Summary
Yabani Caenorhabditis nematodları, genellikle bağırsak lümeninde veya bağırsağı enfekte eden birçok mikropla ilişkilidir. Bu protokol, dauer lütikülün direncinden yararlanarak bağırsağı kolonlaştıran kültürsüz mikropları zenginleştirmek için bir yöntemi detaylandırıyor.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), özellikle bağırsaklar bağlamında konak mikrop etkileşimlerini ve mikrobiyomu incelemek için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştır. Son zamanlarda, vahşi Caenorhabditis nematodlarının ekolojik örneklemesi bakteriler, virüsler, mantarlar ve mikrosporidia dahil olmak üzere çeşitli ilişkili mikroplar keşfetti. Bu mikropların çoğu, daha fazla çalışmayı garanti eden ilginç kolonizasyon veya enfeksiyon fenotiplerine sahiptir, ancak genellikle kültür edilemezler. Bu protokol, C. elegans ve ilgili nematodlarda istenen bağırsak mikroplarını zenginleştirmek ve kıtiküllere bağlı kalan birçok kirletici mikrobun varlığını azaltmak için bir yöntem sunar. Bu protokol, hayvanları gelişimin lahana aşamasına zorlamayı ve dış kontaminasyonu gidermek için bir dizi antibiyotik ve deterjan yıkama kullanmayı içerir. Lahana hayvanları nematodları zorlu çevresel koşullardan koruyan fizyolojik değişikliklere sahip olduğu için, herhangi bir bağırsak mikrobu bu koşullardan korunacaktır. Ancak, zenginleştirmenin işe yarayabilmesi için, hayvanlar dauers haline geldiğinde ilgi mikrobu korunmalıdır. Hayvanlar lahana aşamasından ayrıldıklarında, tek tek tek çizgilere yayılırlar. F1 popülasyonları daha sonra istenen mikroplar veya enfeksiyon fenotipleri için ve görünür kontaminasyona karşı seçilir. Bu yöntemler, araştırmacıların C. elegans ve hücre içi bağırsak patojenlerinin doğal mikrobiyomunun bir kısmını oluşturan bağırsak lümeninde kültürsüz mikropları zenginleştirmelerine izin verecektir. Bu mikroplar daha sonra kolonizasyon veya enfeksiyon fenotipleri ve konak kondisyon üzerindeki etkileri için çalışılabilir.
Introduction
Genetik model organizma C. elegans, konak mikrop etkileşimlerini incelemek için mükemmel bir in vivo sistemdir1,2. Diğer hayvanlara kıyasla nispeten basit fizyolojiye sahiptirler, ancak hücre biyolojilerinin çoğu temel olarak memelilerin biyolojik araştırmalar için iyi bir model haline getirilmesine benzer1,3,4. Ek olarak, mikroskobiktirler, bakımı kolaydır ve kısa ömürleri boyunca şeffaf kalırlar. Bu özellikler, konak-mikrop etkileşimlerini yöneten mekanizmalara hızlı çalışmalar ve in vivo enfeksiyonun görselleştirilmesini ve genetik olarak esnek konakların kolonileşmesini sağlar5,6. Son olarak, C. elegans bakteriyel, mantar ve viral enfeksiyonlara hızla yanıt verir ve onları konak mikrop etkileşimlerini ve bağırsak mikrobiyomunu incelemek için mükemmel bir model haline getirir7,8,9.
