Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulering och akustisk modulering av optiskt förångade perfluorkarbonnanodroppar

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Optiskt aktiverade perfluorkarbonnanodroppar visar löfte i bildapplikationer utanför kärlsystemet. Denna artikel kommer att visa hur man syntetiserar dessa partiklar, tvärbinder polyakrylamidfantomer och modulerar dropparna akustiskt för att förbättra deras signal.

Abstract

Mikrobubblor är det vanligaste bildkontrastmedlet vid ultraljud. På grund av sin storlek är de dock begränsade till vaskulära fack. Dessa mikrobubblor kan kondenseras eller formuleras som perfluorkarbonnanodroppar (PFCnD) som är tillräckligt små för att extravasera och sedan utlösas akustiskt på målplatsen. Dessa nanopartiklar kan förbättras ytterligare genom att inkludera en optisk absorberare som nära infrarött organiskt färgämne eller nanopartiklar (t.ex. kopparsulfidnanopartiklar eller guldnanopartiklar / nanoroder). Optiskt märkta PFCnDs kan förångas genom laserbestrålning i en process som kallas optisk droppförångning (ODV). Denna aktiveringsprocess möjliggör användning av perfluorkarbonkärnor med hög kokpunkt, som inte kan förångas akustiskt under den maximala mekaniska indextröskeln för diagnostisk avbildning. Kärnor med högre kokpunkt resulterar i droppar som kondenseras igen efter förångning, vilket resulterar i "blinkande" PFCnD: er som kort producerar kontrast efter förångning innan de kondenseras tillbaka till nanodroppform. Denna process kan upprepas för att producera kontrast på begäran, vilket möjliggör bakgrundsfri avbildning, multiplexering, superupplösning och kontrastförbättring genom både optisk och akustisk modulering. Denna artikel kommer att visa hur man syntetiserar optiskt utlösbara, lipidskal PFCnDs med hjälp av sond ultraljudsbehandling, skapa polyakrylamidfantom för att karakterisera nanodroplets, och akustiskt modulera PFCnDs efter ODV för att förbättra kontrasten.

Introduction

Mikrobubblor är det mest allestädes närvarande ultraljudskontrastmedlet på grund av deras biokompatibilitet och utmärkta ekogenitet jämfört med mjuka vävnader. Detta gör dem till värdefulla verktyg för att visualisera blodflöde, organavgränsning och andra applikationer1. Men deras storlek (1-10 μm), vilket gör dem exceptionella för avbildning baserat på deras resonansfrekvens, begränsar deras applikationer till vaskulaturen2.

Denna begränsning har lett till utvecklingen av PFCnD, som är nanoemulsioner som består av ett ytaktivt ämne inneslutet runt en flytande perfluorkarbonkärna. Dessa nanopartiklar kan syntetiseras i storlekar så små som 200 nm och är utformade för att dra nytta av "läckande" vaskulatur eller porer och öppna fenestrationer som finns i tumörvaskulatur. Även om dessa störningar är tumörberoende, möjliggör denna permeabilitet extravasering av nanopartiklar från ~ 200 nm - 1,2 μm beroende på tumören 3,4. I sin ursprungliga form producerar dessa partiklar liten eller ingen ultraljudskontrast. Vid förångning - inducerad akustiskt eller optiskt - ändras kärnfasen från vätska till gas, vilket inducerar en två och en halv till femfaldig ökning i diameter 5,6,7 och genererar fotoakustisk och ultraljudskontrast. Medan akustisk förångning är den vanligaste aktiveringsmetoden, skapar detta tillvägagångssätt akustiska artefakter som begränsar avbildningen av förångningen. Dessutom kräver de flesta perfluorkarboner fokuserad ultraljud med ett mekaniskt index över säkerhetströskeln för att förånga8. Detta har lett till utvecklingen av PFCnDs med lägre kokpunkt, som kan syntetiseras genom att kondensera mikrobubblor till nanodroppar9. Dessa droppar är emellertid mer flyktiga och föremål för spontan förångning10.

