Summary
原代小胶质细胞培养通常用于评估新的抗炎分子。本协议描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞。
Abstract
小胶质细胞作为大脑驻留巨噬细胞，是多种功能的基础，包括对环境压力的反应和大脑稳态。小胶质细胞可以采用大谱活化表型。此外，支持促炎表型的小胶质细胞与神经发育和神经退行性疾病有关。 体外 研究广泛用于评估特定细胞类型的潜在治疗策略的研究。在这种情况下，使用原代小胶质细胞培养物在 体外研究 小胶质细胞活化和神经炎症比小胶质细胞系或干细胞衍生的小胶质细胞更相关。然而，某些原代培养物的使用可能会受到缺乏可重复性的影响。该协议提出了一种从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞的可重复和相关方法。这里展示了在4小时和24小时后通过mRNA表达定量和Cy3-珠吞噬细胞测定使用几种刺激物的小胶质细胞活化。目前的工作有望提供一种易于复制的技术，用于从青少年发育阶段分离生理相关的小胶质细胞。
Introduction
小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞样细胞，来源于卵黄囊的红细胞生成前体，在胚胎早期发育期间迁移到神经上皮1。除了免疫功能外，它们在神经发育过程中也起着重要作用，特别是在突触发生、神经元稳态和髓鞘形成方面2。在成年期，小胶质细胞发展出长细胞过程以连续扫描环境。在脑损伤或脑部疾病等稳态破裂的情况下，小胶质细胞可以改变其形态外观，采用变形虫形状，迁移到受伤区域，增加和释放许多细胞保护或细胞毒性因子。小胶质细胞具有异质性激活状态，具体取决于其发育阶段和所受损伤的类型3，4，5。在这项研究中，这些激活状态大致分为三种不同的表型：促炎/吞噬细胞，抗炎和免疫调节，请记住，实际上，情况可能更复杂6。
由于（1）断奶前动物的脆弱性和（2）小胶质细胞细胞数量少，在大脑发育的早期阶段研究体内小胶质细胞活化和神经保护策略的筛选可能具有挑战性。因此，小胶质细胞的体外研究广泛用于毒性7，8，9，神经保护策略5，10，11，12，13，14和共培养15，16，17，18，19，20，21.体外研究可以使用小胶质细胞系、干细胞来源的小胶质细胞或原代小胶质细胞培养。所有这些方法都有优点和缺点，选择取决于最初的生物学问题。使用原代小胶质细胞培养物的好处是同质的遗传背景、无病原体的历史以及控制动物死亡后小胶质细胞被刺激的时间22。
多年来，开发了不同的方法（流式细胞术，摇动或磁性标记）用于培养啮齿动物的初级小胶质细胞，包括新生儿和成人23，24，25，26，27，28，29。在本工作中，使用先前描述的磁激活细胞分选技术使用微珠包被的抗小鼠CD11b 25，27，29进行小鼠新生幼崽的小胶质细胞分离。CD11b是一种在骨髓细胞（包括小胶质细胞）表面表达的整合素受体。当大脑内没有炎症挑战时，几乎所有的CD11b +细胞都是小胶质细胞30。与先前发表的其他方法23，24，25，26，27，28，29相比，本协议平衡了即时离体小胶质细胞活化分析和常见的体外原代小胶质细胞培养。 因此，小胶质细胞（1）在出生后第（P）8天分离，没有髓磷脂去除，（2）无血清培养，（3）在脑分离后仅48小时暴露于siRNA，miRNA，药理化合物和/或炎症刺激。这三个方面中的每一个都使当前的协议具有相关性和快速性。首先，使用小儿小胶质细胞可以在培养中获得动态和反应性活细胞，而无需额外的脱髓鞘步骤，这可能会在体外改变小胶质细胞的反应性。本协议旨在尽可能接近小胶质细胞的生理环境。事实上，小胶质细胞从未遇到过血清，并且该方案也不需要使用血清。此外，早在培养后48小时暴露小胶质细胞可以防止它们失去生理能力。
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Protocol
该协议获得批准，所有动物均根据国家卫生和科学研究研究所（法国Inserm）的机构准则进行处理。介绍了 P8 处 24 只 OF1 小鼠幼崽（雄性和雌性）大脑中小胶质细胞的磁分离，分为 6 孔、12 孔或 96 孔板。实验工作在引擎盖下进行，以保持无菌条件。
1. 制备用于分离和细胞培养的无菌溶液
- 从市售的 10x 溶液中制备 50 mL 不含 Ca 2+ 和 Mg2+ （HBSS-/-） 的 1x Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）（参见材料表）。
