Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Registrering av kalciumtransienter i musens neuromuskulära korsning med hög tidsupplösning med konfokalmikroskopi

Published: December 1, 2021 doi: 10.3791/63308
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Summary

Protokollet beskriver metoden att ladda ett fluorescerande kalciumfärgämne genom den skurna nerven i musmotoriska nervterminaler. Dessutom presenteras en unik metod för att registrera snabba kalciumtransienter i de perifera nervändarna med hjälp av konfokalmikroskopi.

Abstract

Uppskattning av den presynaptiska kalciumnivån är en nyckeluppgift för att studera synaptisk överföring eftersom kalciuminträde i den presynaptiska cellen utlöser en kaskad av händelser som leder till frisättning av neurotransmittorer. Dessutom förmedlar förändringar i presynaptiska kalciumnivåer aktiviteten hos många intracellulära proteiner och spelar en viktig roll i synaptisk plasticitet. Att studera kalciumsignalering är också viktigt för att hitta sätt att behandla neurodegenerativa sjukdomar. Den neuromuskulära korsningen är en lämplig modell för att studera synaptisk plasticitet, eftersom den bara har en typ av neurotransmittor. Denna artikel beskriver metoden för att ladda ett kalciumkänsligt färgämne genom det skurna nervknippet i mössens motoriska nervändar. Denna metod möjliggör uppskattning av alla parametrar relaterade till intracellulära kalciumförändringar, såsom basal kalciumnivå och kalciumövergående. Eftersom tillströmningen av kalcium från cellens yttre till nervterminalerna och dess bindning / avbindning till det kalciumkänsliga färgämnet sker inom några millisekunder, krävs ett snabbt bildsystem för att registrera dessa händelser. Faktum är att höghastighetskameror vanligtvis används för registrering av snabba kalciumförändringar, men de har parametrar med låg bildupplösning. Protokollet som presenteras här för inspelning av kalciumtransient möjliggör extremt god rumslig-tidsmässig upplösning som tillhandahålls av konfokalmikroskopi.

Introduction

Problemet med att mäta snabba kalciumvågor i exciterbara celler är en av de viktigaste och mest utmanande aspekterna av att studera signalöverföring i centrala och perifera nervsystemet. Kalciumjoner spelar en viktig roll för att utlösa neurotransmittorfrisättning, synaptisk plasticitet och modulering av aktiviteten hos olika intracellulära proteiner 1,2,3,4,5. Att studera kalciumsignalering är också viktigt för att hitta sätt att behandla neurodegenerativa sjukdomar6. För att mäta förändringar i kalciumnivåerna används vanligtvis fluorescerande kalciumkänsliga färgämnen och förändringar i deras fluorescensnivå analyseras 7,8,9.

Laddning av kalciumfärger i celler kan uppnås på olika sätt. Övervägande används cellpermeanta färgämnen10,11. I ett sådant fall är det emellertid inte bara svårt att kontrollera koncentrationen av ett färgämne inuti cellen, men det är också svårt att välja målceller för laddning. Denna metod är inte tillämplig för att studera perifera nervändar eftersom färgämnet kommer in i postsynaptiska celler. Istället är cellimpermeant färgämnen mer lämpade för sådana preparat. I detta fall levereras färgämnena till cellerna genom mikroinjektion eller genom en patchpipett12,13,14. Det finns också en metod att ladda genom en nervstubbe. Den senare metoden är mest lämplig för neuromuskulära korsningspreparat 15,16,17,18,19,20. Det gör det möjligt att utföra färgning för endast celler av intresse. Även om denna metod inte ger en korrekt utvärdering av koncentrationen av färgämnet i målcellen, kan koncentrationen uppskattas ungefär genom att jämföra nivån av fluorescens hos cellerna i vila i lösningar med en känd koncentration av kalcium21. I denna studie presenteras en modifiering av denna metod som tillämpas på synapser av däggdjur.