Vahşi C. eleganların ve diğer nematodların örnekleminde bir artış, serbest yaşayan nematodların ekolojisi ve doğal genetik varyasyonun araştırılmasına izin sağlamıştır10,11. Eş zamanlı olarak, örnekleme, C. elegans12,13,14,15 ile etkileşime giren doğal olarak meydana gelen biyolojik patojenlerin ve mikropların keşfini artırmış ve virüsler, bakteriler, mikrosporidia, oomycetes veya mantarlarla etkileşimleri inceleyen birçok konak mikrop modeli sisteminin kurulmasına yol açmıştır16,17,18,19,20 . Tipik olarak, yabani C. elegans çürüyen saplarda ve meyvelerde, genellikle daha ılıman iklimlerde bulunur ve çoğunlukla kendi kendine ürerler21. Bu örnekler laboratuvara getirildiğinde, vahşi nematodlar klonal popülasyonlara izole edilir ve bir dizi ilişkili mikrobiyota taşır. Caenorhabditis nematodlarında yeni ilgi mikropları keşfedilirken, hayvanlar genellikle kolayca görselleştirilmiş fenotipler kullanılarak mikroskopi ile doğrudan enfeksiyon veya kolonizasyon için taranır. Örneğin, viral enfeksiyon bağırsak yapılarının parçalanması olarak görselleştirilebilir ve konak hücrelerin içinde spor veya meront olarak mikrosporidian evreler görülebilir14,22. Gelecekteki araştırmalar için ilgi çekici bir mikrop keşfedildiğinde, vahşi nematodlarda bulunan diğer kirletici mikroplardan ayrılmalıdır, böylece izole bir şekilde çalışılabilir. Çoğu durumda, ilgi mikrobu in vitro olarak kültürlenemez, bu da konak nematoddaki mikrobu zenginleştirmeyi gerekli hale getirir.
Örneğin, bu protokol, nematodların bağırsak lümeninde kolonileştiren ve bağırsak epitel hücrelerine yönlü bir şekilde bağlı kalan bir bakteri içeren C. tropicalis'in vahşi bir izolesini açıklar. Fenotipik olarak, bakteri bağırsak lümeninin iç tarafları boyunca dik büyür ve lahana eti aşaması da dahil olmak üzere hayvanın tüm aşamalarında standart bir Normarski mikroskobu üzerinde görselleştirilen kıl benzeri bir görünüm verir. Bu yabani C. tropicalis suşunun yetiştirildiği nematod büyüme ortamı (NGM) plakası diğer mikroplarla gözle görülür kontaminasyon içeriyordu. Bu protokol, bu bilinmeyen yaparak bakteriyi incelemek için plakalardaki ek kirletici mikrobiyal büyümeyi azaltmak için geliştirilmiştir. Nematodlar, lümendeki bakterileri korumak için lahana aşamasına zorlandı ve daha sonra bir dizi yıkama kullanılarak temizlendi. Daha sonra, bilinmeyen bakteri türleri bağırsakların diseksiyonu ve 16S ribozomal DNA'nın dizilimi için PCR amplifikasyonu ile tanımlandı.
Genel olarak, bu protokol vahşi bir nematod ile ilişkili herhangi bir ilgi mikrob zenginleştirebilir. Daha sonra, araştırmacılar hedef mikrobu belirleyecek, mikroskopi yoluyla in vivo enfeksiyon veya kolonizasyon fenotiplerini görselleştirecek ve konak fitness veya konak mikrop etkileşimlerinin diğer yönleri üzerindeki etkilerini inceleyecekler. Caenorhabditis nematodları ile etkileşime giren yeni mikrobiyal türlerin izolasyonu ve araştırılması, konak bağışıklığının genetik mekanizmalarını ve mikrobiyal patogenez ve mikrobiyom çalışmaları ile ilgili konak mikrop etkileşimlerinin yeni paradigmalarını ortaya çıkarabilebilir.
Protocol
1. NGM plakalarında yabani nematodlar için lahana turşusu oluşumunu teşvik etmek
- Solucanları kültürsüz bir ilgi mikrobu ile elde ettikten sonra gıda kaynağı olarak OP50-1 E. coli ile standart NGM plakalarında vahşi Caenorhabditis suşunu büyütün. Nematodları 20 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Caenorhabditis nematodlarını yetiştirmek için standart sıcaklık 15-25 ° C arasındadır, ancak ilgi mikrobunun kaybını önlemek için ampirik olarak belirlenmelidir. - Tüm OP50-1 tüketilene ve çoğunluğu lahana aşamasına gelene kadar 20 ° C'deki hayvanların tabağını 4-5 gün boyunca aç bırakın.
NOT: Dauers, beslenme eksikliği nedeniyle gelişen ve koruyucu kütiküllere sahip uzun ömürlü larvalardır.
2. Nematodların yıkanması
- Aç kalan solucanların 6 cm'lik tabağına 5 mL M9 minimal tuz ortamı (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) ekleyin.
