Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62937
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

Summary

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

Abstract

אלגנס Caenorhabditis (C. elegans) הוכיח להיות מודל מצוין לחקר אינטראקציות מארח-חיידקים ואת המיקרוביום, במיוחד בהקשר של המעיים. לאחרונה, דגימה אקולוגית של נמטודות Caenorhabditis בר גילה מגוון רחב של חיידקים הקשורים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות, מיקרוסורידיה. רבים של חיידקים אלה יש קולוניזציה מעניינת או פנוטיפים זיהום המצדיקים מחקר נוסף, אבל הם לעתים קרובות בלתי ניתנים לתכלית. פרוטוקול זה מציג שיטה להעשיר את חיידקי המעי הרצויים ב- C. elegans ובנמטוטדות הקשורות ולהפחית את נוכחותם של חיידקים מזהמים רבים ההדבקים בקצרה. פרוטוקול זה כרוך בכפייה על בעלי חיים לשלב הדאואר של ההתפתחות ושימוש בסדרה של שטיפות אנטיביוטיקה וחומרי ניקוי להסרת זיהום חיצוני. מכיוון שלבעלי חיים דאואר יש שינויים פיזיולוגיים המגינים על נמטודות מפני תנאים סביבתיים קשים, כל חיידקי המעי יהיו מוגנים מפני תנאים אלה. אבל, כדי שההעשרה תעבוד, החיידק של העניין חייב להישמר כאשר בעלי חיים מתפתחים לדאוארים. כאשר בעלי החיים עוזבים את במת דאואר, הם מופצים בנפרד לקווים בודדים. אוכלוסיות F1 נבחרות לאחר מכן עבור חיידקים הרצויים או פנוטיפים זיהום ונגד זיהום גלוי. שיטות אלה יאפשרו לחוקרים להעשיר חיידקים בלתי ניתנים לתכלית בלומן המעיים, המרכיבים חלק מהמיקרוביום הטבעי של אלגנים C. ופתוגנים תאיים במעיים. חיידקים אלה ניתן ללמוד לאחר מכן עבור קולוניזציה או פנוטיפים זיהום והשפעותיהם על הכושר המארח.

Introduction

האורגניזם הגנטי C. elegans הוא מערכת ויוו מצוינת לחקר אינטראקציות בין חיידק מארח1,2. יש להם פיזיולוגיה פשוטה יחסית בהשוואה לבעלי חיים אחרים, אך חלק גדול מהביולוגיה התאית שלהם דומה ביסודו ליונקים מה שהופך אותם למודל טוב למחקר ביולוגי1,3,4. בנוסף, הם מיקרוסקופיים, קלים לתחזוקה ונשארים שקופים לאורך כל תוחלת החיים הקצרה שלהם. מאפיינים אלה מאפשרים מחקרים מהירים לתוך המנגנונים השולטים אינטראקציות מארח-חיידקים והדמיה של זיהום ויוו והתיישבות של המארחים הגשים גנטית5,6. לבסוף, C. elegans מגיב במהירות לזיהומים חיידקיים, פטרייתיים ויראליים, מה שהופך אותם למודל מצוין לחקר אינטראקציות בין חיידקים מארחים לבין חיידקי המעיים7,8,9.

עלייה בדגימה של אלגנים פראיים ונמטודות אחרות אפשרה לחקור את האקולוגיה של נמטודות חופשיות וריאציה גנטית טבעית10,11. במקביל, הדגימה גם הגבירה את הגילוי של פתוגנים ביולוגיים טבעיים ומיקרואורגניזמים המתקשרים עם C. elegans12,13,14,15, מה שהוביל להקמת מערכות מודל מארח-חיידקים רבות שחוקרות אינטראקציות עם וירוסים, חיידקים, מיקרוסקופיות, אומיצטים או פטריות16,17,18,19,20 . בדרך כלל, אלגנים C. פראי נמצא בגבעולים ופירות רקובים, לעתים קרובות באקלים ממוזג יותר, ובעיקר הם מתרבים עצמית21. כאשר דגימות אלה מובאות למעבדה, נמטודות בר מבודדות לאוכלוסיות כלות, נושאות מערך של מיקרוביוטה הקשורה. כאשר מגלים חיידקים חדשים של עניין ב נמטודות Caenorhabditis, בעלי חיים נבדקים לעתים קרובות ישירות עבור זיהום או קולוניזציה על ידי מיקרוסקופיה באמצעות פנוטיפים חזותיים בקלות. לדוגמה, זיהום ויראלי יכול להיות חזותי כהתפוררות של מבני מעיים, ושלבים מיקרוספורידיים ניתן לראות בתוך תאים מארחים כמו נבגים או meronts14,22. כאשר מתגלה חיידק בעל עניין לצורך חקירה עתידית, יש להפרידו משאר החיידקים המזהמים שנמצאו בנמטודות הפרא, כך שניתן יהיה לחקור אותו בבידוד. במקרים רבים, לא ניתן לתרבת את החיידק במבחנה, מה שהופך אותו לחיוני להעשיר את החיידק בנמטודה המארחת.

לדוגמה, פרוטוקול זה מתאר איזולט פראי של C. tropicalis המכיל חיידק המתיישב בתוך לומן המעי של נמטודות, דבק בתאי אפיתל המעי בצורה כיוונית. פנוטיפיקית, החיידק גדל בניצב לאורך הצדדים הפנימיים של לומן המעי, נותן לו מראה דמוי זיפים, הדמיה על מיקרוסקופ נורמרסקי סטנדרטי בכל שלבי החיה, כולל שלב דאואר. צלחת גידול נמטודה (NGM) שעליה גדל זן C. tropicalis הפראי הזה הכילה זיהום גלוי עם חיידקים אחרים. פרוטוקול זה פותח כדי להפחית צמיחה מיקרוביאלית מזהמת נוספת על הלוחות לחקר חיידק דבק לא ידוע זה. הנמטודות אולצו להיכנס לשלב דאואר כדי להגן על החיידקים בלומן, ולאחר מכן ניקו באמצעות סדרה של שטיפות. לאחר מכן, מינים חיידקיים לא ידועים זוהו על ידי ניתוח של המעיים והגברת PCR של ה- DNA ריבוזומלי 16S לרצף.

בסך הכל, פרוטוקול זה יכול להעשיר כל חיידק של עניין הקשור נמטודה שנתפסה בטבע. לאחר מכן, החוקרים יזהו את חיידק היעד, דמיינו בזיהום ויוו או פנוטיפים קולוניזציה באמצעות מיקרוסקופיה, ויחקרו השפעות על כושר המארח או היבטים אחרים של אינטראקציות בין מארח למיקרואורגניזמים. הבידוד והחקירה של מינים מיקרוביאליים חדשניים המקיימים אינטראקציה עם נמטודות Caenorhabditis יכולים לחשוף את המנגנונים הגנטיים של חסינות מארח ופרדיגמות חדשניות של אינטראקציות בין חיידקים מארחים הרלוונטיים למחקרי פתוגנזה מיקרוביאלית ומיקרוביום.

Protocol

1. גרימת היווצרות דאואר לנמטודות בר על לוחות גז טבעי נוזלי

  1. לגדל את זן Caenorhabditis פראי על לוחות NGM סטנדרטיים עם OP50-1 E. coli כמקור מזון לאחר קבלת התולעים עם חיידק בלתי תרבותי של עניין. לדגור את הנמטודות ב 20 °C (50 °F).
    הערה: הטמפרטורה הסטנדרטית לגדל נמטודות Caenorhabditis היא בין 15-25 °C (70 °F), אבל צריך להיקבע אמפירית כדי למנוע אובדן של חיידק עניין.
  2. להרעיב את הצלחת של בעלי חיים ב 20 °C (4-5 ימים עד כל OP50-1 הוא נצרך ואת הרוב הגיע לשלב dauer.
    הערה: דאוארים הם זחלים ארוכי טווח המתפתחים עקב היעדר תזונה ויש להם גוון גוון.

