Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Effektiv og omkostningseffektiv elektroporeringsmetode til undersøgelse af primære ciliumafhængige signalveje i granulecelleprækursoren

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

Her præsenterer vi en reproducerbar in vitro elektroporering protokol for genetisk manipulation af primære cerebellar granulat celle prækursorer (GCPs), der er omkostningseffektiv, effektiv og levedygtig. Desuden viser denne protokol også en enkel metode til molekylær undersøgelse af primære ciliumafhængige pindsvinssignaleringsveje i primære GCP-celler.

Abstract

Den primære cilium er en kritisk signalering organelle findes på næsten hver celle, transduces Hedgehog (Hh) signalering stimuli fra celleoverfladen. I granulecelleprækursoren (GCP) fungerer det primære cilium som et centralt signalcenter, der orkestrerer forløbercellespredning ved at modulere Hh-signalvejen. Undersøgelsen af primære cilium-afhængige Hh signalering maskiner lettes ved in vitro genetisk manipulation af stien komponenter til at visualisere deres dynamiske lokalisering til den primære cilium. Imidlertid er transfection af transgener i de primære kulturer af praktiserende læger ved hjælp af de aktuelt kendte elektroporeringsmetoder generelt dyrt og resulterer ofte i lav celle levedygtighed og uønsket transfection effektivitet. Dette papir introducerer en effektiv, omkostningseffektiv og enkel elektroporeringsprotokol, der demonstrerer en høj transfection effektivitet på ~ 80-90% og optimal celle levedygtighed. Dette er en enkel, reproducerbar og effektiv genetisk modifikationsmetode, der gælder for studiet af den primære ciliumafhængige pindsvinsignaleringsvej i primære GCP-kulturer.

Introduction

Cerebellar praktiserende læger er meget udbredt til at studere maskiner af Hh signalering vej i neuronal stamfader celle-typer på grund af deres høje overflod og høj følsomhed over for Hh signalering vej i vivo1,2,3,4. I praktiserende læger fungerer det primære cilium som et afgørende Hh-signaltransduktionshub5, der orkestrerer spredningen af forstadiecellerne6,7,8. In vitro visualisering af Hh signalering komponenter på den primære cilium er ofte udfordrende på grund af deres lave endogene basale niveauer. Derfor er transgene modifikation af proteinekspressionsniveauer og fluorophoremærkning af det interessegen nyttige tilgange til at studere vejen ved molekylær opløsning. Men genmanipulation af GCP primære kulturer ved hjælp af liposom-baserede transfection tilgange ofte resultere i lav transfection effektivitet, hindrer yderligere molekylære undersøgelser9. Elektroporation øger effektiviteten, men kræver normalt ublu leverandørspecifikke og celletypebegrænsede elektroporeringsreagenser10.

Dette papir introducerer en højeffektiv og omkostningseffektiv elektroporeringsmetode til at manipulere Hh-signalvejskomponenterne i GCP-primære kulturer. Ved hjælp af denne modificerede elektroporeringsprotokol blev et grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket Glattet transgen (pEGFP-Smo) effektivt leveret til GCPs og opnåede høj celleoverlevelse og transfekturerate (80-90%). Desuden viste de transfekterede praktiserende læger, som det fremgår af den immunocytokemiske farvning, høj følsomhed over for udglattet agonistisk induceret aktivering af Hh-signalvejen ved at smugle EGFP-Smo til den primære cilier. Denne protokol skal være direkte anvendelig og gavnlig for forsøg, der involverer in vitro genetisk modifikation af celletyper, der er vanskelige at transfekte, såsom primære cellekulturer for mennesker og gnavere samt menneskeskabte pluripotente stamceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrerelaterede procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for håndtering af dyr og protokollen godkendt af Sundhedsministeriet, Hongkong. Animal experiment licenser efter Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) blev opnået fra Department of Health, Hong Kong regering. Dyrearbejdet blev udført i overensstemmelse med den dyresikkerhedsetik, der blev godkendt af HKBU Research Office og Laboratory Safety Committee. Se materialetabellen for at få flere oplysninger om alle materialer, der bruges i denne protokol.