- Steril bir cam pipet ve ampul kullanarak, M9 ve solucanları plakadan pipetle çıkarın ve steril 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Klinik bir santrifüj kullanarak, oda sıcaklığında 30 s için 1000 x g'da tüpteki solucanları aşağı çevirin.
- Steril bir 15 mL pipet kullanarak, M9 süpernatantını solucanların peletinin üzerine çıkarın ve atın. Solucanların üzerine yaklaşık 50 μL M9 bırakarak tüpün altındaki canlı solucanları rahatsız etmeyin.
- Aynı santrifüj tüpüne 10 mL M9 + Triton X-100'ün %0,05'ini ekleyin ve tüpün kapağını yeterince sıkın.
- Harici mikropları çıkarmak için tüpü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir somun makinesinde kuluçkaya yatırın. Tüpü besleyiciden çıkarın ve solucanları 30 s için 1000 x g'da döndürün.
- Steril bir pipet kullanarak, M9 üstnatantını solucanların peletinin üzerine çıkarın ve atın. Solucanların üzerine yaklaşık 50 μL M9 bırakarak tüpün altındaki canlı solucanları rahatsız etmeyin.
- 2.5-2.8 adımlarını üç kez daha izleyin ve yineleyin.
3. Nematodların dezenfektei
- %0,25 SDS (%10 SDS'nin 250 μL'si), 50 μg/mL karbenisilin, 25 μg/mL kanamycin ekleyerek 10 mL M9 tamponunda antibiyotik ve SDS çözeltisi hazırlayın, 12,5 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL gentamycin, 50 μg/mL streptomisin, 37,5 μg/mL kloramfenikol ve 200 μg/mL cefotaxime (bkz. Malzeme Tablosu).
- Antibiyotikte nematod ve SDS çözeltisi içeren tüpü bir gecede oda sıcaklığında bir somuncuya inkübte edin.
NOT: Tüm dauer olmayan solucanlar ve embriyolar ölecek, ancak dauer solucanlarının çoğu bu temizleme işleminden sağ çıkacaktır.
4. Antibiyotik ve SDS çözeltisinin çıkarılması
- Tüpteki solucanları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1000 x g'da aşağı çevirin. Steril bir pipet kullanarak, tüpün altındaki solucanları rahatsız etmeden süpernatantı santrifüj tüpünden çıkarın.
- 10 mL M9 + %0,05 Triton X-100 ekleyin ve tüpün kapağını yeterince sıkın. Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir somun makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Tüpü besleyiciden çıkarın ve solucanları 1 dakika boyunca 1000 x g'da döndürün. 4.2-4.3 adımlarını üç kez izleyin ve yineleyin.
- Son yıkamadan sonra, solucan peletini çözeltinin 100 μL'sinde altta bozulmadan bırakın ve geri kalanını atın.
5. Temiz bir nematod suşu yay
- Steril bir cam pipet kullanarak, 100 μL süpernatant ve peletin OP50-1 ile tohumlanmış 10 cm NGM plakasının ortasına aktarın. Plakanın merkezdeki sıvıyı bozmadan kurumasını bekleyin.
- Dauers'ın merkezden ve OP50-1 çimlerinden 5-10 dakika boyunca sürünerek çıkmasına izin verin.
- Dikkatlice tek bir lahana alın ve 6 cm NGM tohumlu bir tabağa koyun. Toplamda, en az 10 dauer seçin ve OP50-1 (toplam 10 plaka) ile tohumlanmış bireysel 6 cm NGM plakalarında tabaklayın.
- Dauers büyüyene ve sonraki nesil (F1) yetişkin aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 ° C'de 4-5 gün kuluçkaya yatırın. OP50-1 olmayan mikrobiyal büyüme olarak görülen tüm plakalarda kontaminasyon olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
- Her temiz plaka için, ilginin fenotipine bağlı olarak, ilginin fenotipine bağlı olarak, floresan in situ hibridizasyon (FISH)12 gibi Normarski veya floresan mikroskopi ile ilgi mikrobunun yayılmasını doğrulayın.
6. Mikrobiyal türlerin bağırsak diseksiyonu ve PCR tanımlaması
- Aç kalmalarını ve OP50-1 bakteri miktarını azaltmalarını sağlamak için 3-4 gün boyunca 20 ° C'de hayvan yetiştirin. Aç solucanların tabağına 5 mL M9 ortam ekleyin.