Kalciuminträde under den depolariserande fasen av åtgärdspotentialen är en snabb process, särskilt i den neuromuskulära korsningen; För registrering krävs därför lämplig utrustning1. En nyligen genomförd studie med ett spänningskänsligt fluorescerande färgämne visade att varaktigheten av åtgärdspotentialen i musens perifera synaps är cirka 300 μs22. Kalciumövergående, utvärderat med kalciumkänsliga färgämnen i grodans perifera synapser, har en längre varaktighet: stigningstiden är cirka 2-6 ms och sönderfallstiden är cirka 30-90 ms, beroende på kalciumfärgämnet som används23,24. För att mäta snabba processer med hjälp av fluorescerande färgämnen används vanligtvis CCD- eller CMOS-kameror med snabba och känsliga CCD-matriser. Dessa kameror har emellertid nackdelen med låg upplösning, begränsad av storleken på de känsliga elementen i matrisen25,26,27,28. De snabbaste kamerorna med tillräcklig känslighet för att registrera både åtgärdspotentialer och kalciumtransienter som svar på lågfrekvent stimulering av celler har en skanningsfrekvens på 2 000 Hz och en matris med en dimension på 80 x 8029. För att erhålla signaler med högre rumslig upplösning används konfokalmikroskopi, särskilt om det är nödvändigt att bedöma vissa volymetriska förändringar i signalen30,31,32. Men det bör komma ihåg att konfokalmikroskopi har en hög skanningshastighet i linjeskanningsläge, men det finns fortfarande betydande begränsningar för hastigheten på inspelningar av snabba processer när man bygger en rumslig bild33. Det finns konfokalmikroskop baserade på roterande Nipkow-skivor (slitsskanningsmikroskopi) och Multipoint-Array-skannrar, som har en högre skanningshastighet. Samtidigt är de sämre än de klassiska konfokalmikroskopen i konfokal bildfiltrering (pinholes crosstalk för mikroskop med en Nipkow-skiva)32,34,35. Konfokal avbildning med resonansskanning kan också ge en hög spatio-temporal upplösning som krävs för höga temporala mätningar36. Tänk dock på att registrering av svaga fluorescerande svar vid hög skanningshastighet vid användning av resonansskannrar kräver mycket känsliga detektorer som hybriddetektorer36.

Den här artikeln presenterar en metod för att öka den tidsmässiga upplösningen för signaler som spelats in med laserskanningskonfokalmikroskopi (LSCM) samtidigt som den rumsliga upplösningen37 bibehålls. Den nuvarande metoden är en vidareutveckling av de metoder som beskrivits tidigare och överförts till LSCM-plattformen38,39,40. Detta tillvägagångssätt kräver inte förändringar i mikroskophårdvaran och bygger på tillämpningen av en algoritm för inspelning av periodiskt framkallade fluorescerande signaler med en tidsförskjutning i förhållande till stimuleringsmomentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experiment utfördes på isolerade nervmuskelpreparat av levator auris longus (m. LAL) från mössen BALB/C (20-23 g, 2-3 månader gamla)41. De experimentella förfarandena utfördes i enlighet med riktlinjerna för användning av laboratoriedjur från Kazan Federal University och Kazan Medical University, i enlighet med NIH-guiden för vård och användning av laboratoriedjur. Försöksprotokollet uppfyllde kraven i Europeiska gemenskapernas råds direktiv 86/609/EEG och godkändes av den etiska kommittén vid Kazan Medical University.

1. Förberedelse av ringarens och arkiveringslösningar

  1. Bered Ringers lösning för däggdjursmuskler genom att blanda följande ingredienser: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl2 (2 mM), MgCl2 (1 mM), NaH2PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) ochglukos (11 mM). Bubbla genom lösningen med 95% O2 och 5%CO2 och justera dess pH till 7,2-7,4 genom att tillsätta HCl/NaOH vid behov.
  2. Förbered färgämnesladdningslösningen.
    1. Förbered HEPES (10 mM) lösning med pH i intervallet 7,2-7,4. 500 μg kommersiellt färgämne kommer i en 500 μl injektionsflaska. Lös färgämnet i 14 μl av HEPES-lösningen för att erhålla en färgämneskoncentration på 30 mM. Skaka väl och centrifugera tills det är helt upplöst.
    2. Späd lösningen av Ca2+ -indikatorn med HEPES-lösning ner till 1 mM koncentration. Förvara den i en frys (-20 °C) och undvik exponering för ljus.

2. Förfarande för färgning av färg

OBS: Färgladdningsproceduren utförs enligt protokollet för laddning genom nervstubben, anpassad från de protokoll som tidigare publicerats 19,42,43,44,45,46.

  1. Dissekera LAL-muskeln enligt dissektionsproceduren för detta preparat som beskrivs i de tidigare publicerade protokollen47,48.
    1. Fixera vävnaden något sträckt (högst 30% från initial längd) i den elastomerbelagda petriskålen med fina stift i rostfritt stål och tillsätt Ringers lösning tills muskeln är helt täckt.
      OBS: Petriskålen var förfylld med elastomer enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
  2. Förbered fyllningspipetten
    1. Använd en mikropipettdragare (se Materialförteckning), förbered en mikropipett med en fin spets som är så skarp som möjligt för de intracellulära inspelningarna. Använd kapillärer utan inre filament (1,5 mm i ytterdiameter och 0,86 eller 1,10 mm i innerdiameter).
    2. Bryt av mikropipettspetsen efter att ha gjort avsmalningen med ett slipmedel och lämna spetsen öppen till cirka 100 μm i diameter. Eldpolera spetsen nedåt för att begränsa när den inre diametern krymper från >80 μm till 12-13 μm. Fäst ett silikonrör på ena sidan av fyllningspipetten och en spruta (utan nål) på den andra sidan.
  3. Under ett stereomikroskop, hitta den plats där nervstammen förvandlas till separata nervgrenar. Placera påfyllningspipetten med det monterade röret och sprutan på petriskålen med vax. Flytta pipettspetsen tills den står ovanför nerven.
  4. Skär nerven nära muskelfibern med fin sax och lämna en liten bit av nervstubben ca 1 mm lång. Aspirera försiktigt nervstubben tillsammans med någon Ringers lösning, utan att klämma fast den, i spetsen på fyllningspipetten. Ta bort silikonröret från påfyllningspipetten.
  5. Dra en viss mängd av färgämnesbelastningslösningen (~ 0,3 μL) med en spruta med ett långt filament. Denna volym motsvarar cirka 3 cm av filamentet.
    OBS: Ursprungligen är det nödvändigt att göra ett filament från en pipettspets med en volym på 10 μL genom att dra i elden med en alkohollampa eller en gasbrännare.
  6. Sätt försiktigt in glödtrådsspetsen med laddningslösning i påfyllningspipetten. Släpp blandningen direkt på nervstubben. Inkubera preparatet vid rumstemperatur i mörker i 30 minuter.
  7. Skölj sedan preparatet med färsk Ringers lösning och inkubera vid 25 °C i upp till 2 timmar i en glasbägare med 50 ml (eller mer) Ringers lösning (beredningen måste täckas med lösningen). Under denna tid kommer färgämnet att nå synapserna.

3. Videoinspelning med konfokalmikroskopi

OBS: Registrering av kalciumtransienter utförs med ett laserscanningskonfokalmikroskop (LSCM) (se materialförteckning). För att registrera snabba kalciumtransienter användes ett originalprotokoll som tillät inspelningar av signaler med tillräcklig rumslig och tidsmässig upplösning. Metoden har beskrivits grundligt i publikationen av Arkhipov et al37. Mikroskopet var utrustat med ett 20x vattenfördjupningsmål (1,00 NA). Laserlinjen på 488 nm dämpades till 10% intensitet och emissionsfluorescens samlades in från 503 till 558 nm.

  1. Montera preparatet i den kiselelastomerbelagda experimentkammaren och fixa den, något sträckt, med en uppsättning stålmikronålar. Skölj preparatet i stor utsträckning med Ringers lösning.
    OBS: En enkel skräddarsydd perfusionsexperimentkammare av organiskt glas med kammarens botten täckt med en elastomer (beredd i enlighet med tillverkarens instruktioner; se materialtabell) användes. Kammaren har ett lösningsförsörjningsrör. Lösningen pumpas ut via en sprutnål, monterad på en magnethållare (se Materialförteckning). Som en experimentkammare kunde en petriskål användas (som den som används för inkubation av preparatet) men med bifogade tillförsel- och sugrör.
  2. Installera sugelektrod som kommer att användas för att stimulera nerven.
    OBS: Konstruktionen av elektroden liknar vad som publicerades i 2015 års artikel av Kazakov et al49. Placera och fixera elektroden genom att vaxa bredvid badet. Flytta spetsen nära nervstubben och aspirera den i elektroden.
  3. Montera beredningskammaren på mikroskopsteget och placera inlopps- och utloppsbeslagen i kammaren.
  4. För att perfusera preparatet, använd ett enkelt gravitationsflödesdrivet system. Slå på perfusionssugpumpen för att ta bort överskottslösningen.
  5. Anslut den stimulerande sugelektroden till en elektrisk stimulator och se till att muskelsammandragningar uppstår efter stimuli. Se avsnitt 3.9-3.12 för stimuleringsförhållanden och registrering.
  6. Fyll upp perfusionssystemet med Ringers lösning med d-tubokurarin (10 μM).
    OBS: Denna lösning hjälper till att förhindra muskelsammandragningar. D-tubokurarin eller alfa-bungarotoxin-specifika blockerare av nikotinacetylkolinreceptorer på det postsynaptiska membranet skulle helt eller delvis blockera muskelsammandragningar50. För att förhindra muskelsammandragningar kan också specifika blockerare av postsynaptiska natriumkanaler såsom μ-konotoxin GIIIB användas51.
  7. Slå på perfusionssugpumpen och starta perfusion av preparatet med Ringers lösning innehållande d-tubokurarin.
  8. Ställ in bildparametrar i LSCM-programvaran enligt följande.
    1. I LSCM-programvaran (LAS AF; se Materialförteckning), välj Elektrofysiologi.
      OBS: I det här läget, när en bild tas vid tidpunkten, skickas en synkroniseringspuls till stimulatorn med hjälp av avtryckarboxen. Detta framkallar generering av åtgärdspotential i preparatet (figur 1; stimulatorenhet).
    2. Välj Förvärvsläge. För att utlösa stimulatorn med hjälp av mikroskopsynkroniseringspulsen, välj Trigger-inställningarna i jobbmenyinställningarna. Ställ in fältet Trigger Out On Frame på out1-kanalen.
    3. Använd följande inställningar: Skanningsläge: XYT, Skanningsfrekvens: 1400 Hz, Zoomfaktor: 6.1, Pinhole: helt öppet. Se till att sekventiellt transpasserande dubbelriktat X-läge är på.
    4. Ställ in minsta tid för att bilda en bildruta vid 52 ms och bildrutor som ska samlas in i en råvideo vid 20 bildrutor.
      OBS: Dessa inställningar tillåter bildtagning med en upplösning på 128 x 128 pixlar medan du tar en enda bildruta var 52: e ms.
    5. Ställ in argonlaserns excitationsvåglängd på 488 nm med 8% av uteffekten.

Figure 1
Bild 1: Schemat för den experimentella installationen. 1. Laserscanning konfokalmikroskop (LSCM). 2. Synkroniseringsmodul för LSCM (triggerbox). 3. Stimulator. 4. Isoleringsenhet. 5. Det biologiska provet. 6. Sugelektrod för elektrisk stimulering av nerven. 7. Perfusionssystem (7a: perfusatbehållare, 7b: droppare, 7c: flödesregulator, 7d: vakuumkolv). Pilar pekar på utbredningsriktningen för synkroniseringspuls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Tryck på Live Mode-knappen för att växla till Live-läge, vilket hjälper till att få en förhandsgranskning av nervterminaler laddade med färgämnet.

Figure 2
Figur 2: Musnerv och terminaler laddade med Ca2+ -indikatorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Stimuleringsenhet
    OBS: I detta arbete användes stimulatorn som beskrivs i artikeln av Land et al.52 . Denna enhet gör det möjligt att ställa in tidsmässiga parametrar för stimulering via MatLab-programvaran.
    1. Skapa en ny fil, klistra in koden från ovan nämnda artikel i MatLab-kodfönstret och spara filen. Klicka på Kör så visas ett fönster med stimuleringsparametrar. Ställ in fördröjningstiden och varaktigheten av stimulansen.
      OBS: Fördröjningen bestämmer den tidsmässiga upplösningen för den rekonstituerade fluorescerande signalen. Den elektriska pulsen på 0,2 ms varaktighet fördröjs och skickas sedan till isoleringsenheten. Den senare bildar amplituden och polariteten hos den stimulerande pulsen och isolerar elektriskt det biologiska objektet från färdskrivaren.
    2. För att stimulera nerven, välj supramaximal amplitud av den stimulerande impulsen (25% -50% större än den maximala stimuleringsintensiteten som är nödvändig för att aktivera alla nervfibrer).
      OBS: Den presenterade metoden är baserad på en speciell algoritm för inspelningar av enstaka snabba fluorescerande signaler med LSCM med minimerat svep. Vid varje steg i den utvecklade algoritmen flyttas den inspelade fluorescerande signalen från den föregående med ett tidsintervall som är kortare än mikroskopsvepet. Värdet på tidsförskjutningar bestämmer den tidsmässiga upplösningen för den önskade signalen. Antalet steg (skift) i algoritmen beror på den nödvändiga tidsupplösningen och den ursprungliga tidsupplösningen. Med denna registreringsmetod utförs stimuleringen av preparatet med en frekvens av 0,25 Hz.
  2. I Live-läget söker du efter avkastningen och får det bästa fokuset. Kör datainsamlingsprogramvaran.
  3. Skift fördröjningen på stimulatorn med 2 ms mindre i förhållande till föregående värde och kör datainsamlingsprogramvaran.
  4. Upprepa steg 3.11 26 gånger för att få 26 sekvenser, där varje sekvens förskjuts med 2 ms från den föregående.

4. Bearbetning av video

OBS: En serie videobilder som förvärvats av konfokalmikroskopet exporteras i TIFF-format med den fria programvaran LAS X (se materialförteckningen). Denna serie delades in i ramar och exporterades till en mapp. För att generera bildsekvensen med högre tidsupplösning användes ImageJ-programvaran, som har en öppen initial kod för analys och bearbetning av data. Algoritmen för signalbehandling representeras schematiskt i figur 3.

Figure 3
Figur 3: Schema för att kompilera en högupplöst videofil (2 ms på bildruta) från originalvideofiler med låg tidsupplösning (52 ms på bildruta). De ursprungliga videofilerna och motsvarande signaler är färgade i svart, magenta och grönt. Den kompilerade videofilen och den resulterande signalen är färgade röda. Schemat till höger, rad för rad, visar videobilderna som erhållits med ett konfokalmikroskop. Till vänster ändras motsvarande signaler om fluorescens från den valda avkastningen. Den översta linjen bildas ram för ram från de mottagna ramarna enligt schemat. Resultatet är en videobild som består av hela uppsättningen ramar så att det finns en fördröjningstid på 2 ms mellan bildrutorna istället för 52 ms. Varje linje motsvarar en förskjutning av stimuleringssignalen med (n - 1) * t, där t är tidsförskjutning (2 ms) och n är antalet skift iterationer. k betecknar antalet bilder i de ursprungliga videofilerna (raderna 2-4) och beror på varaktigheten av den inspelade signalen. I det här fallet, för att registrera en signal med en varaktighet av 1 s, är det nödvändigt att välja k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 är den erforderliga fördröjningen före stimulering. För att beräkna antalet skift iterationer n måste den initiala tidsupplösningen mellan bildrutor (52 ms) divideras med den erforderliga tidsupplösningen (2 ms). I det här fallet är n = 26, vilket motsvarar 26 registrerade svep. Som ett resultat av de utförda manipuleringarna erhålls en videobild bestående av n * k = 520 bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Kör LAS X-programvara. Öppna projektet som skapades under experimentet. Klicka på Exportera och sedan på Spara som för att spara ramar i .tiff format i målmappen.
  2. Kör ImageJ-programvaran. Klicka på Arkiv > Importera > bildsekvens.
  3. I Öppna bildsekvens fönstret väljer du målmappen och öppnar den första ramen.
  4. I fönstret Sekvensalternativ i fältet Startbild anger du bildrutenumret till 1 för den första bildrutan. I fältet Öka ställer du in värdet lika med antalet ramar i den ursprungliga signalinspelningen (20 för det aktuella fallet) och klickar på OK.
  5. För att spara den genererade filen med sydda första ramar i en separat mapp, klicka på Arkiv > Spara > mapp.
  6. Upprepa steg 4.3-4.5 för de kommande 19 bildrutorna. I fönstret Sekvensalternativ anger du motsvarande bildrutenummer i fältet Startbild .
  7. För att generera hela videon med hög upplösning, sy ihop alla ramar. För att göra detta, klicka på Arkiv > Importera > bildsekvens och välj 1 i fälten Startbild och Steg . Resultatet blir den slutliga videon med ökad tidsupplösning. Spara filen i .tiff eller något annat lämpligt format.

5. Videoanalys

I ImageJ väljer du ROI och bakgrund. Subtrahera bakgrund från ROI. Data representeras som förhållandet, (ΔF / F 0 - 1) * 100%, där F0 är intensiteten av fluorescens i vila och ΔF är intensiteten av fluorescens under stimulering.

  1. Klicka på Bild > staplar > verktyg > Stack Sorter. Klicka sedan på Analys > verktyg > ROI Manager.
  2. Dra och släpp den .tiff filen som sparades i steg 4.7 i ImageJ-fönstret. Expandera bilden för en bättre vy. För att förbättra bildvisualiseringen, klicka på Bild > Justera > ljusstyrka / kontrast > Auto. Det här steget påverkar inte data.
  3. Ställ bakgrunden nära nervterminalen genom att rita ROI. Lägg till den i ROI-hanteraren. Beräkna bakgrunden genom att klicka på Mer > Multi Measure. Kopiera medelvärden, klistra in i kalkylprogrammet och beräkna medelvärdet.
  4. Subtrahera det beräknade medelvärdet från staplarna genom att klicka på Process > Main > Subtrahera. Ange värdet.
  5. Rita ROI runt en nervterminal via en polygonlinje. Lägg till den i ROI-hanteraren.
  6. Mät nervterminalens intensitet: Klicka på Mer > Multi Measure. Kopiera medelvärden och klistra in dem i kalkylprogrammet.
  7. Beräkna den genomsnittliga förskjutningen av signaler.
    OBS: Använd motsvarande punkter beroende på fördröjningstiden före stimulering. Detta steg fastställer F0-värdet som kommer att användas i efterföljande beräkningar.
  8. Dela signalvärdena med det genomsnittliga offsetvärdet.
    OBS: Efter detta steg innehåller signalen inte bidraget från bakgrunden och rå fluorescens till amplitudvärdena för den valda avkastningen.
  9. Subtrahera 1 från värden som erhållits i steg 5.8 och multiplicera sedan med 100%.
  10. Rita ett diagram över Ca2+- transient och beräkna amplituden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter att ha laddat preparatet med färgämne enligt den presenterade tekniken hade de flesta synapser som ligger nära nervstubben en tillräcklig nivå av fluorescens (se figur 2). Efter laddning av preparatet med färgämnet och tillämpning av den beskrivna metoden för registrering och bildbehandling erhölls kalciumtransienter med önskad rumslig och tidsmässig upplösning (se figur 4). Kalciumtransienten har återvunnits med den föreslagna metoden (se figur 3).

Amplitud- och tidsparametrar för de återvunna signalerna analyserades också. Genomsnittliga uppgifter presenteras i tabell 1.

Figure 4
Figur 4: Representativt spår av kalciumsignal från ett experiment. Några viktiga signalparametrar, såsom medelamplitud (MA), stigningstid (RT) och sönderfallstid (DecT) och dess utsprång på axlar anges. MA beräknas med medelvärdespunkter vid toppen, färgade i grönt. RT är den tid det tar för amplituden att stiga från 20% till 80%, vilket beräknas som skillnaden mellan projektioner på x-axeln färgad i blått. DecT är den tid under vilken amplituden minskar med e gånger, vilket beräknas som skillnaden mellan projektioner på x-axeln färgad i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Topp ΔF/F (%) Stigtid 20%-80% (ms) τ (ms)
27,0±4,6 (n=5) 6,8±0,48 (n=5) 456±53(n=5)

Tabell 1: De genomsnittliga parametrarna för den transienta Ca 2+ övergående. Data presenteras som medelvärde ± s.e.m., och n är antalet mätningar i de distinkta nerv-muskelkorsningarna. Peak ΔF / F är medelamplituden för ΔF / F.

Kalciumtransient analys gör det möjligt att bedöma de amplituddynamiska egenskaperna hos förändringar i den presynaptiska kalciumnivån i nervänden under åtgärdspotentialen11. Förändringen i kalciumövergående amplituden korrelerar väl med förändringen i kvantinnehållet53. Kalciumtransient amplitudanalys används vanligtvis för att studera effekten av fysiologiskt aktiva föreningar associerade med modulering av presynaptiska kalciumnivåer på synaptisk överföring54,55. Tidsförloppet för kalciumövergående återspeglar kinetiken för kalciumbindning med färgämnet och dess dissociation23,56. Det är uppenbart när man använder färgämnen med olika affinitet för kalcium 23,56. Även om de tidsmässiga parametrarna för kalciumövergående återspeglar kinetiken hos det kalciumkänsliga färgämnet och inte representerar kinetiken för fritt kalcium i nervterminalen, kan matematiska modelleringsmetoder baserade på experimentella data återställa beteendet hos fritt kalcium i cellen och beräkna koncentrationen av kalciumbuffertar23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden för att ladda Ca2+-känsligt färgämne i musens nervändar genom nervstubben och för att registrera en snabb kalciumtransient med hjälp av ett konfokalmikroskop presenteras i denna artikel. Som ett resultat av genomförandet av denna laddningsmetod hade de flesta synapser som ligger nära nervstubben en tillräcklig nivå av fluorescens för att möjliggöra registrering av kalciumets inträde i nervändarna som svar på lågfrekvent stimulering av motornerven.

Till skillnad från de tidigare presenterade protokollen för att ladda kalciumfärger genom stubben är detta protokoll utformat för användning på däggdjurssynapser. Tidigare protokoll som använts i kallblodiga djurpreparat krävde en inkubation över natten43. I detta protokoll är den erforderliga inkubationen med färgämnet endast 2 h. Beroende på längden på nervsegmentet som återstod efter skärningen kan hastigheten på färgbelastningen och antalet laddade terminaler variera. Det var möjligt att minska inkubationstiden ytterligare i färglösning för kortare nervstubbar. En liknande metod beskrivs för lastning av flugsynapser18,19. Inkubationen av muskeln utfördes också med en liten temperaturökning över rumstemperaturen, vilket förbättrar diffusionen av färgämne längs nerven. Det bidrog således till att minska inkubationstiden och därför kan nuvarande färgladdningsmetod användas för att ladda synapser av däggdjur som inte tolererar långvariga inkubationer. Det är viktigt att välja lämpliga förberedelser för studien. LAL-muskeln är väl lämpad för denna metod, eftersom det är möjligt att skära en nervstubbe tillräckligt nära de synaptiska terminalerna. Andra tunna muskler kan också vara lämpliga för sådan applikation57. Ett av de viktigaste stegen i detta protokoll är att nervstumpen måste placeras i den färgämnesinnehållande lösningen under de första minuterna efter att nerven har skurits. Eftersom nervens längd är kort måste en specifik design av sugelektroden användas för stimulering. I denna forskning användes både glas- och plastelektroder, med diametern jämförbar med nervsegmentets.

Förvärv av kalciumtransienter bör utföras med specialutrustning. Inspelningar av långvariga förändringar i kalciumnivån som svar på frekvensstimulering av motornerven kräver regelbundna kameror eller ett konfokalmikroskop. Medan registrering av kalciumtransienter är ett svar på lågfrekvent stimulering av nerven, behövs känsliga kameror när signalen från färgämnet har låg intensitet och hög hastighet11. Mycket känsliga CCD-kameror eller matriser som består av fotodioder används huvudsakligen för att registrera dessa snabba processer. Kameror med hög känslighet och hastighet tenderar dock att ha låg upplösning. Om högupplöst registrering krävs är konfokalmikroskopimetoder mer lämpliga. I konfokalmikroskop används fotomultiplikatorer för att registrera fluorescens, och nyligen kom hybriddetektorer till användning. De har en mycket hög känslighet jämfört med CCD-kameror och är väl lämpade för att detektera svag fluorescens. Men den största nackdelen med LSCM är låg skanningshastighet när man bygger en rumslig bild. I denna studie, för att registrera kalciumövergående, användes den ursprungliga registreringsmetoden via LSCM, som beskrivs noggrant i artikeln av Arkhipov et al. Med hjälp av denna metod var det möjligt att uppskatta den proximala-distala gradienten av kalciumtransient i de långsträckta grodsynapserna37. Denna registreringsmetod kan vara användbar för att bedöma subcellulär kalciumdynamik i exciterbara celler, till exempel i dendriter och spines i hjärnskivberedningar. I den aktuella studien applicerades den på däggdjurssynapser. Det gjorde det möjligt att få konfokala videobilder med 2 ms provtagning av signaler för att analysera parametrarna för kalciumövergående.

Den beskrivna metoden behandlar fluorescerande signaler, utlösta av en yttre stimulans och har en fast fördröjning innan stimulansen har kommit. Att variera fördröjningen på stimulatorn gör det möjligt att ändra signalstartpunkten och registrera den förskjutna signalen med LSCM. Därefter återställs den ursprungliga signalen med hög tidsupplösning med hjälp av omvänd faltning enligt den tidigare beskrivna algoritmen. En av begränsningarna med den nuvarande metoden är att de ursprungliga signalerna måste ha liten variation i parametrar och ha god reproducerbarhet. För att tillämpa metoden måste man utföra flera skanningar för att få tillräckligt med data för faltning. I det övervägda fallet registrerades 26 försök med 20 ramar vardera, dvs totalt 520 ramar. Varaktigheten av avbildning och antalet prövningar beror på önskad tidsupplösning och signalvaraktighet. Så krävs fokuspositionsstabilitet för preparatet under avbildning. Noggrannheten i signalåtervinningen med den föreslagna metoden bestäms mestadels av storleken på avkastningen. Ju mindre ROI-storlek, desto mindre tid tar det att skanna och desto färre fel uppstår under signalåterställning med den nödvändiga tidsupplösningen37.

Denna studie presenterade en metod för att ladda fluorescerande färgämnen i perifera synapser hos däggdjur och en metod för att registrera snabba fluorescerande kalciumsignaler via ett konfokalt fluorescensmikroskop. Med hjälp av den beskrivna metoden var det möjligt att registrera en signal med god rumslig och tidsmässig upplösning. Registrering av kalciumtransienter är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära processer, såsom reglering av neurotransmittorfrisättning och synaptisk plasticitet54,55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Fluorescensstudier av detta arbete utfördes med ekonomiskt stöd från Russian Science Foundation Grant (projekt nr 19-15-00329). Metoden utvecklades under finansiering från regeringsuppdraget för FRC Kazan Scientific Center of RAS АААА-А18-118022790083-9. Forskningen utvecklades med hjälp av utrustningen från Federal Research Center "Kazan Scientific Center of RAS". Författarna vill tacka Dr. Victor I. Ilyin för kritisk läsning av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Glass Clark Electromedical instruments, UK GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 Sutter Instrument, USA P-97
Flow regulator KD Medical GmbH Hospital Products, Germany KD REG Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES Sigma-Aldrich, USA H0887 100mL
Illumination system Leica CLS 150X Leica Microsystems, Germany
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software Leica Microsystems, Heidelberg, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing BIOSCIENCE TOOLS, USA MTH-S
Microspin FV 2400 Biosan, Latvia BS-010201-AAA
Minutien Pins Fine science tools, Canada 26002-20
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latvia BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt Molecular Probes, USA O6806 500 μg
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10 µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10 µL
Plasticine local producer
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40 mm
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80 Leica Microsystems , Germany
Suction electrode Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer Dow Corning, USA
Syringe local producer 0.5 mL
Syringe local producer 60 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Tags

Neurovetenskap utgåva 178
Registrering av kalciumtransienter i musens neuromuskulära korsning med hög tidsupplösning med konfokalmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y.,… More

Zhilyakov, N. V., Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Mukhamedyarov, M. A., Samigullin, D. V. Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63308, doi:10.3791/63308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter