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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Formulação e modulação acústica de nanogotículas de perfluorocarbono opticamente vaporizadas

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

As nanogotículas de perfluorocarbono ativadas opticamente mostram-se promissoras em aplicações de imagem fora do sistema vascular. Este artigo demonstrará como sintetizar essas partículas, cruzar fantasmas de poliacrilamida e modular as gotículas acusticamente para melhorar seu sinal.

Abstract

As microbolhas são o agente de contraste de imagem mais comumente usado no ultrassom. No entanto, devido ao seu tamanho, eles são limitados a compartimentos vasculares. Essas microbolhas podem ser condensadas ou formuladas como nanogotículas de perfluorocarbono (PFCnDs) que são pequenas o suficiente para extravasar e, em seguida, serem acionadas acusticamente no local alvo. Essas nanopartículas podem ser ainda mais aprimoradas pela inclusão de um absorvedor óptico, como corante orgânico infravermelho próximo ou nanopartículas (por exemplo, nanopartículas de sulfeto de cobre ou nanopartículas/nanobastões de ouro). PFCnDs opticamente marcados podem ser vaporizados através de irradiação a laser em um processo conhecido como vaporização óptica de gotículas (ODV). Este processo de ativação permite o uso de núcleos de perfluorocarbono de alto ponto de ebulição, que não podem ser vaporizados acusticamente abaixo do limiar máximo de índice mecânico para diagnóstico por imagem. Núcleos de ponto de ebulição mais altos resultam em gotículas que se recondensarão após a vaporização, resultando em PFCnDs "piscando" que produzem brevemente contraste após a vaporização antes de condensar de volta à forma de nanogotículas. Esse processo pode ser repetido para produzir contraste sob demanda, permitindo a imagem livre de fundo, multiplexação, super-resolução e aprimoramento de contraste através de modulação óptica e acústica. Este artigo demonstrará como sintetizar PFCnDs de casca lipídica opticamente desencadeáveis utilizando sonicação de sonda, criar simuladores de poliacrilamida para caracterizar as nanogotículas e modular acusticamente os PFCnDs após ODV para melhorar o contraste.

Introduction

As microbolhas são o agente de contraste ultrassônico mais onipresente devido à sua biocompatibilidade e excelente ecogenicidade em comparação com os tecidos moles. Isso os torna ferramentas valiosas para visualizar o fluxo sanguíneo, a delimitação de órgãos e outras aplicações1. No entanto, seu tamanho (1-10 μm), o que os torna excepcionais para exames de imagem com base em sua frequência ressonante, restringe suas aplicações à vasculatura2.

Essa limitação levou ao desenvolvimento de PFCnDs, que são nanoemulsões compostas por um surfactante envolto em torno de um núcleo líquido de perfluorocarbono. Essas nanopartículas podem ser sintetizadas em tamanhos tão pequenos quanto 200 nm e são projetadas para tirar proveito da vasculatura ou poros "com vazamento" e fenestrações abertas encontradas na vasculatura tumoral. Embora essas rupturas sejam dependentes do tumor, essa permeabilidade permite o extravasamento de nanopartículas de ~200 nm - 1,2 μm, dependendo do tumor 3,4. Em sua forma inicial, essas partículas produzem pouco ou nenhum contraste de ultrassom. Após a vaporização - induzida acusticamente ou opticamente - a fase central muda de líquido para gás, induzindo um aumento de duas vezes e meia a cinco vezes no diâmetro 5,6,7 e gerando contraste fotoacústico e ultrassonográfico. Embora a vaporização acústica seja o método de ativação mais comum, essa abordagem cria artefatos acústicos que limitam a imagem da vaporização. Além disso, a maioria dos perfluorocarbonetos requer ultrassom focalizado com índice mecânico além do limiar de segurança para vaporizar8. Isso levou ao desenvolvimento de PFCnDs de menor ponto de ebulição, que podem ser sintetizados pela condensação de microbolhas em nanogotículas9. No entanto, essas gotículas são mais voláteis e sujeitas à vaporização espontânea10.

A vaporização óptica de gotículas (ODV), por outro lado, requer a adição de um gatilho óptico como nanopartículas 11,12,13 ou corante6,14,15 e pode vaporizar perfluorocarbonos de maior ponto de ebulição usando fluências dentro do limite de segurança ANSI 11. Os PFCnDs sintetizados com núcleos de ponto de ebulição mais altos são mais estáveis e se recondensam após a vaporização, permitindo imagens livres de fundo16, multiplexação 17 e super-resolução18. Uma das principais limitações dessas técnicas é o fato de que os PFCnDs de alto ponto de ebulição são ecogênicos após a vaporização por apenas um curto período de tempo, na escala de milissegundos19, e são relativamente fracos. Embora esse problema possa ser mitigado por meio de vaporizações repetidas e média, a detecção e a separação do sinal de gotículas continuam sendo um desafio.

Inspirando-se na inversão do pulso, a duração e o contraste podem ser potencializados modificando a fase do pulso de ultrassonografia19. Ao iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de rarefação (n-pulso), tanto a duração quanto o contraste dos PFCnDs vaporizados aumentam. Em contraste, iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de compressão (pulso-p), resulta em contraste reduzido e menor duração. Este artigo descreverá como sintetizar nanogotículas de perfluorocarbono opticamente acionáveis, simuladores de poliacrilamida comumente usados em imagens e demonstrar o aprimoramento do contraste e a longevidade do sinal aprimorado por meio da modulação acústica.

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Protocol

1. Formulação de nanogotículas de perfluorocarbono

  1. Enxaguar um balão de fundo redondo de 10 ml com clorofórmio e lavar uma seringa de vidro à prova de gás de 10 μL e 1 ml com clorofórmio, aspirando repetidamente o volume total da seringa e expulsando-a por um total de três vezes.
    CUIDADO: O clorofórmio é volátil e pode ser tóxico se inalado. Todo o trabalho com este solvente deve ser realizado em um exaustor.
  2. Com as seringas, adicionar 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/mL), 6,3 μL de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/mL) e 1 mL de IR 1048 (1 mg/mL em clorofórmio) no frasco de fundo redondo. Lembre-se de limpar as seringas entre lipídios/corante para evitar a contaminação do estoque.
    NOTA: Os corantes infravermelhos são sensíveis à luz, e o trabalho deve ser feito em condições fracas ou os frascos devem ser cobertos com papel alumínio.
  3. Remova o solvente utilizando um evaporador rotativo. Certifique-se de que o vácuo seja ajustado lentamente para 332 mbar para evitar colisões. Após 5 min, reduza a pressão para 42 mbar para remover qualquer água que possa ter entrado na solução.
    NOTA: O bolo lipídico pode ser conservado durante a noite num balão de fundo redondo coberto com parafilme a 4 °C.
  4. Suspender o bolo lipídico em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sonicate ou vórtice à temperatura ambiente por 5 min ou até que todo o bolo lipídico tenha sido suspenso e dissolvido na solução. Sonicate por mais 2 minutos para homogeneizar a solução.
  5. Transfira a solução para um frasco para injetáveis de vidro de 7 ml e coloque o frasco para injetáveis num prato de vidro cheio de gelo para permitir que a solução arrefeça durante 5 minutos antes de adicionar 50 μL de perfluorohexano utilizando uma seringa de vidro estanque a gás. Lembre-se de enxaguar a seringa com perfluorohexano antes de a dispensar no frasco para injetáveis.
  6. Coloque o frasco para injetáveis de vidro que contém os lípidos e o banho de gelo no invólucro do sonicador da sonda e submerja a ponta da sonda abaixo do miniscus. Certifique-se de que os lados da sonda sonicator não tocam o lábio do frasco para injetáveis de vidro.
  7. Sonda sonicate a mistura com as seguintes configurações: Amplitude 1, Tempo de processo: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Em seguida, sonicate nas seguintes configurações: Amplitude: 50, Tempo de processo: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Transfira a solução de nanogotículas para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga a 300 x g por 3 min para separar as gotículas maiores (>1 μm) das gotículas menores.
  9. Descarte o pellet e transfira o sobrenadante para outro tubo de centrífuga de 1,5 mL. Lavar o sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 5 min para colocar todas as gotículas em solução. Ressuscite os PFCnDs em 1 mL de PBS pipetando a pelota para cima e para baixo e, em seguida, sonicate em um sonicator de banho por 1 min.
  10. Meça o tamanho das gotículas usando o espalhamento dinâmico de luz (DLS). Diluir o estoque de PFCnDs em 100 vezes (10 μL de estoque de PFCnD em 990 μL de PBS) e banho sonicate para dispersar os PFCnDs antes de medir. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1.
  11. Determine a concentração dos PFCnDs utilizando o analisador de rastreamento de nanopartículas (consulte Tabela de Materiais). Diluir os PFCnDs em 100-1000 vezes para garantir a medição precisa da concentração. O protocolo normalmente produz gotículas em uma concentração na ordem de 10a 10 partículas/mL.
  12. Prepare 10 mL de gel de acoplamento de ultrassom em um tubo de centrífuga de 50 mL e adicione 1% (v/v) ou 100 μL de PFCnDs para fazer a solução de ~108 partículas/mL. Vórtice a solução para misturar. Centrifugar a mistura a 4000 x g durante 3 minutos para remover as bolhas.