- Steril bir cam pipet ve ampul kullanarak, M9 + solucanlarını plakadan pipetlayın ve steril bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Klinik bir santrifüj kullanarak, oda sıcaklığında 30 s için 1000 x g'da tüpteki solucanları aşağı çevirin.
- Steril bir 15 mL pipet kullanarak, tüpün altındaki canlı solucanları rahatsız etmeden süpernatantı santrifüj tüpünden çıkarın.
- 10 mL M9 + %0,05 Triton X-100 ekleyin ve harici mikropları çıkarmak için tüpü bir somun makinesinde 20 dakika kuluçkaya yatırın. Solucanları yıkamak için dört kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, steril bir pipet ucu kullanarak, çözeltinin 100 μL'sinde alttaki peletin rahatsız edilmeden süpernatantını çıkarın.
- Steril bir pipet ucu kullanarak, M9 ve solucanları ellenmemiş bir NGM plakasına aktarın ve solucanlar 20 dakika boyunca sürünürken plakanın kurumasını bekleyin, op50-1'in lütikül ve bağırsaktan çıkarılmasına yardımcı olmak için.
- Kurutulmuş tabağa 250 μL M9 ekleyin ve M9 + solucanları yeni bir katlanmamış NGM plakasına aktarmak için bir cam pipet kullanın. Yine, bu plakanın kurumasına izin verin ve solucanların 20 dakika boyunca sürünmelerine izin verin.
- Plakaya 250 μL M9 ekleyin ve M9 + solucanların 100 μL'sini temiz bir saat camına aktarın.
- İki steril 26 G şırınga iğnesi kullanarak, solucanı bir iğneyle basılı tutarak ve solucanı kesmek için diğer iğneyi kullanarak nematodların kafasını koparın. Kafa kesmeden sonra, bağırsak (granül) ve vücuttan gonad (şeffaf) doğal olarak vücuttan çıkacaktır.
- Bir iğneyle bağırsağı tutup diğeriyle keserek açıkta kalan bağırsağın bir parçasını kesin.
NOT: Mümkünse, Normarski mikroskopisi, FISH veya immünhistokimya23 kullanarak, ilgi mikrobunun şimdiye kadar bağırsaklarda hala mevcut olduğunu doğrulayın. - Tek bir parçalanmış bağırsağı 10 μL steril su içeren 0,5 mL PCR tüpüne aktarın. Farklı hayvanlardan bağırsak içeren toplam en az 5 PCR tüpü için tekrarlayın.
- PCR tüplerini -80 °C'de en az 5 dakika dondurun. PCR tüplerini dondurucudan çıkarın ve numuneleri çözün.
- Bakterileri bağırsaktan ayırmak için sıvıyı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlayın.
- Şüpheli mikrop türüne bağlı olarak, bakteri, maya veya mikrosporidianın küçük ribozomal alt birliğinin DNA dizisine karşı evrensel astar çiftleri kullanarak PCR'yi gerçekleştirin.
NOT: Örneğin, Tablo 1'de evrensel bakteriyel 16S astarları kullanan bir örnek protokol sunulmuştur. - Filtre tabanlı bir DNA temizleme ve konsantrasyon kiti kullanarak amplicon'u arındırın (bkz. Malzeme Tablosu) ve Sanger dizilimini gerçekleştirin.
Representative Results
Vahşi bir C. tropicalis türü (JU1848), Fransız Guyanası Nouragues Ormanı'ndaki çürük palmiye ağacı meyvelerinden izole edilmiştir (Şekil 1A)24. Bu suşun bağırsak lümenini yönlü olarak kolonizleştiren ince mikroplara sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 1B). Bu mikrop, ju1848 suşu ile ortak kültür yoluyla C. elegans strain N2'ye kolayca aktarıldı ve burada bağırsağın lümenini benzer şekilde kolonize etti.
JU1848'in birden fazla nesil boyunca E. coli OP50-1 ile tohumlanan standart NGM plakalarında yayılması, OP50-1 çimlerinde ve dışında çeşitli karanlık, mukozal koloniler olarak görülen görünür kirlenmeye neden oldu (Şekil 2A). Bir tabak vahşi JU1848, hayvanları dauer'e zorlamak için aç bırakıldı ve açıklandığı gibi temizlendi. Temizlikten kurtulan tek lahana hayvanları OP50-1 ile tohumlanmış bireysel 6 cm NGM plakalarına kaplandı ve 20 °C'de 4 gün boyunca büyümesine izin verildi. Görünür mikrobiyal kontaminasyon olmadan birden fazla F1 progeny plakası gözlendi (Şekil 2B). F1 soyunun hala bağırsağın lümeninde yaparak bakteri içerdiği doğrulandı (aşağıya bakın).
Temiz JU1848 hayvanları, protokolde açıklandığı gibi bağırsak parçalarını izole etmek için yıkandı ve kafaları kesildi (adım 6.1-6.12). Diseksiyonlu bağırsağın lümeninde bulunan bakteriler Nomarski mikroskopisi ile doğrulandı (Şekil 3). JU1848 lümeninde bulunan mikrobun bir bakteri olduğundan şüphelenildi, bu nedenle parçalanmış bağırsaklar evrensel bakteriyel 16S astarlar, 27F ve 1492R kullanılarak PCR için bir şablon olarak kullanıldı. Toplam altı ayrı diseksiyonlu bağırsaktan, PCR ürünleri Sanger aracılığıyla sıralandı ve temiz kromatograflar altı dizinin de aynı olduğunu gösterdi. Bu dizilere dayanarak, bu bakteri Alphaproteobacteria sınıfında yeni bir tür olarak tanımlanmıştır, ancak bilinen bir düzen veya cins olarak sınıflandırılamadı (Ek Dosya 1).
Şekil 1: Vahşi bir C. tropicalis lümenini kolonlayan bakterileri yapıştırır. (A) Fransız Guyanası'nın Nouragues ormanında çürük Euterpe sp. (Aile: Arecaceae) palmiye ağacı meyvelerinin alan örnek görüntüsü. (B) Konak bağırsağın lümeninde (lu) fırça benzeri bir görünüm oluşturan binlerce uzun, ince bakteri ile görülen JU1848 suşun Nomarski görüntüsü . Bağırsağı kaplayan bakteriyel (ba) katmanlar braketlerle ([) belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nematod temizliğinden sonra kirletici mikrobiyal büyüme kaybedilir. (A) Yabani suş JU1848, E. coli OP50-1 bakterisi ile tohumlanmış standart 6 cm NGM plakalarda gözle görülür mikrobiyal büyüme yayar. (B) Temizledikten sonra, tek bir lahanadan F1 progeny plakası, 20 °C'de 4 günlük inkübasyondan sonra görünür bir mikrobiyal kontaminasyon göstermiyor .
Şekil 3: Parçalanan bağırsağın lümeninde yaparak bakteri görülür. Nomarski, bağırsakların dökülmesi için kafası kesilmiş temiz bir JU1848 hayvanının görüntüsü. Kolonlaştırıcı bakteri (ba) bir braket ([) ile gösterilir ve nematod vücudunun (nb) dışındaki bir bağırsak parçasının (in) lümeninde (lu) görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Konsantrasyon | Miktar |
| 27F astar (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') | 20 mM | 2,5 μL |
| 1492R astar (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') | 20 mM | 2,5 μL |
| Suda parçalanmış bağırsak | YOK | 3 μL |
| 10x PCR arabelleği | 10x | 5 μL |
| dNTP | 10 mM | 1 μL |
| Taq Polimeraz | 5 U/μL | 0,5 μL |
| Su | YOK | 35,5 μL |
Tablo 1: Evrensel bakteri astarları ve parçalanmış bağırsak kullanarak ÖRNEK PCR protokolü.
Ek Dosya 1: Altı parçalanmış JU1848 bağırsağın PCR'sinden türetilen bakteriyel 16S rDNA dizilerinin KAS hizalaması.
Discussion
Bu protokol, bir dizi temizlik prosedürü kullanılarak vahşi izole edilmiş Caenorhabditis nematodlarından mikropların izolasyonu ve tanımlanmasını açıklar. Çok sayıda mikrop vahşi izole nematodlarla ilişkilidir ve bazıları konak mikrop etkileşimlerinde ve doğuştan gelen bağışıklıkta gelecekteki çalışmalar için kullanılabilecek heyecan verici fenotiplere sahiptir. Birçok kült mikrobiyom ve patojenik bakteri, in vitro bakteri üremesi için standart teknikler kullanılarak vahşi Caenorhabditis nematodlarından izole edilmiştir25,26. Bununla birlikte, tüm mikroplar in vitro olarak kültüre edilemez ve vahşi nematodlarda zenginleştirmek gerekli hale gelir. Bazı mikroplar mikrosporidia gibi dirençli bir spor aşamasına sahiptir ve çoğu bakteri ve mantarı öldürmek için yüksek konsantrasyonlarda SDS kullanılabilir ve bu da sporların özel olarak zenginleştirilmesine izin verir12. Bu protokol, SDS ve antibiyotik tedavisine dirençli olmayan kültürsüz bağırsak mikroplarını zenginleştirmek için bir yöntem sunar.
Burada sunulan teknik, lütikalenin güçlendirilmesi, farengeal pompalamanın bastırılması, ağzın bukla tıkacı ile kaplanması gibi fizyolojik değişiklikler nedeniyle dauer hayvanlarında görülen çevresel dirençten yararlanır27. Bu protokolde kritik bir adım, çeşitli antibiyotikler ve% 0.25 SDS ile gecelik inkübasyondur. Bu adım, iç mikropları sağlam bırakırken tüm dış mikropları öldürmek için kullanılır. C. elegans dauers'ın 30 dakika 27 boyunca %10'da SDS konsantrasyonlarında %10'a kadar yükseldiği gösterilmiş olsa da, bu protokol sadece mikropları öldürmekle kalmayıp bakterileri antibiyotiklere daha fazla maruz bırakmak için orta ama uzun süreli bir kuluçka kullanır. Ayrıca, orta derecede SDS konsantrasyonu, C. tropicalis'in bir gecede% 1 SDS'ye maruz kalması tüm lahana hayvanlarının ölümüyle sonuç verdiğinden, diğer Caenorhabditis türlerinden gelen dauerlerin hayatta kalmasını sağlamaya yardımcı olabilir. Tüm dauers ölürse, SDS konsantrasyonu ve / veya SDS'ye maruz kalma süresi azaltılmalıdır. Tersine, F1 nesil plakalar temizlikten sonra hala görünür kontaminasyona sahipse, SDS konsantrasyonu ve kuluçka süresi artırılmalıdır.
Bir diğer kritik adım ise tek lahana hayvanlarının temizlik sonrası izolasyonudur. SDS ve antibiyotik tedavisinden sonra tüm hayvanlar temiz olmadığı için bu adım çok önemlidir. Bu nedenle, hayvanlar OP50-1 ile 10 cm NGM plakanın ortasına yerleştirilir ve radyal olarak dışa doğru sürünmelerine izin verilir. Op50-1'de uzatılmış tarama, kütiküle bağlı hayatta kalan potansiyel mikropların giderilmesine yardımcı olduğu için genellikle daha fazla distal hayvan seçmek en iyisidir. Bununla birlikte, bu, protokolün sınırlandırılmasına yol açar, çünkü popülasyonda yüksek sıklıkta mevcut değilse, ilgi çekici bir mikrop için zenginleşmek daha zor olacaktır. Burada, bağlı Alfaproteobakteriler nüfusun% 90-95'inde mevcuttu; bu nedenle, çoğu temiz plaka mikrobiyom bakterisi vardı. Bununla birlikte, popülasyonda çok daha düşük bir frekansta bir ilgi mikrobu varsa, daha fazla F1 plakasını taramak gerekebilir.