- 使用市售的组织解离试剂盒根据表 1 中提供的组成制备解离混合物（参见 材料表）。
- 从市售的 10x 溶液中制备 200 mL 含有 Ca 2+ 和 Mg2+ （HBSS+/+） 的 1x HBSS。
- 准备 200 mL 的 1x PBS + 0.5% BSA（称为细胞分选缓冲液）。
- 根据 表2制备CD11b微珠。
- 准备 500 mL 无巨噬细胞血清培养基 （SFM） + 1% 青霉素-链霉素 （P/S）。制作50mL管的等分试样并将其储存在4°C。 这在文的后面被称为小胶质细胞培养基。
注意：所有分离溶液必须在实验当天在无菌条件下新鲜制备并保持在冰上。可以制备小胶质细胞培养基，在50 mL管中等分，并保持在4°C以备将来使用。不需要过滤。
2.脑解剖
- 在没有全身麻醉的情况下，用大剪刀斩首幼犬的头部。
- 用小剪刀在矢状缝合线（15-20毫米）后从颈部到鼻子切开皮肤（图1A-C）。
- 在与头骨平行的大孔内插入一个小剪刀尖。从每侧小心地切到眼睛（图1D，E）。
- 用小剪刀在眼睛之间剪开，将头骨和大脑从头部分离（图1F）。
- 用两个镊子抓住靠近嗅球的头骨并小心撕裂头骨，注意不要损坏下面的大脑（图1G-I）。
- 用剃须刀片去除小脑和嗅觉球，并将大脑切成两块（图1J）。
- 将脑碎片放入含有30-40mL HBSS的 培养皿中（图1K）。
3.脑解离与磁小胶质细胞分离
注意：所有细胞操作和重悬液必须非常小心地使用1，000μL移液器进行。施加高机械作用可能会激活或杀死小胶质细胞。
- 根据表1，每个含有解离混合物的解离管转移12个脑碎片（~1.2g）。对于24只幼崽，需要四个C管（图2A-B）。
- 将C管放在解离器上（使用加热模式）。根据制造商的说明在设备中启动优化的NTDK程序（图2D）。
- 以300× g 离心20秒（在4°C下）以收集所有细胞。用 1，000 μL 移液器上下移液 3 次，完成机械解离（图 2E）。
- 将细胞转移到四个 15 mL 管 + 过滤器中。用 10 mL HBSS+/+ 冲洗过滤器（图 2F）。
- 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用 10 mL HBSS+/+ 重悬沉淀（图 2G）。
- 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用6 mL分选缓冲液重悬沉淀（步骤1.4）（图2H）。
- 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。每管加入 200 μL CD11b 微珠溶液（步骤 1.5），并小心重悬（图 2I）。
- 将试管在4°C孵育15-20分钟。 小心地用 6 mL 分选缓冲液重悬沉淀（图 2I-J）。
- 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用8 mL分选缓冲液重悬沉淀（图2K）。
- 按照分离器上的POSSEL程序（见 材料表）准备八根色谱柱。将细胞转移到色谱柱上 1 mL x 1 mL。等待所有细胞通过，然后再添加另一个 mL。用 1 mL 分选缓冲液在无菌洗脱板上洗脱 CD11b+ 细胞（图 2L）。
- 将CD11b +细胞汇集在新的50 mL管中（图2M）。
- 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用10mL冷小胶质细胞培养基重悬沉淀（步骤1.6）（图2N）。
- 计数CD11b +细胞。在P8时，每个大脑应该获得~650，000个细胞。
注意：在本协议中，使用自动细胞计数器对细胞进行计数（参见 材料表）。 - 将细胞重悬于冷小胶质细胞培养基中至终浓度为650，000-700，000个细胞/ mL，并分配在细胞培养板中。
注意：6孔板用于蛋白质印迹（每孔2 mL）;12 孔板用于 RT-qPCR 分析（每孔 1 mL），96 孔板用于吞噬细胞测定（每孔 250 μL）;这三个都用于这项工作。然而，在本手稿中，没有显示蛋白质印迹分析的结果，但可以使用该方案进行。 - 将板置于37°C，5%CO2过夜。使用带有预热小胶质细胞培养基的 1，000 μL 移液器小心更换培养基。
- 在刺激前将板置于37°C，5%CO2过夜。
注意：不建议从超过 36 只幼崽和 P9 之后分离小胶质细胞。这将增加污染和细胞碎片积累以激活小胶质细胞的风险。
4. 细胞刺激
- 使用市售试剂根据表 3 制备刺激试剂（参见 材料表）。
- 在每个刺激孔中加入适当的体积。
注意：适当的体积取决于刺激物的浓度和孔的大小。 - 将板置于37°C，5%CO2直到6小时，24小时或48小时刺激结束。
- 对于蛋白质印迹分析，吸出上清液并用移液器加入50 μL蛋白质裂解缓冲液（参见 材料表）。使用吸头刮擦板底部以分离裂解的细胞并将其转移到 1.5 mL 管中。储存在-80°C。
注意：如果正确吸出上清液，培养板可以在-80°C下储存多年。 - 对于RT-qPCR分析6，31，吸出上清液并将培养板直接储存在-80°C直至mRNA提取（步骤5）。
- 对于吞噬细胞测定，请参阅步骤6。
5. mRNA提取和RT-qPCR分析
- 按照制造商的方案进行RNA提取，RT-PCR和RT-qPCR（参见材料表）。引物序列5，6，31参见表4。
- 按照先前发布的报告进行 RT-qPCR 分析5.
6. 吞噬细胞测定
- 刺激细胞并在刺激的最后3小时内进行吞噬测定。例如，对于6小时的刺激，在刺激3小时后开始吞噬测定;对于刺激12小时，在刺激开始后9小时开始吞噬测定。
- 考虑到比率（1 个单元格：50 个珠子），计算制备所需的珠子数量。对于 96 孔板的一个孔，需要 8.1 x 106 个磁珠。根据 表5制备珠子混合物。
注意：在加入PBS / FBS混合物之前，请小心地涡旋珠子库存小瓶。 - 在37°C的水浴中孵育1小时。 每10分钟涡旋一次。
- 计算要添加到每个孔中的溶液体积。加入溶液并孵育3小时。
- 用 1x PBS 冲洗孔三次。读取 550 nm 处的荧光发射（Cy3 发射波长）。
7. 纯度质量控制
- 通过流式细胞术（FACS）（细胞分选前后）评估CD11b磁性分离的纯度，然后进行RT-qPCR。
- 计数细胞并重悬于FACS缓冲液（PBS + 2mM的EDTA + 0.5%的牛血清白蛋白）中，以便在步骤3.5和步骤3.14之后获得10 x 106 细胞/ mL的稀释度。
- 常规Fc封闭32，331分钟后，用活性探针（FVS780）和针对小鼠CD45，CD11b，CX3CR1，ACSA-2，O4或其相应的对照同种型32，33的荧光团偶联抗体孵育细胞15分钟，浓度为制造商推荐的浓度（参见材料表）。
- 用FACS缓冲液洗涤细胞，固定并用市售的透化试剂盒透化（参见 材料表）。
- 在透化细胞上再次进行Fc封闭，然后与针对NeuN的荧光团偶联抗体（参见 材料表）或其对照同种型孵育15分钟。
- 用FACS缓冲液洗涤后进行FACS分析。
- 分别根据形态学参数和FVS780染色排除双峰和死细胞后，选择CX3CR1（小胶质细胞），ACSA-2（星形胶质细胞），O4（少突胶质细胞）和NeuN（神经元）的细胞内存在的表面表达的门控策略，以分析阳性细胞的百分比。
- 在步骤5之后，提取mRNA并进行RT-qPCR以定量 Itgam （CD11b），Cx3cr1，Olig2，Synaptophysin 和 Gfap mRNA。使用 Rpl13a mRNA作为报告基因标准化Cq，并对 Itgam mRNA进行相对表达。
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Representative Results
小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞，当暴露于环境挑战（创伤，有毒分子，炎症）时被激活4，5，6，34（图3A）。小胶质细胞的体外研究通常用于评估与这些环境挑战相关的细胞自主机制，并表征药理学或遗传操作后的激活状态。本文提出了一种使用磁耦合珠在幼年阶段分离原发性小胶质细胞的方法。
体外小胶质细胞活化的简单读数是量化与促炎表型（Cd86，Nos2，Ptgs2，Tnf）或抗炎表型（Cd206，Igf1，Arg1，Lgasl3）相关的几种小胶质细胞反应性标志物的mRNA表达5，6，31。 这些表型的描述取决于促炎（IL-1β，LPS）或抗炎（IL-4或IL-10）刺激后的mRNA表达。一些标志物被归类为免疫调节标志物，因为它们通过促炎和抗炎刺激上调（图3A）。我们的团队5、6、31 之前已经描述了这种分类。48 h后，用促炎和抗炎刺激刺激分离的小胶质细胞4 h或24 h.提取mRNA，并RT-qPCR定量基因表达。在4小时和24小时，促炎和免疫调节标志物由IL-1β，IL-1β + IFN-γ和LPS5，6，31诱导。在4小时，IL-4刺激也诱导免疫调节标志物Il-1rn6。它们在IL-4刺激后4小时强烈诱导抗炎标志物。有趣的是，Cd206在IL-1β刺激6后24小时也显着上调（图3B）。
为了评估小胶质细胞在 体外的吞噬活性，使用了荧光Cy3 PVC珠。它们用胎牛血清（FBS）预处理，以促进小胶质细胞的吞噬作用。小胶质细胞通过用IL-1β + IFN-γ或LPS刺激3小时或21小时向促炎表型极化。刺激结束前三小时，将Cy3珠与小胶质细胞一起孵育。用1x PBS冲洗后，量化每个孔中的荧光强度。表示相对于没有磁珠的孔的定量，并拍摄代表性图像（图4）。刺激6小时后，小胶质细胞仅在IL-1β + IFN-γ下开始吞噬Cy3珠。刺激24小时后，两种刺激的Cy3荧光均增加。Cy3荧光的增加突出了吞噬活性的增加（图4C）。
进行流式细胞术（FACS）和RT-qPCR以评估小胶质细胞培养物的纯度。流式细胞术可以区分不同的脑细胞群：CX3CR1 35用于小胶质细胞，O4用于少突胶质细胞36，NeuN用于神经元37，ACSA-2用于星形胶质细胞38。解离后，所有脑细胞都存在;然而，在使用CD11b抗体进行细胞分选后，仅存在小胶质细胞和少量O4细胞（图5A）。原代细胞培养后48小时，通过RT-qPCR评估仅发现小胶质细胞标志物（图5B）。
图 1：显示从颅骨中取出大脑的分步表示。 （A-C） 小剪刀用于在矢状缝合后从颈部到鼻子切割皮肤。（D-E）小剪刀的尖端插入与头骨平行的大孔内，从两侧到眼睛被仔细切割。（F）用小剪刀在眼睛之间剪断头骨和大脑，将头骨和大脑从头部分离。（G-I）用两个镊子抓住头骨靠近嗅觉球，并小心撕裂，以免损坏下面的大脑。（J）用剃刀刀片切除小脑和嗅觉球，将大脑切成两块。（K）将脑碎片置于含有30-40mL HBSS的培养皿中。请点击此处查看此图的大图。
图2：脑解离和小胶质细胞分离的示意图。 （A-C）在P8小鼠脑解剖并去除嗅觉球和小脑后，首先将大脑转移到具有HBSS + / +的培养皿中，然后转移到含有解离混合物的解离管中。将C管放置在解离器上（加热模式），并启动NTDK程序（D）。（E）在程序结束时，将试管在4°C下以300×g离心20秒;然后用 1，000 μL 移液器上下移液 3 次来完成解离。（F）然后将细胞转移到15 mL管+70 μm的过滤器中，并用10 mL HBSS + / +冲洗。（G）然后将样品在4°C下以300×g离心10分钟，除去上清液，并用10mL HBSS + / +重悬沉淀。（H）将试管再次在4°C下以300×g离心10分钟;除去上清液，然后将沉淀重悬于6 mL分选缓冲液中。（I）将试管在4°C下以300×g离心10分钟，除去上清液，加入CD11b微珠（200μL）溶液。将试管在4°C下孵育15-20分钟，然后重悬于6mL分选缓冲液（J）中，并在4°C下以300×g离心10分钟。 （K）除去上清液，小心地将沉淀重悬于8mL分选缓冲液中。（L）然后，在分离器上启动POSSEL程序以准备色谱柱。将细胞转移到色谱柱上1 mL×1 mL，并在带有1 mL分选缓冲液的无菌洗脱板上洗脱CD11b细胞。（M）将CD11b细胞汇集在新的50mL管中，并在4°C下以300×g离心10分钟，并除去上清液。（N）在最后一步中小心地将沉淀重悬于10mL冷小胶质细胞培养基中。将细胞计数并在小胶质细胞培养基中稀释至最终浓度为650，000-700，000个细胞/ mL，分流于细胞培养板中。请点击此处查看此图的大图。
图3：环境挑战后的小胶质细胞活化。 （A）小胶质细胞活化谱的简化示意图。（B）刺激4小时或24小时后小胶质细胞活化标志物的相对定量。双向方差分析，然后是邓内特多重比较检验39 （n = 5-15）;误差线代表 SEM;*p < 0.05， **p < 0.01， ****p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图4：体外小胶质细胞吞噬活性的评估。 （A）刺激6小时或24小时后小胶质细胞Cy3珠（红色）吞噬作用的代表性图像。使用荧光显微镜的20倍物镜获取图像。比例尺 = 100 μm。（B）每孔荧光发射的相对定量。使用双向方差分析进行统计，然后进行邓内特多重比较检验（n = 4-7）;误差线代表 SEM;*p < 0.05， ** p < 0.01， ****p < 0.001。（C）刺激6小时后小胶质细胞（绿色IBA-1 +细胞）Cy3珠（红色）吞噬作用的代表性图片。使用共聚焦显微镜的40倍物镜获取图像。比例尺 = 300 μm。请点击此处查看此图的大图。
图5：细胞分选前后通过流式细胞术评估CD11b磁分离纯度 。 （A）报告细胞分选前后细胞计数器的示例，突出显示细胞浓度和活力。（B）x轴表示CD11b细胞分选后的细胞浓度（细胞/mL）和活力（%）。柱形图;误差线表示 SEM （n = 16）。CD11b+细胞分选前后细胞群标记的表型和基因表达分析。解离后，对来自P8小鼠大脑的CD11b+细胞进行磁分选。分析分选前后小胶质细胞（CX3CR1）、少突胶质细胞（O4或 Olig2 mRNA）、神经元（NeuN或 突触素 mRNA））和星形胶质细胞（ACSA-2或 Gfap mRNA）标记物的表达。（C） CX3CR1、O4、NeuN 和 ACSA-2 表达的 FACS 分析。x 轴表示活细胞的百分比和细胞数。（D）CD11b +细胞表达 Cx3cr1， Olig2， Synaptophysin 和 Gfap mRNA的相对定量（x轴表示 Itgam mRNA的相对靶mRNA表达）。柱形图;误差线表示 SEM （n = 7）。 请点击此处查看此图的大图。
| 溶液 | 对于一个 C 管 （μL） | 适用于四个 C 管 （μL） |
| 缓冲液 X | 2850 | 11400 |
| 酶P（木瓜蛋白酶） | 75 | 300 |
| 酶 A （脱氧核糖核酸酶） | 15 | 60 |
| 缓冲液 Y | 30 | 120 |
| 总 | 2970 | 11880 |
表1：解离混合物的制备。
| 溶液 | 对于一个试管 （μL） | 适用于四管 （μL） |
| CD11b 微珠 | 20 | 80 |
| 排序缓冲区 | 180 | 720 |
| 总 | 200 | 800 |
表2：CD11b微珠溶液的制备。
| 刺激 | 浓度（纳克/毫升） |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| 伊尔-10 | 20 |
表3：刺激试剂。
| 基因 | 蛋白 | 向前 | 反向 |
| 参数1 | 精氨酸酶1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| CD206 | 分化簇 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| CD32 | 分化簇 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| CD86 | 分化簇 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| 格法普 | 神经胶质纤维酸性蛋白 | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| 免疫因子-1 | 胰岛素样生长因子 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | 白细胞介素 1 受体拮抗剂 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra-Il4-ra-ra | 白细胞介素4受体拮抗剂 | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| 伊特甘 | 整合素α M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| 加尔斯3 | 凝集素乳糖苷结合可溶性3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nos2 | 一氧化氮合酶2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| 奥利格2 | 少突胶质细胞转录因子 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | 前列腺素内过氧化物合酶2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | 核糖体蛋白L13a | ACA GCC 法案 CTG 插科打诨 AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | 细胞因子抑制因子3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG AT |
| SPHK1 | 鞘氨醇激酶1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| 西普 | 突触素 | ATCTCAGTGTCCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| TNF-α | 肿瘤坏死因子α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
表4：RT-qPCR引物序列。
| 刺激 | 对于 1 孔 | 对于 n 孔 |
| Cy3 磁珠（1 个细胞：50 个磁珠） | 8, 100, 000 | X = （8， 100， 000） x n |
| 1x 公共广播公司 | Y =（100+X）/n | 50 |
| FBS | 50 |
表5：用于吞噬测定的磁珠混合物的制备。
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Discussion
目前的工作展示了使用磁分选CD11b +细胞的原代小胶质细胞培养物。除了小胶质细胞功能评估（RT-qPCR和吞噬细胞测定）外，还测定了小胶质细胞培养纯度。
经典的小胶质细胞培养物通常由 P1 或 P2 啮齿动物新生儿脑生成，并与星形胶质细胞共培养至少 10 天。然后使用轨道摇床机械分离小胶质细胞。体 外分离 和培养小胶质细胞的方法在1990年代末首次从新生大鼠的大脑中描述40，41。从那时起，它已被广泛用于分析小胶质细胞表型，例如活化/静息小胶质细胞或促炎/抗炎小胶质细胞。此外，该实验对于将小胶质细胞定义为与神经元共培养的神经毒性细胞至关重要。然而，在2014年，Biber和合作者描述了使用经典方法在 体外 研究小胶质细胞的三个显着缺点42。（1）实验使用大鼠/小鼠新生儿大脑（P1/P2），这些细胞没有经过 体内可能发生的所有成熟过程。（2）在共培养基中，使用10%FBS;然而， 在体内，小胶质细胞在“正常”环境中从未遇到过这样的成分。（3）最近的研究表明， 体内 小胶质细胞受到培养物中不存在的几种抑制成分的抑制43，44。此外，许多研究（电生理45和转录组46，47）将非刺激的原发性小胶质细胞描述为“活化”。
本方法提出了一种使用磁细胞分选技术生成小胶质细胞培养物的替代技术。通过该协议，小胶质细胞仅在动物死亡后几个小时收获，无需任何共培养步骤。此外，与10-14 DIV相比，小胶质细胞在刺激前仅培养2天体外（DIV），包括其他方案中的共培养。这样可以更接近小胶质细胞的生理条件。这种体外培养小胶质细胞的程序先前发表于25，26，27，28，29。目前的工作提出了一种针对新生小鼠的优化方案，标准化以减少使用的动物数量，并且没有髓磷脂去除步骤。
为了减少用于原代小胶质细胞培养的小鼠数量，我们决定在OF1菌株的P8上工作。在OF1菌株大脑发育的这个阶段，每个大脑获得多达750，000个小胶质细胞，而在同一年龄，每个C57BL6 / J菌株小鼠大脑获得500，000个小胶质细胞。C57BL6/J菌株已在小胶质细胞培养的不同发育阶段发表27，28。本协议还用于Fmr1KO 小鼠，以评估与该突变相关的小胶质细胞的吞噬特性，以及LysMCre：Dicerfl / + 小鼠，以通过RT-qPCR评估小胶质细胞活化表型。因此，使用C57BL / 6 J小鼠品系比处理OF1菌株更具挑战性，因为（1）在相同发育阶段每个大脑的小胶质细胞较少，以及（2）由于机械激活而更容易死亡的小胶质细胞的脆弱性（请参阅故障排除部分）。
根据原发性小胶质细胞培养选择的发育阶段，必须考虑髓鞘形成，因为它始于 P5 左右。在经典小胶质细胞培养（P0-2）中，髓鞘形成不是问题;然而，在其他已发表的分离小胶质细胞的方法中，使用Percoll梯度或抗髓磷脂抗体25，26，28，29去除髓磷脂。在本方案中，当髓鞘形成已经开始时，动物在P8处被安乐死;大量用于冲洗颗粒，新形成的髓磷脂无需任何其他程序即可去除。这可以是一种故障排除方法（请参阅碎片部分）。