2. Preparação fantasma de poliacrilamida

  1. Desgaseifique a água enchendo um balão de vácuo de 500 ml com 400 ml de água desionizada, sele com uma rolha de borracha e ligue o balão à linha de vácuo. Abra a linha de vácuo e submerja o fundo do balão no sonicador de banho. Sonicate por 5 min ou até que nenhuma formação de bolha de gás seja visível.
  2. Preparar solução de persulfato de amónio (APS) a 10% dissolvendo 500 mg em 5 ml de água desgaseificada. Agite suavemente a solução se o persulfato de amónio não se dissolver totalmente.
  3. Em um copo de 400 mL com uma barra de agitação em uma placa de agitação, adicione 150 mL de água desgaseificada e 50 mL de solução de acrilamida-bisacrilamida a 40% (p/v) para formar 200 mL de solução de acrilamida-bisacrilamida a 10%. Mexa a mistura a 200 rpm para permitir a mistura adequada sem introduzir bolhas.
    CUIDADO: A acrilamida é um carcinógeno, e todo o trabalho deve ser feito em um exaustor com luvas, especialmente se trabalhar com acrilamida em forma de pó.
  4. Pesar 400 mg de sílica e adicioná-la à solução de acrilamida-bisacrilamida a 10% a partir do passo 2.3 para formar uma solução a 0,2 % (p/v) de sílica e acrilamida.
    CUIDADO: A sílica quando inalada pode ser cancerígena. Todo o trabalho, incluindo a pesagem, deve ser realizado em um exaustor.
  5. Prepare um molde quadrado de 58 mm x 58 mm x 78 mm com uma inclusão cilíndrica, cortando as pontas de uma pipeta de transferência de plástico e apoiando-a no molde com fita adesiva de laboratório. Consulte a Figura 2.
  6. Adicionar 2 ml de solução APS a 10 % ao copo para obter uma concentração final de APS a 0,1% e adicionar 250 μL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) à solução fantasma. Deixe a solução mexer brevemente (menos de um min).
  7. Despeje rapidamente a solução no molde, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. A solução deve polimerizar dentro de 10 min. Remova o fantasma passando a extremidade plana de uma espátula de laboratório ao redor da borda do molde e invertendo o molde.
    NOTA: Esses simuladores podem ser reutilizados várias vezes e devem ser submersos em água e armazenados a 4 ° C.