Bu protokol muhtemelen vahşi nematodlarda bulunan herhangi bir sayıda kült olmayan ilgi mikroblarını izole etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mikrop dauer bıçikliti tarafından korunan, dauer hayvanlarında hayatta kalabilen ve konakta gözlemlenebilir bir fenotipe sahip olan bir dokuda olmalıdır. Bu nedenle, bu teknik, burada açıklanan Alfaproteobakteriler türleri dışında bağırsak lümeninde bulunan diğer mikrobiyom bakterilerini zenginleştirmek için kullanılabilir, buna yapışmayan bakteriler de dahildir. Ayrıca, protokol nematod Oscheius tipulae28'i enfekte eden bordetella atropi adlı fakülte içi hücre içi bakteri için zenginleştirmek için kullanıldı. Zenginleştirmeden sonra, B. atropi'nin NGM plakalarında koloniler oluşturduğu ve daha hızlı büyüyen kirleticiler çıkarıldıktan sonra bir ilgi mikrobunun kültlenebilir in vitro olabileceğini gösterdiği bulunmuştur. Bu teknik, hücre içi bir bakteriyi zenginleştirme kapasitesi göz önüne alındığında, Orsay virüsü de dahil olmak üzere mikrosproidians ve virüsler için muhtemelen işe yalayamıştır. Bununla birlikte, bu mikroplar dauer'e giriş ve çıkış geçişini atlatabilmeli.
Bu protokol bir Biyogüvenlik Seviye 1 laboratuvarında gerçekleştirilebilirken, daha fazla mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için steril bir tekniğin sürdürülmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Protokol, antibiyotik türleri / konsantrasyonları, SDS yüzdesi ve / veya nystatin gibi antifungallerin eklenmesi de dahil olmak üzere araştırmacının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Genellikle, vahşi izole edilmiş bir nematodda bulunan kirletici mikropların sayısı önemli ölçüde değişebilir. Burada, NGM plakalarında OP50-1 E. coli büyümesinin belirgin kaybı, temiz bir nematod suşu için bir okuma olarak kullanılmıştır. Ancak, kontamine mikropların kült olmayan popülasyonları olabilir, bu nedenle kontaminasyonun boyutunu görmek için 16S rRNA amplicon dizileme gibi bir metanemik yöntemin yapılması önemlidir26. Solucan suşu temizlendikten sonra dondurulabilir ve gelecekteki çalışmalar için saklanabilir. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların vahşi nematodlardaki kültürsüz mikropları zenginleştirmelerine, konak kondisyon üzerindeki etkileri incelemelerine, kolonizasyon veya enfeksiyonun fenotiplerini karakterize etmelerine ve konak mikrop etkileşimlerinin altında bulunan mekanizmaları anlamak için genetik araçlardan yararlanmalarına izin verir.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Dr. Christian Braendle ve Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Saha İstasyonu'na teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| 10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
| BD PrecisionGlide Needle - 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
| Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
| Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
| Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
| DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
| Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
| Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
| Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
| Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
| Watch glasses | VWR | 470144-850 |
References
- Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15, 1313-1322 (2013).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24, 3-9 (2012).
- Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268, 448-456 (2004).
- Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377, 383-396 (2019).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8215-8220 (2014).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 10, 1004200 (2014).
- Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIG-I Homolog DRH-1 Mediates the Intracellular Pathogen Response upon Viral Infection. Journal of Virology. 94, 01173 (2020).
- Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15, 833-838 (2014).
- Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10, 59 (2012).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology and Evolution. 5, 794-807 (2021).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28, 640-648 (2018).
- Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9, 1000586 (2011).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Félix, M. -A., Wang, D.
- Grover, M., Barkoulas, M. C. elegans as a new tractable host to study infections by animal pathogenic oomycetes. PLoS Pathogens. 17, 1009316 (2021).
- Bakowski, M. A., Luallen, R. J., Troemel, E. R. Microsporidia Infections in Caenorhabditis Elegans and Other Nematodes. Microsporidia: Pathogens of Opportunity: First Edition. , (2014).
- Taffoni, C., Pujol, N. Mechanisms of innate immunity in C. elegans epidermis. Tissue Barriers. 3, 1078432 (2015).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10, 3025-3039 (2020).
- Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 2736-2752 (2008).
- Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Characterization of microsporidia-induced developmental arrest and a transmembrane leucine-rich repeat protein in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 10, 0124065 (2015).
- Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13, 10 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 3941-3949 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
- Androwski, R. J., Flatt, K. M., Schroeder, N. E. Phenotypic plasticity and remodeling in the stress-induced C. elegans dauer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 278 (2017).
- Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Félix, M. -A., Luallen, R. J. Bacterial filamentation is an in vivo mechanism for cell-to-cell spreading. bioRxiv. , (2021).
