. דגירה במשך 4 שעות ב 37 °C (50 °F).
- לפני הכתמת סמנים ביולוגיים על פני השטח, העבירו את הטחול ללוח של 96 בארות עם תחתית בצורת V ושטפו פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים, התואמים לציטומטר הזרימה הזמין באופן מקומי, המכוונים נגד סמנים ביולוגיים על פני השטח, CD3, CD8 ו- CD4 (ראה טבלת חומרים), מדולל 1:400, בתוספת צבע כדאיות לתיקון, מדולל 1:1,000 ב- PBS. Resuspend גלולה גלולה בתמיסת הכתמה ודגור במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), מוגן מפני אור.
- לקיבעון וחדירות של טחול, לשטוף פעמיים במאגר FACS (PBS בתוספת 3% v / v FCS), ולאחר מכן resuspend ב 100 μL של קיבעון / מאגר חדירות (ראה טבלת חומרים) לבאר. דגירה במשך 30 דקות ב 4 °C (65 °F), מוגן מפני אור.
- להכתמת Γ IFN-γ תאיים, יש לשטוף את הטחול במאגר קיבעון/פרמביליזציה ולחדש עם נוגדנים פלואורסצנטיים נגד γ IFN, מדוללים 1:200 במאגר. דגירה למשך שעה אחת לפחות (עד למקסימום של 12 שעות) בטמפרטורה של 4 °C (65 °F), מוגנת מפני אור.
- לפני מדידת הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה, לשטוף טחול פעמיים במאגר קיבעון / permeabilization ו resuspend במאגר FACS. נתח את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים בהתאם לאסטרטגיית ההגאים המוצגת באיור 2.
- ראשית, כדי לזהות תאים בודדים, כתם FSC-H נגד FSC-A. לאחר מכן, כדי לזהות תאי לימפה, כתם SSC נגד FSC-A. לאחר מכן, בחר תאי CD3+, CD4-, CD8+ חיים וקבע את קבוצת המשנה שלהם לייצור IFN-γ כדי לכמת את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים בטחול.
הערה: כלול כתם פלואורסצנטי-מינוס-אחד (FMO) עם כל הפלואורוכרום למעט הפלואורוכרום הממוקד נגד IFN-γ כבקרה טכנית שלילית.
- ראשית, כדי לזהות תאים בודדים, כתם FSC-H נגד FSC-A. לאחר מכן, כדי לזהות תאי לימפה, כתם SSC נגד FSC-A. לאחר מכן, בחר תאי CD3+, CD4-, CD8+ חיים וקבע את קבוצת המשנה שלהם לייצור IFN-γ כדי לכמת את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים בטחול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה נועד להקל על הערכה פשוטה וקלה לשחזור של האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בגידול. בזאת, עכברים מחוסנים עם רכבים חשמליים הנגזרים מתרביות הפריה חוץ גופית של תאים סרטניים המבטאים את המודל אנטיגן עוף ovalbumin (OVA). התגובה החיסונית הבאה מנותחת בתאי T טחול באמצעות ציטומטריית זרימה.
איור 1 מספק סקירה כללית של השלבים המעשיים של הפרוטוקול כולו. מאחר שהעבודה מתמקדת במוות תאי אימונוגני, הצגה צולבת וחסינות נגד גידולים הנגרמת על ידי EV, פרוטוקול זה מוגבל לתפקודם של תאי T ציטוטוקסיים CD8+ . כפי שמוצג באיור 2, התאים היו מגודרים כתאים בודדים, תת-קבוצה של לימפוציטים (לפי גודל וגרגריות), תאים בני קיימא (לא כולל סמן חיים/מת) ותאי CD3+ CD4- CD8+ CD8+ ציטוטוקסי T. הצטברות תאית של IFN-γ הוערך כסמן חלופי להפעלה. סמנים נוספים אפשריים לגבי בידול תא T ותשישות נדונים להלן.
בשיטה המתוארת כאן, עכברים חוסנו עם רכבים חשמליים שמקורם בתאי גידול מבטאי OVA בתרבית בתנאי לחץ יציבים (לא מטופלים) או גנוטוקסיים (שטופלו באוקסליפלטין). רק עכברים שהוזרקו עם רכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול בתנאי לחץ גנוטוקסיים גרמו להפעלה עוצמתית של תאי T ציטוטוקסיים טחול בבעלי חיים נמענים (איור 3A). הזרקת רכבים חשמליים שמקורם בגידולים בתנאים יציבים הביאה להפעלה מסוימת של תאי T, אך זה לא היה שונה באופן משמעותי מהפעלת תאי T בעכברים שהוזרקו לרכב PBS. נתונים אלה מראים כי תחת לחץ גנוטוקסי, תאים סרטניים יכולים לשחרר רכבים חשמליים אימונוגניים חזקים. הייצור של IFN-γ הוגדל במיוחד כאשר טחול של בעלי חיים שטופלו בגידול EV היו ex vivo מחדש עם מודל גידול אנטיגן OVA לפני הניתוח (איור 3B). נתונים אלה מצביעים על כך שרכבים חשמליים שמקורם בגידול יכולים לגרום לתגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן הגידול. מעניין, IFN-γ-ייצור - למרות במידה הרבה פחותה - מזוהה גם בהיעדר reimulation ספציפי אנטיגן. ייתכן, אנטיגנים אחרים הקשורים מלנומה, כגון אנטיגן ההבחנה TRP225, עשוי להיות ממוקד על ידי חלק כלשהו של תגובת תא T המושרה EV.
איור 1: סקירה פיקטוגרפית של הפרוטוקול. (א) הליך בידוד של רכבים חשמליים הנוצרים בתרביות תאים סרטניים הדומים לכימותרפיה. (ב) לוח זמנים לחיסון עכברים עם רכבים חשמליים. (C) פרוטוקול מכתים לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי T ציטוטוקסיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית זרימה של ציטומטריה לניתוח הפעלת תאי T ציטוטוקסית בטחול. המספרים מייצגים את אחוז מאוכלוסיית האב בהתאמה. FSC-A: אזור פיזור קדימה; FSC-H: גובה פיזור קדימה; SSC: פיזור הצידה; חי/ מת: סמן מוות תא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רכבים חשמליים שמקורם בתאי גידול תחת לחץ גנוטוקסי יכולים לגרום לתגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן בבעלי חיים נמענים. (A) עכברים חוסנו עם רכבים חשמליים שמקורם בתאי גידול בתרבית בתנאי לחץ יציבים (לא מטופלים) או גנוטוקסיים (שטופלו באוקסליפלטין). זריקות רכב (PBS) שימשו כבקרה שלילית. IFN-γ הייצור על ידי תאי T ציטוטוקסיים בטחול עם חיסון EV נקבע. עם זאת, השעיות תא הטחול היו מחדש עם אובלבומין ex vivo לפני הניתוח. (B) עכברים טופלו ברכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול בתנאי לחץ גנוטוקסיים כמתואר לעיל. הפעלת תא T הטחול נקבעה לאחר שחזור ex vivo או בנוכחות או היעדר אובלבומין. ברים מתארים את הממוצע לכל קבוצה ושפם השגיאה הסטנדרטית שלה. הניתוח החד-כיווני של מבחן השונות (ANOVA) עם מבחן הפוסט-מבחן Bonferroni שימש להשוואות סטטיסטיות מרובות של ערכת נתונים. רמת המשמעות נקבעה ב- P < 0.05, P < 0.01 ו- P < 0.001 והיא מסומנת כאן בכוכביות (*, **, ו- ***). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק הערכה אימונולוגית של vivo של כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מלנומה תחת לחץ הנגרמת על ידי כימותרפיה תוך הסתגלות לרכבים חשמליים הנפלטים מסרטן שונים תחת טיפולים שונים. חיסון עכברים עם רכבים חשמליים המופקים מתאי B16-OVA שטופלו באוקסליפלטין, למשל, מרחיב את תאי CD8+ T המייצרים IFN-γ בטחול, אשר מגורים עוד יותר על ידי דגירה ex vivo עם אובלבומין, המציין תגובה חיסונית ספציפית לגידול. לכן, זיהוי של רכבים חשמליים אימונוגניים על ידי סינון באמצעות פרוטוקול זה מאפשר הבנה מקיפה יותר של טיפולים קונבנציונליים לסרטן ומאפשר חקירה ממוקדת על תפקידם של כלי רכב חשמליים באימונולוגיה של סרטן.
שימו לב, ניסויים עם רכבים חשמליים דורשים כמה שיקולים מיוחדים. בפרוטוקול זה, רכבים חשמליים מנורמלים באופן חצי כמותי למספר תאי הגידול המשתחררים בתוך 24 שעות. גישה זו משקפת את המטרה לזהות אימונוגניות משופרת, בין אם היא נובעת משינויים באיכות או בכמות של כלי רכב חשמליים משוחררים. לכן, ניתן לשחזור בתוצאות vivo להסתמך על יעילות הבידוד המתמיד של כלי רכב חשמליים. לשם כך, להבטיח כי כדורי EV הם resuspended לחלוטין ומיד כדי למנוע ייבוש הוא צעד קריטי.
בנוסף, יש לכמת ולאפיין רכבים חשמליים, למשל, על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים וכתם מערבי של טרנסממברן קנוני, זוהר, ולפחות סמן EV שלילי אחד20. כימות ואפיון פקדי רכבים חשמליים לבידוד לא עקבי ומטפל בהבדלים כמותיים בערכות משנה של רכבים חשמליים או EV. סוג זה של אפיון EV מהווה חלק מהמידע המינימלי שיש לדווח עליו במחקרים על שלפוחיות חוץ-תאיות, על פי הנחיות האגודה הבינלאומית לשללים חוץ-תאיים (ISEV). עם זאת, שיטות אפיון שונות הן לגיטימיות באותה מידה ויש לבחור אותן לגבי הזמינות המקומית ושאלת המחקר האישית. ראוי לציין, הגדרת המינון של חומר מעניין או הקרנה מייננת מהווה צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול, אשר עשוי לדרוש אימות ניסיוני כדי להשיג רמה נאותה של מוות תאי.
באופן כללי, יש לקחת בחשבון זיהום פוטנציאלי של רכבים חשמליים מבודדים עם חומר הטיפול, חלבונים מסיסים וליפופרוטאינים. אסטרטגיה אחת בהקשר זה מורכבת בשחזור הניסוי עם טכניקות בידוד EV משלימות כי אותו סוג של זיהום20 לא יכול להתפשר. Immunoaffinity, למשל, מבודדת רכבים חשמליים עם תשואה נמוכה יותר אך ספציפיות גבוהה יותר מאשר שיטות מבוססות משקעים גרידא ועשויה לספק שליטה מתאימה בעניין זה26. גישה חלופית היא להשוות בין רכבים חשמליים שמקורם בתאים פראיים לבין בידודים מתאים מהונדסים גנטית עם מחיקה ספציפית של גנים המעורבים בביוגנזה של EV או לפרוס חומרים המפחיתים את פליטת כלי הרכב החשמליים20.
התוצאות המתקבלות מפרוטוקול זה צריכות להיות משלימות על ידי אפיון מקיף יותר של התגובה החיסונית בתיווך EV. במיוחד הסיווג של תאי CD8+ T לתאי זיכרון מפעילים ומשפיעים, באמצעות CD4427, כמו גם תאי זיכרון אנטיגן-נאיביים ומרכזיים, באמצעות CD62L28, עשויים להעביר תובנה עמוקה יותר. יתר על כן, הניתוח של תאי עוזר T, תאי T תקינים ותאי NK עשוי להיות מעניין. לבדיקת היעילות האנטי-סרטנית של רכבים חשמליים, עכברים עשויים להיות מאותגרים עם התאים הסרטניים המתאימים לאחר קבלת חיסון EV או מטופלים עם EVs נגד סרטן מראש, ובכך להתאים את ההנחיות לגילוי מוות תאי אימונוגני 2,29 לגידול ללא תאים זה נגזר. עם זאת, מסקנות מכל ההתקנות הניסיוניות הללו מוגבלות על ידי העובדה שתאים סרטניים בצלחת פטרי עשויים לייצר רכבים חשמליים שונים מבחינה תפקודית מאשר תאים סרטניים המוטמעים במיקרו-סביבה דינמית של גידול30 שלעתים קרובות מדכאת חסינות נגד סרטן. לכן, הערכת רכבים חשמליים הנגזרים מגידול/פיברובלסט cocultures או רקמת גידול ex vivo עשוי לשקף טוב יותר את המצב בפועל. בצעד התרגומי הבא לקראת המציאות הקלינית, ניתן לנתח רכבים חשמליים מחומר המטופל לאימונוגניות לפני ובמהלך הטיפול כדי להעריך את השימושיות שלהם כסמנים ביולוגיים.
כפי שרכבים חשמליים שמקורם בסרטן נמצאו לאחרונה - בנסיבות מסוימות - לווסת את המערכת החיסונית, המסע של חקר הפוטנציאל הקליני שלהם רק החל31. לניתוח מעמיק של המנגנונים החיסוניים שנבחרו במשותף על ידי רכבים חשמליים אימונוגניים, כלים שימושיים כוללים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המדמה את ספיגת הרכב החשמלי על ידי תאים ספציפיים, פריסת עכברים עם ליקויים גנטיים למסלולים חיסוניים ספציפיים, ושיטות סינון לשינויים מולקולריים בתוכן הרכב החשמלי. בסופו של דבר, זיהוי רכבים חשמליים שמקורם בגידולים אימונוגניים, בשיטות סינון המתוארות במסמך זה, יאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים מאחורי חסינות בתיווך EV ולכן מהווה צעד מכריע לרתום את הפוטנציאל שלהם נגד סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ו Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (ל- H.P.), מענק מחקר Harf Mechtild מקרן DKMS למתן חיים (ל- H.P.) פרס חוקר צעיר על ידי ברית המחקר מלנומה (ל- S.H.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), קרן זרעים של האוניברסיטה הטכנית מינכן (ל- S.H.) ומענק מחקר על ידי קרן וילהלם סנדר (2021.041.1, ל- S.H.). H.P. נתמך על ידי תוכנית החוקרים הצעירים של EMBO.
תרומות מחבר:
F.S., H.P., ו S.H. עיצבו את המחקר, ניתחו ופירשו את התוצאות. פ.ס. וס.ה. כתבו את כתב היד. ה.פ. ו-ס.ה. הנחו את המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
