Summary
Um protocolo robusto é apresentado aqui para isolar grânulos de neuromelanina de tecido humano post-mortem substantia nigra pars compacta via microdissecção a laser. Este protocolo revisado e otimizado minimiza massivamente o tempo necessário para a coleta de amostras, reduz a quantidade de amostra necessária e melhora a identificação e quantificação de proteínas pela análise LC-MS/MS.
Abstract
A neuromelanina é um pigmento preto-acastanhado, presente nos chamados grânulos de neuromelanina (NMGs) em neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta. Além da neuromelanina, os NMGs contêm uma variedade de proteínas, lipídios e metais. Embora os neurônios dopaminérgicos contendo NMGs sejam preferencialmente perdidos em doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a demência com corpos de Lewy, pouco se sabe sobre o mecanismo de formação de NMG e o papel dos NMGs na saúde e na doença. Assim, mais pesquisas sobre a caracterização molecular de NMGs são essenciais. Infelizmente, os protocolos padrão para o isolamento de proteínas são baseados na ultracentrifugação do gradiente de densidade e, portanto, exigem grandes quantidades de tecido humano. Assim, um protocolo automatizado baseado em microdissecção a laser (LMD) é estabelecido aqui, que permite a coleta de NMGs e tecido de substância negra (SN) circundante usando quantidades mínimas de tecido de forma imparcial e automatizada. As amostras excisadas são posteriormente analisadas por espectrometria de massas para decifrar a sua composição proteómica. Com este fluxo de trabalho, foram identificadas 2.079 proteínas, das quais 514 proteínas foram identificadas exclusivamente em NMGs e 181 em SN. Os presentes resultados foram comparados com um estudo anterior utilizando uma abordagem semelhante baseada em LMD, alcançando uma sobreposição de 87,6% para ambos os proteomas, verificando a aplicabilidade do protocolo revisado e otimizado aqui apresentado. Para validar os achados atuais, as proteínas de interesse foram analisadas por espectrometria de massa direcionada, por exemplo, experimentos de monitoramento de reação paralela (PRM).
Introduction
Cada tecido consiste em uma mistura heterogênea de diferentes tipos de células, mas o isolamento específico de um tipo de célula muitas vezes é indispensável para uma caracterização mais precisa. A microdissecção a laser (LMD), acoplando um microscópio com uma aplicação a laser, é uma ferramenta poderosa para o isolamento específico de áreas de tecido, células individuais ou subestruturas celulares de um composto complexo. A aplicação de LMD em combinação com espectrometria de massas (LMD-MS) já foi implementada com sucesso para diversas questões de pesquisa, incluindo o isolamento de DNA1, RNA2 e proteínas 3,4,5. Neste protocolo, um protocolo LMD-MS revisado e otimizado é descrito para a análise proteômica do tecido cerebral post-mortem humano e componentes subcelulares para decifrar novos patomecanismos da doença de Parkinson.
A neuromelanina é um pigmento preto, quase insolúvel, encontrado nos neurônios catecolaminérgicos produtores de dopamina da substância negra pars compacta6. Juntamente com proteínas e lipídios, acumula-se em grânulos organelas circundados por uma dupla membrana, denominada grânulos de neuromelanina (NMGs)7,8,9. Os NMGs podem ser observados a partir dos três anos de idade em humanos, aumentando em quantidade e densidade durante o processo de envelhecimento10,11. Até o momento, não há uma hipótese definitiva sobre a formação de neuromelanina, mas uma suposição é que a neuromelanina é formada através da oxidação da dopamina12. Outras hipóteses são baseadas na produção enzimática de neuromelanina (por exemplo, tirosinase)13. Neuromelanina em si foi encontrado para ter uma alta afinidade de ligação a lipídios, toxinas, íons metálicos e pesticidas. Com base nesses achados, supõe-se que a formação de NMGs proteja a célula do acúmulo de substâncias tóxicas e oxidativas e de toxinas ambientais14,15. Além dessa função neuroprotetora, há evidências de que a neuromelanina pode causar efeitos neurodegenerativos, por exemplo, pela saturação de ferro e pela subsequente catálise dos radicais livres16,17. Além disso, a neuromelanina liberada durante processos neurodegenerativos pode ser decomposta por peróxido de hidrogênio, o que poderia acelerar a necrose por metais reativos e outros compostos tóxicos previamente ligados à neuromelanina e pode contribuir para a neuroinflamação e danos celulares18. No entanto, até agora, o papel exato dos NMGs em processos neurodegenerativos, como no curso da doença de Parkinson, não é claramente compreendido. Ainda assim, os NMGs parecem estar envolvidos na patogênese da doença de Parkinson e sua análise específica é de extrema importância para desvendar seu papel na neurodegeneração. Infelizmente, animais de laboratório comuns (por exemplo, camundongos e ratos) e linhagens celulares não possuem NMGs19. Portanto, os pesquisadores confiam especialmente no tecido cerebral post-mortem para sua análise. No passado, o isolamento de NMG por centrifugação por gradiente de densidade dependia da disponibilidade de grandes quantidades de tecido da substância negra 20,21. Hoje, o LMD apresenta uma ferramenta versátil para isolar especificamente NMGs de amostras de cérebro humano para, em seguida, analisá-los por LC-MS / MS.
Neste protocolo, uma versão melhorada e automatizada de um protocolo anterior22 é apresentada para o isolamento de NMGs e tecido circundante (SN), permitindo uma geração de amostras mais rápida, maior número de proteínas identificadas e quantificadas e uma redução severa das quantidades teciduais necessárias.
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Protocol
O uso de tecido cerebral humano foi aprovado pelo comitê de ética da Ruhr-University Bochum, Alemanha (número de arquivo 4760-13), de acordo com os regulamentos e diretrizes alemãs. Este protocolo foi aplicado em fatias de tecido de substantia nigra pars compacta obtidas comercialmente. Uma visão geral gráfica do protocolo apresentado é mostrada na Figura 1.
1. Secção de tecidos
- Pré-resfrie a câmara de criostato.
NOTA: Cada tecido requer diferentes temperaturas de criostato, que podem ser encontradas no respectivo protocolo do fornecedor. - Limpe a faca de aço inoxidável com etanol a 70% e instale-a no suporte da lâmina.
- Transfira o tecido do congelador a -80 °C para o criostato utilizando uma caixa de gelo e deixe-o ajustar à temperatura da câmara de criostato durante 15 minutos.
- Rotule inequivocamente as lâminas de membrana usando um lápis.
Nota: As lâminas de membrana PET/PEN são necessárias para a coleta de amostras à base de LMD. Manuseie as lâminas de membrana PET/PEN com cuidado, pois são extremamente frágeis. - Aplique uma gota de meio de secção congelada comercial no suporte do tecido. Antes de ser completamente congelado, coloque o tecido no meio de seção congelado e deixe-o endurecer, de modo que o tecido seja conectado ao suporte do tecido.
- Instale o suporte de tecido na câmara de criostato e ajuste sua orientação antes de começar a seccionar. A orientação ideal do suporte depende da orientação do tecido.
NOTA: Pode ser necessário aparar o tecido até que o plano de secção necessário para as fatias seja atingido. - Antes que a área de interesse do tecido seja atingida, ajuste a configuração de corte para a espessura desejada do tecido.
NOTA: 5 ou 10 μm é a espessura sugerida para este protocolo, pois cortes de 20 μm de espessura foram considerados incompatíveis com a coleta de amostras baseada em LMD22. - Corte duas seções e descarte-as.
- Coloque a placa anti-rolo.
- Corte uma seção do tecido, abra a placa anti-rolo com cuidado, faça uma lâmina de membrana e evite o dobramento do tecido ao colocar a seção de tecido na lâmina da membrana.
NOTA: O armazenamento das lâminas de membrana à temperatura ambiente antes da adesão permite a fixação precisa da amostra. Várias seções podem ser colocadas na mesma lâmina de membrana, mas a sobreposição de tecido deve ser evitada. - Armazenar seções de tecido colocadas em lâminas de membrana no criostato até que a secção seja concluída.
- Conservar o tecido criossectado a -20 °C até processamento posterior ou proceder directamente ao procedimento a seguir indicado. Conservar as lâminas seccionadas do tecido a -80 °C até nova utilização.
2. Microdissecção a laser e catapultação de pressão
NOTA: Como os grânulos de neuromelanina são visíveis sem qualquer coloração devido à sua cor preto-acastanhada, nenhuma coloração é necessária para este protocolo. No entanto, diferentes procedimentos de coloração podem ser combinados com este protocolo, se necessário. Tenha em mente que o uso de soluções de bloqueio ou anticorpos influenciará as análises de LC-MS/MS.
- Ligue o sistema MicroBeam e abra o software associado no computador (consulte Tabela de materiais).
- Coloque a lâmina da membrana do tecido no SlideHolder no RoboStage com o tecido voltado para cima.
NOTA: Dependendo do dispositivo LMD, pode ser necessário colocar a lâmina de membrana de tal forma que o tecido esteja voltado para baixo. Em geral, a coleta de amostras é realizada em um ambiente com temperatura controlada para garantir condições ideais e reprodutíveis. - Defina o microscópio para a ampliação desejada (50 vezes é usado aqui) para as varreduras de visão geral.
- Use a função Digitalizar, que pode ser encontrada na janela Navegador da interface do software, para adquirir uma varredura geral da seção de tecido. Procure o canto superior esquerdo e o canto inferior direito da área de interesse e selecione-os na interface do software. Em seguida, selecione Verificar todos os ROIs para executar as varreduras.
Observação : varreduras de visão geral não são obrigatórias, mas permitem uma melhor orientação no slide e podem ser salvas para uso posterior. - Ajustar a ampliação do microscópio para o tecido apropriado, que é de 400 vezes no presente caso de grânulos de neuromelanina.
- Procure uma área com grânulos de neuromelanina. Selecione Análise de Campo de Visão na interface do software, selecione Inverter Resultado e defina o limite para os canais RGB para que apenas os grânulos de neuromelanina sejam destacados em vermelho na janela de visualização. Clique em OK para usar as configurações ajustadas para o campo de visão.
Observação : pode ocorrer que objetos menores com uma cor escura também são selecionados. Para explicar isso, descarte todos os objetos que cobrem uma área menor que 100 μm2 antes de isolar os grânulos de neuromelanina. Para fazer isso, abra a Lista de Elementos clicando no ícone na barra de ferramentas, selecione o slide em consideração e ordene os elementos por área. Selecione aqueles com áreas menores que 100 μm2 e exclua-os. - Ajuste as configurações do laser usando uma área do slide que seja coberta apenas pela membrana.
NOTA: Sugere-se usar o Assistente de Ajuste a Laser de Corte e seguir as instruções do software. As configurações de laser necessárias podem diferir entre diferentes slides. Para seções de 5 μm com ampliação de 400 vezes, as configurações típicas são de 32 energia e 51 foco para corte, e 28 de energia e -1 foco para catapultação de pulso a laser (LPC). - Ajuste as configurações de velocidade para posicionamento e corte para garantir o isolamento adequado.
NOTA: A velocidade de 30% foi considerada ideal para o isolamento de NMG. - Encha a tampa do tubo de coleta de amostras com água ultrapura de 50 μL e insira a tampa no coletor do RoboMover.
NOTA: O coletor de tubos usado para os experimentos atuais pode transportar um tubo de coleta de amostras de cada vez. - Posicione o RoboMover acima do RoboStage II usando a interface do software para iniciar a coleta de amostras.
Observação : para fazer isso, abra a janela RoboMover, que exibe o coletor. Clique na tampa do tubo de coleta de amostras exibida na janela do RoboMover para mover a tampa para a área de trabalho. Ajuste a altura ideal de movimento e trabalho na janela do RoboMover. Caso contrário, a água na tampa pode cair sobre o escorregador ou os objetos catapultados não chegarão à tampa. - Inicie o laser. Controle as configurações de energia e foco durante o processo a laser e ajuste as configurações, se necessário. Garantir o isolamento adequado e a catapulta dos objetos isolados para a tampa do tubo de coleta de amostras para pelo menos os dez primeiros objetos.
NOTA: O isolamento e a catapultura adequados devem ser verificados visualmente. Ambos devem resultar em uma área livre de tecido do tamanho do objeto pré-selecionado na fatia de tecido (ver Figura 2C,D). Ajuste as configurações do laser se o objeto permanecer preso à fatia de tecido após o corte e a catapultação. Para catapultar, a opção CenterRoboLPC é considerada adequada para o isolamento de NMG. As configurações de catapulta podem ser ajustadas para cada objeto selecionado na Lista de Elementos. - Quando a amostragem estiver concluída, navegue pelo RoboMover até sua posição inicial. Remova o tubo de coleta de amostras.
NOTA: Quando o número de objetos coletados é bastante baixo e os objetos são grandes o suficiente, a coleta de amostras pode ser garantida clicando em Cap Check, que colocará a tampa do tubo de coleta de amostras sob o microscópio para que o número de objetos dentro da água na tampa possa ser contado (consulte a Figura 2H). - Gire a amostra usando uma centrífuga. Spos curtos de 5 s com força centrífuga crescente devido à aceleração da centrífuga foram considerados suficientes. Neste ponto, armazenar as amostras a -80 °C, uma vez que todas as amostras devem ser processadas em conjunto.
NOTA: Para a comparação do perfil proteômico, o tecido ao redor dos NMGs também foi isolado após sua excisão. O isolamento do tecido circundante foi realizado com ampliação de 50 vezes. - Secar as amostras num concentrador de vácuo. 1,5 h foram considerados suficientes para 50 μL de água.
- Solubilizar e lisar o tecido em ácido fórmico de 40 μL por 20 min (temperatura ambiente).
- Melhorar a lise do tecido por sonicação a 45 kHz (kilohertz) por 5 minutos em um banho de sonicação. Encha o banho de sonicação com gelo para evitar que os tubos derretam. Conservar as amostras a -80 °C até novo processamento.
3. Digestão tríptica
- Descongelar amostras no gelo.
- Seque completamente as amostras em um concentrador de vácuo.
- Encher a amostra com 50 μL de um tampão de digestão adequado, por exemplo, 50 mM de bicarbonato de amónio.
- Após a adição de 1,25 μL de 1,4-ditiotreitol a 200 mM, incubar as amostras durante 30 minutos a 60 °C e 300 rpm utilizando um termófis e arrefecê-las posteriormente à temperatura ambiente (RT).
- Em seguida, incubar amostras em RT por 30 min no escuro após a adição de 1,36 μL 0,55 M de iodoacetamida.
- Adicionar uma quantidade adequada de tripsina às amostras e incubá-las durante a noite (~16 h) a 37 °C.
NOTA: Para 1.000.000 μm2, 0,1 μg de tripsina foi considerado suficiente. - Adicionar 2,6 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% às amostras para interromper a digestão (concentração final de TFA a 0,5%).
- Seque completamente as amostras usando um concentrador de vácuo. Em seguida, encha as amostras até um volume final definido com TFA a 0,1%. As amostras de NMG foram preenchidas com até 20 μL, das quais 5 μL foram utilizadas para um experimento espectrométrico de massa (EM).
- Conservar as amostras a -80 °C até nova utilização. Determine a concentração de peptídeos por análise de aminoácidos ou outro método de quantificação adequado (por exemplo, Detecção Direta).
NOTA: Quantidades de amostra baixas podem não ser quantificáveis usando as técnicas mencionadas. Para garantir uma carga de amostra idêntica, cada amostra deve conter a mesma quantidade de tecido isolado e todas as amostras devem ser tratadas igualmente.
4. Cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas
NOTA: A seguinte análise espectrométrica de massa (MS) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é otimizada para o sistema LC específico com um dispositivo de coluna de aprisionamento e espectrômetro de massa usado aqui (consulte Tabela de Materiais). Para outros sistemas LC e MS, recomenda-se a adaptação de parâmetros.
- Usando o software Xcalibur, ajuste as configurações de HPLC da seguinte maneira.
- Coluna do purgador: Ajuste a temperatura para 60 °C, o caudal para 30 μL/min, o tampão de funcionamento para 0,1% de ácido trifluoroacético.
- Coluna analítica de fase reversa C18: Ajuste a temperatura para 60 °C, a vazão para 30 μL/min, o tampão de corrida A para 0,1% de ácido trifluoroacético, o tampão de corrida B para 84% de acetonitrila e o gradiente para 5%-30% de tampão de corrida B ao longo de 98 min.
NOTA: A adaptação do gradiente pode ser inevitável e é fortemente recomendada ao usar diferentes tecidos ou células. O tempo total do gradiente pode variar devido ao carregamento da amostra no início do gradiente e à lavagem da amostra no final do gradiente. O gradiente total neste protocolo consiste em 7 min de carga da amostra e lavagem adicional da coluna por 15 min, resultando em um tempo total de gradiente de 120 min.
- Crie um método de aquisição dependente de dados (DDA) usando a Configuração de Instrumento XCalibur, que pode ser encontrada no menu de roteiro do software HPLC.
- Na guia Parâmetros Globais , defina o modo de infusão Cromatografia Líquida, a Largura de Pico LC Esperada (30 s) e o Estado de carga Padrão (2).
- Prossiga para a guia Parâmetros de varredura e adicione as seguintes varreduras e filtros na ordem mencionada: MS OT, MIPS, Intensidade, Estado de carga, Exclusão dinâmica e ddMS2 OT HCD.
NOTA: As configurações de parâmetro detalhadas para cada varredura e filtro podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. As configurações ideais de MS e DDA podem variar para o espectrômetro de massa específico usado, bem como para o tipo de amostra, e devem, portanto, ser adaptadas. - Preparar amostras dissolvendo 200-400 ng de peptídeos de amostra em um volume definido de TFA a 0,1% em entradas de frascos de vidro espectrométricos de massa inertes. Se a determinação da concentração não for aplicável devido à baixa quantidade de amostra, verifique a carga idêntica da amostra comparando a Corrente Iónica Total (TIC).
NOTA: Para fazer isso, abra o arquivo resultante da medição espectrométrica de massa em um software adequado, por exemplo, FreeStyle, e verifique o cromatograma. As intensidades devem ser comparáveis para todas as amostras. Uma TIC representativa é mostrada na Figura 3. - Analise os dados brutos obtidos usando um software adequado para proteômica, por exemplo, MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics ou Proteome Discoverer, e realize uma análise estatística de dados com base na questão de pesquisa.
5. Análise de dados brutos proteômicos utilizando MaxQuant
NOTA: Uma informação detalhada sobre os parâmetros MaxQuant é fornecida na Tabela Suplementar 2. Eles são brevemente descritos abaixo.
- Carregue arquivos brutos no software MaxQuant no cabeçalho de dados brutos clicando em Carregar.
- Atribua nomes de amostra clicando em Definir experimento.
- Defina parâmetros específicos do grupo. Primeiro, adicione modificações. Devido ao processamento da amostra, escolha Deamidation (NQ), Oxidation (M) e Carbamidomethylation (N-term) como modificações variáveis e adicione Carbamidomethylation (C) como modificação fixa.
- Escolha Tripsina como enzima de digestão na guia Digestão .
- Adicione a opção de quantificação livre de rótulos LFQ na guia Quantificação livre de rótulos . Se mais de 10 arquivos forem processados, escolha a opção Fast LFQ para reduzir o tempo de processamento. Adicionar opção iBAQ como medida para quantificação de proteínas24.
- Certifique-se de que todos os outros parâmetros específicos do grupo permaneçam nas configurações de fábrica.
- Vá para a guia Parâmetros Globais e adicione o arquivo FASTA derivado de uniprot.org na guia Sequências . Modifique a regra de identificador de acordo e adicione o ID da taxonomia, neste caso, 9606 para o homo sapiens.
- Para quantificação de proteínas, escolha os peptídeos Unique e Razor .
- Certifique-se de que todos os outros parâmetros globais permaneçam nas configurações de fábrica.
- Clique em Iniciar e recupere a saída .txt grupos de proteínas após a análise de MaxQuant para uma análise mais aprofundada em Perseus.
6. Análise estatística utilizando Perseu
- Carregue o arquivo .txt proteingroups no Perseus, adicione os valores do iBAQ como colunas principais e classifique todas as outras colunas de acordo com seu tipo.
- Filtre iscas e contaminantes filtrando linhas com base na coluna categórica.
- Filtre os resultados com base em valores válidos. No presente caso, com apenas duas amostras incluídas na análise, optou-se por um número mínimo de um valor válido.
- Exporte a saída de Perseus em formato .txt para processamento posterior, por exemplo, no Excel, e avalie os resultados em relação à questão de pesquisa.
7. Validação de proteínas selecionadas
NOTA: Os métodos comumente usados para validação de dados de EM são, por exemplo, coloração imunológica ou Western Blot. Devido à cor escura e à autofluorescência da neuromelanina, a coloração imunológica de proteínas dentro dos grânulos de neuromelanina com anticorpos conjugados com peroxidase ou fluoróforo de rábano não é aplicável. Para a análise de Western Blot, quantidades muito grandes de tecido post-mortem seriam necessárias. Portanto, as proteínas selecionadas são validadas por espectrometria de massa direcionada e, no presente caso, foram criados experimentos de monitoramento paralelo de reação (PRM).
- Selecione proteínas para validação. Escolha peptídeos dessas proteínas já detectados em experimentos de DDA. Os peptídeos não devem conter clivagens ou modificações perdidas para garantir uma quantificação confiável.
NOTA: Pode haver várias razões para a validação de uma proteína específica, por exemplo, abundâncias diferenciais nas condições investigadas. Para os resultados representativos, foi selecionada a dinaína citoplasmática 1 de cadeia pesada 1, que foi considerada equivalentemente abundante em amostras de NMG e SN e, portanto, poderia ser usada como referência para garantir uma carga igual da amostra. - Use os peptídeos selecionados para configurar a primeira versão de um método PRM usando o software HPLC. Mantenha todas as configurações de cromatografia e parâmetros globais do método DDA.
- Adicione MS OT e tMS2 OT HCD como tipos de varredura. Certifique-se de que as configurações para MS OT são as mesmas que para o método DDA. As configurações detalhadas para o método PRM podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1.
- Para tMS2 OT HCD, adicione peptídeos selecionados como uma lista de inclusão. Portanto, adicione a sequência de aminoácidos e o valor m/z observado nas medições de DDA. Para o primeiro experimento de PRM, não adicione janelas de tempo de retenção ou defina t start como 0 e t stop como 120 (para um gradiente de 120 minutos).
- Avalie o método PRM após a medição usando um software adequado, por exemplo, Skyline, e obtenha o tempo de retenção dos peptídeos adicionados à lista de inclusão. Para peptídeos incluídos, verifique se picos comparáveis são observáveis para pelo menos três íons precursores em exames MS1 e cinco íons fragmentos em exames MS2 com baixo erro de massa (±5 ppm).
- Refine o método PRM, por exemplo, aumentando a resolução para a verificação de HCD tMS2 OT e adicionando janelas de tempo de retenção à lista de inclusão.
NOTA: Janelas de tempo de retenção de 3 min foram consideradas adequadas nos experimentos atuais (o tempo de retenção observado no primeiro experimento PRM ± 1,5 min). - Com o método PRM refinado, realizar a quantificação de peptídeos e proteínas de interesse com base na área de pico nos níveis MS1 e MS2 com software adequado.
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Representative Results
O isolamento específico de NMGs e tecido SN é o passo mais importante para o sucesso da aplicação deste protocolo. Usando a função Análise de Campo de Visão no software fornecido pelo fornecedor do LMD, os NMGs podem ser selecionados automaticamente de maneira dependente da cor. Portanto, as áreas teciduais contendo NMGs (Figura 2A) devem ser identificadas e uma Análise de Campo de Visão com limiares de cor ajustados deve ser realizada, resultando na marcação dos NMGs (Figura 2B). Após a filtragem de objetos que cobrem uma área abaixo de 100 μm², somente os NMGs devem permanecer rotulados para isolamento (Figura 2C). O isolamento preciso dos NMGs marcados é obtido após o ajuste das configurações do laser (Figura 2D). Após o isolamento dos NMGs (Figura 2E), o tecido SN pode ser selecionado com ampliação de 50 vezes (Figura 2F) e isolado (Figura 2G) para comparação do perfil proteômico. Para o tecido SN, objetos isolados podem ser visualizados usando a função Cap Check (Figura 2H). Para ambos os tipos de amostra, NMG e SN, o isolamento de 500.000 μm2 de tecido cerebral mostrou-se suficiente para este protocolo, permitindo um mínimo de três MS por amostra.
Um exemplo representativo de um experimento DDA de 120 min é mostrado na Figura 3 (como a coluna principal é lavada nos últimos 15 min da medição, o cromatograma é cortado pouco antes de 105 min). O método aplicado deve permitir uma eluição da amostra ao longo de todo o gradiente, criando picos acentuados e concisos, e a intensidade da corrente iónica total (TIC) deve ser comparável em todas as amostras.
A aplicação do protocolo apresentado em uma amostra de 500.000 μm² de NMG e uma amostra de tecido SN de 1.000.000 μm² com volumes ajustados para amostras de MS (5 μL para NMG e 2,5 μL para SN) para garantir carga peptídica idêntica, resultou na identificação de 1.898 grupos proteicos (PGs) na amostra NMG e 1.565 PGs na amostra SN. Uma comparação mais aprofundada revelou 1.384 PGs a serem identificados em ambas as amostras, enquanto 514 PGs foram identificados exclusivamente em NMG e 181 PGs em tecido SN (Figura 4). No total, 2.079 PGs foram identificados neste experimento representativo. A comparação com um conjunto de dados de referência de um estudo anterior22 mostrou que 87,6% dos PGs relatados nesse estudo também puderam ser identificados pelo presente protocolo revisado e automatizado, comprovando sua aplicabilidade. Além disso, o número de PGs identificados poderia ser melhorado em 1.143.
Como quantidades mínimas de amostra não permitem a aplicação de métodos clássicos de validação, como Western Blots, a validação de proteínas de interesse pode ser alcançada por abordagens espectrométricas de massa direcionadas, por exemplo, PRM. Resultados representativos para o peptídeo ESPEVLLTLDILK da proteína citoplasmática dineína 1 cadeia pesada 1 são mostrados na Figura 5. O valor de iBAQ desta proteína foi ligeiramente maior nos NMGs em comparação com o SN nas medições de DDA, o que pôde ser verificado por experimentos PRM baseados na área de pico nos níveis MS1- (Figura 5A,B,E) e MS2 (Figura 5C,D,F).
Figura 1: Fluxo de trabalho para a caracterização proteômica de grânulos de neuromelanina (NMGs) e tecido circundante (SN). Amostras de NMG e SN foram isoladas de cortes teciduais via microdissecção a laser (LMD). As proteínas foram isoladas e a digestão tríptica em solução foi realizada. Os peptídeos resultantes foram analisados por meio de medidas de LC-MS/MS no modo de aquisição dependente de dados (DDA). A análise dos dados foi realizada por meio dos softwares MaxQuant e Perseu. A validação das proteínas selecionadas foi realizada com experimentos de monitoramento de reações paralelas (PRM). Os dados do PRM foram analisados por meio do software Skyline. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seleção e isolamento baseado em LMD de amostras NMG e SN. No início, uma área contendo NMGs, visível sem coloração adicional na ampliação de 400 vezes, é colocada sob o microscópio (A). Depois de realizar uma Análise de Campo de Visão, os NMGs e outras áreas escuras são selecionados (B). Somente os NMGs permanecem selecionados após a filtragem (C) e são isolados após as configurações do laser serem ajustadas (D). Após todos os NMGs serem isolados (E), o tecido SN é selecionado com ampliação de 50 vezes (F) e isolado (G). Como os objetos isolados para amostras SN são bastante grandes, eles podem ser observados na tampa de coleta de amostras usando a função Cap Check (H). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Corrente iônica total (TIC) de uma medição DDA de 120 minutos. O cromatograma mostra a abundância relativa dos íons correspondentes aos peptídeos eluidores ao longo da faixa de tempo de retenção de 0 a ~105 min. Como a coluna principal é lavada entre o 105º e o 120º min, o cromatograma é cortado no105º min. A intensidade do pico mais alto é de 2,86 x 108. Números acima dos picos indicam o tempo de retenção e o íon mais abundante desse pico específico (BP=pico base). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama de Venn mostrando a correspondência dos grupos proteicos (PGs) identificados em NMGs e SN tecido. No total, 1.898 PGs foram identificados em NMGs e 1.565 PGs em tecido SN, dos quais 1.384 PGs foram identificados em ambas as áreas teciduais. 514 PGs foram identificados exclusivamente no tecido NMG, enquanto 181 PGs foram identificados exclusivamente no tecido SN. O diagrama foi criado usando a ferramenta online Venny25. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados dos experimentos de PRM para o peptídeo ESPEVLLTLDILK (dineína citoplasmática 1 cadeia pesada 1, ++). Cromatogramas nos níveis MS1- (A,B) e MS2 (C,D), bem como áreas de pico nos níveis MS1- (E) e MS2 (F), são mostrados para uma amostra exemplar de NMGs e tecido SN. Cores diferentes são usadas para denotar diferentes precursores (no nível MS1) ou íons produto (no nível MS2). Os cromatogramas são exibidos após a realização do Savitzky-Golay Smoothing. As intensidades e as áreas de pico foram comparáveis nos níveis MS1- (A,B,E) e MS2 (C,D,F). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar 1: Parâmetros dos experimentos de espectrometria de massas. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 2: Parâmetros da análise MaxQuant. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A LMD é uma técnica amplamente aplicável para o isolamento de áreas teciduais específicas, células únicas ou estruturas subcelulares. No protocolo revisado e automatizado aqui apresentado, esta técnica é aplicada para o isolamento específico de grânulos de neuromelanina (NMGs) e tecido circundante de NMG (SN). Até agora, duas abordagens diferentes para o isolamento de NMGs fora do tecido cerebral post-mortem humano foram publicadas e amplamente utilizadas:
a) Gradiente descontínuo de sacarose consumindo 1 g de tecido da substância negra 20. Como o tecido humano post-mortem da substância negra é raro e de alto interesse para várias questões de pesquisa, infelizmente é bastante desafiador estabelecer um grande estudo de coorte se forem necessárias grandes quantidades de tecido por paciente. Portanto, essa abordagem foi melhorada reduzindo a quantidade tecidual necessária para 0,15 g para isolamento suficiente dos NMGs26. No entanto, ainda assim, pelo menos metade de uma substância completa nigra pars compacta era necessária.
b) A excisão de NMGs usando LMD. Em 2016, Plum et al estabeleceram um novo protocolo baseado na excisão precisa de NMGs via LMD. Com este protocolo, a quantidade de amostra necessária poderia ser reduzida para dez seções de tecido de 10 μm, resultando em uma redução impressionante da amostra de tecido necessária de 150 mg para 16,6 mg22.
O protocolo otimizado e automatizado baseado em LMD aqui apresentado requer quantidades de amostra ainda menores, pois mais finas (5 μm em comparação com 10 μm) e menos cortes de tecido (máximo de 7 em comparação com 8) tiveram que ser usadas e requer menos tempo para a geração da amostra (4 h por amostra em comparação com 1-2 dias) através do uso de detecção automatizada de NMG. Assim, o tempo de coleta de amostras necessário foi reduzido maciçamente e o número de PGs identificados pôde ser drasticamente aumentado com a aplicação de um método LC-MS otimizado e instrumentação de última geração. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras questões de pesquisa e tecidos.
Para a adaptação do protocolo apresentado quanto às questões de pesquisa definidas pelo usuário, destacam-se os seguintes aspectos com base na experiência:
a) Isolamento de quantidades de amostra comparáveis: Como o rendimento peptídico esperado deste protocolo é bastante baixo em comparação, por exemplo, à cultura de células ou lisados teciduais, a determinação da concentração de peptídeos pode não ser possível. Assim, é crucial que quantidades iguais de tecido sejam isoladas via LMD, que pode ser estimada com base na área tecidual dos objetos selecionados. Na configuração atual, áreas de tecido de 500.000 μm² são suficientes para a geração de peptídeos para pelo menos três medições de EM.
b) Tripsina-digestão: A duração da digestão e a concentração de tripsina devem ser comparáveis entre as amostras.
c) Adaptação de parâmetros para diferentes tecidos: Dependendo do tecido a analisar, a quantidade de tecido coletada precisa ser ajustada, tornando necessário ajustar a quantidade de tripsina adicionada também. A relação tripsina/proteína não deve ser inferior a 1:40.
d) Limitação do processo LMD: Para o isolamento baseado em LMD de objetos de interesse, existem limitações quando se trata do tamanho dos objetos selecionados e da espessura das fatias. Devido à perda de tecido durante o corte a laser do tecido, objetos menores que 100 μm² foram considerados pequenos demais para isolamento.
e) Adaptação dos parâmetros LC e MS: Dependendo dos sistemas LC e MS utilizados, a quantidade de tecido isolado deve ser aumentada (por exemplo, ao operar com um sistema de microfluxo) e os parâmetros MS devem ser adaptados (por exemplo, ao trabalhar com um sistema detector baseado em armadilha de íons).
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por de. NBI, um projeto do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) (número de concessão FKZ 031 A 534A) e P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) e Center for Protein Diagnostics (ProDi) subvenções, ambos do Ministério da Inovação, Ciência e Pesquisa da Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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