1. Forberedelse forud for erfaring

  1. Udarbejdelse af kulturmedier og buffere
    1. Serumfrit medium (SFM)
      1. For at forberede 50 mL SFM tilsættes 500 μL 100x L-glutaminerstatning, 500 μL Penicillin-Streptomycin, 1 mM natrium pyruvat og 12,5 μL på 1 M KCl (endelig 250 μM) til 49 mL neurobasal medium.
      2. Flængen opdeles i 2 aliquots på 10 mL og 40 mL i 50 mL koniske rør og opbevar dem ved 4 °C i op til en måned.
    2. Fordøjelsesblokeringsmedium: 10% FBS i SFM
      1. Tilsæt 1,1 mL varmeaktiveret FBS til en 10 mL aliquot af SFM for at forberede fordøjelsesblokeringsmedium.
    3. GCP kulturmedium: SFM med B27
      1. For at forberede GCP kulturmedium skal der tilsættes 800 μL serumfrit B-27-tillæg til en 40 mL aliquot AF SFM.
        BEMÆRK: B-27-suppleret SFM kan opbevares ved 4 °C i op til en måned. Frisklavede medier giver dog optimale resultater.
    4. Dissektionsbuffer: EBSS med glukose + HEPES
      1. Tilsæt 6 g/L glukose til calcium- og magnesiumfri Earles Balanced Salt Solution (EBSS), der indeholder 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre).
      2. Opløsningen steriliseres ved at passere gennem et 0,2 μm sprøjtefilter og opbevare det ved 4 °C til langtidsopbevaring.
    5. Fordøjelsesbuffer
      BEMÆRK: Forbered dig frisk før brug.
      1. Forbered 2 mL fordøjelsesbuffer til fordøjelsen af 2-4 cerebellarvæv og 4 mL til 4-10 væv. For at forberede 4 mL fordøjelsesbuffer opløses 1,5 mg L-cystein (endelig koncentration 200-400 μg/mL) i 4 mL EBSS. Vend røret gentagne gange, indtil pulveret er helt opløst.
      2. Sterilisere opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter og en 5 mL sprøjte, og overfør opløsningen til en steril 35 mm cellekulturret.
      3. Der tilsættes 4 μL papain (1:1.000 fortynding fra en bestandskoncentration på 20 enheder/mg) og 40 μL DNase I (1:100 fortynding fra en 10 mg/mL-bestand til en endelig koncentration på 0,1 mg/mL).
      4. Inkuberes opløsningen ved 37 °C i en CO2-inkubator i mindst 30 min eller indtil brug.
        BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at aktivere papain. For at opnå optimale resultater må der ikke være mere end 45 min ved 37 °C før brug. Sørg for, at opløsningen bliver gennemsigtig, og der er ingen hvide bundfald før brug.
  2. Formalingsdæksler
    1. For at forberede dækslerne til celletilbehør skal inkuberes autoklaven 12 mm glasdæksler med 100 μg/mL poly-D-lysin (PDL, 1 mg/mL i steril dH2O) i mindst 1 time ved 37 °C. Opbevar dækslerne i den samme PDL-opløsning ved 4 °C, indtil de anvendes.
    2. På dagen for primær cellekultur opsamles PDL'en i et rent konisk rør, og dækslerne skylles tre gange med steril dH2O grundigt for at fjerne resterende PDL.
      BEMÆRK: PDL'en kan opbevares ved 4 °C til genbrug.
    3. Overfør de PDL-coatede glasdæksler på en 24-brønds plade ved at placere et coverlip i hver brønd.
    4. Fjern overskydende vand, og der tilsættes 200-300 μL Matrigel (rekonstitueret i overensstemmelse med instruktionerne i produktdataarket i serumfri DMEM-F12) for fuldt ud at dække dækslerne.
    5. Inkuberes dækslerne i Matrigel i 1 time ved 37 °C i CO2-inkubatoren .
      BEMÆRK: Fjern Matrigel før cellesåning. Dette Matrigel kan opsamles og opbevares ved 4 °C til flere genbruger.
  3. Forberedelse af preplating kultur skål
    1. Beklæg en 60 mm cellekulturret med 2 mL 100 μg/mL PDL (rekonstruer 1 mg/mL PDL-lageropløsningen i steril dH2O) ved inkubation ved 37 °C i 1 time.
    2. Umiddelbart før cellesåning fjernes og opsamles den brugte PDL i et rent konisk rør, og den opbevares ved 4 °C til flere genbruger. Skyl og vask den PDL-belagte skål tre gange med steril dH2O. Lufttørre kulturskålen før cellesåning.
    3. Brug en 60 mm cellekultur skål til frøceller høstet fra maksimalt 2 hele-cerebellum væv.
    4. Forbered yderligere kulturretter til yderligere lillehjerner.
      BEMÆRK: Se trin 2.1.18 og 2.1.19 for anvendelse af forberedelseskulturskålen.