Optisk droppförångning (ODV), å andra sidan, kräver tillsats av en optisk utlösare såsom nanopartiklar 11,12,13 eller färgämne 6,14,15 och kan förånga perfluorkarboner med högre kokpunkt med hjälp av fluenser inom ANSI-säkerhetsgränsen 11. PFCnDs syntetiserade med högre kokpunktskärnor är mer stabila och kommer att kondenseras efter förångning, vilket möjliggör bakgrundsfri avbildning16, multiplexering 17 och superupplösning18. En av de största begränsningarna med dessa tekniker är det faktum att PFCnDs med hög kokpunkt är ekogena efter förångning under endast en kort tidsram, på skalanmillisekunder 19, och är relativt svaga. Även om detta problem kan mildras genom upprepade förångningar och medelvärde, är detektion och separering av droppsignal fortfarande en utmaning.

Med inspiration från pulsinversion kan varaktigheten och kontrasten förbättras genom att modifiera fasen av ultraljudsavbildningspulsen19. Genom att starta ultraljudsavbildningspulsen med en sällsynthetsfas (n-puls) ökar både varaktigheten och kontrasten hos de förångade PFCnD: erna. Däremot resulterar start av ultraljudsavbildningspulsen med en kompressionsfas (p-puls) i minskad kontrast och kortare varaktighet. Denna artikel kommer att beskriva hur man syntetiserar optiskt utlösbara perfluorkarbonnanodroppar, polyakrylamidfantomer som vanligtvis används vid avbildning, och visar kontrastförbättring och förbättrad signallivslängd genom akustisk modulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Perfluorkarbon nanodropp formulering

  1. Skölj ur en 10 ml rundkolv med kloroform och tvätta ur en 10 μl och 1 ml gastät glasspruta med kloroform genom att upprepade gånger aspirera hela sprutvolymen och driva ut den i totalt tre gånger.
    VARNING: Kloroform är flyktigt och kan vara giftigt vid inandning. Allt arbete med detta lösningsmedel ska utföras i en rökhuv.
  2. Tillsätt 200 μl DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μl 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC, 25 mg/ml) och 1 ml IR 1048 (1 mg/ml i kloroform) i rundkolven med dosering. Kom ihåg att rengöra sprutorna mellan lipider/färgämnen för att förhindra kontaminering av beståndet.
    OBS: Infraröda färgämnen är ljuskänsliga och arbetet bör utföras under svaga förhållanden eller kolvar bör täckas med aluminiumfolie.
  3. Ta bort lösningsmedlet med hjälp av en roterande förångare. Se till att vakuumet långsamt justeras till 332 mbar för att förhindra stötar. Efter 5 min, minska trycket till 42 mbar för att avlägsna allt vatten som kan ha kommit in i lösningen.
    OBS: Lipidkakan kan förvaras över natten i en rund bottenkolv täckt med parafilm vid 4 °C.
  4. Suspendera lipidkakan i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sonikat eller virvel vid rumstemperatur i 5 minuter eller tills hela lipidkakan har suspenderats och lösts upp i lösningen. Sonicate i ytterligare 2 min för att homogenisera lösningen.
  5. Överför lösningen till en 7 ml injektionsflaska av glas och placera injektionsflaskan i en glasskål fylld med is så att lösningen kan svalna i 5 minuter innan du tillsätter 50 μl perfluorhexan med en gastät glasspruta. Kom ihåg att skölja ur sprutan med perfluorhexan innan du doserar den i injektionsflaskan.
  6. Placera glasflaskan som innehåller lipider och isbad i sonden sonicator kapsling och sänk ner sondspetsen under miniscus. Se till att sidorna av sonicator sonden inte vidrör läppen på glasflaskan.
  7. Sond sonikerar blandningen med följande inställningar: Amplitud 1, Processtid: 20 s, Puls-On: 1s, Pulse-off: 5s. Sedan sonicate vid följande inställningar: Amplitud: 50, Processtid: 5 s, Puls-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Överför nanodropplösningen till ett 1,5 ml centrifugrör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter för att separera ut de större dropparna (>1 μm) från mindre droppar.
  9. Kassera pelleten och överför supernatanten till ett annat 1,5 ml centrifugrör. Tvätta supernatanten genom att centrifugera vid 3000 x g i 5 min för att pelletera alla droppar i lösning. Återsuspendera PFCnDs i 1 ml PBS genom att pipettera pelleten upp och ner och sedan sonika i en bad sonicator i 1 min.
  10. Mät dropparnas storlek med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS). Späd stam PFCnDs med 100 gånger (10 μL PFCnD-stam i 990 μL PBS) och badsonikat för att sprida PFCnDs före mätning. Representativa resultat visas i figur 1.
  11. Bestäm koncentrationen av PFCnDs med hjälp av nanopartikelspårningsanalysatorn (se Materialförteckning). Späd PFCnDs med 100-1000 gånger för att säkerställa noggrann mätning av koncentrationen. Protokollet ger vanligtvis droppar i en koncentration i storleksordningen 1010 partiklar/ml.
  12. Förbered 10 ml ultraljudskopplingsgel i ett 50 ml centrifugrör och tillsätt 1% (v / v) eller 100 μL PFCnDs för att göra lösning av ~ 108 partiklar / ml. Vortex lösningen att blanda. Centrifugera blandningen vid 4000 x g i 3 minuter för att avlägsna bubblor.

