Summary
هنا ، نقدم طريقة اقتصادية وفعالة لعزل وتوليد خلايا تغصنية عالية النقاء مشتقة من نخاع العظام من الفئران بعد 7 أيام من الزراعة مع 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.
Abstract
يتزايد الطلب على الخلايا المتغصنة (DCs) تدريجيا مع تقدم أبحاث علم المناعة. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في جميع الأنسجة. تتضمن الطريقة التقليدية لعزل DCs في المقام الأول تحفيز تمايز نخاع العظم (BM) إلى DCs عن طريق حقن جرعات كبيرة (>10 نانوغرام / مل) من عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة - البلاعم / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4) ، مما يجعل الإجراء معقدا ومكلفا. في هذا البروتوكول ، باستخدام جميع الخلايا BM المستزرعة في وسط 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4 ، بعد 3-4 تبادلات نصف مستزرعة ، تم حصاد ما يصل إلى2.7 × 10 7 خلايا CD11c + (DCs) لكل فأر (عظم الفخذ) بنقاء 80٪ -95٪. بعد 10 أيام في الثقافة ، زاد التعبير عن CD11c و CD80 و MHC II ، في حين انخفض عدد الخلايا. بلغ عدد الخلايا ذروته بعد 7 أيام من الثقافة. علاوة على ذلك ، استغرقت هذه الطريقة 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم ، وتم الحصول على عدد كبير من DCs بعد أسبوع واحد من الثقافة.
Introduction
الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) لتنشيط الخلايا التائية الساذجة وتحفيز استجابات محددة للخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ضد الأمراض المعدية وأمراض الحساسية والخلايا السرطانية1،2،3. DCs هي الرابط الرئيسي بين المناعة الفطرية والمناعة التكيفية وتلعب دورا أساسيا في الدفاع المناعي والحفاظ على التسامح المناعي. في السنوات ال 40 الماضية ، سعى العديد من الباحثين إلى تحديد المجموعات الفرعية من DCs ووظائفها في الالتهاب والمناعة. وفقا لتلك الدراسات ، تتطور DCs على طول السلالات النخاعية واللمفاوية من خلايا نخاع العظام. اكتسبت لقاحات الأورام معالم مهمة في السنوات الأخيرة ولها مستقبل واعد. ميكانيكيا، تقوم لقاحات الأورام بتعديل الاستجابة المناعية ومنع نمو الورم عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا باستخدام مستضدات الورم. يلعب اللقاح القائم على DCs دورا مهما في العلاج المناعي للورم وقد تم تحديده كواحد من أكثر العلاجات المضادة للورم الواعدة 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام DCs على نطاق واسع في اختبار الأدوية الجديدة المستهدفة جزيئيا ومثبطات نقاط التفتيش المناعية5.
يحتاج الباحثون بشكل عاجل إلى عدد كبير من DCs عالية النقاء لمواصلة دراسة دور DCs. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في الأنسجة المختلفة والدم ، حيث تمثل 1٪ فقط من خلايا الدم في البشر والحيوانات. تعد زراعة الخلايا المتغصنة لنخاع العظم في المختبر (BMDC) طريقة مهمة للحصول على كميات كبيرة من خلايا DC. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام بروتوكول Lutz لتوليد DCs من نخاع العظم على نطاق واسع من قبل الباحثين6. على الرغم من أن البروتوكول فعال في الحصول على خلايا DC ، إلا أنه معقد ومكلف ، حيث يتضمن إضافة تركيزات عالية من السيتوكينات وتحلل خلايا الدم الحمراء.
في هذه الدراسة ، أبلغنا عن طريقة لعزل جميع خلايا نخاع العظم تقريبا من نخاع عظم الفأر (BM) وتحفيز التمايز في BMDC بعد 7-9 أيام من الحضانة في المختبر ، مع تركيز أقل من GM-CSF و IL-4. يستغرق هذا الإجراء 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم تقريبا وتعليقها في وسط كامل. باختصار ، نحن نقدم طريقة زراعة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لشركة BMDC في هذا البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة نانجينغ الطبية.