2. Eksperimentel dag 0

  1. Isolation og dyrkning af mus primære praktiserende læger
    BEMÆRK: GCP-kulturmetoden blev ændret fra en standardprotokol, og den korte protokol blev kort beskrevet i vores tidligere arbejde6,11,12. For optimalt GCP-udbytte skal du bruge postnatal (P) dag 6 eller P7 hvalpe til isolering af GCP. Udfør følgende dissektionstrin 2.1.6-2.1.10 så hurtigt som muligt for optimal celle levedygtighed.
    1. Præwarm SFM, fordøjelsesblokering medium, kultur medium, og Opti-MEM ved 37 °C under dissektion.
    2. På en ren bænk, presoak alle dissektionsapparater i 70% ethanol til desinfektion.
    3. Fyld en 60 mm cellekulturskål med 2-3 mL dissektionsbuffer og chill den på is.
    4. Den friske fordøjelsesbuffer som beskrevet i punkt 1.1.5 og holdes varm ved 37 °C.
    5. Brug 70% ethanol til at tørre hovedet af hvalpen til desinfektion.
    6. Halshugge hvalpen uden bedøvelse. Brug kraften til at holde hovedet og steriliseret kirurgisk saks til at skære fra bagsiden af kraniet for at halshugge hvalpen. Fjern forsigtigt hud og kranium for at afdække hjernen ved hjælp af sammenkrulninger.
    7. Brug knytnæve til at klemme lillehjernen af og hurtigt suge det i den forkølede dissektionsbuffer, der blev udarbejdet i trin 2.1.3.
    8. Fjern meningerne med lillehjernen nedsænket i dissektionsbufferen under et dissekeringmikroskop. Blodkarberigede meninges skal fremstå lyserøde under dissekeringmikroskopet.
    9. Fjern alle meninges ved hjælp af sammentrækninger.
      BEMÆRK: Et lillehjernen uden meninges skal have et hvidligt udseende.
    10. Fjern eventuelle synlige midbrain væv og choroid plexus fra lillehjernen.
    11. Lillehjernen overføres til en 35 mm kulturskål, der er udfyldt med varm fordøjelsesbuffer, der er udarbejdet i trin 2.1.4. Undgå at overføre overskydende dissektionsbuffer. Skær lillehjernen i fine stykker ved hjælp af mikrospring saks så hurtigt som muligt.
    12. Inkuberes straks den hakkede lillehjernen ved 37 °C i 15 min i en CO2-inkubator . Forlæng inkubationstiden til 20 min, hvis der skal behandles mere end 4 cerebellums.
      BEMÆRK: Efter inkubation vil vævet klumpe sammen.
    13. Overfør straks det fordøjede væv til bunden af et nyt sterilt 15 mL centrifugerør ved hjælp af en P1000 pipettespidsforbrydes med fordøjelsesblokeringsmedium (undgå at overføre fordøjelsesbuffer).
    14. Tilsæt et passende volumen af fordøjelsesblokeringsmedium (1 mL for 1 lillehjernen) for at afslutte fordøjelsen og pipetten forsigtigt op og ned forsigtigt 30 gange ved hjælp af en P1000-mikropipette for yderligere at adskille vævet i en enkeltcellet suspension. Undgå dannelse af luftbobler.