制造商和先前发表的小胶质细胞磁分离使用补充有 10% FBS - 1% P/S25，26，27，28，29 的 DMEM F-12 培养基。Biber等人42描述了小胶质细胞很少接触体内血清。事实上，中枢神经系统的细胞外液很少含有蛋白质和生物活性因子29。这就是为什么在本协议中使用无血清巨噬细胞（SFM）培养基+ 1%P / S的原因。
磁激活细胞分选（MACS）方案还可以分离和培养具有一些修饰的出生后大鼠小胶质细胞25，29。确实使用微珠包被的抗大鼠CD11b / c分离大鼠小胶质细胞。然而，由于大脑尺寸大于P8小鼠，每列每个解离管只能使用一个大脑。在先前发表的方案中，从P10-14大鼠大脑中分离小胶质细胞，包括髓鞘去除步骤29。尽管之前对培养基有评论，但对于大鼠小胶质细胞培养，建议将F-12培养基+ 10%FBS和每12孔板550，000-600，000个细胞用于下游应用。
故障 排除
解离：如 表 1中所述的解离混合物计算在OF1小鼠中可以解离并在P8进行的最大脑量。如果添加更多的大脑，则在步骤3.2结束时无法完成解离，并且会发现未解离的脑组织。在这种情况下，建议在具有非解离组织的管上运行NTDK程序，并将其他管保持在4°C。
堵塞的过滤器和/或色谱柱：如前所述，解离混合物是根据步骤3.5期间可以通过过滤器的最大脑组织量计算的。如果添加更多的大脑，过滤可能需要更长的时间，但最终，它会通过。建议小心地将细胞悬液重悬在过滤器顶部，直到过滤所有细胞悬液。
在步骤3.12中，实验者必须将标记的细胞悬液通过磁场内的柱子。在手术的这个阶段，色谱柱可能会堵塞（1）如果每管解离过多的脑组织，（2）如果重悬体积不正确，或（3）如果有一些机械诱导的细胞死亡（可能存在一些DNA）;在这种情况下，建议用 200 μL 尖端小心地去除可见 DNA。
机械诱导的细胞死亡和/或激活：这里描述的方案提出了一个主要挑战：避免机械激活。为此，轻柔移液并保持低离心速度至关重要。否则，未成熟的小胶质细胞可能会因机械应力而死亡或被激活，从而导致RT-qPCR结果的高度变异性。
碎片：在这个过程中，当髓鞘形成刚刚开始时，动物在P8处被安乐死，因此没有精确去除髓磷脂的程序。在这个发育阶段，髓磷脂可以很容易地通过离心去除。计算此程序中描述的重悬体积以去除最大髓磷脂。如果不尊重，髓磷脂可能会在培养孔中以细胞碎片的形式出现。当在第2天更换培养基在培养孔中观察到时，实验者不能完全去除它。小胶质细胞倾向于吞噬这种碎片，这可能会影响刺激前的小胶质细胞活化状态，从而影响实验的可重复性。
所有先前描述的故障排除（解离，过滤器和/或色谱柱堵塞，机械诱导的细胞死亡和/或活化以及碎片）都可能导致细胞计数时获得的CD11b +细胞数量的变化（图5B）。我们建议高度重视这一点，以优化最终的细胞产量。
污染：在该协议中，小胶质细胞在SFM培养基+ 1%P / S中培养。因此，建议在加入 P/S 后将培养基分装在 50 mL 管中，以避免培养基污染。此外，所有实验都需要尽可能在无菌条件下进行。
mRNA数量/质量：我们的团队致力于miRNA或siRNA转染。本方案与使用磁转染的此类应用高度兼容，但对方案稍作修改;实验者需要每 12 孔板收获 700，000 个细胞，以获得用于 RT-qPCR 的高质量 mRNA。尽管本研究未进行RNAseq，但在此之前，我们的团队使用每12孔板48500，000个细胞对RNAseq进行了mRNA提取。
总之，该方案可以复制，有望成为在幼年发育阶段分离小胶质细胞的新标准。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
图形是使用BioRender创建的。该研究由Inserm，巴黎大学，地平线2020（PREMSTEM-874721），法国基金会，ARSEP基金会，切尔沃研究基金会，摩纳哥格雷斯基金会资助，以及未来投资-ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS和Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.的额外资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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