1. عزل نخاع العظم وإعداد الخلايا BM
- التضحية C57BL / 6 الفئران (18-22 غرام ، 6-8 أسابيع من العمر) عن طريق الاختناق CO2 . إصلاح الماوس على طاولة تشغيل الماوس. تطهير الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- قطع جلد الساق لفضح العضلات والشريان الفخذي. قم بتثبيت الشريان الفخذي وتمزيقه باستخدام ملقطين ، ثم اسحب الطرف القريب نحو البطن.
ملاحظة: لا تقطع الشريان الفخذي مباشرة. خلاف ذلك ، فإنه سوف يسبب نزيفا مفرطا ويلوث مجال الرؤية. - قطع جميع العضلات حول عظم الفخذ.
- قم بتمديد الأطراف السفلية للفأر ببطء إلى الخارج حتى يتم سماع صوت خلع مفصل الورك ويكون هبوط رأس الفخذ مرئيا.
- افصل الأطراف السفلية عن الجسم باستخدام مقص على طول الجزء الداخلي من رأس الفخذ.
- قطع الساقين الخلفيتين من نهاية مفصل الركبة للحصول على عظم الفخذ الحر والكامل.
- إزالة العضلات المرتبطة بعظم الفخذ باستخدام الشاش.
ملاحظة: لا تمزق العضلات مباشرة. عظم الفخذ من الفئران دقيق ، يجب الحفاظ على سلامته. - اغمري عظم الفخذ في 75٪ من الكحول لمدة 2-5 دقائق.
2. الثقافة التعريفية ل BMDC
- شطف الكحول المتبقي مع PBS. استخدم ملقط مرقئ لتثبيت الجزء الأوسط والسفلي من عظم الفخذ ومجموعة أخرى لتثبيت الطرف السفلي من عظم الفخذ. يتم تطبيق ملقط مرقئ أفقيا على عظم الفخذ ، ويتم فصل عظم الفخذ عن خط المشاش.
ملاحظة: لا يمكن رؤية خط المشاش بسهولة حتى كسور عظم الفخذ. يتم تنفيذ كل هذه الخطوات والخطوات التالية في بيئة معقمة. - استخدم حقنة 1 مل (إبرة: 0.6 مم × 25 مم) لاختراق تجويف نخاع العظم من كسر خط المشاش وتدوير الإبرة لاختراق رأس الفخذ ومن خلال تجويف نخاع العظم. اخفق واغسل تجويف نخاع العظم باستخدام 1 مل من الوسط الكامل الذي يحتوي على GM-CSF / IL-4 حتى يصبح العظم أبيض.
ملاحظة: وسط الاستزراع الكامل: 10٪ FBS ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، 55 ميكرومتر β-Mercaptoethanol ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، و 10 نانوغرام / مل IL-4. - أعد تعليق جميع الخلايا في 24 مل من وسط الثقافة الكامل (~ 5 × 105 خلايا / مل). بعد الخلط ، تم زرع جميع الوسائط على طبق من 6 آبار مع 4 مل / بئر ، ثم تم تحضينها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة يومين.
ملاحظة: ليس من الضروري تحليل كريات الدم الحمراء. - استبدل كل الوسط بعد 2 أيام بوسط يحتوي على GM-CSF / IL-47. في الأيام الرابع والسادس والثامن ، استبدل نصف الوسط بالوسط الكامل الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.
ملاحظة: في هذه الخطوة، تتم إزالة الخلايا المعلقة مثل كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية. - التقط صورا كل يوم لتسجيل نمو الخلايا. بدءا من اليوم السادس ، قم بحصاد بئر واحد من الخلايا يوميا لحساب رقم الخلية واكتشاف التعبير CD11c و CD80 و MHC II 6,7.
3. الكشف عن التدفق الخلوي للتعبير عن CD11c و CD80 و MHC II
- بعد غسل DCs باستخدام PBS ، أعد تعليق 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأضف 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة CD16/32 المضادة للفأر ، واحتضنها لمدة 10 دقائق على الجليد لمنع مواقع المستضدات غير المحددة.
- أضف 1 ميكروغرام من Percp/cy5.5-CD11c، و0.5 ميكروغرام من PE-CD80، و0.04 ميكروغرام من الأجسام المضادة APC-MHC II، واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة supernatant ، وإضافة 1 مل من 4٪ paraformaldehyde ، وإصلاح لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وإعادة التعليق في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
- إجراء قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخراج الخلايا 1 × 10 7-1.7 × 107 من عظمي الفخذ وأعيد تعليقها في 24 مل من الوسط قبل زرعها في صفيحة من 6 آبار (الشكل 1 أ). بعد 2 أيام ، تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق تغيير وسط الثقافة بالكامل. قبل تغيير الوسط ، لوحظ وجود عدد كبير من الخلايا المعلقة (الشكل 1 ب). بعد 3 أيام من الثقافة ، بدأت مستعمرات الخلايا الصغيرة في التكون. في اليوم السادس ، زاد حجم وعدد المستعمرات بشكل كبير. في اليوم السابع ، بلغ عدد الخلايا ذروته (22 × 10 6-27 × 106) ثم انخفض تدريجيا (الشكل 2A). أصبح سطح خلايا DC خشنا مع pseudopodia أطول ، مما يدل على مورفولوجيا خلايا DC الناضجة النموذجية (الشكل 2B). أظهر تحليل التدفق الخلوي أن نسبة CD11c الإيجابية إلى إجمالي الخلايا كانت 71٪ في اليوم السادس ، في حين ارتفعت النسبة إلى 96.1٪ في اليوم العاشر (الشكل 2C ، 2D).
لتقييم التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك ، تم تلطيخ CD11c و CD80 و MHCII بشكل مشترك. كما هو موضح في الشكل 3A ، زاد التعبير عن CD11c و CD80 و MHC II تدريجيا مع زيادة وقت الزراعة من اليوم 6 إلى اليوم 10. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل التدفق الخلوي زيادة تدريجية في نسب CD11c و CD80 مزدوجة الإيجابية، CD11c و MHCII مزدوجة الإيجابية (الشكل 3B، 3D)، والخلايا الموجبة الثلاثية (الشكل 3C، 3D).
الشكل 1: صور تمثيلية ل DCs في أوقات ثقافية مختلفة . (A) مخطط انسيابي لزراعة BMDC. (ب) صور تمثيلية للمدن النامية في أوقات ثقافية مختلفة. تم تعليق خلايا نخاع العظم في 24 مل من وسط الاستزراع مع 10 نانوغرام / مل GM-CSF و IL-4 وزرعت في صفيحة من 6 آبار. BF ، قبل تغيير وسط الثقافة ؛ AF ، بعد تغيير وسط الثقافة. سهم أحمر ، مستعمرة العاصمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عدد ونقاء DCs في أوقات الاستزراع المختلفة. (أ) إجمالي عدد الخلايا في جميع وسائط الاستزراع. (ب) الصور التمثيلية لل DCs. (C,D) التدفق الخلوي والتمثيل البياني لتحليل نسبة DCs. تم فرز الخلايا الموجبة بواسطة CD11c. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك في DCs. (أ) التعبير عن CD11c و CD80 و MHC ΙΙ في DCs. (B) تحليل التدفق الخلوي لنسبة CD11c و CD80 مزدوج الإيجابية و CD11c و MHC ΙΙ مزدوج الموجب وثلاثي الموجب. (ج، دال) تحليل التدفق الخلوي من اليوم 6 - اليوم 10 والتمثيل الرسومي لإظهار التحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدى البشر والفئران مجموعات فرعية مختلفة من DC ، بما في ذلك DCs الكلاسيكية (cDCs ، بما في ذلك cDC1s و cDC2s) و plasmacytoid DCs (pDCs) ، و DCs المشتقة من الخلية الأحادية (MoDCs) 9،10،11. من المقبول عموما أن cDC1s تنظم استجابات الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) لمسببات الأمراض داخل الخلايا والسرطان ، و cDC2s تنظم الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض خارج الخلية والطفيليات والمواد المسببة للحساسية12. يمكن إنتاج عدد كبير من DCs في المختبر من الخلايا السلفية BM في الفئران في وجود GM-CSF و IL-4 6,13,14. تلعب نقاء وكمية DCs أدوارا رئيسية في العلاج المناعي الناجح ل DC. أظهر الباحثون أن جرعتين من 1 × 105 إلى 1 × 106 DCs يمكن أن تثير استجابات فعالة للخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) في نموذج xenograft15،16،17،18. وهذا يعني أنه يجب زراعة عدد كبير من DCs عالية النقاء لمزيد من التحقيق في دور DCs في العلاج المناعي للورم.