2. שטיפת הנמטודות

  1. הוסף 5 מ"ל של M9 מדיה מלחים מינימליים (42 mM Na2HPO4, 22 מ"מ KH2PO4, 8.6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) לצלחת 6 ס"מ של תולעים מורעבות.
  2. באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית ונורה, pipette עד M9 ותולעים מהצלחת ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל.
  3. באמצעות צנטריפוגה קלינית, לסובב את התולעים בצינור ב 1000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
  4. באמצעות פיפטה סטרילית של 15 מ"ל, להסיר ולהשליך את supernatant M9 מעל גלולה של תולעים. אל תפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור על ידי השארת כ 50 μL של M9 מעל התולעים.
  5. הוסף 10 מ"ל של M9 + 0.05% של Triton X-100 לאותו צינור צנטריפוגה והידק כראוי את מכסה הצינור.
  6. לדגור את הצינור על nutator במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החיידקים החיצוניים. הסר את הצינור מן nutator ולסובב את התולעים ב 1000 x g עבור 30 s.
  7. באמצעות פיפטה סטרילית, להסיר ולהשליך את M9 supernatant מעל גלולה של תולעים. אל תפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור על ידי השארת כ 50 μL של M9 מעל התולעים.
  8. בצע את השלבים 2.5-2.8 שלוש פעמים נוספות.

3. חיטוי הנמטודות

  1. הכן פתרון אנטיביוטי ו- SDS ב 10 מ"ל של חוצץ M9 על ידי הוספת 0.25% SDS (250 μL של 10% SDS), 50 מיקרוגרם / מ"ל של קרבניצילין, 25 מיקרוגרם/מ"ל של קנאמיצין, 12.5 מיקרוגרם/מ"ל של טטרציקלין, 100 מיקרוגרם/מ"ל של גנטאמיצין, 50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, 37.5 מיקרוגרם/מ"ל של כלוראמפניקול, ו-200 מיקרוגרם/מ"ל של צפוטקסימה (ראו טבלת חומרים).
  2. לדגור על הצינור המכיל נמטודות בתמיסת האנטיביוטיקה וה-SDS על מטור בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    הערה: כל התולעים והעוברים שאינם דאואר ימותו, אך רבות מתולעי דאואר ישרדו את תהליך הניקוי הזה.

4. הסרת פתרון האנטיביוטיקה וה-SDS

  1. ספין את התולעים בצינור ב 1000 x g במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סטרילית, להסיר את supernatant מצינור צנטריפוגה מבלי להפריע התולעים בתחתית הצינור.
  2. הוסף 10 מ"ל של M9 + 0.05% טריטון X-100 והידוק כראוי את המכסה של הצינור. לדגור על הצינור על nutator במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את הצינור מן nutator לסובב את התולעים ב 1000 x g במשך 1 דקות. בצע את שלבים 4.2-4.3 שלוש פעמים.
  4. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר את גלולה תולעת ללא הפרעה בתחתית ב 100 μL של הפתרון ולהשליך את השאר.

5. להפיץ זן נמטודה נקי

  1. באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית, להעביר 100 μL של supernatant ואת הכדור למרכז של צלחת NGM 10 ס"מ זרעים עם OP50-1. אפשר לצלחת להתייבש מבלי להפריע לנוזל במרכז.
  2. אפשר לדאוארים לזחול החוצה מהמרכז ודרך מדשאת OP50-1 למשך 5-10 דקות.
  3. הרימו בזהירות דאואר אחד וציפו אותו על צלחת זרעים של NGM 6 ס"מ. בסך הכל, לבחור לפחות 10 dauers צלחת אותם לוחות NGM בודדים 6 ס"מ זרעים עם OP50-1 (10 לוחות סה"כ).
  4. לדגור על הצלחות במשך 4-5 ימים ב 20 °C (5 °F) עד dauers גדל הדור הבא (F1) הגיע לשלב הבוגר. בדוק חזותית זיהום על כל הצלחות, נראה כמו צמיחה מיקרוביאלית שאינה OP50-1.
  5. עבור כל צלחת נקייה, לאמת את התפשטות המיקרואורגניזם של עניין באמצעות נורמרסקי או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כגון פלואורסצנטית בהכלאה במקום (FISH)12, בהתאם פנוטיפ של עניין.