2. Beredning av polyakrylamidfantom

  1. Avgasa vatten genom att fylla en 500 ml vakuumkolv med 400 ml avjoniserat vatten, försegla med en gummikork och anslut kolven till vakuumledningen. Öppna vakuumlinjen och sänk ner botten av kolven i badljudsmedlet. Sonicate i 5 min eller tills ingen gasbubbla bildning är synlig.
  2. Bered 10% ammoniumpersulfatlösning (APS) genom att lösa 500 mg i 5 ml avgasat vatten. Snurra försiktigt lösningen om ammoniumpersulfatet inte löser sig helt.
  3. I en 400 ml bägare med en omrörningsstång på en omrörningsplatta, tillsätt 150 ml avgasat vatten och 50 ml 40% (w / v) akrylamid-bisacrylamidlösning för att bilda 200 ml 10% akrylamid-bisacrylamidlösning. Rör om blandningen vid 200 rpm för att möjliggöra korrekt blandning utan att införa bubblor.
    VARNING: Akrylamid är cancerframkallande och allt arbete bör utföras i en dragskåp med handskar, särskilt om du arbetar med akrylamid i pulverform.
  4. Väg upp 400 mg kiseldioxid och tillsätt den till 10 % akrylamid-bisakrylamidlösning från steg 2.3 för att bilda en 0,2 % (vikt/volym) kiseldioxid- och akrylamidlösning.
    VARNING: Kiseldioxid vid inandning kan vara cancerframkallande. Allt arbete inklusive vägning ska utföras i en dragskåp.
  5. Förbered en 58 mm x 58 mm x 78 mm fyrkantig form med en cylindrisk inkludering genom att skära av spetsarna på från en plastöverföringspipett och stödja den i formen med labbtejp. Se figur 2.
  6. Tillsätt 2 ml 10 % APS-lösning till bägaren för att göra en slutlig koncentration på 0,1 % APS och tillsätt 250 μl tetrametyletylendiamin (TEMED) till fantomlösningen. Låt lösningen röra om en kort stund (mindre än en min).
  7. Häll snabbt lösningen i formen, samtidigt som du är försiktig så att du inte introducerar luftbubblor i lösningen. Lösningen ska polymeriseras inom 10 min. Ta bort fantomen genom att köra den plana änden av en labbspatel runt formens kant och invertera formen.
    OBS: Dessa fantomer kan återanvändas flera gånger och bör sänkas ner i vatten och förvaras vid 4 °C.