    15. Før forsigtigt celleaffjedringen gennem en cellesnak på 70 μm til et nyt sterilt centrifugerør for at fjerne celleklumper.
    16. Pass en yderligere 1 mL af frisk fordøjelse blokerende medium gennem celles si til at indsamle resterende celler fra cellesien.
    17. Centrifuge filtratet ved 200 × g i 5 min ved stuetemperatur (RT). Fjern supernatanten og genbrug pellet med 1 mL SFM. Gentag dette trin to gange. Undgå at danne luftbobler.
    18. Brug pelleten igen i et sidste volumen på 2 mL GCP-kulturmedium, og celleaffjedringen overføres til den PDL-coatede 60 mm preplaterende kulturskål, der fremstilles i trin 1.3. Inkuberes i 15 min ved 37 °C i en CO2-inkubator .
      BEMÆRK: Må ikke overstige 20 min.
    19. Efter inkubation skal du trykke på kulturskålen fra siden for at løsne de løst klæbende GCP-celler. Saml de klæbende GCP-celler i kulturmedium ved at skånsom pipetter ved hjælp af en P1000 pipette. SCP-affjedringen opsamles i et nyt 15 mL centrifugerør. Kassér 60 mm fadet.
      BEMÆRK: Stærkt klæbende astroglilier og fibroblastceller vil forblive fastgjort på 60 mm skålbunden og vil blive adskilt i dette trin. Udelade dette skridt vil kompromittere renheden af GCP kultur.
    20. Tæl cellerne og fortsæt straks til elektroporering.
  2. Dag in vitro (DIV) 0: Elektroporation for Hh receptor transgene overekspression: pEGFP-Smo
    1. Ved elektroporering ved hjælp af en 2 mm mellemrums-kuvette fremstilles følgende plasmidcellee elektroporationsblanding for hver elektroporationsreaktionsreaktion: 1,2 × 106 celler og 10 μg pEGFP-mSmo (juster DNA-lagerkoncentrationen til ~2-5 μg/μL i Tris-EDTA-buffer eller steril dH2O) i 100 μL opti-MEM.
      BEMÆRK: Reducer det samlede celletal, hvis cellerne er utilstrækkelige (selvom dette kan reducere elektroporationseffektiviteten). Du må dog ikke justere mængden af plasmid eller den samlede mængde Opti-MEM, der anvendes pr. cuvette. Hvis det samlede celletal, der kræves til forsøget, overstiger 1,5 × 106 celler, skaleres elektroporationsblandingen i overensstemmelse hermed og udfører flere elektroporationsreaktioner separat. Cuvette kan genbruges op til 5 gange.
    2. Skæringspladen efter elektroporationscellen tilsættes ved at tilsætte 0,5 mL kulturmedium i hver brønd af den 24-brønds kulturplade, der indeholder coatede coverlips (fra trin 1.2), og hold den varm ved 37 °C i en CO2-inkubator .
    3. Fra trin 2.1.20 pipettes det nødvendige antal celler i et sterilt 1,5 mL mikrocentrifugerør og spin ved 200 × g i 5 min ved RT. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i 200 μL opti-MEM. Gentag dette trin to gange med Opti-MEM for at sikre, at der ikke er noget restkulturmedie i røret
      BEMÆRK: For hver brønd / coverslip af en 24-brønd plade, elektroporate og frø 1,2-1,3 × 106 celler / godt for at opnå ~ 70-75% celle sammenløb på den næste dag i kulturen.
    4. Angiv parametrene for elektroporation som vist i tabel 1.
    5. Pipette elektroporation reaktion forsigtigt at blande godt og bruge en lang P200 spids til at overføre en nøjagtig volumen på 100 μL af blandingen i 2 mm hul cuvette. Undgå at danne bobler.
    6. Læg cuvette i cuvettekammeret.
    7. Tryk på elektroporatorens Ω knap (se materialetabellen), og noter impedansværdien, som skal være ~30-35. For at sikre, at den elektriske impedansværdi Ω falder inden for intervallet 30-35, skal du holde sig til et præcist volumen på 100 μL.
    8. Tryk på startknappen for at starte pulsen.
    9. Registrer værdierne for den målte strøm og joule, der vises på læserammen.
    10. Fjern cuvette fra cuvettekammeret.
    11. Tilsæt straks 100 μL af præwarmed kulturmedium i cuvette og genbruge det ved blid pipetter op og ned 2-3 gange. Celleaffjedringen overføres straks til den 24-brøndsplade, der er forberedt i trin 2.2.2.
      BEMÆRK: For at minimere celledøden sås cellerne umiddelbart efter elektroporationen.
    12. Inkuberes cellerne ved 37 °C i en CO2-inkubator . Lad cellerne være uforstyrrede i 3 timer for at undgå cellefordeling.
    13. Ved 3 h post såning, forsigtigt aspirere og kassere halvdelen af supernatant medium til at fjerne flydende døde celler og vragrester og erstatte med den samme mængde af præwarmed kultur medium.
    14. Inkuber cellerne ved 37 °C i CO2-inkubatoren og genopfylde halvdelen af mediet hver anden dag.
    15. Overhold cellerne under fluorescensmikroskopet den næste dag, dvs. DIV1 (figur 1) for GFP-signal for at bestemme effektiviteten af Smo-overekspression.
    16. Til stimulering af Hh-signalvejen på DIV 1 efter genopfyldning af halvdelen af mediet tilsættes 0,2 μM Udglattet agonist (SAG) til cellerne, samtidig med at der tilføjes en lige stor mængde DMSO til styringen. Inkuber i 24 timer før cellefiksering.
      BEMÆRK: Hold lydstyrken af DMSO/SAG tilføjet så lavt som muligt. Her blev der tilføjet 0,5 μL DMSO eller 0,5 μL på 0,2 mM SAG pr. 500 μL medium pr. brønd, hvilket er et fortyndingsforhold på 1:1.000.

3. DIV 2: Visualisering af primær cilier og undersøgelse af Hh signalering vej

  1. Cellefiksering
    1. Ved 24 timer efter behandlingen skal kulturmediet fjernes og skylles cellerne 2-3 gange med fosfatbufferet saltvand (PBS) ved hjælp af en engangspastaurpipette, samtidig med at cellerne løsnes.
    2. Fastgør cellerne ved at tilsætte ~400 μL 4% paraformaldehyd (fremstillet i PBS) og inkuber ved RT i 10 min.
    3. Skyl og vask 2-3 gange med PBS ved hjælp af en engangs Pasteur pipette.
    4. Opbevares i PBS ved 4 °C i op til 2 måneder eller fortsæt til immunstaining.
  2. Immunocytokemisk farvning af praktiserende læger og primær ciliummarkør
    1. I en 24-brønds plade vaskes cellerne to gange i PBS med blid rysten i 5 min hver gang.
    2. Tilsæt 0,5 mL 100 mM ammoniumchlorid til cellen og inkuber ved RT i 10 minutter for at slukke fiksativ.
    3. Skyl en gang og vask 2-3 gange med PBS med blid rystelser i 10 min hver gang.
    4. Forsigtigt pipette 30 μL af blokering buffer (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% varmeinaktiveret hest serum i PBS) på et stykke parafilm til at danne en dråbe uden luftbobler.
    5. Overfør forsigtigt dækslet fra brønden til BB-dråben med den cellesåede side nedad. Inkuber cellerne med BB i et fugtigt kammer i 1 time på RT.
    6. Forbered den primære antistofblanding i BB som vist i materialetabellen. For at sondere cellerne med primært antistof gentages trin 3.2.4 og 3.2.5, idet BB erstattes med den primære antistofblanding. Inkuber cellerne med det primære antistof i 2 timer på RT.
    7. Ved hjælp af sammenklæsere overføres dækslerne tilbage til 24-brøndspladen med den cellesåede side opad. Skyl cellerne én gang og vask 3-4 gange i PBS med blid rysten i 10 min hver gang.
    8. Forbered den sekundære antistofblanding i BB som vist i materialetabellen. For at inkubere cellerne med det sekundære antistof gentages trin 3.2.4 og 3.2.5, idet BB erstattes med den sekundære antistofblanding. Inkuberes i mørket i 1 time på RT.
    9. Gentag trin 3.2.7 for postgymnasial inkubation af antistofinkubation.
    10. Monter dækslaget på en ren mikroskopisk glasrutschebane ved hjælp af monteringsmedium.
    11. Lufttørre rutsjebanen i mørke natten over og fortsæt til konfokal billeddannelse13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af Opti-MEM (se materialetabellen) som det universelle reagens kan denne foreslåede elektroporeringsmetode opnå en konstant høj elektroporationseffektivitet ved ~80-90% (figur 1). Elektroporationseffektiviteten af Smo-EGFP-vektoren blev bestemt ved DIV 2 post elektroporation ved kvantificering af procentdelen af grønne fluorescenspositive celler i alle parrede boxprotein-6 (Pax6)-udtrykkende GCP-celler. Elektroporationseffektiviteten for DMSO- og SAG-behandlede grupper forekom sammenlignelig (figur 1 og tabel 2).

Desuden viser immunstaining af den primære ciliummarkør, Arl13b, at Ciliationshastigheden for GCP ved DIV 2 af kulturen var ~ 18% i både køretøjs- og SAG-behandlede grupper (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). Ciliationshastigheden illustreres som den procentdel af Pax6-udtrykkende GCPs, der bærer et primært cilium (Arl13b-positiv) på celleoverfladen ved DIV 2 efter elektroporation (figur 2 og tabel 3).

At dechifrere den primære cilium-afhængige Hh signalering vej, en agonist af Smo, SAG, blev brugt til at aktivere Hh signalering vej. Ved Hh vej aktivering, Smo receptor er beriget på axoneme af den primære cilium14. Vores resultater viser signifikant øget Smo-EGFP lokalisering på den primære cilium axoneme af Pax6-udtrykkende GCP-celler på 24 timer efter SAG behandling (Figur 3, kvantificering data ændret fra tidligere arbejde6), hvilket indikerer en dyb aktivering af den primære cilium-afhængige Hh signalering vej.

Figure 1
Figur 1: Elektroporeringsopsætning og elektroporationseffektiviteten af praktiserende læger. (A) Elektroporering setup. Højre, sort pilespids betegner elektroporation cuvette. (B, C) Repræsentative billeder viser elektroporationseffektiviteten af Smo-EGFP-vektoren bestemt ved kvantificering af procentdelen af GFP-positive celler i alle Pax6-udtrykkende GCP-celler (tabel 2). Repræsentative billeder viser de grønne fluorescerende signaler på Pax6-udtrykkende (violette) GCP-celler på DIV 2 post elektroporation efter 24 timers behandling med (B) DMSO og (C) SAG. Kerner blev mærket med DAPI (blå). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: GCPs = granulecelleprækursorer; GFP = grønt fluorescerende protein; Pax6 = parret kasseprotein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxid; SAG = Udglattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Procentdel af ciliation på DIV 2 af GCP primær kultur. (A, B) Repræsentative billeder skildrer procentdelen af ciliation på DIV 2 af GCP primær kultur. Repræsentative billeder viser den primære cilier (grøn) på Pax6-udtrykkende (røde) GCP-celler på DIV 2 post elektroporation efter 24 timers behandling med (A) DMSO og (B) SAG. Kerner blev mærket med DAPI (blå). Det primærecilium (grønt) er angivet med hvide pilespidser. Skalastænger = 20 μm. (C) Graf illustrerer kvantificeringsdata for 4 uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse, Umalet Studerendes t-test. Fejllinjer viser ±SEM. Forkortelser: GCP = granulecelleprækursor; Pax6 = parret kasseprotein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxid; SAG = Udglattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; n.s. = Ikke signifikant; SEM = standardfejl i middelværdien; Arl13b = ADP ribosylation faktor-lignende protein 13B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Øget Smo lokalisering på det primære cilium af Pax6-udtrykkende GCP-celler ved SAG-behandling. (A) Repræsentative billeder skildrer Smo-EGFP lokalisering (grøn) på det primære cilium (rød, hvid firkantet boks) på Pax6-udtrykkende (violet) GCP-celler ved DIV 2 post elektroporation efter 24 timers behandling med DMSO og SAG. Kerner blev mærket med DAPI (blå). Skalastænger = 5 μm. (B) Grafen illustrerer kvantificeringsdata for 4 uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse, umalet Studerendes t-test. P ≤ 0,001. Fejllinjer viser ± SEM. I alt n for DMSO-gruppe = 97, i alt n for SAG-gruppe = 130. Figur 3B blev ændret fra 6. Forkortelser: GCP = granulecelleprækursor; Smo = Glattet; Pax6 = parret kasseprotein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxid; SAG = Udglattet agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; SEM = standardfejl i middelværdien; Arl13b = ADP ribosylation faktor-lignende protein 13B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Indstilling for poringpuls Indstillingen Overfør puls
Primære mus-praktiserende læger Primære neuroner Primære mus-praktiserende læger Primære neuroner
Spænding 275 V 275 V 20 V 20 V
Længde 1 ms 0,5 ms 50 ms 50 ms
Interval 50 ms 50 ms 50 ms 50 ms
Nej. 2 2 5 5
D-sats 10% 10% 40% 40%
Polaritet + + ± ±

Tabel 1: Elektroporationsparametrene for mus primære praktiserende læger og primære neuroner ved hjælp af Super Electroporator NEPA21 TYPE II. Forkortelse: GCP = granule celle forløberen.

Elektroporeringseffektivitet Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) Gennemsnitlig
DMSO-behandlet gruppe 90,57% ± 10,12% 96,62% ± 3,09% 98,89% ± 0,97% 90,72% ± 11,31% 94,02% ± 1,36%
SAG-behandlet gruppe 91,8% ± 8,69% 79,97% ± 2,77% 89,35% ± 5,67% 88,59% ± 13,54% 87,42% ± 1,71%
Gennemsnitlig elektroporeringseffektivitet 91,31% ± 7,99% 88,27% ± 10,81% 94,12% ± 6,36% 89,65% ± 11,21% 90,84% ± 0,84%

Tabel 2: Elektroporeringseffektivitet af Smo-EGFP vektordetermineret ved kvantificering afpercentage af GFP-positive celler i alle Pax6-udtrykkende GCP-celler. Data fra fire uafhængige eksperimenter (Exp.) vises. (I alt n = 2980). Forkortelser: Smo = Glattet; GFP = grønt fluorescerende protein; GCP = granulecelleprækursor; Pax6 = parret kasseprotein-6.

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 gennemsnitlig
Ciliation sats - DMSO 18,88% ± 3,61% 19,58% ± 7,42% 16,60% ± 1,48% 14,35% ± 7,99% 17,35% ± 0,59%
Ciliation sats - SAG 13,93% ± 3,39% 17,30% ± 2,15% 22,19% ± 10,35% 19,56% ± 1,15% 18,24% ± 0,88%

Tabel 3: Procentdelen af ciliation på DIV 2 af GCP primær kultur. Data fra fire uafhængige eksperimenter (Exp.) vises. (I alt n for DMSO-gruppe = 1169, i alt n for SAG-gruppe = 816). Forkortelser: GCP = granulecelleprækursor; DIV = dag in vitro; DMSO = dimethylsulfoxid; SAG = Udglattet agonist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transfection af transgener i primær GCP kultur ved elektroporation metode er typisk forbundet med lav celle levedygtighed og dårlig transfection effektivitet9,10. Dette papir introducerer en omkostningseffektiv og reproducerbar elektroporering protokol, der har vist høj effektivitet og levedygtighed. Derudover demonstrerer vi også en enkel metode til at studere den primære ciliumafhængige Hh-signalvej i primære GCP-celler.

Andre almindelige elektroporeringsmetoder kræver ofte dyre celletypespecifikke elektroporeringsreagenser, der skal købes hos specifikke producenter. Den metode, der er beskrevet her, anses for gunstig, da den bruger et fælles og økonomisk elektroporeringsreagens til forskellige celletyper. Desuden viste disse data, at elektroporationseffektiviteten nåede ~ 80-90%, hvilket er meget effektivt sammenlignet med andre elektroporation og transfektionsmetoder9,10.

For at opretholde højere celle levedygtighed, der er et par kritiske skridt, som man bør tage i betragtning. Cerebellum dissektions- og dissociationsprocedurerne skal være afsluttet inden for den kortest mulige tidsramme på 1-2 timer. Et andet kritisk skridt er at undgå bobledannelse i plasmidcelle elektroporationsblandingen før pulser under elektroporering. Efter pulser skal der straks tilsættes præwarmed kulturmedium i cuvetterne og cellerne såede så hurtigt som muligt. Cellerne skal være uforstyrret i de første 3 timer efter celle såning. De ovennævnte forholdsregler vil øge celle levedygtighed op til ca. 70-80% på den anden dag i kulturen.

En bemærkelsesværdig begrænsning ved at studere det primære cilium i den primære kulturplatform er, at ciliationen i dyrkede celler generelt er lavere end den observerede in vivo. Tidligere data 6 viste, at in vivo-satsen for ciliation på GCP ved både E15.5 og P15 var ca. 60-80%. I modsætning hertil var in vitro-hastigheden af ciliation i primær GCP-kultur ~ 20%6. Ikke desto mindre er dette et generelt fænomen, der kan skelnes på tværs af de fleste (hvis ikke alle) celletyper, når man sammenligner hyppigheden af ciliation mellem in vitro - og in vivo-undersøgelser .

Især gælder denne metode også for andre primære kulturer som neurale stamfaderceller og kortikale og hippocampale neuronkulturer, hvilket er opnåeligt ved at ændre elektroporationsparameteren, dvs. porende pulsspænding, længde og antal pulser. For at udvide anvendelsen af denne protokol til et bredere studieområde findes de anbefalede elektroporationsparametre for primære neuroner i tabel 1. Derudover hjælper det universelle elektroporation reagens, dvs Opti-MEM, der anvendes i denne protokol, også med at undgå yderligere kedelig optimeringsindsats sammenlignet med andre elektroporationsprotokoller, der kræver optimering med hensyn til reagenskompatibilitet. Denne optimerede, omkostningseffektive elektroporeringsprotokol til undersøgelse af det primære cilium og Hh-signalering i primære GCP-kulturer kan bruges som referenceprocedure for andre primære ciliumrelaterede undersøgelser ved hjælp af primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af HKBU Seed Fund og Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) til C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Tags

Neurovidenskab Primær cilier cerebellar granulat prækursor in vitro elektroporation Hedgehog signalering vej primær GCP kultur Glattet
Effektiv og omkostningseffektiv elektroporeringsmetode til undersøgelse af primære ciliumafhængige signalveje i granulecelleprækursoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C.… More

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter