Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruktion av modell lipidmembran som innehåller G-protein kopplade receptorer (GPCR)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll använder agarose svullnad som en kraftfull och generaliserbar teknik för att införliva integrerade membranproteiner (IMPs) i jätte unilameller lipid vesicles (GUVs), som beskrivs här för rekonstitution av mänskliga 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), en av klasserna av farmakologiskt viktiga G protein-kopplade receptorer.

Abstract

Robusta in vitro-undersökningar av strukturen och funktionen hos integrerade membranproteiner har varit en utmaning på grund av plasmamembranets komplexitet och de många faktorer som påverkar proteinbeteendet i levande celler. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är ett biomimetiskt och mycket tunable in vitro-modellsystem för att undersöka protein-membraninteraktioner och undersöka proteinbeteende på ett exakt, stimulansberoende sätt. I detta protokoll presenterar vi en billig och effektiv metod för att tillverka GUVs med den mänskliga serotonin 1A-receptorn (5-HT1AR) stabilt integrerad i membranet. Vi tillverkar GUVs med en modifierad hydrogel svullnad metod; Genom att deponera en lipidfilm ovanpå en blandning av agaros och 5-HT1AR och sedan hydrera hela systemet, kan blåsor bildas med korrekt orienterad och funktionell 5-HT1AR införlivad i membranet. Dessa GUVs kan sedan användas för att undersöka protein-membran interaktioner och lokalisering beteende via mikroskopi. I slutändan kan detta protokoll öka vår förståelse av funktionaliteten hos integrerade membranproteiner, vilket ger djupgående fysiologisk insikt.

Introduction

Syntetiska modellmembran är kraftfulla verktyg i undersökningen av de grundläggande egenskaperna och funktionerna hos biomembraner. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är en av de mest framstående plattformarna för att studera en mängd olika plasmamembranegenskaper och kan konstrueras för att efterlikna olika fysiologiska förhållanden1,2,3,4,5,6,7,8. Det är välkänt att plasmamembranet och dess organisation spelar en nyckelroll i en mängd cellulära processer, såsom signaltransduktion, vidhäftning, endocytos och transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs har tillverkats med olika metoder, inklusive mild hydrering16, hydrogelsvullnad17, elektroformation18, mikrofluidiska tekniker19,20,21,22, jetting23 och lösningsmedelsutbyte24,25,26. På grund av utmaningar med att hantera integrerade membranproteiner (IMPs) har in vitro-plattformar för att studera dem begränsats. GUVs presenterar en förenklad plattform för att studera IMP: er i en miljö som efterliknar deras ursprungliga miljö. Även om det har funnits flera metoder för proteinrekonstitution i GUVs, uppstår utmaningar från att införliva proteiner med rätt orientering och upprätthålla protein funktionalitet27.

Den mest framgångsrika proteinrekonstitutionen i GUV kräver tvättmedelsutbytesmetoden. vilket innebär att proteinerna från deras ursprungliga miljö solubiliseras med tvättmedel, följt av proteinrening, och sedan ersätta tvättmedelsmolekylerna med lipider genom olika metoder28. Medan tvättmedel tjänar till att stabilisera den tertiära strukturen hos IMPs under rening, är tvättmedel micelles en relativt onaturlig miljö för dessa proteiner, som är bättre stabiliserade, särskilt för funktionella studier, i lipidbilayers28,29,30. Dessutom har det varit svårt att införliva funktionella transmembranproteiner i lipidbilayer med traditionella GUV-tillverkningstekniker på grund av dessa proteiners storlek, delikatess och de ytterligare åtgärder för utbyte av tvättmedel som skulle behövas27,31,32,33. Användningen av organiskt lösningsmedel för att avlägsna tvättmedel orsakar proteinaggregering och denaturering34. En förbättrad tvättmedelsmedierad metod har varit lovande, men försiktighet behövs för tvättmedelsborttagningssteget och optimering kan behövas för specifika proteiner31,35. Dessutom kan metoder som använder elektroformation begränsa valet av protein och kanske inte är lämpliga för alla lipidkompositioner speciellt laddade lipider31,36,37. En annan teknik som har använts är peptidinducerad fusion av stora unilamellerblåsor (LUVs) som innehåller önskat protein med GUVs, även om det befanns vara mödosamt och kan leda till införande av främmande molekyler-de fusogenic peptiderna33,38,39. Gigantiska plasmamembranblåsor (GPMVs), som härrör från levande celler, kan användas för att övervinna några av dessa problem, men de tillåter minimal kontroll av den resulterande lipid- och proteinsammansättningen14,40,41. Därför utgör integrationen av IMP i bilipidskiktet av GUVs med hjälp av vår modifierade agarose svullnad metod en tillförlitlig metod för att ytterligare undersöka dessa proteiner i membran miljön42,43,44,45.

Cellulär signalering och kommunikation involverar en familj av proteiner som kallas G-proteinkopplade receptorer (GPCR); GPCR är bland den största familjen av proteiner och är associerade med modulering humör, aptit, blodtryck, kardiovaskulär funktion, andning, och sömn bland många andra fysiologiska funktioner46. I denna studie använde vi human serotonin 1A-receptor (5-HT1AR) som är en prototypisk medlem av GPCR-familjen. 5-HT1AR finns i centrala nervsystemet (CNS) och blodkärlen; det påverkar många funktioner som kardiovaskulära, gastrointestinala, endokrina funktioner, samt deltar i regleringen av humör47. Ett stort hinder för GPCR-forskning uppstår från deras komplexa amfifila struktur, och GUVs presenterar en lovande plattform för undersökning av olika egenskaper av intresse, allt från proteinfunktionalitet, lipid-proteininteraktioner och protein-proteininteraktioner. Olika metoder har använts för att studera lipid-proteininteraktioner såsom ytplasmonresonans (SPR)48,49, nukleär magnetisk resonansspektroskopi (NMR)50,51, proteinfettöverlägg (PLO) analys51,52,53,54, infödd masspektrometri55, isoterm titreringskaorimetri (ITC)56,57 och liposom sedimenteringsanalys58,59. Vårt labb har använt den förenklade GUV-metoden för att undersöka effekten av lipid-proteininteraktioner på proteinfunktionalitet genom att inkapsla BODIPY-GTPγS, som binder till Giα-underenheten i receptorns aktiva tillstånd. Deras bindning släcker fluoroforen som producerar en fluorescenssignal som kan detekteras över tid45. Dessutom undersökte olika studier lipid-proteininteraktioner och proteiners roll för att känna av eller stabilisera membrankrökning60,61, och att använda en genomförbar GUV-metod kan vara en viktig fördel.

Detta protokoll visar en enkel metod för att införliva GPCRs i membranet av GUVs med hjälp av ett modifierat agarose hydrogel system17,42. Dessutom, baserat på vårt tidigare arbete, kan vår metod vara lämplig för IMP som kan bära kortvarig exponering för 30-40 °C. Kortfattat sprider vi en tunn film av agaros i kombination med membranfragment som innehåller GPCR av intresse. Efter gelering av detta lager deponerar vi en lipidlösning ovanpå agaroset och låter lösningsmedlet avdunsta. Rehydrering av systemet utfördes sedan med en vattenbuffert, vilket resulterade i bildandet av GUVs med protein som ingår i lipidbilayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinmärkning

  1. Låt NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragment och en 7 K MWCO spin desaltning kolonn att balansera vid rumstemperatur.
  2. Lös upp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoxid (DMSO).
  3. Tillsätt 5 μL 1 M natriumbikarbonatlösning för att öka pH-värdet på 5-HT1AR-lösningen till pH 8.
  4. Tillsätt 3,66 μL av NHS-rhodaminlösningen till 50 μL av 5-HT1AR-lösningen och pipetten försiktigt upp och ner i ett mikrocentrifugerör.
    OBS: Se till att ha minst 10x molaröverskott av NHS-rhodamin.
  5. Håll blandningen skyddad mot ljus och sätt på rotatorn vid rumstemperatur i 1 h.
  6. Tvätta en 7 k MWCO-spinnkolonn med 200 μL 1x fosfatbuffertsaltlösning (1x PBS) tre gånger i 1,5 min vid 1,5 RCF för varje tvätt.
  7. Tillsätt det märkta proteinet i en kolumn och balansera mängden i ett annat mikrocentrifugerör.
  8. Snurra ner det märkta proteinet en gång i 5 min vid 1,5 RCF.
  9. Ta ett UV-vis-spektrum med en nanodroppetropofotometer vid 280 nm och 554 nm och beräkna märkningseffektiviteten enligt tillverkarens handbok.
  10. Förvara det märkta proteinet vid 5 °C tills vidare. Lösningen är stabil i ungefär en vecka efter märkning.

2. GUV med membran-inkorporerad 5-HT 1A

  1. Beredning av material och reagenser
    1. Låt proteinet, lipiderna och BSA (Bovin serumalbumin) balansera till rumstemperatur.
    2. Rengör täckena genom att placera dem i metanol och soniska i 30 min vid 40 °C. Se till att metanolen helt täcker täckingarna och att vattennivån i vattenbadet ligger över metanolnivån i behållaren.
      OBS: Metanol är giftigt och bör hanteras i lämplig kemisk huva.
    3. Torka av överskottet av metanol på täcksläparna med en mild luftström. Placera täckhyllan täckt i en ugn på 40 °C i 15 minuter för att säkerställa att de överflödiga täcksläparna torkar av.
    4. Påbörja plasmarengöringsprocessen. Placera först täcksliparna i plasmarengöraren och stäng av luftintagsventilen för att evakuera all luft inuti kammaren.
    5. När kammaren är under vakuum rengör du täckslämmorna i 5 minuter med hög RF-effektinställning och ett nästan komplett vakuum, med endast ett litet luftintag i vakuumkammaren. För att säkerställa rätt plasmanivå, justera vakuumkammarens öppning så att plasmans resulterande färg är en stadig, ljusrosa.
      OBS: Det är viktigt när du använder luft att plasman förblir en ljusrosa färg under plasmabehandlingssteget, eftersom en mörkare lila färg indikerar att det finns en felaktig mängd luft i kammaren och kommer att resultera i en suboptimmal plasmabehandling.
    6. När 5 min har passerat stänger du av RF-strömmen och släpper vakuumet.
      OBS: Se till att täckbedragena förblir täckta när de tas ut ur plasmakammaren.
  2. Hydrogel beredning
    1. Kombinera 6 mg ultralåg smälttemperatur agaros med 300 μL ultrapure vatten (dvs. 2% (w/v) agaros).
      OBS: 2% agaros kommer att användas för att göra proteinfria GUVs. Agaroselösning kan hållas vid 45 °C i två dagar.
    2. Kombinera 9 mg lågtemperaturagaros med 300 μL ultrapurvatten för 3 w/v% agaros med den som beredd i steg 3.1. 3% agaros kommer att användas för att göra protein införlivade GUVs.
    3. Virvel lösningen kort innan du placerar dem på 90 °C värmeblocket i 10 min. Virvla sedan röret igen innan du överför det till ett 45 °C värmeblock för att hålla det i smält form tills vidare användning.
  3. Agaros- och proteinblandning
    1. Blanda 21 μL 3% agaros med 7 μL 5-HT1AR membranfragment. Pipettera upp och ner långsamt många gånger för att säkerställa tillräcklig blandning. Inkubera sedan vid 45 °C i 1 min.
  4. Hydrogel- och lipiddeposition
    1. För proteinfria GUV: Gör en tunn film på nyrengjorda täcken med 20 μL 2% agaros. Släpp snabbt ett annat täckslip ovanpå agarosedroppen och skjut försiktigt isär täcksläckorna för att göra en tunn film på båda täcksliparna.
      OBS: Detta steg är knepigt genom att glidningen av droppen måste ske medan agaroset fortfarande är i smält form.
    2. För proteininkorporerade GUV: Pipettera protein-/agarosblandningen upp och ner en gång till och deponera sedan 20 μL av 2% agaros på ett plasmarenat täckslip. Följ slip-casting-anvisningarna enligt beskrivningen ovan.
    3. Låt agarosen gelskyddad mot ljus i 30 min vid rumstemperatur.
    4. Sätt in lipiderna droppvis ovanpå agarosskiktet. Använd totalt 10 μL 2 mg/ml 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfatolin (POPC) med 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) märkt med ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (ATTO-488- DPPE) (eller lipidblandning). Sätt ner dropparna med en gaskromatografinål och sprid en droppe i taget via en mild luftström.
      OBS: Försiktighet krävs med detta steg för att göra ett relativt enhetligt lager av lipider ovanpå hydrogelen. Kloroform är också giftigt och bör hanteras i lämplig kemisk huva.
    5. Montera Sykes-Moore (S-M) kamrarna genom att placera en O-ring ovanpå täckslipet och placera sedan den övre komponenten i kammaren ovanpå O-ringen. Använd den nyckel som tillhandahålls av tillverkaren för att montera kammaren genom att skruva ihop kammarkomponenterna för att försegla kammaren och förhindra läckage.
      OBS: Kammarens överkant ska dras åt på O-ringen, men försiktighet krävs för att se till att täcket förblir intakt eftersom täckslipet kan spricka om O-ringen inte sitter ordentligt i kammaren. Se också till att kammaren är tillräckligt tätad så att kammaren inte läcker när svullnadslösningen tillsätts. Om kammaren inte dras åt tillräckligt resulterar det i läckage och förlust av prov.
  5. Svullnad och skörd av blåsor
    1. Återfukta hela systemet genom att försiktigt leda 450 μL sackaros i 1x PBS och försiktigt knacka på kamrarna för att säkerställa tillräcklig bufferttäckning av hydrogel-lipidskikten.
      OBS: Sackaroslösningen kan ersättas med en rehydreringsbuffert som innehåller biologiska sonder av intresse.
    2. Placera kamrarna vid 45 °C och täck kammarens övre del med ett täckslip för att förhindra avdunstning. Låt provet svälla, skyddat mot skräp och ljus i 1 timme.
    3. Tillsätt 100 μL 1 mg/ml BSA i ultrapurvatten i varje brunn på en 96-brunnsplatta avsedd att användas. Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
    4. Tvätta tre gånger med ultrarent vatten och en gång med 200 mM sackaros i 1x PBS.
    5. Tillsätt slutligen 200 mM glukos i 1x PBS tills GUV-provlösningen tillsätts.
      OBS: BSA användes för att blockera GUV adsorption.
    6. Efter att ha låtit hydrogelen svälla skakar du försiktigt och knackar på kammaren för att lossa eventuella GUV som kan förbli fästa vid hydrogelytan. Rör sedan försiktigt upp GUV-sackaroslösningen.
      OBS: Som ett valfritt steg för att säkerställa att alla blåsor lossnar från ytan, rör försiktigt en del av sackarosupphängningen tillbaka på hydrogelytan.
    7. Flytta suspensionen till ett tidigare förberett mikrocentrifugerör som innehåller 700 μL 200 mM glukos i 1x PBS.
      OBS: Densitetsgradienten leder till sedimentering av blåsorna till botten av centrifugröret.
    8. Låt blåsorna sätta sig i ytterligare en timme för att säkerställa att blåsorna kan sjunka till botten av mikrocentrifugeröret, vilket möjliggör optimal insamling.
    9. Efter sedimentering av GUV i glukos, överför 300 μL från botten av centrifugröret (de sedimenterade blåsorna) till den tidigare beredda och BSA-behandlade 96-brunnsplattan för att undersöka vesiklarna under det konfokala mikroskopet.
      OBS: Var noga med att undvika botten av mikrocentrifugeröret för att minimera mängden skräp som samlas in i det slutliga provet.
  6. Kontrollera proverna under mikroskopet.
    1. Lys en 488 nm laser på provet (som gör att vi kan visualisera membranet, eftersom bilayer har märkts med ATTO-488-DPPE).
    2. Shine en 561 nm laser på provet (som gör att vi kan visualisera proteinet, eftersom det har märkts med NHS-Rhodamine).
      OBS: Försiktighet krävs när provet avbildas eftersom fotooxidation kan destabilisera blåsorna. Blåsor observerades samma dag.

Figure 1
Bild 1: Illustration av de detaljerade protokollstegen. Skapad med BioRender.com Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Koncentrationen av protein mättes, och graden av märkning beräknades som molarförhållandet mellan färgämnet och proteinet till 1:1. Genom att undersöka GUVs med hjälp av konfokal mikroskopi, kunde vi bekräfta framgångsrik bildandet och protein integration av blåsor. Lipiderna var märkt med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, och proteinet var kovalent märkt via rhodamin NHS-ester modifiering av primära aminer. Figur 2a och figur 2b visar en proteininkorporerad vesikel i ATTO 488 respektive rhodaminkanalerna. Alla mikrografer har korrigerats med mörk ström och flatfield. Figur 2c och figur 2d visar en negativ kontroll GUV utan protein införlivat. Figur 3a och figur 3b visar ett proteininkorporerat GUV med linjeintensitetsprofiler som ges av den streckade vita linjen i samma blåsor i båda kanalerna. Linjeintensitetsprofilen visar en tvådimensionell plot av pixlarnas intensitet längs den vita ritade linjen i bilden. X-axeln är avståndet längs linjen och y-axeln är pixelintensiteten. ImageJ-programvara användes för att plotta profilintensiteten för den angivna linjen.

Figure 2
Figur 2: Mikrografer som jämför proteininkorporerade GUV:er och GUV utan protein (kontroll). Mikrografer (a) och b) visar protein införlivad GUV fluorescens med respektive ATTO 488 respektive rhodamin kanaler. Mikrografer (c) och (d) visar ett protein utelämnat GUV när det är upphetsad med ATTO 488 respektive rhodamin kanaler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Översta raden visar mikrografer av proteininkorporerade GUV i ATTO 488 (a) och rhodamin b) kanaler. Linjeintensitetsprofiler för de angivna vitstreckade linjerna finns nedan. Analysen utfördes med hjälp av ImageJ-programvara. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har identifierat två steg som är avgörande för framgången för det övergripande protokollet: plasmabehandling och lipiddeposition. Plasmarengöring av täcksliparna är avgörande för att säkerställa att det finns tillräcklig täckning och vidhäftning av agaroshydrogelen till glastäcket. Plasmarengöring åstadkommer två saker: för det första tar det bort spår av organiskt material från glasytan; För det andra aktiverar den täckytan, vilket möjliggör en ökning av vätbarheten eftersom glasytans hydrofilicitet ökar62,63. Att röra täckytan efter plasma kommer att inaktivera och förorena den ultraclean ytan och rekommenderas starkt mot. Vår rekommendation är att endast vidröra själva kanterna och undersidan av täckslipet vid hantering av täcksliparna för agarose slip casting steg. Det andra kritiska steget är nedfallet av lipider på den torra hydrogelytan. Denna metod använder en droppvis lipiddeposition, vilket kräver en gaskromatografi (GC) nål och en luftström för att deponera några mikroliter lipidlösning åt gången, vilket möjliggör exakt kontroll av mängden lipid som tillsätts och placeringen av lipidfilmen på hydrogelytan. Nackdelen med denna metod är att om den inte görs noggrant kan det resultera i några utvalda områden med en tjockare lipidfilm, vilket resulterar i minskade GUV-utbyten. Således är det viktigt att se till att det finns så jämnt tunt av ett lipidskikt som möjligt på agarosens yta.

En av de viktigaste fördelarna med detta protokoll är flexibiliteten hos själva plattformen; denna metod lämpar sig mycket bra för förändringar i protein- och lipidkomposition, liksom inkapsling och buffertändringar. Detta protokoll kan i princip inkludera alla transmembranproteiner, eftersom vi framgångsrikt har kunnat införliva ett antal olika transmembranproteiner, allt från adenosinreceptorn (A2AR) till växtakvadiner utan att offra funktionalitet42,45,64. Traditionellt har proteiner införlivats i GUV efter solubilisering av tvättmedel eller införlivande i proteo-liposomer eller små unilameller vesicles som sedan kan integreras i en förformad GUV65. Fördelen med vår modifierade hydrogelsvullnadmetod är att den tar bort beroendet av tvättmedel eller mellanliggande blåsor och ger en mellanliggande hydratiserad byggnadsställning. Fördelarna med detta är tvåfaldiga: vi kan stabilt införliva funktionella GPCR i membranet i en mer fysiologiskt relevant buffert utan att förlita oss på tvättmedelsutbytesmetoder som kräver mer förberedelse och vård när det gäller koncentrationen av nämnda tvättmedel, och att den process genom vilken GUVs knoppar av hydrogelens yta möjliggör korrekt orientering av proteinerna i bilayer66 . Vi har visat att GUV-spirande processen innebär sammanslagning av många mindre blåsor i nanometerskala till större blåsor i mikronskala, vilket uppmuntrar till korrekt proteinorientering från början. Vi har visat att så är fallet i vårt tidigare arbete. Kort sagt, vi kovalent märkt en antikropp som riktar sig mot en specifik cytosolisk slinga av Adenosin receptorn och inkuberade den märkta antikroppen med proteinet, och införlivade sedan det märkta proteinet i lipidfärg-märkta GUVs med hjälp av den modifierade hydrogel svullnad metoden. Vi exponerade sedan de protein-införlivade blåsorna för en laddad quencher, som inte kan korsa bilayer. Vi ser därefter en 50% minskning av fluorescens av lipidfärgämnet, men fluorescensen av det märkta proteinet förblir opåverkad av quencher, vilket visar korrekt orientering44.

Tidigare arbete från vårt labb har undersökt den roll där lipidhuvudgruppsladdning, zwitterionic och net-joniska laddade lipider, liksom buffert- och hydrogelegenskaper som pH, jonstyrka, osmolaritet och hydrogelkoncentration har på dynamiken i GUV-formation67. Kort sagt, lipidladdning påverkar inte i stor utsträckning GUV-bildandet, medan buffertegenskaper som ökningar av sackaroskoncentrationen (t.ex. 500 mM sackaros i 185 mM jonisk styrka PBS-buffert) påverkar GUV-bildandet negativt, vilket resulterar i oregelbundet formade blåsor som sannolikt inte lätt kommer att låna sig till skörd. Sura lösningar (pH = 3) ökar formationshastigheten, medan en mer grundläggande lösning (pH = 8) undertrycker GUV-bildningshastigheten. GUVs bildas fortfarande vid både sura och grundläggande buffertar, med endast marginella skillnader i blåsstorlek. Låga agaroskoncentrationer (~ 0,1-1 w/v%) påverkar också GUV-bildandet negativt på grund av brist på homogen yttäckning och en minskning av hydrogelsvullnad, en nödvändig kraft i kolescensen och spirande av GUV från hydrogelytan. Således har vi fastställt att en 2 w/v% slutlig agaroskoncentration med en sackaros/ glukoslösning på 100-200 mM, kombinerat med en buffert jonisk styrka på 185 mM PBS vid pH 7,4 uppnår en bra balans mellan agarossvullnad, GUV-formationshastighet och efterföljande vesikelstorlek. För blåsor som innehåller protein möjliggör en ökning av den ursprungliga agaroskoncentrationen till 3 w/v% en slutlig agaroskoncentration på 2 w/v% efter tillsats av proteinlösningen. Förutom formationsdynamik underlättar sackaros-/glukosbuffertsystemet också sedimentering och efterföljande insamling av bildade GUV: er, samt visualisering under faskontrastmikroskopi65,68.

Det finns några försiktighetspunkter när det gäller detta protokoll, särskilt när det gäller agaros och val av blåsor. Till exempel, medan vi använder en ultralåg smälttemperatur agaros, måste agaros-vatten suspensionen nå minst 60 °C för att bli smält, och agaros-proteinblandningen inkuberas vid 45 °C.  Enligt vår erfarenhet eliminerar denna temperatur inte aktiviteten hos 5-HT1AR, men försiktighet är berättigad för andra proteiner. I allmänhet börjar agarosen vi använder gel vid 20 °C och därmed kan svullnadsreaktionen ske vid temperaturer över 20 °C, men denna process kan inte fungera under den temperaturen. Det bör också noteras att ju närmare temperaturen kommer till 20 °C, desto mindre effektivt blir svullnadssteget, vilket leder till efterföljande minskningar av GUV-utbyten. Därför krävs försiktighet för den temperatur som krävs för att bibehålla den smälta agarosen och se till att nämnda temperatur inte kommer att denaturera proteinet av intresse samt aspirera sedimenteringslösningen för att undvika att överskott av suspenderad agaros ingår i det slutliga provet. Denna metod i sitt nuvarande tillstånd resulterar också i en heterogen GUV-populationstorlek, med vissa blåsor som visar multilamellritet och andra bristfälliga blåsor fenomen som blåsor inom blåsor. Detta är typiskt för vanliga GUV-bildningsmetoder och kräver vaksamhet och diskretion när man väljer blåsor för mikroskopi och analys. GUVs som visar ovanligt höga nivåer av fluorescens rekommenderas inte heller för analys, eftersom agaros finns på insidan av några av dessa blåsor. Opublicerat arbete från vårt labb har kunnat köra mikropipette aspiration experiment med hjälp av blåsor gjorda med hjälp av denna teknik, vilket illustrerar att agarose metoden producerar blåsor utan mekaniker-ändra agarose i lumen.

Bortsett från begränsningar presenterar detta protokoll en robust och enkel metod för att generera proteininkorporerade GUVs. Det kan generera höga utbyten av GUVs i fysiologiskt relevanta förhållanden som införlivar korrekt orienterade transmembranproteiner i bilayer utan att kompromissa med deras funktionalitet. Detta är en avvikelse från andra metoder för vesikelbildning, som involverar elektriska strömmar eller mild hydrering, som avsevärt skulle skada proteinets struktur och göra det icke-funktionellt eller kräva ytterligare tvättmedelssluklings- och borttagningssteg. Med tanke på att GPCR representerar uppemot en tredjedel av alla farmaceutiska mål finns det ett betydande intresse för att kunna studera denna familj av proteiner i en mycket tunable, hög genomströmning, biomimetisk plattform. Mer specifikt sträcker sig tillämpningarna av detta arbete från studier av protein-lipidinteraktioner, hur lipidmikromiljön påverkar proteinfunktionalitet och lokalisering och andra grundläggande biofysiska frågor som kan ligga till grund för läkemedelsutveckling och upptäckt. Ett exempel på detta finns i det arbete som utförts i vårt labb, som har kunnat urskilja variationer i receptorns funktionalitet som ett resultat av lipidoxidation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Matthew Blosser för värdefull diskussion och råd. Detta arbete stöddes av Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) och National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

Bioengineering nummer 180
Konstruktion av modell lipidmembran som innehåller G-protein kopplade receptorer (GPCR)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter