Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris
1 juillet 2022
Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.
Protocole économique et efficace d’isolement et de génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris. Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing.One.Introduction. Avec l’augmentation de la recherche sur l’immunité tumorale, la demande de cellules DC augmente progressivement.
Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle consistant principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse en DC est compliquée et coûteuse. Deux. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM Nous sacrifions des souris et fixons sur la table d’opération de la souris.
Couper la peau des muscles exposés gauches et de l’artère fémorale. Ne coupez pas directement l’artère fémorale. Sinon, il provoquera des saignements abondants et contaminera le champ de vision.
Coupez tous les muscles autour du fémur. Étirez lentement les membres inférieurs de la souris vers l’extérieur jusqu’à ce que le prolapsus de la tête fémorale puisse être observé. Séparez les membres inférieurs du corps.
Coupez la patte arrière pour obtenir un fémur libre et complet. Retirez les muscles à l’aide de gaze. Ne déchirez pas directement les muscles.
Le fémur des souris est fragile. Placez le fémur dans 75% d’alcool pendant deux à cinq minutes. Trois. Culture injectable de BMDC Rincer l’alcool résiduel avec du PBS.
Serrez la partie centrale et inférieure du fémur avec une pince hémostatique et serrez l’extrémité inférieure du fémur avec une autre pince hémostatique. Les pinces hémostatiques sont appliquées littéralement sur le fémur et le fémur est brisé de la ligne épiphysaire. Utilisez une seringue d’un ml pour percer la cavité de la moelle osseuse de la ligne épiphysaire.
Utilisez un milieu complet en deux parties pour rincer la cavité de la moelle osseuse jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir les liquides de rinçage. Compléter le milieu complet contenant du GM CSF/IL-4 à 24 ml et semer dans une plaque de 6 puits avec 4 ml par puits. Quatre.Résultats.
Après deux jours, remplacer tout milieu contenant du GM-CSF/IL-4. La moitié a remplacé le milieu complet contenant du GM-CSF/IL-4, les quatrième, sixième et huitième jours. Le nombre de cellules a atteint un pic le septième jour, puis a diminué progressivement.
Les cellules DC ont formé un grand nombre de synapses montrant une morphologie typique des cellules DC matures. Les analyses de la sous-métrique de flux montrent que le ratio de CD11c a imposé ce que 71% le sixième jour, le ratio large augmente à 96,1% le 10ème jour. L’expression de CD11c, CD80 et MSC2 augmentait progressivement avec l’augmentation du temps de culture. Cinq.Conclusion.
En bref, nous avons établi un protocole économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris, ce qui ne prend que 10 minutes pour séparer les cellules de la moelle osseuse. Un grand nombre de DC de haute pureté a été récolté après six à sept jours de culture avec 10 ng par ml, GM-CSF et IL-4.
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Aperçu
Cet article présente une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse chez la souris avec une haute pureté. Le protocole implique une culture de 7 jours avec GM-CSF/IL-4.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle essentiel dans la recherche sur l'immunité antitumorale.
- Les DC sont rares dans les tissus, ce qui rend leur isolement difficile.
- Les méthodes traditionnelles de différenciation des DC sont complexes et coûteuses.
- Cette étude vise à simplifier le processus de génération de DC à partir de moelle osseuse.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rentable pour isoler les DC.
- Améliorer l'efficacité de la génération des DC à partir de moelle osseuse de souris.
- Appuyer la recherche en immunité tumorale en fournissant des DC de haute pureté.
Méthodes utilisées
- Isolation de la moelle osseuse chez les souris.
- Culture des cellules de la moelle osseuse avec GM-CSF/IL-4.
- Évaluation de la pureté et de la viabilité cellulaire.
- Approvation par le Comité d'éthique institutionnel pour l'expérimentation animale.
Résultats principaux
- Isolation réussie de DCs dérivées de moelle osseuse à haute pureté.
- Efficacité démontrée du nouveau protocole.
- Potentiel d'application plus large dans la recherche sur l'immunité tumorale.
- Réduction du temps et des coûts par rapport aux méthodes traditionnelles.
Conclusions
- La méthode développée constitue une alternative viable pour la génération de DC.
- Cette approche peut faciliter des recherches ultérieures en immunologie.
- De futures études pourraient explorer des applications dans divers contextes thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole résout le goulot d'étranglement lié à l'approvisionnement en cellules dendritiques pour la recherche en immunologie et en immunité tumorale, en proposant une méthode économique et à haut rendement pour isoler des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse chez la souris. Il permet une production échelonnée de cellules dendritiques caractérisées sur le plan phénotypique, avec une consommation réduite de réactifs et un temps de manipulation diminué, soutenant ainsi la validation précoce de cibles et les études mécanistiques dans les pipelines de l'immunothérapie. L'approche améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques en fournissant un système reproductible et pertinent pour la maladie afin d'évaluer la modulation immunitaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la fonction des cellules dendritiques dans les voies de présentation de l'antigène et d'activation des lymphocytes T.
- Valeur opérationnelle : Réduit le coût et la complexité de la génération de cellules dendritiques grâce à une différenciation standardisée par GM-CSF/IL-4.
- Valeur scientifique : Facilite la validation fonctionnelle de cibles par la caractérisation phénotypique de l'expression de CD11c, CD80 et du CMH II au fil du temps.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des populations de cellules dendritiques de haute pureté (80 % à 95 % de CD11c+) adaptées à des tests immunologiques standardisés.
- Valeur opérationnelle : Fournit jusqu'à 2,7 × 107 cellules par souris, permettant des formats de criblage à haut débit.
- Valeur scientifique : Offre un système biologique reproductible pour évaluer les effets de composés sur la maturation des cellules dendritiques et leur fonction immunitaire.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Génère un système pertinent pour la maladie permettant de modéliser les réponses des cellules dendritiques dans des contextes d'immunité tumorale.
- Valeur opérationnelle : Permet l'évaluation préclinique d'agents immunomodulateurs à l'aide d'entrées cellulaires définies.
- Valeur scientifique : Facilite la détection mécanistique des risques en reliant le phénotype des cellules dendritiques à des résultats fonctionnels dans des systèmes de co-culture.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, en passant par l'évaluation préclinique, en fournissant une source renouvelable de cellules dendritiques pour des tests axés sur l'immunité.
- Biologie de la découverte : Soutient les tests d'hypothèses sur les voies immunitaires dépendantes des cellules dendritiques et l'engagement des cibles.
- Criblage : Fournit des résultats cellulaires quantitatifs reproductibles pour évaluer l'activité immunomodulatrice.
- Analytique : Permet la mesure par cytométrie en flux de CD11c, CD80 et du CMH II comme indicateurs de maturation.
- Recherche translationnelle : Relie la génération in vitro de cellules dendritiques à des modèles précliniques d'activation et de tolérance immunitaires.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé et évolutif de production de cellules dendritiques applicable à l'ensemble des projets d'immunologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à des entrées cellulaires dendritiques définies sur la base de phénotypes.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps et le coût par un prélèvement de moelle osseuse en 10 minutes et une faible concentration de cytokines (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller ou de ne pas aller en fournissant des modèles fiables de cellules dendritiques pour le criblage d'immunothérapies.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats immunomodulateurs en utilisant des cellules effectrices immunitaires standardisées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en isolement de moelle osseuse murine et en techniques de culture cellulaire aseptiques.
- Dépend de l'accès à des plaques de 6 puits, à des pinces hémostatiques et à la cytométrie en flux pour la validation phénotypique.
- Exige une standardisation de la concentration en cytokines et du calendrier de renouvellement du milieu entre les utilisateurs.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'adaptation à d'autres souches de souris ou à des fonds génétiques différents.
- Est limité par la fenêtre de culture de 7 à 10 jours et par la diminution concomitante de la viabilité cellulaire après le pic.