3. Avbildning av nanodroppar av perfluorkarbon

  1. Slå på och värm upp det pulserade lasersystemet i ~ 20 minuter enligt tillverkarens instruktioner. Se till att det fiberoptiska buntet är ordentligt anslutet till laserutgången och att de två benen är ordentligt placerade i fiberbunthållaren.
  2. Slå på ultraljudsavbildningssystemet, anslut matrisbildgivare (L11-4v) till systemet och fixa givaren i hållaren för att justera dess bildplan med lasertvärsnitt.
  3. Ställ in lasersystemets pulsrepetitionsfrekvens på 10Hz och placera en effektmätare i slutet av fiberbunten för att mäta energi. Ställ in q-switchfördröjningen tills den uppskattade fluensen är 70 mJ / cm2.
    VARNING: Lämpliga glasögon måste bäras vid avfyrning av lasern och lasergardiner måste omsluta utrymmet.
  4. Återfyll en av kanalerna i polyakrylamidfantomen med ultraljudsgel/PFCnD-blandningen med en 1 ml plastglidspetsspruta. Täck rikligt toppen av kanalen med ultraljudsgel och ta bort eventuella bubblor med en 1 ml plastlockspetsspruta. Placera polyakrylamidfantomen under givaren och fiberbunten enligt figur 3.
  5. Använd den kombinerade laser ultraljud och elasticitet (CLUE) bildplattform baserad på programvaran20 för att avbilda PFCnD synkroniserad med optisk aktivering. Ändra de allmänna användardefinierade parametrarna i Param-strukturen för avbildning: ställ in start-/slutdjup till 0/40 mm, mittfrekvens till 6,9 MHz och givarnamn till "L11-4v".
  6. Definiera en ny RunCase och designa en modulsekvens för upprepad optisk aktivering/rekondensation och amerikansk avbildning av PFHnDs. Detta görs genom att lista fördefinierade moduler som ultrasnabb avbildning (mUF), extern laser (mExtLaser) och tomgång (mIdle).
    1. Upprepa sekvensuppsättningen mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF två gånger för att samla in både n-puls- och p-pulsbilddata.
      OBS: Den första mExtLaser-modulen i varje sekvens ställs in som en skenlaser genom att ställa in ExtLaser.Enable till 0 och "mIdle" ingår för att minimera tiden mellan amerikanska bakgrundsbilder och n / p-puls US-bilder efter laseraktivering.
  7. Ange modulparametrar för varje modul som placeras i det aktuella körningsfallets modulsekvens. Få åtkomst till varje modulparameter efter index som motsvarar dess ordning i modulsekvensen. Moduler kör fördefinierade operationer med modulparametrar som användaren har angett här.
    1. Ställ in ExtLaser.QSdelay i externa lasermoduler till värdet för laser Q-switchfördröjning inställd i steg 3.3, i mikrosekunder. Den här modulen väntar på att lasersystemets blixtlampa utlöses och genererar Q-switch-utlösare efter den fördröjning som anges i QSdelay.
    2. I ultrasnabb bildmodul ställer du in Resource.numFrame på 100, ställer in SeqControl.PRI på 200 (μs) och ställer in TW.polarity på 1 för P-puls och -1 för N-puls (se bild 4 för motsvarande pulsform). Denna modul kommer att överföra ultrasnabb 0-graders planvåg med pulstyp specificerad i TW.polaritet.
      1. Skaffa ett bildfönster med full bländare på 38,8 mm bred för antal bildrutor i Resource.numFrame, pulsrepetitionsintervall för SeqControl.PRI och spara sedan data för offlinebearbetning.
    3. Ställ in SeqControl.lastPRI_Module i tomgångsmodulen på tiden mellan laserpulser (100 ms) subtraherade med Q-switchfördröjning, bilddatainsamlingstid (20 ms) och en marginal på 20 μs för signalen att färdas. Denna modul håller systemet under "ingen drift" -tillstånd under tiden i SeqControl.lastPRI_Module för att fylla tidsgapet mellan slutet av bilddatainsamlingen och nästa laserpulsexcitation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik formulering och centrifugalseparation av PFCnDs bör ge droppar runt storleken 200-300 nm i diameter (figur 1A). Felaktigt separerade droppar kan visa små toppar runt 1 μm. Dessa lösningar kan vara ytterligare bad sonicated för att bryta upp de större dropparna. Dropparnas storlek kommer att öka med tiden på grund av koalescering och/eller diffusion i en process som kallas Ostwaldmognad21,22 (figur 1B).

Akustisk modulering av dropparna genom att manipulera bildpulsen förbättrade kontrasten hos de förångade PFCnD: erna. Detta demonstrerades i PFCnD-bilder rekonstruerade genom att subtrahera intilliggande ramar av de strålformade bilderna så att endast signalen som returneras från förångad PFCnD är synlig och stationär bakgrundssignal undertrycks. Kontrasten kvantifieras av förhållandet mellan skillnaden mellan genomsnittliga signaler för det cirkulära inkluderingsområdet och genomsnittlig bakgrundssignal över genomsnittlig bakgrundssignal. Bakgrundssignalen definieras av signalerna från två rektangulära ROI i bakgrunden som ligger på samma djup och motsvarande område som inneslutningarna. Kontrasten från inklusionen för N-pulsen är ungefär 3,2 gånger större (dvs. 220 % förbättring) än P-pulsen (figur 5).

Den inverterade bildpulsen ökade också signalens livslängd från PFCnD-förångning. Detta kvantifierades genom att tröskel pixlarna i det cirkulära inkluderingsområdet som överskrider bakgrundssignalen. Procentandelen pixlar i inkluderingen som låg över tröskelvärdet definierades som det hyperekoiska området (%). För att undersöka PFCnDs hyperekogena beteende över tid beräknas hyperekoiskt område för varje bildruta och normaliseras av det hyperekoiska området i den första ramen och anpassas sedan till en exponentiell sönderfallsmodell. Denna funktion användes för att bestämma den karakteristiska sönderfallstiden, definierad som det tidsspann det tar för det hyperekoiska området efter PFCnD-aktivering att sönderfalla till endast 10 % av det ursprungliga området (figur 6a). Den karakteristiska sönderfallstiden för normaliserat hyperekoiskt område är upp till 3,5 gånger längre vid N-pulsavbildning jämfört med P-puls. Representativa B-läges differentiella bildramar i tid för varje N-puls- och P-pulsavbildning visas i figur 6b.

Figure 1
Figur 1: DLS-storleksmätningar av PFCnDs och stabilitet. (A) Storleksintensitetsfördelningen för droppar i genomsnitt från tre mätningar av droppar efter syntes (genomsnittlig PDI: 0,132± 0,016; genomsnittligt Z-medelvärde: 259,3 ± 0,7 nm). (B) Storleksintensitetsfördelningen för droppar i genomsnitt från tre mätningar tagna 24 timmar efter syntesen (genomsnittlig PDI: 0,252± 0,061; genomsnittligt Z-medelvärde: 322,5 ± 4,5 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bild och schematisk bild av polyakrylamidform. (A) Bild av formen gjord av labbtejp och plastbehållaren. (B) Schematiskt med mätningar av polyakrylamidfantomen efter avlägsnande från mögel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ett schema över laserpulsleverans och ultraljudsavbildning. (A) Komponenterna i enheten är märkta och laserstråle / ultraljudsavbildningsplaninriktning i förhållande till inkluderingspositionen illustreras. (B) En bild som visar den faktiska inställningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Simulerad ultraljudsavbildningspuls. Vågformerna simuleras av programvara för ultraljudsavbildningssystem, samplad med 250 MHz. Vågformen av P-puls och N-puls genereras med samma centrumfrekvens och pulsbredd men har 180° fasskillnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kontrastmätning. Genomsnittligt kontrastvärde för inkluderingsområdet för N-puls och P-puls, felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Karakteristisk sönderfallskurva för hyperekoisk area och representativa differentiella B-lägesmagiker . (A) Normaliserat hyperekoiskt område inducerat av PFCnD-aktivering över tid för N-puls- och P-pulsavbildning vid samma tvärsnitt. Den prickade linjen indikerar 10% av det ursprungliga hyperekoiska området. Den tid då den monterade tomten skär med den streckade linjen representerar den karakteristiska sönderfallstiden. (B) Bilder visar ett beskuret ROI-fönster centrerat på inkluderingen, plottat på en dB-skala med ett dynamiskt omfång på 35. Den översta raden visar det återkondenserande beteendet som avbildas av P-pulsen och den nedre raden visar N-pulsen. Den gulfärgade streckade linjen indikerar inkluderingsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Total volym fantom (ml) 50 100 250 500
DI-vatten (ml) 37.5 74.9 187.4 375
40% PA-lösning (ml) 12.5 25.1 62.6 125
Kiseldioxid (mg) 100 200 500 1000
10% APS-lösning (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabell 1: Sammanfattning av reagenserna och mängderna för tvärbindning av polyakrylamidfantom baserat på mögelvolym. Denna tabell ger en kortfattad värdesammanfattning av de reagenser som används och mängder baserat på flera vanliga formvolymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sond ultraljudsbehandling är en relativt enkel och lätt att lära sig metod för att tillverka PFCnDs. Det finns några steg där försiktighet måste vidtas. Vid hantering av kloroform är det absolut nödvändigt att en positiv förskjutningspipett eller glassprutor används, eftersom den är flyktig och kommer att "läcka" från vanliga luftförskjutningspipetter. Dessutom, om du använder en positiv förskjutning, se till att en lämplig spets används eftersom kloroform löser upp de flesta plastspetsar, vilket kan införa föroreningar i lösningen. En positiv förskjutningspipett eller glasspruta rekommenderas också för perfluorhexan, eftersom den är både flyktig och tätare än vatten. Vanligtvis kan de individuella effekterna av volatilitet och hög densitet minskas genom förvätning i luftförskjutningspipetter och med hjälp av en skala för att justera volymen som ställts in på pipetten. Men när det gäller perfluorhexan som har båda egenskaperna kommer volatiliteten att göra det svårt att få exakta viktmätningar, vilket gör en positiv förskjutningspipett / glasspruta till det mest livskraftiga alternativet.

Innan sond sonikering av lösningen är det viktigt att inkubera lipid- och perfluorkarbonlösningen i ett isbad så att den kan svalna för att förhindra kokning av perfluorkarbonen under ultraljudsbehandling. Detta steg kommer att vara särskilt viktigt för lägre kokande perfluorkarbon, såsom perfluoropentan. Dessutom måste försiktighet iakttas vid sondering av lösningen. Ultraljudsbehandling sond spetsen bör vara nedsänkt, men det bör inte komma i kontakt med botten eller sidorna av glasflaskan eftersom det kan skada spetsen och krossa injektionsflaskan och tömma lipidlösningen i isbadet.

PFCnD-tillverkningsprotokollet kan anpassas på några mindre sätt. Om en roterande förångare inte är tillgänglig i steg 1.3 kan lösningen torkas med en stadig ström av kvävgas eller placeras i en vakuumkammare över natten för att bilda lipidkakan. När det gäller lipiderna använder denna formulering ett 9: 1-förhållande mellan DSPE-PEG: DSPC jämfört med standardförhållandet 1: 9 för DSPE-PEG: DSPC, eftersom det resulterar i mindre och mer storlek stabila droppar23. Denna formulering kan anpassas för att möjliggöra ytkonjugering genom att ersätta en liten fraktion (~ 2 mol %) av DSPE-PEG med en funktionaliserad DSPE-PEG med önskad enhet (t.ex. biotin, tiol, amin, etc.).

I allmänhet är sondsonicatorer kommersiellt tillgängliga, relativt enkla att använda och kan enkelt anpassas till andra högre kokpunkt perfluorkarboner och ytaktiva formuleringar, men det kan inte användas för att göra droppar med perfluorkarbonkärnor som är gasformiga vid rumstemperatur utan betydande modifieringar. En sådan modifiering är att använda sond ultraljudsbehandling för att skapa mikrobubblor och sedan tillämpa tryck och minska temperaturen för att kondensera mikrobubblorna till droppar24. Även om denna metod är ett smart sätt att generera akustiskt förångbara droppar, är det svårt att kapsla in tillräckligt med färgämne i mikrobubblorna för att säkerställa ODV efter kondens. Ett alternativt tillvägagångssätt är att konjugera färgämnet (t.ex. Cy7.5) till lipiderna och bilda mikrobubblor som kan kondenseras ner till ODV-kapabel låg kokpunkt PFCnDs25.

Sond ultraljudsbehandling producerar också en hög koncentration av nanodroppar (~ 1010 droppar / ml) på relativt kort tid. Denna teknik resulterar dock i en stor storleksfördelning som minskar mängden nanodroppar som extravaserar. Medan detta kan förbättras genom centrifugalfiltrering eller sprutfilter för att avlägsna större droppar, kommer de resulterande PFCnD: erna att uppvisa större polydispersitet jämfört med droppar syntetiserade med mikrofluidik eller filtrerade genom extrudering26. En annan nackdel med sond ultraljudsbehandling är att ultraljudsbehandling sond spetsen oundvikligen kommer att bli pitted från kavitation under ultraljudsbehandling och kommer att behöva bytas ut regelbundet.

Ett alternativt tillvägagångssätt för att skapa droppar använder mikrofluidiska enheter som kan användas för att skräddarsy droppar till en viss storlek med ett lågt polydispersitetsindex (PDI). Dessa enheter producerar dock droppar i relativt långsam takt (~ 104-10 6 droppar / s) 26 och, även om det har skett flera utvecklingar som stegemulgering 27, spetsströmning i flödesfokuseringsanordningar28,29 och användning av ouzoeffekten med en förskjuten fiskbensmikromixer30 - Att generera nanostora droppar är fortfarande utmanande. Dessutom är denna teknik inte kommersiellt tillgänglig, och tillverkningen av dessa enheter kräver specialiserad expertis.

Andra metoder som är kommersiellt tillgängliga inkluderar extrudering och homogenisering. Extrudering använder membran för att passera droppar igenom, vilket resulterar i droppar i nanostorlek med ett smalare storleksintervall jämfört med ultraljudsbehandling. Men denna metod är starkt formuleringsberoende och är utmanande att införliva färgämne eller terapeutisk last i droppen26. Högtryckshomogenisering använder kommersiellt tillgängliga homogenisatorer som använder högt tryck och skjuvspänning för att generera monodispersa lipidpartiklar i nanoskala på ett skalbart sätt31,32,33. Denna metod har anpassats för att skapa droppar med hög och låg kokpunkt perfluorkarboner32,34. En mer omfattande genomgång av droppformuleringsmetoder och provprotokoll finns i följande granskning26.

Fantomer är ett värdefullt verktyg för att karakterisera nanodropparnas prestanda in vitro. I detta protokoll används polyakrylamidbaserade fantomer med kiseldioxid. De vanligaste problemen med polyakrylamidfantom är relaterade till långsam eller ingen polymerisation. Långsam polymerisation, även om den är mindre problematisk, kan leda till heterogen fördelning av inbäddad spridning. Den vanligaste skyldige för denna fråga är användningen av gamla lösningar av ammoniumpersulfat som minskar produktionen av fria radikaler som initierar tvärbindningen. Detta kan enkelt åtgärdas genom att göra lösningen färsk eller inte använda beredda lösningar som är äldre än en vecka. En annan möjlighet är nedbrytningen av TEMED - detta kommer att framgå vid bildandet av en gul fällning. En annan vanlig fråga är närvaron av luftbubblor i det polymeriserade fantomet. Korrekt avgasning av vattnet och noggrann hantering för att undvika överskott av ytomrörning bör mildra detta problem. En alternativ strategi skulle vara att avgasa hela lösningen efter steg 2.5. Detta bör dock utföras i en dragskåp på grund av närvaron av akrylamid.

Dessa fantomer är också utmärkta för att avbilda beteendet hos begränsade droppar för att studera individuellt droppbeteende; Detta kan göras genom att lägga till PFCnDs i fantomen i steg 2.4. Eftersom tvärbindningen beror på en kemisk reaktion produceras dessutom relativt lite värme jämfört med en fysisk tvärbindning baserad på en övre kritisk lösningstemperatur som gelatin. Detta minskar sannolikheten för spontan förångning av de inbäddade dropparna.

Även om det finns en mängd olika metoder för att syntetisera fantomer, producerar polyakrylamid ett relativt hållbart och icke-nedbrytbart fantom som har låg akustisk dämpning35 och optisk absorptionskoefficient36. Dessa egenskaper kan ställas in för att närmare efterlikna de akustiska och optiska egenskaperna hos mänsklig vävnad genom att justera koncentrationen av den slutliga polyakrylamidlösningen och genom att inkludera partiklar i fantomet, såsom kiseldioxid, glaspärlor eller titandioxid36. Dessutom kan fantomernas mekaniska egenskaper justeras genom att modifiera procentandelen polymerinnehåll (dvs. procentandel akrylamid och bis(akrylamid)) och procentandel tvärbindare (dvs. procentandel bis(akrylamid) av det totala polymerinnehållet)37. Alternativa fantomer inkluderar men är inte begränsade till agar38, gelatin39, polyvinylalkohol (PVA)40, etc.

De kritiska stegen för en framgångsrik avbildning av aktiverad PFCnD-distribution och hyperekogen dynamik är följande. 1) Synkronisera lasersystemet (aktiveringskälla) och ultraljudsavbildningssystemet. 2) Rikta in lasertvärsnittet både med målområdet av intresse och med ultraljudsavbildningsplanet. 3) Justera ultraljudsavbildningsparametrar som är korrekta för PFCnD-avbildning (dvs. bildhastighet, pulsvågform, etc.).

Den optiska aktiveringen av PFCnD har en märkbar fördel jämfört med akustiskt aktiverade att den kan undvika den akustiska störningen som drastiskt försämrar kvaliteten på ultraljudsbilden samtidigt som den observerar dess återkondenserande fas i tid. Det är dock utmanande att integrera och anpassa lasersystemet med ultraljudsavbildningssystemet både rumsligt och tidsmässigt. Användningen av en 3D-tryckt hållare möjliggör repeterbar och kontrollerad ljusleverans. Ljusleveransen kan också felsökas genom att sätta in en metallstav i inkluderingen i polyakrylamidfantomen eftersom metallstaven ska producera fotoakustisk kontrast för att indikera ljusleverans. Temporal synkronisering uppnåddes genom att bygga av en tidigare utvecklad plattform20, som möjliggör både synkronisering av lasing- och bildsystemet samtidigt som Verasonics bildsystems fullständiga programmerbarhet bibehålls med ett användarvänligt gränssnitt. Dessutom tillhandahåller programmet konventionell B-lägesavbildning i realtid och fotoakustisk avbildning för att hjälpa till med felsökning och lokalisering av intresseområdet där PFCnDs distribueras. Denna inställning kräver dock en extern nanosekundpulserad laser. För närvarande, såvitt vi vet, finns det några kommersiella system som har integrerade laser-ultraljudsavbildningssystem som kan möjliggöra PFCnD-avbildning, t.ex. Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 och iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF och inVision 512-echo).

Den ultrasnabba ultraljudsavbildningen av PFCnD: s förångnings-rekondenserande beteende lider huvudsakligen av låg känslighet. Medan de vanligaste lösningarna för förbättring av bildkänslighet inkluderar sammansättning med flera ramar, begränsas dessa tekniker av deras inneboende egenskap att försämra bildhastigheten, eftersom PFCnD-avbildningen är mycket sårbar för rörelseartefakter genom att den inkluderar tidsdifferentiell process. Pulspolaritetsmoduleringen i vårt protokoll adresserar effektivt detta problem vid PFCnD-avbildning genom att utnyttja den akustiska dynamiken hos förångade PFCnD: er för att få mer diskriminabel och långvarig bild samtidigt som den inte påverkar tidsupplösningen alls.

Medan ODV möjliggör droppar med unika funktioner som upprepad förångning och fotoakustisk kontrast, har aktiveringsmetoden begränsad djuppenetration jämfört med ultraljud. Eftersom ljuspenetrationen är begränsad begränsar detta applikationerna till huvudsakligen ytliga procedurer som en ersättning för sentinellymfkörtelbiopsi41. Denna begränsning kan potentiellt kringgås genom kateterbaserade ljusleveranssystem, vilket möjliggör aktivering djupt i vävnaden. Eftersom kontrasten är akustisk kommer förångning att kunna avbildas på djup som är jämförbar med ADV. En alternativ aktiveringsteknik kan vara magnetisk droppförångning, där magnetiska kontrastmedel såsom järnoxidnanopartiklar är inkapslade i droppen42. Detta möjliggör förångning på vilket djup som helst.

I framtiden kan vårt protokolls förmåga att avbilda och modulera det hyperekogena svaret hos PFCnD samtidigt användas till flera applikationer där övervakning och manipulation av PFCnD krävs. Till exempel kan längre detekterbar tid förbättra bildkvaliteten för superupplösningsavbildning genom att ge ett större antal bilder till genomsnittet. Dessutom har mer exakt kontroll av PFCnD potential att höja effektiviteten och säkerheten för bubbelmedierade terapier som BBB-öppning och läkemedelsleverans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet stöddes delvis av Bröstcancerforskningsstiftelsen under bidrag BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
  2. Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
  3. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
  4. Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
  5. Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
  6. Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
  7. Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
  8. Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
  9. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  10. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  11. Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
  12. Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
  13. Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
  14. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
  15. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
  16. Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
  17. Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
  18. Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
  19. Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
  20. Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
  21. Taylor, P. Ostwald ripening in emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. 75 (2), 107-163 (1998).
  22. Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
  23. Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
  24. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  25. Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
  26. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  27. Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
  28. Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
  29. Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
  30. Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
  31. Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
  32. Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
  33. Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
  34. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  35. Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
  36. Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
  37. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  38. Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
  39. Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
  40. Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
  41. Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
  42. Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).

Tags

Bioengineering utgåva 173 ultraljud perfluorkarbonnanodroppar nanodroppar kontrastmedel emulsion nanopartikel fotoakustisk fasförändring
Formulering och akustisk modulering av optiskt förångade perfluorkarbonnanodroppar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter