Summary
이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.
Abstract
일체막 단백질의 구조와 기능에 대한 견고한 체외 조사는 플라즈마 멤브레인의 복잡성과 살아있는 세포에서 단백질 거동에 영향을 미치는 수많은 요인으로 인해 어려움을 받고 있습니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 단백질 막 상호 작용을 조사하고 정확하고 자극의존적인 방식으로 단백질 행동을 조사하기위한 생체 모방 및 고도의 튜닝 시험 관 모델 시스템입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 인간 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1AR)로 GUV를 제조하기위한 저렴하고 효과적인 방법을 제시(5-HT1AR) 안정적으로 멤브레인에 통합. 변형된 하이드로겔 부종 방법을 사용하여 GUV를 제조합니다. 아가로즈와 5-HT1AR의 혼합물 위에 지질 필름을 증착한 다음 전체 시스템을 수분을 공급함으로써, 소포는 멤브레인에 통합된 적절히 지향적이고 기능적인 5-HT1AR으로 형성될 수 있다. 이 GUV는 그 때 현미경 검사를 통해 단백질 막 상호 작용 및 현지화 행동을 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 일체형 막 단백질의 기능에 대한 이해를 발전시켜 심오한 생리적 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
합성 모형 멤브레인은 생물막의 근본적인 특성 및 기능에 대한 조사에서 강력한 도구입니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 다양한 플라즈마 막 특성을 연구하는 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나이며 다른 생리 적 조건을 모방하도록 설계 될 수있다1,2,3,4,5,6,7,8. 플라즈마 멤브레인과 그 조직이 신호 트랜스듀션, 접착, 내분비증 및 수송9,10,11,12,13,14,15와 같은 수많은 세포 공정에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있습니다.
GUV는 부드러운 수화16, 하이드로겔 부종17, 전기형성18, 미세유체 기술19,20,21,22, jetting23 및 용매 교환24,25,26을 포함한 다양한 방법을 사용하여 제조되었습니다. 일체막 단백질(ImP)을 처리하는 데 따르는 어려움으로 인해 이를 연구하는 시험관 내 플랫폼은 제한적이었습니다. GUV는 자신의 기본 환경을 모방하는 환경에서 IMP를 연구하기 위한 간소화된 플랫폼을 제공합니다. GUV에 있는 단백질 재구성을 위한 몇몇 접근이 있더라도, 도전은 올바른 방향에 단백질을 통합하고 단백질 기능을 유지에서 생겨나기 27.
GUV에서 가장 성공적인 단백질 재구성은 세제 교환 방법이 필요합니다. 세제에 의해 그들의 토착 환경에서 단백질을 용해시키고, 단백질 정제를 선행한 다음, 각종 방법을 통해 지질으로 세제 분자를 대체하는 관련시킵니다28. 세제는 정화 하는 동안 IMP의 삼차 구조를 안정화 하는 동안, 세제 미셀은 이러한 단백질에 대 한 상대적으로 부자연스러운 환경, 더 나은 안정화, 특히 기능 연구에 대 한, 지질 bilayers28,29,30. 더욱이, 기존의 GUV 제조 기술을 사용하여 지질 이중층에 기능성 막 단백질을 통합하는 것은 이러한 단백질의 크기, 진미, 그리고 필요한 추가 세제 교환 단계로 인해 어려웠다27,31,32,33. 세제를 제거하기 위해 유기 용매를 사용하면 단백질 응집 및 데니션34가 발생합니다. 개선된 세제 매개 방법은 유망하고 있지만, 세제 제거 단계에 주의가 필요하며 특정 단백질31,35에 최적화가 필요할 수 있습니다. 추가적으로, 전기형성을 활용하는 방법은 단백질의 선택을 제한할 수 있고 특히 충전된 지질31,36,37에 적합한 모든 지질 조성물에 적합하지 않을 수 있다. 사용 된 또 다른 기술은 GUV와 원하는 단백질을 포함하는 대형 unilamellar 소포 (LUV)의 펩타이드 유도 융합이지만, 힘들게 발견되었지만 이물질 펩타이드33,38,39의 삽입으로 이어질 수 있습니다. 살아있는 세포에서 파생되는 거대한 혈장 막 소포 (GPMV)는 이러한 문제 중 일부를 극복하는 데 사용할 수 있지만 결과 지질 및 단백질 조성물의 최소 제어를 허용14,40,41. 따라서, 변형된 아가로즈 팽창 방법을 이용한 GUV의 이중지질층에서 ImPs의 통합은 멤브레인 환경에서 이러한 단백질을 추가로 검사하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시한다42,43,44,45.