3. Imagem de nanogotículas de perfluorocarbono

  1. Ligue e aqueça o sistema de laser pulsado por ~20 minutos seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que o feixe de fibra óptica esteja conectado corretamente à saída do laser e que as duas pernas estejam adequadamente colocadas dentro do suporte do feixe de fibra.
  2. Ligue o sistema de imagem de ultrassom, conecte o transdutor de imagem de matriz (L11-4v) ao sistema e fixe o transdutor dentro do suporte para alinhar seu plano de imagem com a seção transversal do laser.
  3. Defina a frequência de repetição de pulso do sistema a laser para 10Hz e coloque um medidor de potência no final do feixe de fibras para medir a energia. Ajuste o atraso do interruptor q até que a fluência estimada seja de 70 mJ/cm2.
    CUIDADO: Óculos apropriados devem ser usados ao disparar o laser e as cortinas de laser devem envolver o espaço.
  4. Encha um dos canais no simulador de poliacrilamida com a mistura de gel de ultrassom/PFCnD usando uma seringa de ponta deslizante de plástico de 1 mL. Cubra liberalmente a parte superior do canal com gel de ultrassom e remova todas as bolhas com uma seringa de ponta deslizante de plástico de 1 mL. Coloque o fantasma de poliacrilamida sob o transdutor e o feixe de fibras, conforme mostrado na Figura 3.
  5. Use a plataforma de imagem combinada de ultrassom e elasticidade a laser (CLUE) baseada no software20 para visualizar PFCnD sincronizado com ativação óptica. Altere os parâmetros gerais definidos pelo usuário na estrutura Param para geração de imagens: defina a profundidade de início/fim para 0/40mm, a frequência central para 6,9MHz e o nome do transdutor para 'L11-4v'.
  6. Defina um novo RunCase e projete uma sequência de módulos para ativação/recondensação óptica repetida e imagens de US de PFHnDs. Isso é feito listando módulos predefinidos, como imagem ultrarrápida (mUF), laser externo (mExtLaser) e ocioso (mIdle).
    1. Repita o conjunto de sequências mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF duas vezes para adquirir dados de imagem n-pulse e p-pulse.
      NOTA: O primeiro módulo mExtLaser em cada sequência é definido como um laser simulado definindo ExtLaser.Enable como 0 e o 'mIdle' é incluído para minimizar o tempo entre as imagens de fundo dos EUA e as imagens dos EUA de pulso n/p após a ativação do laser.
  7. Defina os parâmetros do módulo para cada módulo colocado na sequência de módulos do caso de execução atual. Acesse cada parâmetro de módulo por índice correspondente à sua ordem na sequência de módulos. Os módulos executarão operações predefinidas com os parâmetros do módulo definidos pelo usuário aqui.
    1. Defina ExtLaser.QSdelay em módulos de laser externos para o valor de atraso do interruptor Q do laser ajustado na etapa 3.3, em microssegundos. Este módulo aguarda a saída do acionamento da lanterna do sistema a laser e gera o gatilho Q-switch após o atraso especificado no QSdelay.
    2. No módulo de imagem ultrarrápido, defina Resource.numFrame como 100, defina SeqControl.PRI como 200 (μs) e defina TW.polarity como 1 para pulso P e -1 para pulso N (consulte a Figura 4 para a forma de pulso correspondente). Este módulo transmitirá onda plana ultrarrápida de 0 graus com tipo de pulso especificado em TW.polarity.
      1. Adquira uma janela de imagem de abertura total de 38,8 mm de largura para o número de quadros em Resource.numFrame, intervalo de repetição de pulso de SeqControl.PRI e, em seguida, salve os dados para processamento off-line.
    3. Defina SeqControl.lastPRI_Module no módulo ocioso para o período de tempo entre pulsos de laser (100 ms) subtraídos pelo atraso do interruptor Q, tempo de aquisição de dados de imagem (20 ms) e uma margem de 20 μs para o sinal viajar. Este módulo mantém o sistema sob o estado de "nenhuma operação" pelo tempo em SeqControl.lastPRI_Module para preencher a lacuna de tempo entre o final da aquisição de dados de imagem e a próxima excitação de pulso de laser.

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Representative Results

A formulação bem-sucedida e a separação centrífuga dos PFCnDs devem produzir gotículas em torno do tamanho de 200-300 nm de diâmetro (Figura 1A). Gotículas inadequadamente separadas podem mostrar pequenos picos em torno de 1 μm. Essas soluções podem ser ainda mais sonicadas por banho para quebrar as gotículas maiores. O tamanho das gotículas aumentará ao longo do tempo devido à coalescência e/ou difusão em um processo conhecido como amadurecimento de Ostwald21,22 (Figura 1B).

