Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires
25 juillet 2022
Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.
Ce protocole nous permet de cultiver la microglie dans des conditions qui imitent étroitement les caractéristiques in vivo. En utilisant la technologie de tri cellulaire magnétique, notre protocole nous permet de stimuler la microglie seulement deux jours in vitro, sans utiliser de sérum dans le milieu de culture. Pour commencer, utilisez de petits ciseaux pour couper la peau du cou au nez, en suivant la suture sagittale de 15 à 20 millimètres.
Insérez les pointes avec le foramen magnum parallèle au crâne. Couper de chaque côté aux yeux. Coupez entre les yeux avec de petits ciseaux pour détacher le crâne et le cerveau de la tête.
Avec deux pinces, saisissez le crâne près des bulbes olfactifs et déchirez soigneusement le crâne. Avec une lame de rasoir, retirez le cervelet et le bulbe olfactif et coupez le cerveau en deux morceaux. Placez les morceaux de cerveau dans une boîte de Petri contenant 40 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium.
Préparer le mélange de dissociation selon ce tableau. Transférer 12 morceaux de cerveau dans un tube C pour un poids total de 1,2 gramme par tube de dissociation. Placez ensuite les tubes C sur le dissociateur avec chauffage.
Démarrez le programme NTDK optimisé dans le dissociateur. Centrifuger pendant 20 secondes. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois.
Transférer les cellules dans quatre tubes de 15 millilitres munis de crépines. Rincez les passoires avec 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium. Centrifuger pendant 10 minutes et retirer le surnageant avec une pipette de 10 millilitres.
Ajoutez soigneusement 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium et remettez la pastille en suspension. Encore une fois, centrifuger et retirer le surnageant. Re-suspendre la pastille avec six millilitres de tampon de tri.
Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution de microbilles CD11b et incuber les tubes pendant 15 à 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, remettre en suspension la pastille avec six millilitres de tampon de tri.
Répétez la centrifugation et remettez la pastille en suspension avec huit millilitres de tampon de tri. Ensuite, suivez le programme Possel sur le séparateur pour préparer huit colonnes. Passez les cellules à travers la colonne en ajoutant un millilitre de suspension cellulaire à la fois.
Avec un millilitre de tampon de tri, éluer les cellules CD11b positives sur une plaque d’élution stérile. Regroupez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger et remettre en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu microglial froid.
Comptez les cellules CD11b positives. Re-suspendre les cellules dans un milieu microglial froid pour obtenir une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules par millilitre. Distribuer la suspension dans des plaques de culture cellulaire.
Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu microglial préchauffé et répétez l’incubation pendant la nuit. Stimuler les cellules avant cette étape et effectuer un dosage phagocytaire pendant les trois dernières heures de la stimulation.
Calculez le nombre de perles selon ce tableau à un ratio de 50 perles par cellule. Préparez le mélange de perles. Incuber le tube pendant une heure au bain-marie à 37 degrés Celsius.
Vortex toutes les 10 minutes. À chaque puits, ajoutez le volume calculé de la solution de billes et incuber pendant trois heures. En utilisant cette approche, l’activité phagocytaire de la microglie a été évaluée après stimulation par des facteurs pro-inflammatoires, tels que l’interleukine-1 bêta, plus l’interféron gamma, ou les lipopolysaccharides.
Après une stimulation de six à 24 heures, les billes fluorescentes de microglie Cy3 ont été analysées au microscope confocal. Après six heures, la microglie commence à phagocyter les billes Cy3 uniquement dans des conditions d’interleukine-1 bêta plus interféron gamma. Après 24 heures, il y avait une augmentation de la fluorescence Cy3 pour les deux types de stimulation, soulignant une activité phagocytaire accrue.
La pureté de la culture microgliale a été augmentée par cytométrie en flux, qui a montré une augmentation de la viabilité cellulaire après le tri. À l’aide de la cytométrie de flux et des marqueurs de population de cellules RT-qPCR, on a analysé avant et après le tri des cellules CD11b positives du cerveau de souris au huitième jour postnatal. Ces analyses ont distingué diverses populations de cellules cérébrales, telles que CX3CR135 pour la microglie, O4 ou OLIG2 pour les oligodendrocytes, NeuN ou synaptophysine, pour les neurones, et ACSA-2, ou GFAP pour les astrocytes.
Après tri cellulaire à l’aide d’anticorps CD11b, seules les microglies ont été obtenues. Il est important de pipeter très doucement tout en ajoutant la suspension à la colonne pour éviter le colmatage et éviter la mort mécanique des cellules. Après cette méthode, la protéomique transcriptomique, comme le sang occidental, ou Luminex, et même l’immunochimie peuvent être effectuées afin de voir l’effet de la stimulation microgliale.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole reproductible pour l'isolement de microglies primaires chez des souris néonatales, en utilisant la technologie de tri magnétique. La méthodologie permet la culture de microglies dans des conditions proches de leurs caractéristiques in vivo, offrant des aperçus sur leur activité phagocytaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les microglies
Contexte
- Les microglies jouent des rôles cruciaux dans le système nerveux central.
- Comprendre les réponses des microglies aux stimuli est important pour la recherche en neuroinflammation.
- Le tri magnétique des cellules constitue une stratégie viable pour isoler les microglies.
- Les protocoles antérieurs peuvent manquer de reproductibilité ou de pertinence par rapport aux conditions in vivo.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole permettant d'isoler et de cultiver efficacement des microglies primaires.
- Permettre l'évaluation des réponses des microglies à des stimuli inflammatoires.
- Évaluer la pureté et la viabilité des microglies isolées.
Méthodes utilisées
- Méthode de culture cellulaire utilisant le tri magnétique pour isoler les microglies de souriceaux néonatals.
- Le modèle biologique implique des microglies corticales provenant de souriceaux néonatals.
- L'immunochimie et la cytométrie en flux ont été utilisées pour évaluer la pureté cellulaire.
- Les étapes clés comprennent la dissection, la dissociation enzymatique et le tri à l'aide de microbilles anti-CD11b.
- Des tests de phagocytose ont permis d'évaluer l'activité microgliale en réponse à des facteurs pro-inflammatoires.
Résultats principaux
- Les microglies ont démontré une activité phagocytaire accrue en réponse à des conditions inflammatoires spécifiques.
- Une viabilité et une pureté cellulaires accrues ont été confirmées par cytométrie en flux après tri.
- La microscopie confocale a mis en évidence des différences marquées dans l'activité phagocytaire selon la durée de stimulation.
- La méthode a permis de clarifier les distinctions entre différentes populations de cellules cérébrales.
Conclusions
- La présente étude établit une méthode fiable pour isoler les microglies de souris en vue d'expérimentations in vitro.
- Les résultats améliorent la compréhension des fonctions microgliales et de leurs réponses à l'inflammation.
- Ce protocole constitue une base pour de futures recherches sur les processus neuroinflammatoires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Ce protocole fournit une méthode reproductible pour isoler des microglies primaires chez des souris néonatales, permettant ainsi des modèles in vitro physiologiquement pertinents pour la recherche sur la neuroinflammation. En obtenant une haute pureté et viabilité grâce à un tri magnétique basé sur le CD11b, cette approche facilite la réduction mécanistique des risques lors de la validation ciblée et du développement d'essais pour les troubles du SNC. La méthode améliore la fiabilité prédictive du criblage préclinique en maintenant la fonctionnalité des microglies et leurs états d'activation, qui imitent étroitement les conditions in vivo.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des phénotypes d'activation des microglies et des réponses pro-inflammatoires pertinentes pour les hypothèses sur les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système de culture standardisé, sans sérum, qui réduit la variabilité biologique et soutient des études cohérentes sur l'engagement des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des résultats phagocytaires et transcriptionnels quantifiables pour le criblage de composés modulateurs dans les voies inflammatoires.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole d'isolement reproductible et évolutif, compatible avec les plaques multi-puits et les tests de stimulation en cours de temps.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation liée aux maladies en préservant les marqueurs d'identité des microglies (par exemple, CX3CR1) et les réponses fonctionnelles à des stimuli tels que l'IL-1β/l'IFN-γ et le LPS.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité translationnelle, de la découverte à la validation préclinique, grâce à une purification standardisée et une validation fonctionnelle par cytométrie en flux et microscopie confocale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce, en fournissant des cellules primaires validées pour le test d'hypothèses, la préparation des tests et la génération de données permettant l'identification de composés d'intérêt et l'évaluation des risques précliniques.
- Découverte biologique : Permet une dé-risque mécanistique en isolant les microglies afin de clarifier leur implication dans les voies des processus neuroinflammatoires.
- Écranage : Fournit des cellules prêtes à l'essai avec des lectures quantifiables de phagocytose et d'ARNm pour des études de criblage de composés et de modulation de cibles.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de variables dépendantes, notamment l'activité phagocytaire (absorption de billes marquées Cy3) et l'expression génique (RT-qPCR), pour l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Préserve la fidélité phénotypique et l'expression des marqueurs, facilitant l'alignement des biomarqueurs et la continuité lors de la validation préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'isolement réutilisable, applicable à plusieurs projets étudiant la fonction des microglies dans des modèles de maladies du système nerveux central.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à des modèles microgliaux physiologiquement pertinents.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par tri magnétique et conditions de culture définies, minimisant ainsi la variabilité d'un lot à l'autre.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision « aller/ne pas aller » en fournissant des données précliniques fiables sur la modulation des cibles et les profils de réponse inflammatoire.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles du SNC en se basant sur des données validées d'engagement microglial et de résultats fonctionnels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection de tissus néonatals, en dissociation enzymatique et en techniques de tri cellulaire magnétique.
- Dépend de l'accès à des trieurs cellulaires (par exemple, MACS), à des centrifugeuses et à une infrastructure stérile pour la culture tissulaire.
- Exige une préparation standardisée des réactifs et un contrôle précis des durées d'incubation afin d'assurer un rendement et une viabilité constants des cellules positives pour CD11b.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles ou à d'autres stades de développement peut nécessiter une optimisation des paramètres de dissociation et de tri.
- Les limites pratiques incluent la sensibilité mécanique lors du passage en colonne, nécessitant un pipetage doux pour éviter les obstructions et les dommages cellulaires.