الطريقة التقليدية للحصول على خلايا نخاع العظم هي قطع طرفي عظم الفخذ وشطفهما بالوسط 6,7. في هذه الدراسة ، استخدمنا بشكل مبتكر الهياكل التشريحية الفسيولوجية لقطع عظم الفخذ. تم استخدام ملقط مرقئ لتثبيت الطرف السفلي من عظم الفخذ وتحريكه أفقيا. خط المشاش ضعيف من الناحية الفسيولوجية ، مما يجعله عرضة للكسور عند الإجهاد19. بعد فصل عظم الفخذ عن خط المشاش ، تبقى كمية صغيرة من العظام في تجويف النخاع. يمكن للإبرة اختراق العظم بسهولة في تجويف نخاع العظم. هذه الطريقة سهلة التشغيل ، وتحمي خلايا نخاع العظم الثمينة ، وتوفر أساسا خلويا لزراعة عدد كبير من DCs. لقد قمنا بزراعة DCs باستخدام مزيج من 10 نانوغرام / مل GM-CSF و 10 نانوغرام / مل IL-4 ، مما يساهم في نضج DCs أكثر من GM-CSF وحده. أفاد Labeur and Son أن الاستخدام المشترك ل GM-CSF و IL-4 في وسط DCs أدى إلى تعبير أعلى عن علامات النضج ، مثل IFN-ɣ و TNF-α و IL-6 ، وتعزيز القدرة على تقديم المستضدات7،20،21. واقترح سون وآخرون أيضا أن الجمع بين GM-CSF و IL-4 يعزز نضج DCs 7,21.
في هذه الدراسة ، قمنا مباشرة بزراعة خلايا نخاع العظم التي تم جمعها دون تحلل كريات الدم الحمراء وفصلناها عن طريق الطرد المركزي المتدرج ، مما قد يؤدي إلى فقدان الخلايا ، وفي النهاية ، إلى انخفاض في DCs المحصودة. قبل تغيير الوسط ، كان هناك العديد من الخلايا المعلقة في نظام الزراعة ، بما في ذلك كريات الدم الحمراء والخلايا التائية والخلايا البائية والخلايا المحببة. أثناء الزراعة المشتركة ، قد تنتج هذه الخلايا السيتوكينات لتعزيز نضج DCs.
من حيث القيود ، استخدم هذا البروتوكول اثنين فقط من عظم الفخذ من الفأر ، باستثناء التيبياس الأصغر ، مما أدى إلى فقدان بعض الخلايا الجذعية الوسيطة. باختصار ، قمنا بتطوير بروتوكول فعال من حيث التكلفة وكفء لعزل وتوليد الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام من الفئران ، والتي تستغرق 10 دقائق فقط لفصل خلايا نخاع العظام. تم حصاد عدد كبير من DCs عالية النقاء بعد 6 أيام إلى 7 أيام من الحضانة مع 10 نانوغرام / مل من GM-CSF و IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح وأنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج خطة تيانجين للعلوم والتكنولوجيا (20JCQNJC00550) ، ومشروع تيانجين للعلوم والتكنولوجيا الصحية (TJWJ202021QN033 و TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