A modulação acústica das gotículas através da manipulação do pulso de imagem melhorou o contraste dos PFCnDs vaporizados. Isso foi demonstrado em imagens de PFCnD reconstruídas subtraindo quadros adjacentes das imagens formadas por feixe, de modo que apenas o sinal retornado do PFCnD vaporizado seja visível e o sinal de fundo estacionário seja suprimido. O contraste é quantificado pela razão entre os sinais médios da área de inclusão circular e o sinal de fundo médio sobre o sinal de fundo médio. O sinal de fundo é definido pelos sinais de dois ROIs retangulares do fundo que estão na mesma profundidade e área equivalente que as inclusões. O contraste da inclusão para o pulso N é aproximadamente 3,2 vezes maior (ou seja, 220% de melhora) do que o pulso P (Figura 5).

O pulso de imagem inverso também aumentou a longevidade do sinal da vaporização do PFCnD. Isso foi quantificado por meio do limiar dos pixels na região de inclusão circular que excede o sinal de fundo. A porcentagem de pixels na inclusão que estava acima do limiar foi definida como a área hiperecoica (%). Para examinar o comportamento hiperecogênico dos PFCnDs ao longo do tempo, a área hiperecoica é calculada para cada quadro e normalizada pela área hiperecoica do primeiro quadro e, em seguida, ajustada a um modelo de decaimento exponencial. Essa função foi utilizada para determinar o tempo de decaimento característico, definido como o período de tempo necessário para que a área hiperecoica após a ativação do PFCnD decaia para apenas 10% da área inicial (Figura 6a). O tempo de decaimento característico da área hiperecoica normalizada é até 3,5 vezes maior na imagem de pulso N em comparação com o pulso P. Quadros de imagem diferenciais representativos de modo B no tempo para cada imagem de pulso N e pulso P são mostrados na Figura 6b.

Figure 1
Figura 1: Medidas de tamanho DLS de PFCnDs e estabilidade. (A) A distribuição de intensidade de tamanho das gotículas em média a partir de três medidas de gotículas após a síntese (PDI média: 0,132± 0,016; média Z-média: 259,3 ± 0,7 nm). (B) A distribuição da intensidade de tamanho das gotículas foi calculada em média a partir de três medidas realizadas 24 horas após a síntese (PDI média: 0,252± 0,061; média Z-média: 322,5 ± 4,5 nm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem e esquema do molde de poliacrilamida. (A) Imagem do molde feito de fita de laboratório e do recipiente de plástico. (B) Esquema com medidas do fantasma de poliacrilamida após remoção do molde. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Um esquema da entrega de pulso de laser e imagem de ultrassom . (A) Os componentes do conjunto são rotulados e o alinhamento do feixe de laser / plano de imagem de ultrassom em relação à posição de inclusão é ilustrado. (B) Uma imagem mostrando a configuração real. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Pulso de ultrassonografia simulado. As formas de onda são simuladas por software de sistema de imagem de ultrassom, amostrado por 250 MHz. A forma de onda do pulso P e do pulso N são geradas com a mesma frequência central e largura de pulso, mas têm 180° de diferença de fase. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Medição de contraste. Valor médio de contraste da área de inclusão para N-pulso e P-pulso, barras de erro representam desvio padrão (n=3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Curva de decaimento característica da área hiperecoica e magos diferenciais representativos do modo B . (A) Área hiperecoica normalizada induzida pela ativação do PFCnD ao longo do tempo para imagens de pulso N e pulso P na mesma seção transversal. A linha pontilhada indica 10% da área hiperecoica inicial. O momento em que o gráfico ajustado se cruza com a linha pontilhada representa o tempo de decaimento característico. (B) As imagens mostram uma janela de ROI cortada centrada na inclusão, plotada em uma escala de dB com uma faixa dinâmica de 35. A linha superior mostra o comportamento de recondensação representado pelo pulso P e a linha inferior mostra o pulso N. A linha tracejada de cor amarela indica a área de inclusão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Volume total de Phantom (mL) 50 100 250 500
DI água (mL) 37.5 74.9 187.4 375
Solução de PA a 40% (ml) 12.5 25.1 62.6 125
Sílica (mg) 100 200 500 1000
Solução APS a 10% (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabela 1: Resumo dos reagentes e quantidades para a reticulação fantasma de poliacrilamida com base no volume do molde. Esta tabela fornece um resumo conciso dos reagentes utilizados e das quantidades com base em vários volumes de moldes comuns.

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Discussion

A sonicação da sonda é um método relativamente simples e fácil de aprender para fabricar PFCnDs. Existem alguns passos em que o cuidado deve ser tomado. Ao manusear clorofórmio, é imperativo que uma pipeta de deslocamento positivo ou seringas de vidro seja usada, pois é volátil e "vazará" das pipetas de deslocamento de ar padrão. Além disso, se estiver usando um deslocamento positivo, certifique-se de que uma ponta apropriada seja usada, pois o clorofórmio dissolverá a maioria das pontas plásticas, o que pode introduzir contaminantes na solução. Uma pipeta de deslocamento positivo ou seringa de vidro também é recomendada para o perfluorohexano, pois é volátil e mais densa que a água. Normalmente, os efeitos individuais de volatilidade e alta densidade podem ser reduzidos pela pré-umectação em pipetas de deslocamento de ar e usando uma escala para ajustar o volume definido na pipeta, respectivamente. Mas no caso do perfluorohexano, que possui ambas as propriedades, a volatilidade dificultará a obtenção de medições precisas de peso, tornando uma pipeta de deslocamento positivo / seringa de vidro a opção mais viável.

Antes de sondar a solução, é importante incubar a solução lipídica e perfluorocarboneta em um banho de gelo para permitir que ela esfrie para evitar a ebulição do perfluorocarbono durante a sonicação. Esta etapa será especialmente importante para o perfluorocarbono de baixa ebulição, como o perfluoropentano. Além disso, deve-se tomar cuidado ao sondar a solução. A ponta da sonda de sonicação deve estar submersa, mas não deve fazer contato com o fundo ou os lados do frasco para injetáveis de vidro, pois pode danificar a ponta e quebrar o frasco, esvaziando a solução lipídica no banho de gelo.

O protocolo de fabricação de PFCnD pode ser adaptado de algumas maneiras menores. Se um evaporador rotativo não estiver disponível na etapa 1.3, a solução pode ser seca com um fluxo constante de gás nitrogênio ou ser colocada em uma câmara de vácuo durante a noite para formar o bolo lipídico. Em relação aos lipídios, esta formulação utiliza uma proporção de 9:1 de DSPE-PEG:DSPC em comparação com a relação padrão de 1:9 de DSPE-PEG:DSPC, pois resulta em gotículas menores e mais estáveisde tamanho 23. Esta formulação pode ser adaptada para permitir a conjugação superficial substituindo uma pequena fração (~2 mol %) do DSPE-PEG por um DSPE-PEG funcionalizado com a metade desejada (por exemplo, biotina, tiol, amina, etc.).

Em geral, os sonicadores de sonda estão comercialmente disponíveis, relativamente simples de usar e podem ser facilmente adaptados a outros perfluorocarbonetos de ponto de ebulição mais alto e formulações de surfactantes, mas não podem ser usados para fazer gotículas com núcleos de perfluorocarbono que são gasosos à temperatura ambiente sem modificações significativas. Uma dessas modificações é a utilização de sonicação de sonda para criar microbolhas e, em seguida, aplicar pressão e reduzir a temperatura para condensar as microbolhas em gotículas24. Embora este método seja uma maneira inteligente de gerar gotículas acusticamente vaporizáveis, é difícil encapsular corante suficiente dentro das microbolhas para garantir ODV após a condensação. Uma abordagem alternativa é conjugar o corante (por exemplo, Cy7.5) com os lipídios e formar microbolhas que podem ser condensadas em PFCnDs de baixo ponto de ebulição25 capazes de ODV.

A sonicação da sonda também produz uma alta concentração de nanogotículas (~10 10 gotículas / mL) em um período relativamente curto de tempo. No entanto, essa técnica resulta em uma distribuição de tamanho grande que reduzirá a quantidade de nanogotículas que se extravasarão. Embora isso possa ser amenizado por meio de filtragem centrífuga ou filtros de seringa para remover gotículas maiores, os PFCnDs resultantes exibirão maior polidispersão em comparação com gotículas sintetizadas usando microfluídica ou filtradas por extrusão26. Outra desvantagem da sonicação da sonda é que a ponta da sonda de sonicação inevitavelmente ficará esburacada da cavitação durante a sonicação e precisará ser substituída periodicamente.

Uma abordagem alternativa para a criação de gotículas utiliza dispositivos microfluídicos que podem ser usados para adaptar gotículas a um tamanho específico com um baixo índice de polidispersão (PDI). No entanto, esses dispositivos produzem gotículas a uma taxa relativamente lenta (~104-10 6 gotículas/s)26 e, embora tenha havido vários desenvolvimentos, como emulsificação de etapas 27, fluxo de ponta em dispositivos de foco de fluxo28,29 e utilização do efeito ouzo com um micromisturadorde espinha de arenque escalonado30 - a geração de gotículas nanométricas ainda continua a ser um desafio. Além disso, essa técnica não está disponível comercialmente, e a fabricação desses dispositivos requer conhecimentos especializados.

Outros métodos que estão comercialmente disponíveis incluem extrusão e homogeneização. A extrusão utiliza membranas para passar gotículas, resultando em gotículas de tamanho nano com uma faixa de tamanho mais estreita em comparação com a sonicação. No entanto, este método é fortemente dependente da formulação e é um desafio para incorporar corante ou carga terapêutica dentro da gota26. A homogeneização de alta pressão faz uso de homogeneizadores comercialmente disponíveis que utilizam alta pressão e tensão de cisalhamento para gerar partículas lipídicas monodispersas e em nanoescala de forma escalável31,32,33. Este método foi adaptado para criar gotículas com perfluorocarbonos de alto e baixo ponto de ebulição32,34. Uma revisão mais substancial dos métodos de formulação de gotículas e protocolos de amostra pode ser encontrada na revisão a seguir26.

Os fantasmas são uma ferramenta valiosa para caracterizar o desempenho de nanogotículas in vitro. Neste protocolo, simuladores à base de poliacrilamida com sílica são usados. Os problemas mais frequentes com simuladores de poliacrilamida estão relacionados à polimerização lenta ou inexistente. A polimerização lenta, embora menos problemática, pode levar a uma distribuição heterogênea da dispersão incorporada. O culpado mais comum por esse problema é o uso de soluções antigas de persulfato de amônio que reduzem a produção de radicais livres que iniciam a reticulação. Isso pode ser facilmente resolvido tornando a solução fresca ou não usando soluções preparadas com mais de uma semana. Outra possibilidade é a degradação do TEMED - isso será evidente na formação de um precipitado amarelo. Um outro problema comum é a presença de bolhas de ar no simulador polimerizado. A desgaseificação adequada da água e o manuseio cuidadoso para evitar o excesso de agitação superficial devem mitigar esse problema. Uma estratégia alternativa seria desgaseificar toda a solução após a etapa 2.5. No entanto, isso deve ser realizado em um exaustor devido à presença de acrilamida.

Esses fantasmas também são excelentes para a imagem do comportamento de gotículas restritas para estudar o comportamento individual das gotículas; isso pode ser feito adicionando PFCnDs ao fantasma na etapa 2.4. Além disso, uma vez que a reticulação é devida a uma reação química, relativamente pouco calor é produzido em comparação com uma reticulação física baseada em uma temperatura de solução crítica superior, como a gelatina. Isso reduz a probabilidade de vaporização espontânea das gotículas embutidas.

Embora exista uma variedade de métodos para sintetizar simuladores, a poliacrilamida produz um simulador relativamente durável e não degradável que possui baixa atenuação acústica35 e coeficiente de absorção óptica36. Essas propriedades podem ser ajustadas para imitar mais de perto as propriedades acústicas e ópticas do tecido humano, ajustando a concentração da solução final de poliacrilamida e através da inclusão de partículas no fantasma, como sílica, contas de vidro ou dióxido de titânio36. Além disso, as propriedades mecânicas dos simuladores podem ser ajustadas modificando a porcentagem do teor de polímero (ou seja, porcentagem de acrilamida e bis(acrilamida)) e a porcentagem de reticulante (ou seja, porcentagem de bis(acrilamida) no teor total de polímero)37. Fantasmas alternativos incluem, mas não estão limitados a ágar38, gelatina39, álcool polivinílico (PVA)40, etc.

As etapas críticas para uma imagem bem-sucedida da distribuição ativada do PFCnD e da dinâmica hiperecogênica são as seguintes. 1) Sincronize o sistema de laser (fonte de ativação) e o sistema de imagem de ultrassom. 2) Alinhar a seção transversal do laser tanto com a região alvo de interesse quanto com o plano de imagem do ultrassom. 3) Ajuste os parâmetros de imagem de ultrassom próprios da imagem PFCnD (ou seja, taxa de quadros, forma de onda de pulso, etc.).

A ativação óptica do PFCnD tem uma vantagem notável sobre os ativados acusticamente que pode evitar a interferência acústica que degrada drasticamente a qualidade da imagem de ultrassom enquanto observa sua fase de recondensação no tempo. No entanto, é um desafio integrar e alinhar o sistema de laser com o sistema de imagem de ultrassom, tanto espacial quanto temporalmente. O uso de um suporte impresso em 3D permite a entrega de luz repetível e controlada. A entrega de luz também pode ser solucionada pela inserção de uma haste de metal na inclusão no fantasma de poliacrilamida, pois a haste de metal deve produzir contraste fotoacústico para indicar a entrega de luz. A sincronização temporal foi alcançada através da construção de uma plataforma20 desenvolvida anteriormente, que permite a sincronização do sistema de lasing e imagem, mantendo a programação total do sistema de imagem Verasonics com uma interface amigável. Além disso, o programa fornece imagens convencionais em tempo real de modo B e imagens fotoacústicas para auxiliar na solução de problemas e localização da região de interesse onde os PFCnDs são distribuídos. No entanto, essa configuração requer um laser pulsado de nanossegundos externo. Atualmente, até onde sabemos, existem alguns sistemas comerciais que integram sistemas de imagem de ultrassom a laser que podem permitir imagens PFCnD, por exemplo, Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 e iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF e inVision 512-echo).

A ultrassonografia ultrarrápida do comportamento vaporizador-recondensante do PFCnD sofre principalmente de baixa sensibilidade. Embora as soluções mais comuns para o aprimoramento da sensibilidade da imagem incluam a composição de vários quadros, essas técnicas são limitadas por sua característica inerente de degradar a taxa de quadros, uma vez que a imagem PFCnD é altamente vulnerável a artefatos de movimento, pois inclui o processo diferencial de tempo. A modulação da polaridade do pulso em nosso protocolo aborda efetivamente esse problema na imagem PFCnD, aproveitando a dinâmica acústica dos PFCnDs vaporizados para ter uma imagem mais discriminatória e prolongada, sem afetar a resolução temporal.

Enquanto o ODV permite gotículas com capacidades únicas, como vaporização repetida e contraste fotoacústico, o método de ativação tem penetração de profundidade limitada em comparação com o ultrassom. Como a penetração da luz é limitada, isso restringe as aplicações a procedimentos principalmente superficiais, como a substituição da biópsia do linfonodo sentinela41. Essa limitação pode ser potencialmente contornada através de sistemas de liberação de luz baseados em cateter, permitindo a ativação profunda no tecido. Como o contraste é acústico, a vaporização poderá ser fotografada em profundidade comparável ao ADV. Uma técnica alternativa de ativação pode ser a vaporização de gotículas magnéticas, na qual agentes de contraste magnéticos, como nanopartículas de óxido de ferro, são encapsulados dentro da gota42. Isso permitirá a vaporização em qualquer profundidade.

No futuro, a capacidade do nosso protocolo de visualizar e modular a resposta hiperecogênica do PFCnD ao mesmo tempo pode ser usada para várias aplicações onde o monitoramento e a manipulação do PFCnD são necessários. Por exemplo, um tempo detectável mais longo pode melhorar a qualidade da imagem da imagem de super-resolução, fornecendo um número maior de quadros à média. Além disso, um controle mais preciso do PFCnD tem potencial para elevar a eficiência e a segurança de terapias mediadas por bolhas, como a abertura do BBB e a entrega de medicamentos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O trabalho foi apoiado em parte pela Breast Cancer Research Foundation sob a concessão BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

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References

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Formulação e modulação acústica de nanogotículas de perfluorocarbono opticamente vaporizadas
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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

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