세포 신호 및 통신은 G 단백질 결합 수용체로 알려진 단백질의 가족을 포함 (GPCRs); GPCR은 단백질의 가장 큰 가족 중 하나이며 기분 조절과 관련이 있습니다, 식욕, 혈압, 심장 혈관 기능, 호흡, 및 다른 많은 생리 적 기능 중 수면46. 이 연구에서는, 우리는 GPCR 가족의 프로토 타입 구성원인 인간 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1AR)를 사용했습니다. 5-HT1AR은 중추 신경계 (CNS) 및 혈관에서 찾을 수 있습니다; 그것은 심장 혈관 등 수많은 기능에 영향을, 위장, 내 분 비 기능, 뿐만 아니라 mood47의 규칙에 참여. GPCR 연구에 큰 장벽은 복잡한 양용 성 구조에서 발생하며, GUV는 단백질 기능성, 지질 단백질 상호 작용 및 단백질 단백질 상호 작용에 이르기까지 다양한 관심 특성을 조사할 수있는 유망한 플랫폼을 제시합니다. 표면 플라스몬 공명(SPR)48,49, 핵자기 공명 분광 법(NMR)50,51, 단백질 지질 오버레이(PLO) 분석 51,52,53,54, 토착 질량 분광법 5,555, 모종 질량 분광법 5C와 같은 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 접근법이 활용되었습니다. 퇴적 분석 58,59. 우리의 실험실은 수용체의 활성 상태에서 Giα 서브유닛과 결합하는 BODIPY-GTPγS를 캡슐화하여 단백질 기능에 지질 단백질 상호 작용의 효력을 조사하기 위하여 단순화된 GUV 접근을 이용했습니다. 그들의 결합은 시간이 지남에 따라 검출될 수 있는 형광 신호를 생성하는 형광신호를 풀어 내지 않습니다45. 더욱이, 다양한 연구는 지질 단백질 상호 작용과 감지 또는 안정화 막 곡률60,61에서 단백질의 역할을 조사하고, 가능한 GUV 접근을 활용하는 것이 주요 이점이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 변형된 아가로즈 하이드로겔 시스템17,42를 사용하여 GPCRs를 GUV의 멤브레인에 통합하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리의 이전 작업에 따라, 우리의 방법은 30-40 ° C에 단기 노출을 견딜 수있는 IMP에 적합 할 수있다. 간단히, 우리는 관심의 GPCR을 포함하는 막 파편과 결합 된 아가로즈의 박막을 확산. 이 층의 겔화에 따라, 우리는 아가로즈 위에 지질 용액을 착유하고 용매가 증발 할 수 있습니다. 시스템의 재수화는 수성 완충제로 수행되었고, 그 결과 지질 이중층에 단백질이 통합된 GUV의 형성을 초래하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 단백질 라벨링
- NHS-로다민, 5-HT1A 멤브레인 파편, 그리고 17 K MWCO 스핀 탈염 컬럼을 실내 온도에서 평형화 할 수 있습니다.
- 디메틸 설산화물(DMSO)의 100 μL에서 NHS 로다민 1 mg을 녹입니다.
- 5μL의 1M 나트륨 중탄산염 용액을 추가하여 5-HT1AR 용액의 pH를 pH 8로 증가시면 됩니다.
- NHS-로다민 용액의 3.66 μL을 5-HT1AR 용액의 50 μL에 추가하고 마이크로 센티슈에이체 튜브에서 파이펫을 부드럽게 위아래로 넣습니다.
참고: NHS-로다민을 10배 이상 초과하는 경우를 확인하십시오. - 혼합물을 빛으로부터 보호하고 실온에서 회전기위에 1시간 동안 착용하십시오.
- 7k MWCO 스핀 컬럼을 1x 인산완충식식염수(1x PBS)의 200μL로 세척하여 1.5RCF에서 1.5분 동안 3회 세척할 수 있습니다.
- 표지된 단백질을 한 컬럼에 추가하고 다른 미세원심분리기 튜브의 양을 균형이 조정합니다.
- 1.5 RCF에서 5 분 동안 라벨이 부착 된 단백질을 한 번 회전하십시오.
- 280nm 및 554 nm의 나노 드롭 분광계를 사용하여 UV-vis 스펙트럼을 취하고 제조업체 매뉴얼에 따라 라벨링 효율을 계산합니다.
- 라벨이 부착된 단백질을 추가 사용까지 5°C로 보관하십시오. 이 솔루션은 라벨링 후 약 1주일 동안 안정적입니다.
2. 멤브레인 통합 5-HT 1A와 GUV
- 재료 및 시약 의 준비
- 단백질, 지질 및 BSA(소 혈청 알부민)가 실온에 평형화되도록 합니다.
- 이 시간 동안, 페탄올에 배치하고 40 °C에서 30 분 동안 초음파 처리하여 커버립을 청소하십시오. 메탄올이 덮개를 완전히 덮고 수조의 수위가 용기의 메탄올 수준 이상인지 확인하십시오.
참고 : 메탄올은 독성이 있으며 적절한 화학 적 후드로 처리해야합니다. - 커버의 여분의 메탄올을 부드럽게 공기가 흐르는 입술을 말리십시오. 커버슬립 랙을 40°C 오븐에 15분 동안 놓아 덮어도 커버립이 건조되도록 합니다.
- 플라즈마 세척 프로세스를 시작합니다. 먼저, 커버립을 플라즈마 클리너에 넣고 공기 내림수밸브를 닫아 챔버 내부의 모든 공기를 배출합니다.
- 챔버가 진공 상태인 후, 높은 RF 전원 설정과 거의 완전한 진공을 사용하여 5분 동안 커버립을 청소하고 진공 챔버에 약간의 공기 섭취만 하면 됩니다. 플라즈마의 적절한 수준을 보장하기 위해, 플라즈마의 결과 색상이 꾸준하고 밝은 분홍색되도록 진공 챔버의 개방을 조정합니다.
참고: 플라즈마가 플라즈마 처리 단계의 기간 동안 밝은 분홍색 으로 남아 있는 공기를 사용할 때 매우 중요하며, 더 어두운 보라색 색상은 챔버에 공기가 부적절하게 양이 있음을 나타내고 최적이 아닌 플라즈마 처리를 초래할 것입니다. - 5분이 지나면 RF 전원을 차단하고 진공을 해제합니다.
참고: 플라즈마 챔버에서 제거하면 커버립이 덮여 있는지 확인하십시오.
- 하이드로겔 제제
- 초순수 300μL(즉, 2% (w/v) 아가로즈)와 6 mg의 초저용 온도 아가로즈를 결합합니다.
참고: 2% 아가로즈는 단백질이 없는 GUV를 만드는 데 사용됩니다. 아가로즈 용액은 2일 동안 45°C로 보관할 수 있다. - 3.1 단계에서 준비된 바와 같이 초순수 300μl과 초저온 아가로즈 9mg을 3w/v%의 아가로에 결합합니다. 3% 아가로즈는 단백질을 통합한 GUV를 만드는 데 사용될 것입니다.
- 용액을 90°C 열 블록에 10분 동안 배치하기 전에 잠시 용액을 소용돌이시다. 이어서, 튜브를 45°C 열 블록으로 이송하기 전에 튜브를 다시 소용돌이쳐 더 이상 사용할 때까지 용융 형태로 유지한다.
- 초순수 300μL(즉, 2% (w/v) 아가로즈)와 6 mg의 초저용 온도 아가로즈를 결합합니다.
- 아가로즈와 단백질 혼합
- 5-HT1AR 멤브레인 단편의 7 μL과 3% 아가로즈의 21 μL을 섞는다. 파이펫을 여러 번 천천히 위아래로 내려가 적절한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 45°C에서 1분 동안 배양합니다.
- 하이드로겔 및 지질 증착
- 단백질이 없는 GUV의 경우: 2%의 아가로즈 20μL를 사용하여 갓 플라즈마 를 청소한 커버립에 박막을 만듭니다. 아가로즈 액적 위에 또 다른 커버슬립을 빠르게 떨어뜨리고 커버립을 부드럽게 밀어 두 커버립에 얇은 필름을 만듭니다.
참고: 이 단계는 아가로즈가 아직 용융 된 형태로 있는 동안 액적의 슬라이딩이 발생해야한다는 점에서 까다롭습니다. - 단백질 통합 GUV의 경우: 단백질/아가로즈 혼합물을 한 번 더 위아래로 돌린 다음, 플라즈마 세척 커버슬립에 2% 아가로즈의 20 μL을 증착합니다. 위에서 설명한 슬립 캐스팅 방향을 따릅니다.
- 실온에서 30분 동안 빛으로부터 보호되는 아가로즈를 허용합니다.
- 아가로즈 층 위에 지질을 떨어 뜨립니다. 총 10 μL의 1mg/mL 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-인포콜린(POPC)을 사용 하 여 0.4 몰% 1,2-디팔미토일-sn 아가로즈 필름 위에 클로로포름에 ATTO 488(ATTO-488-DPPE) (또는 관심의 지질 혼합물)으로 표지된 글리세로-3-인포에탄탄민(DPPE). 가스 크로마토그래피 바늘을 사용하여 물방울을 입금하고 부드러운 공기 스트림을 통해 한 번에 한 방울을 퍼뜨립니다.
참고: 하이드로겔 위에 비교적 균일한 지질 층을 만들기 위해서는 이 단계에서 주의가 필요합니다. 또한, 클로로폼은 독성이 있으며 적절한 화학 적 후드로 처리해야합니다. - 커버슬립 위에 O-링을 배치한 다음 챔버의 상단 구성 요소를 O 링 위에 배치하여 Sykes-Moore(S-M) 챔버를 조립합니다. 제조업체가 제공한 키를 사용하여 챔버 구성요소를 함께 나사로 연결하여 챔버를 조립하여 챔버를 밀봉하고 누출을 방지하십시오.
참고: 챔버의 상단은 O 링에 조여야하지만 O 링이 챔버에 제대로 앉지 않으면 커버 슬립이 손상되지 않도록주의가 필요합니다. 또한, 부종 용액이 첨가될 때 챔버가 누출되지 않도록 챔버가 충분히 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 챔버를 충분히 조이지 못하면 시료가 누출되고 손실됩니다.
- 단백질이 없는 GUV의 경우: 2%의 아가로즈 20μL를 사용하여 갓 플라즈마 를 청소한 커버립에 박막을 만듭니다. 아가로즈 액적 위에 또 다른 커버슬립을 빠르게 떨어뜨리고 커버립을 부드럽게 밀어 두 커버립에 얇은 필름을 만듭니다.
- 소포의 붓기 와 수확
- 1x PBS에서 200mM 자당 450 μL을 부드럽게 파이프화하고 챔버를 부드럽게 눌러 전체 시스템을 수분을 공급하여 하이드로겔 지질 층의 적절한 완충 범위를 보장합니다.
참고: 자당 용액은 생물학적 관심 있는 프로브를 포함하는 재수화 완충액으로 대체될 수 있습니다. - 챔버를 45°C로 배치하고 챔버의 상단 부분을 커버슬립으로 덮어 증발을 방지합니다. 1시간 동안 이물질과 빛으로부터 보호된 시료가 팽창하도록 허용합니다.
- 사용할 96웰 플레이트의 각 웰에 초순수수에 1 mg/mL BSA1의 100 μL을 넣습니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 초순수물로 3회, PBS 1x200mM로 1회 세척합니다.
- 마지막으로 GUV 샘플 용액을 추가할 때까지 1x PBS에 200mMMM의 포도당을 추가합니다.
참고 : BSA는 GUV 흡착을 차단하는 데 사용되었다. - 하이드로겔이 팽창하도록 허용한 후, 부드럽게 흔들어 서 챔버를 눌러 하이드로겔 표면에 부착된 상태로 유지될 수 있는 GUV를 제거합니다. 그런 다음 GUV-자당 용액을 조심스럽게 피펫으로 마무리합니다.
참고: 모든 소포가 표면에서 분리되도록 하는 선택적 단계로, 자당 현탁액 중 일부를 하이드로겔 표면에 부드럽게 피펫합니다. - 서스펜션을 1x PBS에서 200mM 포도당의 700 μL을 포함하는 이전에 준비된 미세 원심분리기 튜브로 이동합니다.
참고: 밀도 그라데이션은 원심분리기 튜브의 바닥에 소포가 침전될 것입니다. - 소포가 마이크로센트리푸지 튜브의 바닥으로 가라앉을 수 있도록 한 시간 동안 정착하여 최적의 수집을 허용합니다.
- 포도당에서 GUV의 정착 후, 원심분리기 튜브 (정착 소포)의 바닥에서 300 μL을 이전에 준비된 BSA 처리 96 웰 플레이트로 전송하여 공초점 현미경하에서 소포를 검사합니다.
참고: 최종 시료에서 채취한 잔해의 양을 최소화하기 위해 마이크로원심분리기 튜브의 맨 바닥을 피하십시오.
- 1x PBS에서 200mM 자당 450 μL을 부드럽게 파이프화하고 챔버를 부드럽게 눌러 전체 시스템을 수분을 공급하여 하이드로겔 지질 층의 적절한 완충 범위를 보장합니다.
- 현미경의 밑에 견본을 확인하십시오.
- 샘플에 488 nm 레이저를 비추는 (이중 층이 ATTO-488-DPPE로 표시되었기 때문에 멤브레인을 시각화 할 수 있습니다).
- 샘플에 561 nm 레이저를 샤인 (그것은 NHS-로다민으로 표시 되었기 때문에 우리가 단백질을 시각화 할 수 있습니다).
참고: 광산화가 소포를 불안정하게 할 수 있기 때문에 샘플을 이미징하는 동안 주의가 필요합니다. 소포는 같은 날에 관찰되었다.
그림 1: 자세한 프로토콜 단계의 그림입니다. BioRender.com 만든 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단백질의 농도를 측정하였고, 라벨링 정도는 염료와 단백질 사이의 어금니 비로 1:1로 계산되었다. 공초점 현미경 검사를 사용하여 GUV를 검사함으로써 소포의 성공적인 형성 및 단백질 통합을 확인할 수 있었습니다. 지질은 0.4 mol% ATTO 488-DPPE로 표지되었고, 단백질은 1차 아민의 로다민 NHS-에스테르 변형을 통해 공유로 표지되었다. 도 2a 및 도 2b 는 각각 ATTO 488 및 로다민 채널에서 단백질 통합 소포를 보여준다. 모든 현미경 사진은 어두운 전류와 평면 고쳐졌습니다. 도 2c 및 도 2d 는 단백질이 통합되지 않은 음성 대조군 GUV를 나타내고 있다. 도 3a 및 도 3b 는 두 채널에서 동일한 소포의 파선 흰색 선에 의해 주어진 라인 강도 프로파일과 GUV를 통합한 단백질을 보여준다. 선 강도 프로파일은 이미지 내의 흰색 그려진 선을 따라 픽셀의 강도의 2차원 플롯을 보여줍니다. x축은 선을 따라 있는 거리이고 y축은 픽셀 강도입니다. ImageJ 소프트웨어는 표시된 선의 프로파일 강도를 플롯하는 데 사용되었습니다.
그림 2: 단백질이 없는 GUV와 GUV를 통합한 단백질을 비교하는 현미경 사진(대조군). 현미경(a) 및 (b) 각각 ATTO 488 및 로다민 채널과 GUV 형광을 통합한 단백질을 각각 보여준다. 현미경(c) 및 (d)는 각각 ATTO 488 및 로다민 채널에 흥분할 때 GUV를 생략한 단백질을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 탑 행은 ATTO 488 (a) 및 로다민 (b) 채널에서 GUV를 통합한 단백질의 현미경 그래프를 보여줍니다. 표시된 흰색 파선에 대한 선 강도 프로파일은 아래와 같습니다. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
플라즈마 처리와 지질 증착이라는 전체 프로토콜의 성공에 중요한 두 가지 단계를 확인했습니다. 플라즈마 청소는 두 가지를 달성 : 첫째, 유리 표면에서 유기 물질의 흔적을 제거; 둘째, 커버슬립 표면을 활성화하여 유리 표면 친수성이 증가함에 따라 웨이트성이 증가하여 62,63. 커버슬립 표면 후 플라즈마 세척을 만지면 초클린 표면이 비활성화되고 오염되는 것을 강력히 권장합니다. 우리의 추천은 아가로즈 슬립 주조 단계에 대한 커버립을 처리 할 때 커버 슬립의 가장자리와 밑면을 만터치하는 것입니다. 이 방법은 가스 크로마토그래피(GC) 바늘과 공기 스트림이 한 번에 몇 마이크로리터의 지질 용액을 증착해야 하는 드롭와이즈 지질 증착을 사용하여 하이드로겔 표면에 지질 필름의 양을 정밀하게 제어할 수 있도록 합니다. 이 방법의 단점은 신중하게 수행하지 않으면 두꺼운 지질 필름을 가진 몇 가지 선택 영역이 발생할 수 있으므로 GUV 수율이 감소할 수 있습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 이점 중 하나는 플랫폼 자체의 유연성입니다.이 방법은 단백질 및 지질 조성의 변화뿐만 아니라 캡슐화 및 버퍼 수정에 매우 잘 빌려준다. 이 프로토콜은 원칙적으로 아데노신 수용체(A2AR)에서 부터 기능 희생 없이 아쿠아포린을 심는 다양한 다른 막 단백질을 성공적으로 통합할 수 있기 때문에 모든 대막 단백질을 포함할 수 있습니다. 전통적으로, 단백질은 세제에 의한 용해화 에 의하여 GUV에 통합되었습니다 또는 proteo-liposomes 또는 더 이상 형성된 GUV65로 통합될 수 있는 작은 unilamellar 소포로 통합되었습니다. 변형된 하이드로겔 팽창 방법의 장점은 세제 또는 중간 소포의 종속성을 제거하고 중간 수화 스캐폴드를 제공한다는 것입니다. 이 것의 장점은 두 가지: 우리는 안정적으로 상기 세제의 농도에 관한 더 많은 준비와 관리를 필요로 세제 교환 방법에 의존하지 않고 보다 생리적으로 관련 버퍼에 멤브레인에 기능 GPCRs를 통합 할 수 있습니다, 그리고 GUV가 하이드로겔의 표면떨어져 싹 이 공정이중 층6666에서 단백질의 올바른 방향을 허용 . 우리는 GUV 신진 프로세스가 처음부터 정확한 단백질 방향을 장려하는 더 큰 미크론 규모의 소포로 많은 작은 나노미터 규모의 소포의 결합을 포함한다는 것을 보여주었습니다. 우리는 이전 작업에서 이 것을 보여 주었으며, 요컨대, 우리는 아데노신 수용체의 특정 세포경고리를 표적으로 하는 항체를 공유적으로 표지하고 단백질로 표지된 항체를 배양한 다음, 변형된 하이드로겔 팽창 방법을 사용하여 지질 염료 표지 된 GUV에 표지된 단백질을 통합하였다. 그런 다음 단백질 에 통합 된 소포를 양층 교차 할 수없는 충전 된 담종에 노출시켰습니다. 우리는 그 후에 지질 염료의 형광에 있는 50% 감소를 봅니까, 그러나 표지된 단백질의 형광은 적당한 방향을 보여주는 quencher에 의해 영향을 받지 않습니다 남아 있습니다44.
우리의 실험실에서 이전 연구는 지질 헤드 그룹 충전, zwitterionic 및 그물 이온 충전 지질뿐만 아니라 pH, 이온 강도, 삼투성 및 하이드로겔 농도가 GUV formation67의 역학에 있는 버퍼 및 하이드로겔 특성을 조사하는 역할을 조사했습니다. 요컨대, 지질 전하는 GUV 형성에 크게 영향을 미치지 않으며, 자당 농도 증가와 같은 완충 특성(예를 들어, 185mM 의 이온 강도 PBS 버퍼에서 500mM Sucrose)은 GUV 형성에 부정적인 영향을 미치며, 불규칙한 모양의 소포는 수확에 쉽게 빌려주지 않을 가능성이 높습니다. 산성 용액(pH = 3)은 형성 속도를 높이고, 보다 기본적인 용액(pH = 8)은 GUV 형성 속도를 억제한다. GUV는 여전히 산성 및 기본 버퍼모두에서 형성되며 소포 크기의 한계 차이만 있습니다. 낮은 아가로즈 농도(~0.1-1w/v%)도 균일한 표면 커버리지의 부족과 하이드로겔 부종 감소, 하이드로겔 표면에서 GUV의 결합 및 신진에 필요한 힘으로 인해 GUV 형성에 부정적인 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 100-200 mMMMMMMMMM의 자당/포도당 용액을 갖는 2w/v% 최종 아가로즈 농도를 pH 7.4에서 185m PBS의 완충 이온 강도와 결합하여 아가로즈 팽윤, GUV 형성 속도 및 후속 소포 크기의 균형을 이루게 하는 것을 결정했습니다. 단백질을 함유하는 소포의 경우, 초기 아가로즈 농도를 3w/v%로 증가시키면 단백질 용액을 첨가한 후 2w/v%의 최종 아가로즈 농도가 허용됩니다. 형성 역학 외에도, 자당/포도당 완충 시스템은 또한 형성된 GUV의 퇴적물 및 후속 수집뿐만 아니라 위상 대비 현미경 65,68하에서 시각화를 용이하게 한다.
이 프로토콜에 관한 주의의 몇 가지 포인트가 있다, 특히 아가로즈 및 소포의 선택에 관한. 예를 들어, 우리는 초저용온도 아가로즈를 사용하는 동안, 아가로즈-물 현탁액은 녹아 되기 위하여 적어도 60°C에 도달해야 하며, 아가로즈 단백질 혼합물은 45°C에서 배양된다. 우리의 경험에서,이 온도는 5-HT1AR의 활동을 제거하지 않습니다, 하지만 주의는 다른 단백질에 대한 보증. 일반적으로, 우리가 사용하는 아가로즈는 20°C에서 겔화하기 시작하여 20°C 이상의 온도에서 팽윤 반응이 일어날 수 있지만, 이 과정은 그 온도 이하로 작동할 수 없습니다. 또한 온도가 20°C에 가까워질수록 팽창 단계가 덜 효율적이며 GUV 수율의 후속 감소로 이어질 수 있습니다. 따라서, 용융 아가로즈를 유지하는 데 필요한 온도에 주의가 필요하며, 최종 샘플에 포함되는 과잉 중단 된 아가로즈를 피하기 위해 침전 용액을 흡입뿐만 아니라 관심있는 단백질을 분해하지 않도록하는 데 주의가 필요합니다. 현재 상태에서이 방법은 또한 이질적인 GUV 인구 규모귀착되며, 일부 소포는 소포 내의 소포와 같은 다각형 및 기타 결함이있는 소포 현상을 표시합니다. 이것은 일반적인 GUV 형성 방법의 전형이고 현미경 검사법과 분석을 위한 소포를 선택할 때 경계와 재량이 필요합니다. 비정상적으로 높은 수준의 형광을 표시하는 GUV는 분석에도 권장되지 않으며, 아가로즈는 이러한 소포 중 일부의 내부에서 찾을 수 있습니다. 우리의 실험실에서 게시되지 않은 연구는 이 기술을 사용하여 만든 소포를 사용하여 마이크로 피펫 포부 실험을 실행할 수 있었으며, 아가로즈 방법은 루멘에서 역학을 바꾸는 아가로즈없이 소포를 생성한다는 것을 설명합니다.
한계를 제쳐두고, 이 프로토콜은 단백질 통합 GUV를 생성하는 강력하고 간단한 방법을 제시합니다. 이것은 전기 전류 또는 부드러운 수화를 포함하는 소포 형성의 그밖 방법에서 출발입니다, 단백질의 구조물을 현저하게 손상시키고 기능하지 않는 렌더링하거나 추가 세제 용해화 및 제거 단계를 요구할 것입니다. GPCR이 모든 제약 목표의 3분의 1 이상을 나타낸다는 점을 감안할 때, 고도로 튜닝가능한 고처리량, 생체 모방 플랫폼에서 이 단백질 제품군을 연구할 수 있다는 점에서 상당한 관심이 있습니다. 보다 구체적으로, 이 작업의 응용 프로그램은 단백질 지질 상호 작용의 연구, 지질 마이크로 환경이 단백질 기능 및 국소화에 미치는 영향, 그리고 제약 약물 개발 및 발견을 알릴 수있는 다른 기본적인 생물 물리학 질문에서 다양합니다. 이것의 예는 지질 산화의 결과로 수용체 기능에 있는 분산을 분별할 수 있던 우리의 실험실 내완료된 작업에서 찾아볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 귀중한 토론과 조언을 매튜 블로셔에게 감사드립니다. 이 작품은 해군 연구실 (N00014-16-16-1-2382)과 국립 과학 재단 (PHY-1915017)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
| TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
| 16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
| Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
| glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
| standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
References
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
- Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
- Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
- Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
- Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
- Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
- Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
- Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
- Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
- Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
- le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
- Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
- Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
- Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
- Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
- López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
- Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Nichols, D. E., Nichols, C. D.
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
- Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
- Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
- Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
- Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
- Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
- Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
- Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
- Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
- Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
- Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
- Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
- Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
- Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
- Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
- Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
- Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
- Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).