6. ניתוח מעיים וזיהוי PCR של מינים מיקרוביאליים

  1. לגדל בעלי חיים ב 20 °C (3-4 ימים) כדי לאפשר להם לגווע ברעב ולהפחית את כמות חיידקי OP50-1. הוסף 5 מ"ל של מדיה M9 לצלחת של תולעים מורעבות.
  2. באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית ונורה, pipette את M9 + תולעים מהצלחת ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל.
  3. באמצעות צנטריפוגה קלינית, לסובב את התולעים בצינור ב 1000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
  4. באמצעות פיפטה סטרילית של 15 מ"ל, הסר את הסופר-טבעי מצינור הצנטריפוגה מבלי להפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור.
  5. הוסף 10 מ"ל של M9 + 0.05% Triton X-100 ודגר את הצינור על nutator במשך 20 דקות כדי להסיר חיידקים חיצוניים. חזור ארבע פעמים כדי לשטוף את התולעים.
  6. לאחר הכביסה האחרונה, באמצעות קצה פיפטה סטרילי, להסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור בתחתית 100 μL של הפתרון.
  7. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, העבירו את M9 והתולעים לצלחת NGM לא מנוצלת ותנו לצלחת להתייבש בזמן שהתולעים זוחלות במשך 20 דקות כדי לעזור להסיר את OP50-1 מהעור והמעי.
  8. הוסף 250 μL של M9 לצלחת היבשה והשתמש פיפטה זכוכית להעביר M9 + תולעים ללוח NGM חדש unseeded. שוב, תן לצלחת להתייבש ולאפשר לתולעים לזחול במשך 20 דקות.
  9. הוסף 250 μL של M9 לצלחת ולהעביר 100 μL של M9 + תולעים לכוס שעון נקי.
  10. באמצעות שתי מחטי מזרק סטריליות 26 G, לערוף את הנמטודות על ידי החזקת התולעת למטה עם מחט אחת ושימוש במחט השנייה כדי לחתוך את התולעת. לאחר עריפת ראש, המעי (פרטני) ואת gonad (שקוף) מהגוף באופן טבעי לצאת מהגוף.
  11. לחתוך חתיכה של המעי החשוף על ידי החזקת המעי עם מחט אחת לחתוך אותו עם השני.
    הערה: אם אפשר, ודא כי החיידק של עניין עדיין קיים במעיים נצחיים באמצעות מיקרוסקופיה נורמרסקי, דגים, או אימונוהיסטוכימיה23.
  12. להעביר מעי ניתח יחיד לתוך צינור PCR 0.5 מ"ל המכיל 10 μL של מים סטריליים. חזור על הפעולה עבור סך של לפחות 5 צינורות PCR המכילים מעיים מבעלי חיים שונים.
  13. להקפיא את צינורות PCR ב -80 °C (5 °F) למשך מינימום של 5 דקות. מוציאים את צינורות ה-PCR מהמקפיא ומפשירים את הדגימות.
  14. Pipette את הנוזל למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להפריד את החיידקים מן המעי.
  15. נהלו PCR באמצעות זוגות פריימר אוניברסליים כנגד רצף הדנ"א של תת-unit ריבוזומלי קטן של חיידקים, שמרים או מיקרוסורידיה, בהתאם לסוג המיקרואורגניזמים החשוד.
    הערה: לדוגמה, פרוטוקול מדגם באמצעות פריימרים אוניברסליים 16S חיידקי מוצג בטבלה 1.
  16. טהרו את האמפליקון באמצעות ערכת ניקוי וריכוז DNA מבוססת מסנן (ראו טבלת חומרים) ובצעו רצף של סנגר.

Representative Results

זן טרופי C. בר (JU1848) היה מבודד מפירות עץ דקל רקובים ביער נוראגס בגיאנה הצרפתית (איור 1A)24. נמצא כי בזן זה יש חיידקים דקים המתיישבים בלומן של המעי באופן כיווני (איור 1B). חיידק זה הועבר בקלות לזן C. elegans N2 באמצעות תרבית משותפת עם זן JU1848, שם הוא התיישב לומן של המעי באופן דומה.

הפצת JU1848 על לוחות NGM סטנדרטיים שנזרעו עם E. coli OP50-1 במשך דורות רבים הביאה ללא הרף לזיהום גלוי, הנתפס כמושבות כהות ומורכבות על מדשאת OP50-1 ומחוצה לה (איור 2A). צלחת של JU1848 פראי גוועה ברעב כדי לכפות על בעלי חיים לדאוור ונוקתה כמתואר. בעלי חיים דאואר יחיד ששרדו ניקוי היו מצופים על לוחות NGM בודדים 6 ס"מ זרעים עם OP50-1 מותר לגדול במשך 4 ימים ב 20 °C (50 °F). לוחות מרובים של צאצאי F1 נצפו ללא זיהום מיקרוביאלי גלוי (איור 2B). צאצאי F1 אומתו עדיין להכיל חיידקים דבקים בלומן של המעי (ראה להלן).

בעלי חיים טהורים JU1848 נשטפו וערפו את ראשם כדי לבודד חלקי מעיים כמתואר בפרוטוקול (שלבים 6.1-6.12). דבקות בחיידקים בלומן של המעי הניתח אומתה באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי (איור 3). החיידק בלומן של JU1848 נחשד כחיידק, ולכן המעיים שניתחו שימשו כתבנית ל- PCR באמצעות פריימרים חיידקיים אוניברסליים 16S, 27F ו- 1492R. מתוך שישה מעיים ניתחו בודדים, מוצרי ה- PCR רצף באמצעות סנגר, וכרומטוגרפים נקיים הראו כי כל ששת הרצפים היו זהים. בהתבסס על רצפים אלה, חיידק זה זוהה כמין חדש בכיתה Alphaproteobacteria אבל לא ניתן לסווג אותו לסדר ידוע או סוג (קובץ משלים 1).

Figure 1
איור 1: חיידקים דבקים המיישבים את הלומן של C. tropicalis בר. (A) תמונת מדגם שדה של פירות עץ דקל רקובים של Euterpe sp. (משפחה: ארסאיי) ביער נוראגס בגיאנה הצרפתית. (B) תמונת נומרסקי של זן JU1848 הנראית עם אלפי חיידקים ארוכים ודקים היוצרים מראה דמוי מברשת בלומן (lu) של המעי המארח (ב). השכבות החיידקיות (ba) המציפות את המעי מסומנות בסוגריים ([). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: גידול מיקרוביאלי מזהם הולך לאיבוד לאחר ניקוי נמטודה. (A) זן בר JU1848 מפיץ צמיחה מיקרוביאלית ניכרת על לוחות NGM סטנדרטיים 6 ס"מ זרעים עם חיידקים E. coli OP50-1. (B) לאחר ניקוי, צלחת של צאצאי F1 מ dauer יחיד מראה שום זיהום מיקרוביאלי גלוי לאחר 4 ימים של דגירה ב 20 °C (70 °F. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: חיידקים דבקים נראים בלומן של המעי הניתח. תמונת נומרסקי של חיה JU1848 נקייה שנפשה נערף כך שהמעיים נשפכים החוצה. החיידקים המתיישבים (ba) מסומנים בסוגריים ([) והם נראים בלומן (lu) של חתיכת המעי (ב) שנמצאת מחוץ לגוף הנמטודה (nb). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מגיב ריכוז כמות
27F פריימר (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 20 מ"ר 2.5 μL
פריימר 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 20 מ"ר 2.5 μL
המעי נותח במים N/A 3 μL
מאגר PCR 10x פי 10 5 μL
dNTP 10 מ"ר 1 μL
טאק פולימראז 5 U/μL 0.5 μL
מים N/A 35.5 μL

טבלה 1: פרוטוקול PCR לדוגמה באמצעות פריימרים חיידקיים אוניברסליים ומעי ניתח.

קובץ משלים 1: יישור שרירים של רצפי rDNA 16S חיידקיים הנגזרים מ- PCR של שישה מעי JU1848 נותחו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בידוד וזיהוי של חיידקים מ נמטודות Caenorhabditis מבודד בטבע באמצעות סדרה של הליכי ניקוי. חיידקים רבים קשורים לנמטודות מבודדות בטבע, ולחלקם יש פנוטיפים מרגשים שניתן להשתמש בהם למחקרים עתידיים באינטראקציות בין חיידקים מארחים וחסינות מולדת. חיידקים רבים הניתנים לריפוי וחיידקים פתוגניים מבודדים מנמטודות קאנוהבדיטיס פראיות בטכניקות סטנדרטיות לצמיחה חיידקית במבחנה25,26. עם זאת, לא כל החיידקים יכולים להיות מתורבתים במבחנה, וזה הופך להיות הכרחי כדי להעשיר אותם נמטודות בר. חיידקים מסוימים יש שלב נבגים עמיד, כגון microsporidia, וריכוזים גבוהים של SDS יכול לשמש כדי להרוג את רוב החיידקים והפטריות, המאפשר העשרה ספציפית של נבגים12. פרוטוקול זה מציג שיטה להעשרת חיידקי מעיים בלתי ניתנים לחישוב שאינם עמידים ל- SDS וטיפול אנטיביוטי.

הטכניקה המוצגת כאן מנצלת את ההתנגדות הסביבתית הנראית בבעלי חיים דאואר עקב שינויים פיזיולוגיים כגון חיזוק הקיטור, דיכוי שאיבת הלוע וכיסוי הפה בתקע בוקל27. צעד קריטי בפרוטוקול זה הוא דגירה בין לילה עם אנטיביוטיקה שונים ו 0.25% SDS. שלב זה משמש להריגת כל החיידקים החיצוניים תוך השארת חיידקים פנימיים ללא פגע. בעוד C. elegans dauers הוכחו לשרוד ריכוזי SDS גבוהים ב 10% במשך 30 דקות 27, פרוטוקול זה משתמש דגירה מתונה אך ממושכת לא רק להרוג חיידקים אבל לחשוף עוד יותר חיידקים לאנטיביוטיקה. יתר על כן, ריכוז מתון של SDS יכול לעזור להבטיח כי dauers ממיני Caenorhabditis אחרים לשרוד, כמו חשיפה של C. טרופי ל 1% SDS לילה הביא למותם של כל בעלי החיים דאואר. אם כל dauers למות, אז הריכוז של SDS ו / או את אורך החשיפה SDS צריך להיות מופחת. לעומת זאת, אם לוחות הדור F1 עדיין יש זיהום גלוי לאחר ניקוי, ריכוז SDS וזמן הדגירה צריך להיות מוגבר.

צעד קריטי נוסף הוא בידוד של בעלי חיים דאואר יחיד לאחר ניקוי. צעד זה הוא קריטי כמו לא כל בעלי החיים נקיים לאחר SDS וטיפול אנטיביוטי. לכן, בעלי החיים ממוקמים במרכז צלחת NGM 10 ס"מ עם OP50-1 ומותר לזחול רדיאלית כלפי חוץ. לעתים קרובות עדיף לבחור בעלי חיים דיסטליים יותר, כמו זחילה ממושכת דרך OP50-1 נראה לעזור להסיר כל חיידקים פוטנציאליים ששרדו מחוברים לחיתוך. עם זאת, זה מוביל להגבלת הפרוטוקול, שכן זה יהיה מאתגר יותר להעשיר עבור חיידק של עניין אם זה לא קיים באוכלוסייה בתדירות גבוהה. כאן, אלפאפרוטאובקטריה דבקה היה נוכח 90%-95% מהאוכלוסייה; לכן, רוב הצלחות הנקיות היו חיידק המיקרוביום. עם זאת, אם חיידק של עניין קיים בתדר נמוך בהרבה באוכלוסייה, ייתכן שיהיה צורך לסנן לוחות F1 רבים יותר.

פרוטוקול זה יכול לשמש ככל הנראה כדי לבודד כל מספר של חיידקים שאינם ניתנים לפולחן של עניין שנמצאו בנמטודות בר. עם זאת, החיידק חייב להיות ברקמה מוגנת על ידי עור דאואר, מסוגל לשרוד בבעלי חיים דאואר, ויש לי פנוטיפ נצפה בפונדקאי. ככזה, טכניקה זו יכולה לשמש להעשרת חיידקי מיקרוביום אחרים בלומן המעי מלבד מינים Alphaproteobacteria המתוארים כאן, כולל חיידקים שאינם לדבוק. כמו כן, הפרוטוקול שימש להעשרה עבור חיידק תאיים פקולטי, Bordetella atropi, אשר מדביק את nematode Oscheius tipulae28. לאחר העשרה, B. atropi נמצא ליצור מושבות על לוחות NGM, מראה כי חיידק של עניין עשוי להתגלות להיות culturable במבחנה פעם מזהמים גדל מהר יותר מוסרים. טכניקה זו ככל הנראה תעבוד עבור מיקרוספרואידים ווירוסים, כולל וירוס Orsay, בהתחשב ביכולת זו להעשיר חיידק תאי. עם זאת, חיידקים אלה חייבים להיות מסוגלים לשרוד את המעבר אל ומחוץ לדאוור.

חשוב לזכור כי בעוד פרוטוקול זה יכול להתבצע במעבדה Biosafety רמה 1, טכניקה סטרילית חייבת להישמר לאורך כל הדרך כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי נוסף. הפרוטוקול יכול להשתנות בהתאם לצרכי החוקר, כולל סוגים / ריכוזים של אנטיביוטיקה, אחוז SDS, ו / או תוספת של antifungals כגון nystatin. לעתים קרובות, מספר החיידקים המזהמים שנמצאו בנמטודה מבודדת בטבע יכול להשתנות באופן דרמטי. כאן, האובדן לכאורה של צמיחת non-OP50-1 E. coli על לוחות NGM שימש לקריאה עבור זן נמטודה נקי. אבל, ייתכן שיש אוכלוסיות שאינן פולחן של חיידקים מזהמים נוכחים, ולכן זה חיוני כדי לנהל שיטת metagenomics כגון 16S rRNA רצף אמפליסון כדי לראות את היקף הזיהום26. לאחר ניקוי זן התולעת, ניתן להקפיא אותו ולאחסן אותו למחקרים עתידיים. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להעשיר חיידקים בלתי ניתנים לתכלית בנמטודות בר, ומאפשר להם לחקור השפעות על כושר המארח, לאפיין פנוטיפים של קולוניזציה או זיהום, ולנצל כלים גנטיים כדי להבין את המנגנונים שבבסיס אינטראקציות בין מארח למיקרובים.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

תודה לד"ר כריסטיאן בראנדל ולמרכז הלאומי דה לה רשצ'ה סיאנטיפיק (CNRS) תחנת שדה נוראגס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP1356
10% SDS Invitrogen AM9822
BD PrecisionGlide Needle - 26 G Fisher Scientific 305115
Carbenicillin Millipore-Sigma C1389-1G
Cefotaxime Millipore-Sigma C7039-500mg
Chloramphenicol Millipore-Sigma C0378-25G
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research 11-303C
DreamTaq Polymerase Fisher Scientific EP0711
Gentamycin Millipore-Sigma G1264-250mg
Kanamycin Millipore-Sigma K1876-1G
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Streptomycin Millipore-Sigma S6501-50G
Tetracyclin Millipore-Sigma T7660-5G
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Watch glasses VWR 470144-850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15, 1313-1322 (2013).
  2. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24, 3-9 (2012).
  3. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268, 448-456 (2004).
  4. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377, 383-396 (2019).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8215-8220 (2014).
  7. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 10, 1004200 (2014).
  8. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIG-I Homolog DRH-1 Mediates the Intracellular Pathogen Response upon Viral Infection. Journal of Virology. 94, 01173 (2020).
  9. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15, 833-838 (2014).
  10. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10, 59 (2012).
  11. Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology and Evolution. 5, 794-807 (2021).
  12. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  13. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28, 640-648 (2018).
  14. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9, 1000586 (2011).
  15. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  16. Félix, M. -A., Wang, D. Natural viruses of Caenorhabditis nematodes. Annual Review Genetics. 53, 313-326 (2019).
  17. Grover, M., Barkoulas, M. C. elegans as a new tractable host to study infections by animal pathogenic oomycetes. PLoS Pathogens. 17, 1009316 (2021).
  18. Bakowski, M. A., Luallen, R. J., Troemel, E. R. Microsporidia Infections in Caenorhabditis Elegans and Other Nematodes. Microsporidia: Pathogens of Opportunity: First Edition. , (2014).
  19. Taffoni, C., Pujol, N. Mechanisms of innate immunity in C. elegans epidermis. Tissue Barriers. 3, 1078432 (2015).
  20. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10, 3025-3039 (2020).
  21. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  22. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Characterization of microsporidia-induced developmental arrest and a transmembrane leucine-rich repeat protein in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 10, 0124065 (2015).
  24. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13, 10 (2013).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Androwski, R. J., Flatt, K. M., Schroeder, N. E. Phenotypic plasticity and remodeling in the stress-induced C. elegans dauer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 278 (2017).
  28. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Félix, M. -A., Luallen, R. J. Bacterial filamentation is an in vivo mechanism for cell-to-cell spreading. bioRxiv. , (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 174
ניקוי סלקטיבי של נמטודות <em>קנורהבדיטיס</em> פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, E., Longares, J. F.,… More

Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria. J. Vis. Exp. (174), e62937, doi:10.3791/62937 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter