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Biology

अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी बदली ढक्कन के साथ एक स्तन इमेजिंग विंडो का उपयोग कर

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63326
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

Summary

यह प्रोटोकॉल एक बदली ढक्कन (आर.एमआईडब्ल्यू) के साथ एक उपन्यास स्तन इमेजिंग विंडो का वर्णन करता है। आर.एमआईडब्ल्यू के आरोपण के बाद इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी विभिन्न विकास चरणों के दौरान सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त स्तन ग्रंथि के अनुदैर्ध्य और बहु-दिवसीय इमेजिंग की अनुमति देता है।

Abstract

स्तन ग्रंथि की शाखित संरचना अत्यधिक गतिशील है और जन्म के बाद विकास और रीमॉडेलिंग के कई चरणों से गुजरती है। त्वचा फ्लैप सर्जरी या इमेजिंग खिड़कियों के आरोपण के साथ संयोजन में इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग विभिन्न विकास चरणों में स्वस्थ स्तन ग्रंथि की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है। अधिकांश स्तन इमेजिंग प्रौद्योगिकियां घंटों से दिनों की समय सीमा तक सीमित होती हैं, जबकि अधिकांश स्तन ग्रंथि रीमॉडेलिंग प्रक्रियाएं दिनों से हफ्तों के समय सीमा में होती हैं। स्तन ग्रंथि रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए, विस्तारित समय सीमा के लिए ब्याज के ऊतक तक ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देने वाले तरीकों की आवश्यकता होती है। यहां, एक बदली ढक्कन (आर.एमआईडब्ल्यू) के साथ टाइटेनियम स्तन इमेजिंग विंडो का एक बेहतर संस्करण वर्णित है जो कई हफ्तों तक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ स्तन ग्रंथि के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, आर.एमआईडब्ल्यू इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रयोग की पूरी अवधि में ऊतक पहुंच प्रदान करता है और इसलिए इसका उपयोग स्थानीय ऊतक हेरफेर, लेबलिंग, दवा प्रशासन या छवि-निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन के लिए किया जा सकता है। एक साथ लिया गया, आर.एमआईडब्ल्यू स्तन ग्रंथि विकास, होमियोस्टेसिस और बीमारी के दौरान सेलुलर गतिशीलता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।

Introduction

स्तन उपकला स्तनधारियों में मौजूद एक अद्वितीय स्रावी अंग है, जो संतानों को पोषण देने के लिए दूध का उत्पादन और स्राव करता है। पूरे जीवन में, स्तन ग्रंथि विकास और विकास के कई दौर से गुजरती है, जो ऊतक 1 के संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों के साथहोती है। विकास के चरण के आधार पर, ऊतक रीमॉडेलिंग में योगदान देने वाले सेल प्रकार अलग-अलग होते हैं, साथ ही डक्टल पेड़ के भीतर स्थान भी होता है।

मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) देशी और न्यूनतम रूप से परेशान सेटिंग 2,3,4 में विवो में स्तन कोशिका गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है। स्तन ग्रंथि तक दृश्य पहुंच प्राप्त करने के लिए, स्तन ग्रंथि के विकास के विभिन्न चरणों के दौरान कई अस्थायी पूर्व विवो या त्वचा फ्लैप इमेजिंग तकनीकों को प्रकाशित किया गया है, जिसमें यौवन 4,5,6,7, वयस्कता 2,8, स्तनपान 9,10,11,12 और ट्यूमर गतिशीलता 13,14 शामिल हैं 15. यद्यपि इन तकनीकों के परिणामस्वरूप स्तन कोशिका गतिशीलता की उच्च स्थानिक और अस्थायी रूप से हल की गई इमेजिंग होती है, समय सीमा घंटों तक सीमित होती है जबकि अधिकांश स्तन ग्रंथि रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं में दिन से हफ्तों तक का समय लगता है। इसलिए, विस्तारित समय सीमा के लिए ब्याज के ऊतक तक ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देने वाले तरीकों की आवश्यकता होती है। इन वर्षों में, स्तन ट्यूमर इमेजिंग 15,16,17,18 के लिए कई स्थायी इमेजिंग खिड़कियां विकसित की गई हैं, जिसमें टाइटेनियम स्तन इमेजिंग विंडो (एमआईडब्ल्यू) 2,3,19 शामिल है। यद्यपि स्तन ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है, स्वस्थ स्तन ग्रंथि संरचना का दृश्य कुछ दिनों तक सीमित रहा। हाल ही में, एक लचीली सिलिकॉन इमेजिंग विंडो विकसित की गई थी, जो कई हफ्तों में यौवन स्तन ग्रंथि के दृश्य की अनुमतिदेती है 20. हालांकि, स्तन ग्रंथि एक एडिपोसाइट समृद्ध वसा पैड में एम्बेडेड होती है, जो व्यापक प्रकाश-बिखरने की ओर जाता है और परिणामस्वरूप स्तन नलिका संरचनाओं की सीमित दृश्यता होती है। इसलिए, स्तन ग्रंथि में लंबे समय तक ऊतक गतिशीलता की कल्पना करने के लिए हर समय बेहतर इमेजिंग स्थितियों की आवश्यकता होती है। न तो शास्त्रीय एमआईडब्ल्यू, और न ही लचीली सिलिकॉन खिड़की ऊतक हेरफेर या इमेजिंग से पहले भौतिक ऊतक स्थान के अनुकूलन की अनुमति देती है, क्योंकि खिड़की सर्जरी और आरोपण के बाद एक बंद प्रणाली बनाती है। नतीजतन, अंतर्निहित स्तन ऊतक के लिए इष्टतम ऑप्टिकल पहुंच लंबे समय तक बाधित होने की संभावना है। इसके विपरीत, त्वचा फ्लैप तकनीक इमेजिंग सत्र के दौरान ऊतक के अनुकूलन और पुनर्स्थापन की अनुमति देती है और एक त्वचा फ्लैप को कई बारदोहराया जा सकता है 2. हालांकि, त्वचा फ्लैप के माध्यम से बार-बार इमेजिंग सत्र केवल तभी संभव होते हैं जब त्वचा की वसूली की अनुमति देने के लिए सर्जरी के बीच पर्याप्त समय (कम से कम 7 दिन) आवंटित किया जाता है और इसलिए ज्यादातर लंबे समय के तराजू पर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूल होता है। इसके अलावा, इसकी आक्रामक प्रकृति और घाव बंद होने पर संक्रमण और निशान के बड़े जोखिम के कारण इस प्रक्रिया को कई बार नहीं करने की सलाह दी जाती है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यानी, एक उच्च आवृत्ति पर लंबे समय तक इष्टतम इमेजिंग स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए और एक ही समय में ऊतक हेरफेर की अनुमति देने के लिए, एक बदली ढक्कन (आर.एमआईडब्ल्यू) के साथ एमआईडब्ल्यू का एक बेहतर टाइटेनियम संस्करण स्वस्थ और रोगग्रस्त स्तन ग्रंथि को कई दिनों से सप्ताह2 (चित्रा 1 ए) की कल्पना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। आर.एमआईडब्ल्यू को इष्टतम ऊतक पहुंच प्रदान करने के लिए कस्टम डिज़ाइन किया गया था, जो आईवीएम प्रयोग की पूरी अवधि में प्रत्यक्ष ऊतक हेरफेर को सक्षम करता है, और इस तरह लंबे समय तक सही समय और स्थान पर स्तन ग्रंथि के दृश्य की अनुमति देता है। बंद होने पर, आर.एमआईडब्ल्यू शास्त्रीय एमआईडब्ल्यू (चित्रा 1 सी) की तुलना में एक एयरटाइट सिस्टम बनाता है। सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में खोले जाने पर, आर.एमआईडब्ल्यू स्थानीय ऊतक हेरफेर को ऑप्टिकल पहुंच में सुधार करने की अनुमति देता है और पदार्थों के स्थानीय प्रशासन को भी सक्षम बनाता है, जैसे मार्ग अवरोधक या एगोनिस्ट, विभिन्न सेल प्रकार के ब्याज के इंजेक्शन, जैसे कि कैंसर सेल या प्रतिरक्षा कोशिका आबादी, या ऊतक लेबलिंग-रंगों के अलावा। अंतर्निहित ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना इमेजिंग सत्रों के बीच किसी भी समय ढक्कन खोला जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक बदली ढक्कन के साथ स्तन इमेजिंग खिड़की का डिजाइन( ए) अंगूठी से चिपके 10 मिमी कवरग्लास के साथ स्तन इमेजिंग विंडो के बदली ढक्कन का शीर्ष दृश्य और साइड व्यू। (बी) स्तन इमेजिंग विंडो का शीर्ष दृश्य और साइड व्यू, जिसमें पर्स-स्ट्रिंग सिवनी का उपयोग करके माउस की त्वचा के भीतर खिड़की को सुरक्षित करने के लिए बीच में एक नाली के साथ एक बाहरी अंगूठी और आंतरिक अंगूठी होती है। बाहरी अंगूठी में एक छोटा नाली होता है जो ढक्कन के चार अनुमानों (बाहों) को फिट करता है। (सी) ढक्कन के उद्घाटन और समापन तंत्र का प्रदर्शन कार्टून और चित्र। तिरछा अनुमान सुनिश्चित करते हैं कि ढक्कन खिड़की के फ्रेम के अंदर तय हो गया है। इस आंकड़े को मेसल एट अल से संशोधित किया गया है 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह प्रोटोकॉल आर.एमआईडब्ल्यू के डिजाइन और आरोपण प्रक्रिया के साथ-साथ एक अनुदैर्ध्य आईवीएम रणनीति का वर्णन करता है ताकि एक ही स्तन नलिकाओं और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर उनके विज़ुअलाइज़ेशन को फिर से देखा जा सके। आर.एमआईडब्ल्यू विविध फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल में स्तन ग्रंथि के विभिन्न विकास चरणों के दौरान निम्नलिखित कोशिका विभाजन और रूपात्मक परिवर्तनों की अनुमति देता है। एक साथ लिया गया, आर.एमआईडब्ल्यू स्तन ग्रंथि विकास, होमियोस्टेसिस और बीमारी के दौरान सेलुलर गतिशीलता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है।

Protocol

इस पत्र में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को आईएसीयूसी और केयू ल्यूवेन के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और अनुमोदित परियोजना आवेदन पी 160/2020 के संदर्भ में किया गया था। इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करने से पहले, कृपया संस्थागत पशुचिकित्सा के साथ एनाल्जेसिया रणनीति की समीक्षा करें और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार प्री-और पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया का प्रशासन करें।

1. आर.एमआईडब्ल्यू की तैयारी (अनुमानित समय: 2 घंटे)

नोट: आर.एमआईडब्ल्यू के निर्माण के लिए, एक स्थानीय निर्माता को ढूंढना उचित है जो टाइटेनियम जैसी कठिन सामग्रियों के साथ काम करने में माहिर है, क्योंकि इसके लिए विशेष उपकरण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। टाइटेनियम प्रोस्थेटिक्स के डिजाइन और निर्माण में विशेषज्ञता वाली कार्यशालाओं में आमतौर पर आर.एमआईडब्ल्यू भागों का उत्पादन करने के लिए मशीनरी और विशेषज्ञता होती है।

  1. आर.एमआईडब्ल्यू के ढक्कन को एक बाँझ सतह पर रखें, ढक्कन के बाहर ऊपर की ओर (और ढक्कन की बाहों को नीचे की ओर ढलान; चित्रा 1 ए)।
  2. ढक्कन के पूरे रिम के चारों ओर साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला गोंद लागू करें और ढक्कन के शीर्ष पर 10 मिमी गोल ग्लास कवरस्लिप सावधानीपूर्वक रखें।
    नोट: सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान बैकअप के रूप में हमेशा ग्लास कवरस्लिप के साथ एक अतिरिक्त ढक्कन तैयार करें।
  3. ग्लास कवरस्लिप की स्थिति के लिए एक बाँझ लकड़ी की छड़ी का उपयोग करें और ग्लास कवरस्लिप और ढक्कन के फ्रेम के बीच एक एयर-टाइट सील सुनिश्चित करने के लिए इसे नीचे धकेलने के लिए कुछ बल लागू करें। सुनिश्चित करें कि ढक्कन की बाहों में छेद कांच द्वारा कवर नहीं किए गए हैं।
  4. एक बंद पेट्री डिश में कम से कम 30 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में डूबकर ढक्कन और आर.एमआईडब्ल्यू कीटाणुरहित करें।
    नोट: साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला गोंद के विघटन से बचने के लिए 80% इथेनॉल में 1 घंटे से अधिक समय तक ढक्कन न छोड़ें।
  5. एसीटोन में भिगोए गए कपास टिप का उपयोग करके ग्लास कवरस्लिप से अतिरिक्त साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला गोंद निकालें।
  6. ढक्कन और आर.एमआईडब्ल्यू को आगे के उपयोग तक बाँझ वातावरण में स्टोर करें।
    नोट: आर.एमआईडब्ल्यू फ्रेम और ढक्कन को अधिकतम 1 सप्ताह के लिए बाँझ ट्यूब या बैग में रखा जा सकता है। प्रयोग को फिर से शुरू करते समय, हमेशा जांचें कि क्या ग्लास कवरस्लिप प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले ढक्कन से अभी भी ठीक से जुड़ा हुआ है।

2. सर्जरी की तैयारी (अनुमानित समय: 15 मिनट)

नोट: आर.एमआईडब्ल्यू प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए, किसी भी तनाव की मादा चूहों (>3.5 सप्ताह पुराना) का उपयोग किया जा सकता है।

  1. बाँझ दस्ताने का उपयोग करके बाँझपन बनाए रखें, और माउस के संपर्क में आने वाली सभी वस्तुओं को निष्फल करें। पानी और हल्के साबुन के साथ सर्जिकल उपकरण धोलें, हवा सूखी, बिना किसी उजागर कोनों या किनारों के एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें, और सर्जरी से पहले 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के चक्र के लिए एक आटोक्लेव का उपयोग करके निष्फल करें।
  2. एक बाँझ सर्जिकल मंच तैयार करें और 80% इथेनॉल के साथ सतहों को निष्फल करें।
    नोट: बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए, सर्जरी एक प्रवाह कैबिनेट में किया जा सकता है।
  3. हीटिंग पैड चालू करें और एक बाँझ पर्दे के साथ चटाई को कवर करें। बाँझ पर्दे पर बाँझ उपकरणों लेआउट और एक पेट्री डिश में बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में आर.एमआईडब्ल्यू और कम से कम दो ग्लास से ढके ढक्कन रखें (बाहरी संदूषण से बचने के लिए ढक्कन बंद करें)।
  4. ओ2 मिश्रण का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में माउस को संवेदनाहारी करें। सुनिश्चित करें कि जानवर आसानी से हेरफेर करने और बिना किसी संघर्ष के नाक के मुखौटे में स्थानांतरित होने के लिए पर्याप्त आराम से है।
  5. एक संज्ञाहरण नाक मुखौटा करने के लिए प्रेरण कक्ष से माउस स्थानांतरण और 1.5% करने के लिए आइसोफ्लूरेन स्तर को कम -2 % आइसोफ्लूरेन / पंजा निकासी परीक्षण करके पूर्ण संज्ञाहरण सत्यापित करें।
  6. पंजा वापसी परीक्षण करने के लिए, नाखूनों या कुंद अंत संदंश का उपयोग करके पशु पंजा को दृढ़ता से चुटकी लें। किसी भी मांसपेशी पलटा की अनुपस्थिति में, जानवर को बेहोश मानें और सर्जिकल तैयारी के लिए आगे बढ़ें। पशु हेरफेर से पहले इस परीक्षण को करें और संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए संवेदनाहारी और सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान नियमित रूप से दोहराएं।
  7. कॉर्नियल डिहाइड्रेशन को रोकने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
  8. एक रेजर ब्लेड (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके 4स्तन ग्रंथि के आसपास के क्षेत्र को दाढ़ी दें। एक मील का पत्थर के रूपमें 4 निप्पल का उपयोग करें। चिपचिपा टेप का उपयोग करके ढीले बालों को हटा दें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, बालों को हटाने के लिए डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग किया जा सकता है।
  9. 80% इथेनॉल या पोविडोन-आयोडीन के साथ उजागर त्वचा कीटाणुरहित करें और 1.5% आइसोफ्लूरेन / ओ2 मिश्रण का उपयोग करके एक संज्ञाहरण नाक मास्क में थूथन के साथ अपनी पीठ पर बाँझ सर्जिकल क्षेत्र में माउस की स्थिति रखें।
  10. पेपर टेप का उपयोग करके माउस के सामने और हिंद अंगों को सुरक्षित करें।
    नोट: सर्जरी के दौरान और बाद में जितना संभव हो उतना हीटिंग पैड पर संवेदनाहारी और पुनर्प्राप्त माउस छोड़ दें।
  11. सर्जिकल क्षेत्र को उजागर छोड़ने के दौरान माउस को कवर करने के लिए एक प्रीकट बाँझ सर्जिकल ड्रेप या धुंध का उपयोग करें।

3. आर.एमआईडब्ल्यू प्रत्यारोपण (अनुमानित समय: 30 मिनट)

  1. सत्यापित करें कि क्या जानवर को पंजा वापसी परीक्षण करके पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी किया गया है। धीरे एक ठीक ग्रेफ संदंश का उपयोग कर त्वचा लिफ्ट और एक अभिविन्यास बिंदु (चित्रा 2 ए) के रूप में 4निप्पल का उपयोग कर 4 स्तन वसा पैड के शीर्ष पर त्वचा में छोटे वसंत कैंची का उपयोग कर एक 10-15 मिमी विकर्ण चीरा बनाने के लिए। सुनिश्चित करें कि पेरिटोनियम या स्तन ग्रंथि को काटना या नुकसान न पहुंचाएं।
  2. लिम्फ नोड या ट्यूमर घाव के स्थान सहित स्तन ऊतक की मैक्रोस्कोपिक विशेषताओं के आधार पर ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें, और चीरा के संबंध में आरओआई को केंद्रीय रखने का प्रयास करें।
  3. आर.एमआईडब्ल्यू फ्रेम (चित्रा 2बीआई) फिट करने के लिए एक जेब बनाने के लिए चीरा लाइन के चारों ओर 5-8 मिमी तक के कुंद विच्छेदन का उपयोग करके स्तन वसा पैड और अंतर्निहित ऊतक परतों से त्वचा को अलग करें।
  4. बाँझ संदंश का उपयोग कर R.MIW उठाओ और परीक्षण करें कि चीरा खिड़की डालने के लिए काफी बड़ा है या नहीं। यदि आवश्यक हो, तो आर.एम.आई.डब्ल्यू फिट होने तक चीरा को थोड़ा बड़ा करें।
  5. आर.एमआईडब्ल्यू को हटा दें और 5-0 रेशम सिवनी (ब्रेडेड, गैर-पुनरुत्थान योग्य) का उपयोग करके चीरा के चारों ओर एक पर्स-स्ट्रिंग सिवनी रखें। चीरा के पुच्छल अंत से शुरू होने वाली त्वचा के अंदर तक चीरा के किनारे से 1-2 मिमी सिवनी रखें।
  6. चीरा के साथ लगभग 5 मिमी ऊपर ले जाएँ और अंदर से बाहर तक त्वचा के माध्यम से सिवनी धागे को पास करें। चीरा के किनारे के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं, जिससे 5-6 छोरों (चित्रा 2 बीआईआई) से मिलकर एक गोलाकार सिवनी बनाई जा सके। सिवनी धागे का अंतिम निकास पहले प्रवेश द्वार से लगभग 2-5 मिमी दूर स्थित होना चाहिए।
    नोट: सावधान रहें कि सीवन को चीरा के किनारे के बहुत करीब न रखें, क्योंकि इससे त्वचा आंसू का खतरा बढ़ जाता है। चीरा के किनारे से सिवनी को बहुत दूर रखने से अतिरिक्त त्वचा और आर.एमआईडब्ल्यू के नाली के बीच संक्रमण का खतरा बढ़ जाता है।
  7. चीरा के अंदर आर एमआईडब्ल्यू फिट करें और आरएमआईडब्ल्यू के नाली में त्वचा को सावधानीपूर्वक रखने के लिए ग्रेफ संदंश का उपयोग करें। सिवनी के छोरों को बाहर छोड़ना सुनिश्चित करें।
  8. पर्स-स्ट्रिंग सिवनी के छोरों पर खींचें और सिवनी के दोनों सिरों पर धीरे से खींचकर आर.एमआईडब्ल्यू के नाली में सिवनी को कस लें (चित्रा 2बीआईआईआई)। सर्जिकल समुद्री मील के साथ बांधें और अतिरिक्त धागे को काट लें।
  9. अंतर्निहित ऊतक से बचने के लिए सुनिश्चित करते हुए, टूथपिक का उपयोग करके आर.एमआईडब्ल्यू के आंतरिक रिम पर पेट्रोलियम जेली लागू करें। धीरे बाँझ संदंश या दो उंगलियों के साथ खिड़की के फ्रेम नीचे की ओर धक्का, और आर एमआईडब्ल्यू फ्रेम (चित्रा 1 बी) में ढक्कन की स्थिति। यह स्तन ग्रंथि ऊतक और आर.एमआईडब्ल्यू ढक्कन के बीच हवा की मात्रा से बचेगा।
  10. ढक्कन की बाहों में छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों प्लेस और ढक्कन दक्षिणावर्त (लगभग 5 °) (चित्रा 1 सी और चित्रा 2 बीआईवी) घुमा द्वारा ढक्कन कस लें।
  11. यदि आर.एमआईडब्ल्यू ढक्कन को कसने के बाद कुछ हवा बनी हुई है, तो अतिरिक्त हवा को हटाने के लिए एक बाँझ इंसुलिन सुई का उपयोग करें। स्तन ऊतक और ढक्कन के बीच गुहा में त्वचा के माध्यम से सुई का परिचय दें और धीरे-धीरे सवार को बाहर निकालें, जिससे स्तन ग्रंथि ऊतक और आर.एमआईडब्ल्यू ढक्कन के बीच एक वैक्यूम बन जाए।
  12. चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासन, सर्जरी के बाद, एनाल्जेसिया जैसे ब्यूप्रेनोर्फिन (बाँझ 0.9% एनएसीएल में पतला 0.1 मिलीग्राम / सर्जरी के बाद 8 घंटे और 16 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्शन दोहराएं।
  13. माउस को पिंजरे में वापस रखने के लिए ठीक करने और बारीकी से निगरानी करने के लिए रखो जब तक कि यह पूरी तरह से जाग न जाए, या तत्काल इमेजिंग के लिए चरण 4 के साथ आगे बढ़ें।
  14. इस पोस्ट-सर्जिकल चरण में, श्वसन, प्रतिक्रियाशीलता, व्यवहार, मुद्रा और शरीर के वजन जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों के आधार पर असुविधा या जटिलताओं के संकेतों के लिए चूहों की बारीकी से निगरानी करें। सूजन और परिगलन के संकेतों के लिए खिड़की के आसपास की त्वचा की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। यदि कोई जटिलता नहीं होती है, तो आर.एम.आई.डब्ल्यू आरोपण के बाद कई हफ्तों में दोहराए गए आईवीएम सत्रों की अनुमति देगा।

Figure 2
चित्रा 2: सर्जिकल प्रक्रिया और खिड़की प्रत्यारोपण का अवलोकन( ए) एक विकर्ण चीरा एक महिला माउसके 4 निप्पल के पास बनाया जाता है और त्वचा और अंतर्निहित ऊतक कुंद विच्छेदन द्वारा डिस्कनेक्ट कर रहे हैं। (बी) वंक्षण लिम्फ नोड और वसा पैड के आकार का उपयोग ऊतक (आई) के सही अभिविन्यास के लिए किया जा सकता है। चीरा (द्वितीय) के चारों ओर त्वचा में एक पर्स-स्ट्रिंग सिवनी रखी जाती है, और खिड़की के फ्रेम में फिटिंग के बाद, खिड़की के फ्रेम को सुरक्षित करने के लिए नाली में सीवन को कड़ा किया जाता है, और सर्जिकल समुद्री मील (III) द्वारा सुरक्षित किया जाता है। अंतिम चरण विंडो फ्रेम (चतुर्थ) में ढक्कन का सम्मिलन और लॉकिंग है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से दोहराया इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी

नोट: यहां वर्णित दोहराया आईवीएम रणनीति को एक मोटर चालित चरण और 35.8 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे जलवायु कक्ष से लैस एक उल्टे मल्टीफोटॉन कॉन्फोकल सिस्टम के लिए अनुकूलित किया गया था।

  1. ओ2 मिश्रण का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में माउस को संवेदनाहारी करें। एक पंजा वापसी परीक्षण (चरण 2.6 में वर्णित) प्रदर्शन करके चेतना के नुकसान की पुष्टि करें। इमेजिंग सत्र के दौरान कॉर्नियल निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों का मरहम लागू करें।
  2. आर.एमआईडब्ल्यू फ्रेम और ढक्कन की स्थिति का निरीक्षण करें, जिसमें टांके की स्थिरता या ढक्कन को कोई संभावित नुकसान शामिल है। ढक्कन को नुकसान के मामले में, ढक्कन को चरण 5 में वर्णित के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  3. माउस को पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस), कस्टम-निर्मित इमेजिंग बॉक्स (चित्रा 3 ए) में स्थानांतरित करें और नाक शंकु में सिर के साथ माउस रखें। इमेजिंग बॉक्स में एक फ्रेम होता है जो माइक्रोस्कोप के स्वचालित चरण के भीतर फिट बैठता है। फ्रेम को आर.एमआईडब्ल्यू (चित्रा 3 ए) के व्यास के छेद के साथ एक कस्टम-निर्मित जड़ना रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
  4. नाक शंकु के साथ एक इनलेट बॉक्स के सामने से जुड़ा होता है और 2% -3% आइसोफ्लूरेन/ ओ 2 मिश्रण का उपयोग करके आइसोफ्लूरेन वाष्पीकरण स्टेशन से जुड़ा होता है। परिसंचरण सुनिश्चित करने और बॉक्स में आइसोफ्लूरेन के संचय को रोकने के लिए एक आउटलेट एक संवेदनाहारी मैला ढोने वाली इकाई से जुड़ा हुआ है। इमेजिंग बॉक्स को पारदर्शी ढक्कन का उपयोग करके बंद किया जा सकता है।
  5. जड़ना पर माउस को इस तरह से रखें कि आर.एमआईडब्ल्यू इमेजिंग बॉक्स जड़ना (चित्रा 3 ए) के छेद में गिर जाता है। माउस को स्थिर करने और श्वसन के कारण ऊतक गति को कम करने के लिए माउस के पीछे पैराफिल्म और पेपर टेप लागू करें।
  6. ढक्कन के साथ इमेजिंग बॉक्स बंद करें और माइक्रोस्कोप के चरण में इमेजिंग बॉक्स डालें।
  7. एक स्थिर, लेकिन सतही संज्ञाहरण (आमतौर पर 1.5% -0.8% आइसोफ्लूरेन / ओ2 मिश्रण के बीच) को बनाए रखने के लिए इमेजिंग सत्र के दौरान धीरे-धीरे आइसोफ्लूरेन खुराक को कम करें।
  8. नीचे वर्णित इमेजिंग के दौरान उचित पोषण प्रदान करें।
    1. इमेजिंग सत्र <3 घंटे के लिए, जलयोजन के लिए बाँझ पीबीएस के 200-300 μL के साथ माउस चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
    2. इमेजिंग सत्र >3 घंटे के लिए, नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करें।
      1. दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए, पोषक तत्वों के साथ माउस को संक्रमित करें। इसके लिए, अमीनो एसिड और ग्लूकोज युक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाँझ इन्फ्यूज मिश्रण का उपयोग करें। माउस की गर्दन में एक लचीली सुई चमड़े के नीचे रखें और इसे पेपर टेप के साथ सुरक्षित करें।
      2. एक लचीली सिलिकॉन ट्यूब के लिए तैयार पोषक तत्व मिश्रण के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न करें और पोषक तत्व मिश्रण के माध्यम से धक्का जब तक यह ट्यूब के अंत तक पहुँच गया है।
      3. लचीली सुई के लिए सिलिकॉन ट्यूब कनेक्ट करें। ट्यूबिंग के अंत में ले लो और इसे इमेजिंग बॉक्स के छेद में से एक के माध्यम से रखें (अंदर से बाहर तक, बॉक्स में सुई लगाव पक्ष छोड़कर)।
      4. हर 30 मिनट में इन्फ्यूज समाधान के 50 μL इंजेक्ट करें।
  9. माइक्रोस्कोप के चरण में इमेजिंग बॉक्स को सुरक्षित करें और माइक्रोस्कोप के एपिफ्लोरेसेंस मोड का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें।
  10. माउस मॉडल (चित्रा 3 बी) के आधार पर वांछित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स लागू करें। पोत संरचनाएं, कोलेजन पैटर्न (दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी द्वारा कल्पना की गई), और वंक्षण लिम्फ नोड सहित अन्य स्थिर शारीरिक संरचनाओं का उपयोग स्थलों के रूप में किया जा सकता है। 12-बिट गहराई पर एक उल्टे मल्टीफोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें, और 1.0 से 4.0 μm (कुल जेड-स्टैक 150 से 800 μm तक) से लेकर जेड-स्टेप आकार का उपयोग करके 25x पानी का उद्देश्य प्राप्त करें। निम्न मानक सेटिंग्स लागू करें: 1024 x 1024 प्रारूप, 600 हर्ट्ज स्कैन गति, द्विदिश मोड।
  11. 860 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी का प्रदर्शन करके और 425-435 एनएम पर पता लगाकर कोलेजन आई फाइबर की कल्पना करें। विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए उत्तेजना और पता लगाने तरंग दैर्ध्य तालिका 1 में इंगित किए गए हैं।

तालिका 1. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. ऊतक (चित्रा 3 बी) का एक संदर्भ नक्शा बनाने के लिए एक बड़ा सिंहावलोकन टाइलेस्कैन उत्पन्न करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर नेविगेटर मोड में सर्पिल समारोह का उपयोग करें। सर्पिल अवलोकन के भीतर आरओआई को परिभाषित करें, जेड स्टैक निर्धारित करने के लिए ऊपरी और निचले जेड विमानों को परिभाषित करें। ऊतक के विस्तृत त्रि-आयामी (xyz) या चार-आयामी Z-स्टैक (xyzt) प्राप्त करने के लिए प्रारंभ करें दबाएं।
    नोट: पूरे इमेजिंग प्रयोग के दौरान माउस बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए। लंबे इमेजिंग सत्रों के लिए, एक पल्स ऑक्सीमीटर और तापमान जांच की सिफारिश की जाती है। माउस की श्वास नियमित और एक ही गति से होनी चाहिए। यदि माउस हांफने के संकेत दिखाना शुरू कर देता है, तो आइसोफ्लूरेन की मात्रा कम हो जानी चाहिए।
  2. प्रत्येक इमेजिंग सत्र के अंत में, पूरी तरह से जागने तक माउस को हीटिंग पैड पर रखें। यदि माउस असुविधा या कम गतिशीलता के संकेत दिखाता है, तो पिंजरे को हीटिंग पैड पर लंबे समय तक रखें और नियमित चाउ के बजाय पोषक तत्व जैल प्रदान करें।
    नोट: इमेजिंग सत्रों के बीच में, माउस को असुविधा के संकेतों के लिए बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए जैसे कि भोजन और पानी की खपत में कमी, तेजी से सांस लेना, आंदोलन में कमी, कंपकंपी, असामान्य शरीर की मुद्रा, या अनियंत्रित फर। असुविधा के स्पष्ट संकेतों के मामले में, पशु कल्याण के बारे में संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें और मानवीय समापन बिंदु तक पहुंचने पर प्रयोग को समाप्त करें।
  3. प्रत्येक दोहराया इमेजिंग सत्र के लिए चरण 4.1-4.12 दोहराएँ और कई समय बिंदुओं (चित्रा 3 बी) पर एक ही स्थिति (ओं) को वापस लेने के लिए अवलोकन टाइल्सकैन का उपयोग करें। इमेजिंग आवृत्ति अनुसंधान प्रश्न और अध्ययन प्रक्रिया के समय पर निर्भर करेगी, और आमतौर पर इमेजिंग सत्रों से दिन में दो बार से प्रति सप्ताह एक बार भिन्न होती है।
  4. वांछित प्रायोगिक अवधि के अंत में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफ्लूरेन के साथ गहरे संज्ञाहरण का उपयोग करके एक प्रत्यारोपित आर.एमआईडब्ल्यू के साथ जानवरों को इच्छामृत्यु दें। यदि वांछित है, तो आगे पूर्व विवो विश्लेषण के लिए ब्याज के अंगों को विच्छेदित करें।
  5. वैकल्पिक रूप से, विवो विश्लेषण में भविष्य के लिए जानवर को जीवित रखें। उस स्थिति में, वसंत कैंची के साथ काटने के द्वारा आर.एमआईडब्ल्यू पकड़े थैली सिवनी को हटा दें और ध्यान से कुंद संदंश का उपयोग कर माउस त्वचा से खिड़की की अंगूठी को अलग करें। त्वचा के किनारों को साफ करें जो पहले खिड़की को पकड़ते थे और एक साधारण निरंतर सिवनी (अवशोषक सामग्री, जैसे पॉलीग्लाइकोलिक एसिड) के साथ आगे बढ़ते हैं।
  6. एक बार जब त्वचा बंद हो जाती है, तो शुरुआत और अंत सिवनी धागे को दो वर्ग समुद्री मील (4 थ्रो) के साथ बांधें। ऊतक इस्किमिया को कम करने के लिए, त्वचा के किनारे पर रक्त प्रवाह की अनुमति देने के लिए समुद्री मील पर्याप्त ढीली होनी चाहिए। सूजन को रोकने और त्वचा के उपचार को बढ़ावा देने के लिए पोविडोन-आयोडीन के साथ घाव कीटाणुरहित करें।

Figure 3
चित्रा 3: अनुदैर्ध्य आईवीएम वर्कफ़्लो। (ए) एक विशिष्ट बहु-दिवसीय आईवीएम प्रयोग का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) वयस्क स्तन ग्रंथि के भीतर एक ट्यूमरजेनिक क्षेत्र की इमेजिंग। प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले, एक कम-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन टाइल्सकैन (शीर्ष पैनल) बाद के इमेजिंग दिनों में ब्याज के क्षेत्र (ओं) की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकता है। कोलेजन मैं पैटर्न (दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी, मैजेंटा), ऊतक संरचना और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (हरे, पीले और लाल रंग में चित्रित) के साथ अलग-अलग लेबल वाली कोशिकाओं के पैटर्न का उपयोग एक ही ऊतक क्षेत्र को वापस लेने के लिए किया जा सकता है। स्केल बार 1 मिमी (अवलोकन टाइलेस्कैन) और 100 μm (नीचे पैनल) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) आर 26-कंफेटी रिपोर्टर निर्माण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। टैमोक्सीफेन-प्रेरित क्रे-पुनर्संयोजन पर, कंफेटी स्टोकेस्टिक रूप से पुन: संयोजक का निर्माण करता है, जिसके परिणामस्वरूप चार फ्लोरोफोरस (एनजीएफपी, वाईएफपी, आरएफपी, या एमसीएफपी) में से एक की अभिव्यक्ति होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. इमेजिंग सत्रों के बीच में आर.एमआईडब्ल्यू के ढक्कन को खोलना और बंद करना

  1. बाँझ दस्ताने का उपयोग करके बाँझपन बनाए रखें, और माउस के संपर्क में आने वाली सभी वस्तुओं को निष्फल करें। सर्जरी से पहले आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण (विवरण के लिए चरण 2 देखें)।
  2. हीटिंग पैड चालू करें और एक बाँझ पर्दे के साथ चटाई को कवर करें और आइसोफ्लूरेन / ओ2 मिश्रण के 3% का उपयोग करके एक प्रेरण कक्ष में माउस को संवेदनाहारी करें। एक पंजा वापसी पलटा परीक्षण करके पर्याप्त संज्ञाहरण सत्यापित करें।
  3. एक संज्ञाहरण नाक मुखौटा करने के लिए प्रेरण कक्ष से माउस स्थानांतरण और 1.5% -2% आइसोफ्लूरेन /
  4. ढक्कन की बाहों में छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों रखें और ढक्कन विरोधी दक्षिणावर्त घुमाकर ढक्कन को ढीला करें। यदि आवश्यक हो, तो ढक्कन के ढीलेपन की सुविधा के लिए खिड़की पर कुछ पूर्व-गर्म बाँझ पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) लागू करें।
  5. आगे के उपयोग तक बाँझ पीबीएस के साथ एक बाँझ पकवान में आर.एमआईडब्ल्यू के ढक्कन को रखें। डेमी-पानी और बाद में 80% इथेनॉल के साथ ढक्कन के कवरग्लास को साफ करें। ढक्कन को आगे के उपयोग तक बाँझ पीबीएस में रखें।
  6. ऊतक की सतह पर बाँझ पीबीएस की कुछ बूंदों को जोड़कर उजागर ऊतक को सूखने से रोकें।
  7. लागू करें या उजागर ऊतक पर ब्याज की किसी भी पदार्थ या कोशिकाओं को इंजेक्ट, 50 μL की एक अधिकतम मात्रा का उपयोग किया जा सकता है। ऊतक द्वारा तरल अवशोषित होने तक कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। वैकल्पिक रूप से, ऊतक को विशिष्ट आरओआई के लिए इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए बाँझ, कुंद संदंश का उपयोग करके हेरफेर या पुनर्स्थापित किया जा सकता है।
  8. आर.एमआईडब्ल्यू के आंतरिक रिम पर पेट्रोलियम जेली लागू करें, जिससे अंतर्निहित ऊतक से बचना सुनिश्चित हो सके। चरण 3.9 में वर्णित आर.एमआईडब्ल्यू फ्रेम में ढक्कन की स्थिति, ढक्कन की बाहों में छेद के माध्यम से पतली संदंश की युक्तियों को रखें, और ढक्कन को दक्षिणावर्त (लगभग 5 °) घुमाकर ढक्कन को कस लें।

Representative Results

स्तन ग्रंथि के विभिन्न विकास चरणों के दौरान स्तन उपकला कोशिकाओं के प्रसार गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल किया गया था। आर.एमआईडब्ल्यू के डिजाइन को चित्रा 1 में दर्शाया गया है, और आर.एमआईडब्ल्यू को प्रत्यारोपित करने की प्रक्रिया को चित्रा 2 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। आर.एम.आई.डब्ल्यू. शल्य चिकित्सा स्तन ग्रंथि और त्वचा के बीच प्रत्यारोपित किया जाता है। एक सीवन खिड़की की अंगूठी के भीतर पकड़ और टांके (चित्रा 2) पर खींचने से चूहों को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। आर.एमआईडब्ल्यू को धारण करने वाले टांके गैर-अवशोषित रेशम से बने होते हैं, जिसमें हाइपोएलर्जेनिक गुण, एक नरम बनावट होती है, और इसे संभालना आसान होता है। आर.एमआईडब्ल्यू अंगूठी टाइटेनियम से बना है, जो सबसे जैव संगत सामग्रियों में से एक है जो आरोपण21 के बाद सूजन या परिगलन को बढ़ावा नहीं देता है। यदि सड़न रोकनेवाला स्थितियों का पालन किया जाता है और टांके अच्छी तरह से निष्पादित किए जाते हैं, तो आर.एमआईडब्ल्यू स्तन ग्रंथि प्रत्यारोपण पश्चात की जटिलताओं का कम जोखिम पैदा करता है। इसके अलावा, पेट इमेजिंग विंडो प्रत्यारोपण22 के विपरीत, आर.एमआईडब्ल्यू आरोपण माउस अस्तित्व के लिए एक सीमित कारक नहीं है क्योंकि स्तन ग्रंथि एक महत्वपूर्ण अंग नहीं है और नैतिक प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट सीमा तक दैनिक इमेजिंग की अनुमति देता है। खिड़की के आरोपण की अवधि को सीमित करने वाला एकमात्र कारक त्वचा का होमियोस्टैटिक टर्नओवर है, जो अंततः 4 - 6 सप्ताह के बाद टांके गिरने का कारण बन जाएगा। इसलिए, टांके की स्थिरता का नियमित रूप से निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। यदि वांछित है, तो खिड़की की स्थिरता को आश्वस्त करने के लिए टांके को हटाया जा सकता है और सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में एक नए पर्स-स्ट्रिंग सिवनी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है (जैसा कि चरण 3.5 - 3.8 में वर्णित है)।

मल्टीडे इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते समय एक बड़ी चुनौती लगातार दिनों में आरओआई को वापस ले रही है। इस अंत में, आरओआई (ओं) (चित्रा 3 बी) का चयन करने से पहले एक त्वरित अवलोकन स्कैन शामिल किया जा सकता है। कई ऊतक स्थलों का उपयोग ऊतक के एक ही क्षेत्र को पीछे हटाने के लिए किया जा सकता है, जिसमें कोलेजन नेटवर्क सिग्नल (दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी द्वारा कल्पना की गई), ऊतक संरचना, साथ ही कोशिकाओं के स्थानीय पैटर्न अलग-अलग या स्टोकेस्टिक रूप से रंगों या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 3 बी) के साथ लेबल किए गए हैं। इस प्रतिनिधि उदाहरण में, एक एमएमटीवी-पीवाईएमटी की चौथी स्तन ग्रंथि पर एक आर.एमआईडब्ल्यू प्रत्यारोपित किया गया था ; आर 26-सीआरईआरटी 2हेट; आर 26-कंफेटीहेट मादा माउस स्पष्ट ट्यूमर गठन की शुरुआत में। इसके बाद, स्टोकेस्टिक पुनर्संयोजन को 1.5 मिलीग्राम टैमोक्सीफेन के इंजेक्शन से प्रेरित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप कुछ कोशिकाओं (चित्रा 3 सी) में कंफेटी निर्माण का पुनर्संयोजन हुआ। पुनर्संयोजित ट्यूमर कोशिकाओं को 20 दिनों (चित्रा 3 बी, सी) की अवधि के लिए पीछा किया गया था। यदि लगातार दिनों में स्तन ग्रंथि के एक ही क्षेत्र की इमेजिंग को रोक दिया जाता है, तो खिड़की को एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में खोला जा सकता है (जैसा कि चरण 5.1 में वर्णित है) आगे साफ करने के लिए, और दृश्यता और छवि अधिग्रहण (चित्रा 3 ए) में सुधार करने के लिए ऊतक को पुनर्स्थापित करें।

इस पद्धति का उपयोग करके, युवावस्था के दौरान विकासशील स्तन ग्रंथि का एकल-कोशिका स्तर पर पालन किया गया था। आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से दोहराया आईवीएम आर 26-सीआरईआरटी 2हेट का उपयोग करके किया गया था; आर 26-एमटीएमजीहेट मादा चूहों की उम्र 4-6 सप्ताह के बीच, जिसमें सभी कोशिकाओं को झिल्ली टीडीटोमैटो (चित्रा 4 ए) 23 के साथ लेबल किया जाता है। चूहों को टैमोक्सीफेन (0.2 मिलीग्राम / 25 ग्राम शरीर के वजन) की कम खुराक के साथ इंजेक्ट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एमटीएमजी निर्माण का छिटपुट पुनर्संयोजन हुआ, जिससे स्तन ग्रंथि (चित्रा 4 बी) सहित सभी ऊतकों में कुछ कोशिकाओं में लाल से हरे रंग में परिवर्तन हुआ। एक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर डक्टल बढ़ाव और डक्टल ब्रांचिंग (चित्रा 4 सी) सहित स्तन ग्रंथि के भीतर रूपात्मक परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए एक ही आरओआई को कई दिनों में फिर से देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, स्टोकेस्टिक सेल लेबलिंग और मल्टी-डे आईवीएम का यह संयोजन डक्टल वातावरण के गतिशील परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति देता है, जैसे कि लम्बी और शाखाओं वाली नलिकाओं (चित्रा 4 डी) के आसपास स्ट्रोमा में एकल कोशिकाओं की गतिशीलता के साथ-साथ वंक्षण लिम्फ नोड (चित्रा 4 ई) के भीतर सेलुलर गतिशीलता।

Figure 4
चित्रा 4: यौवन शाखाओं के मल्टी-डे आईवीएम मॉर्फोजेनेसिस( ए) यौवन आर 26-सीआरईआरटी 2; 4-6 सप्ताह के बीच की उम्र में आर 26-एमटीएमजी चूहों को टैमोक्सीफेन की कम खुराक के साथ इंजेक्ट किया गया था, जिससे आर 26-एमटीएमजी एलील के क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के लिए अग्रणी था और स्तन ग्रंथि के विकास में गतिशील परिवर्तनों का पालन करने के लिए 1, 3 और 5 दिनों में चित्रित किया गया था। (बी) आर 26-एमटीएमजी माउस निर्माण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, जिसके परिणामस्वरूप गैर-पुनर्संयोजित स्थितियों में झिल्ली टीडीटोमैटो (एमटी) की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति होती है। क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर, एमटी को झिल्ली ईजीएफपी (एमजी) अभिव्यक्ति के लिए स्विच किया जाता है। (सी) आर 26-सीआरईआरटी 2 में आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से इमेज किए गए कई दिनों में एक लम्बी और ब्रांचिंग स्तन वाहिनी का 3 डी प्रतिपादन ; 6 सप्ताह की उम्र में आर 26-एमटीएमजी महिला माउस। (डी) ब्रांचिंग टिप (शीर्ष पैनल) और लम्बी शाखा (नीचे पैनल) की एकल जेड-प्लेन छवियां। एमटी को लाल रंग में दर्शाया गया है, और सियान में एमजी, स्केल बार 100 μm (ए और बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्ट्रोमा में एकल कोशिकाओं को सफेद तारांकन द्वारा हाइलाइट किया जाता है। ध्यान दें कि स्ट्रोमा में एकल कोशिकाओं को उजागर करने के लिए सिग्नल तीव्रता को मैन्युअल रूप से बढ़ाया गया था, जिससे स्तन उपकला कोशिकाओं की थोड़ी अतिरंजित उपस्थिति हुई। (ई) आर 26-सीआरईआरटी 2 के वंक्षण लिम्फ नोड की प्रतिनिधि छवियां; आर 26-एमटीएमजी महिला माउस को आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से चित्रित किया गया है, जिसमें एक अवलोकन टाइल स्कैन (बाएं पैनल), एक एकल जेड-प्लेन (शीर्ष) की ज़ूम छवियां (दाएं पैनल), और एक 3 डी रेंडरिंग (नीचे) दिखाया गया है। दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (कोलेजन आई) को हरे रंग में, एमटी को लाल रंग में और एमजी को सियान में दिखाया गया है। स्केल बार 500 μm (अवलोकन टाइलेस्कैन) और 100 μm (ज़ूम छवियों) का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा पैनल सी और डी को मेसल एट अल से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसी तरह, वयस्क स्तन ग्रंथि में, प्रस्तावित आर.एम.आई.डब्ल्यू दृष्टिकोण असंगत दृश्यता के साथ कई दिनों में एक ही डक्टल संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देता है। यहां तक कि कम उज्ज्वल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मॉडल24 का उपयोग, जैसे कि सीडीएच 1-एमसीएफपी (ईकाडेरिन-एमसीएफपी) माउस मॉडल, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 5) पर डक्टल स्थिरता और सूक्ष्म रूपात्मक परिवर्तनों के दृश्य की अनुमति देता है। ध्यान दें कि ऊतक रिपोजिशनिंग (चित्रा 5) के बाद दिन 3 और दिन 5 के बीच दृश्यता में काफी सुधार हुआ है।

Figure 5
चित्रा 5: वयस्क स्तन ग्रंथि की बहु-दिवसीय इमेजिंग 3 डी ने लगातार कई दिनों में एक वयस्क महिला सीडीएच 1-एमसीएफपी (सियान, एकाडेरिन-पॉजिटिव ल्यूमिनल कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को चिह्नित करते हुए) माउस की स्तन नलिका संरचना की छवियों को प्रस्तुत किया। कोलेजन आई पैटर्न (दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी, मैजेंटा) का उपयोग उसी आरओआई को वापस लेने के लिए किया गया था, और सीडीएच 1-एमसीएफपी सिग्नल का उपयोग डक्टल (ल्यूमिनल) कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया गया था। ध्यान दें कि आर.एमआईडब्ल्यू ढक्कन के उद्घाटन और ऊतक के पुनर्स्थापन से दिन 3 के बाद दृश्यता में सुधार हुआ था। स्केल पट्टियाँ 100 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एकल-कोशिका स्तर पर हार्मोनल चक्र के दौरान स्तन उपकला कोशिकाओं की प्रसार विषमता का आकलन करने के लिए, फोटो-परिवर्तनीय किकुम ग्रीन-रेड (किकजीआर) रिपोर्टर माउस मॉडल25,26 का उपयोग किया गया था, जिसमें किकजीआर प्रोटीन की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति है। किकजीआर एक उज्ज्वल फ्लोरोफोर है जो वायलेट प्रकाश के संपर्क में आने पर हरे-से-लाल रूपांतरण से गुजरता है और लाल / हरे अनुपात का उपयोग सेल2 (चित्रा 6 ए, बी) की प्रसार गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है। आर.एमआईडब्ल्यू दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने कई दिनों तक वयस्क स्तन ग्रंथि के डक्टल पेड़ के भीतर एक ही कोशिकाओं का पालन किया और डक्टल पेड़ (चित्रा 6 सी) में पहले अप्रत्याशित प्रोलिफेरेटिव विषमता पाई। उच्च और निम्न प्रसार कोशिकाओं को विभिन्न परिवर्तित क्षेत्रों (चित्रा 6 सी, डी) पर समान रूप से वितरित किया गया था। आश्चर्यजनक रूप से, स्थानीय स्तर पर, पड़ोसी कोशिकाओं ने अपने लाल / हरे अनुपात (चित्रा 6 सी, डी) में बड़े अंतर दिखाए। फोटो रूपांतरण के 10 दिनों के बाद विभिन्न कोशिकाओं (उनके प्रसार गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में) के लाल / हरे अनुपात का परिमाणीकरण, एक ही डक्टल माइक्रो-एनवायरनमेंट (चित्रा 6 ई) के भीतर कुछ कोशिकाओं की अत्यधिक चर कमजोर पड़ने की दर ों का पता चला। साथ में, ये डेटा वयस्क स्तन ग्रंथि के भीतर एक उल्लेखनीय स्थानीय प्रसार विषमता को प्रकट करते हैं, और साथ ही, एक वैश्विक समान कारोबार दर।

Figure 6
चित्रा 6: किकजीआर माउस मॉडल का उपयोग करके वयस्क स्तन ग्रंथि में प्रोलिफेरेटिव विषमता के अनुदैर्ध्य आईवीएम( ए) किकजीआर चूहों को वायलेट प्रकाश के संपर्क में आने से पहले और बाद में दिन 0 पर चित्रित किया गया था। रूपांतरण के बाद इमेजिंग सत्र 2, 6 और 10 दिनों में दोहराया गया था। (बी) प्रसार (बाएं पैनल) के बाद किकजीआर स्तन उपकला कोशिकाओं के फोटो-रूपांतरण पर काल्पनिक परिणामों का योजनाबद्ध चित्रण और समय के एक समारोह के रूप में कोई प्रसार (दाएं पैनल)। (सी) स्तन ग्रंथि के एक ही क्षेत्र को 10 दिनों की अवधि में आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से चित्रित किया गया था। छोटे क्षेत्रों को दिन 0 पर फोटो-परिवर्तित किया गया था और समय के साथ किकुमे लाल सिग्नल की एक समान कमजोर पड़ने की दर दिखाते हैं, जो पूरे उपकला में समान कारोबार दर का संकेत देता है। (डी) पैनल सी में संकेतित क्षेत्रों की ज़ूम छवियां (एकल जेड-प्लेन) फोटो-रूपांतरण के 6 और 10 दिनों के बाद सेलुलर स्तर पर प्रोलिफेरेटिव विषमता दिखाती हैं। स्केल बार 100 μm (पैनल C) और 10 μm (पैनल D) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ई) तीन फोटो परिवर्तित क्षेत्रों में यादृच्छिक रूप से चयनित कोशिकाओं (एन = 48 कोशिकाओं) के लाल / हरे अनुपात का परिमाणीकरण। एक उच्च लाल / हरा अनुपात कम कमजोर पड़ने की दर और कम प्रसार गतिविधि का संकेत है, जबकि कम लाल / हरा अनुपात उच्च कमजोर पड़ने की दर और प्रसार का संकेत है। चित्रा पैनल सी- ई को मेसल एट अल से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

आर.एमआईडब्ल्यू अपने मूल और न्यूनतम रूप से बाधित वातावरण में स्वस्थ और रोगग्रस्त स्तन ग्रंथि के अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति देता है और विभिन्न विकास चरणों में स्तन ग्रंथि के बार-बार दृश्य की अनुमति देता है। आर.एमआईडब्ल्यू डिजाइन प्रयोग के दौरान किसी भी बिंदु पर खिड़की खोलने की अनुमति देता है। ब्याज के ऊतक तक दीर्घकालिक दृश्य पहुंच बाधित हो सकती है, उदाहरण के लिए, कवरस्लिप पर सेल मलबे के संचय से। ऐसे मामलों में, पूरे दृश्यमान ऊतक क्षेत्र और ढक्कन की सफाई की अनुमति देने के लिए इमेजिंग सत्र से पहले या तुरंत बाद आर.एम.आईडब्ल्यू खोला जा सकता है। हटाने योग्य ढक्कन ऊतक के जोड़तोड़ के साथ-साथ पदार्थों के स्थानीय अनुप्रयोग, जैसे विशिष्ट अवरोधकों और उपचारों, लेबलिंग रंगों, या विशिष्ट सेल प्रकार के ब्याज की अनुमति देता है।

यह विधि पहले वर्णित स्तन स्किनफ्लैप प्रक्रियाओं 4,7,8,13 की सीमा को पार करती है, जो एक इमेजिंग सत्र तक सीमित हैं, और ब्रांचिंग मॉर्फोजेनेसिस (चित्रा 5), होमियोस्टैटिक ऊतक टर्नओवर (चित्रा 6), या सेलुलर स्तर पर ट्यूमर वृद्धि (चित्रा 3 बी) जैसी प्रक्रियाओं की कल्पना कर सकती है ). फिर भी, एक ही समय में, आर.एमआईडब्ल्यू इमेजिंग सत्रों के बीच ऊतक के स्थानीय हेरफेर की अनुमति देता है, जिसमें पहले प्रकाशित एमआईडब्ल्यू3,18 और अन्य सभी इमेजिंग खिड़कियों20,22 की तुलना में आर.एमआईडब्ल्यू की एक बड़ी संपत्ति शामिल है। आर.एमआईडब्ल्यू खोलते समय, संक्रमण के किसी भी स्रोत को रोकने के लिए हर समय सड़न रोकनेवाला स्थितियों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में आर.एमआईडब्ल्यू को खोलने की क्षमता प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करने की अनुमति देती है, जो ब्याज के ऊतकों तक दीर्घकालिक दृश्य पहुंच में काफी सुधार करती है। विशेष रूप से, स्तन ग्रंथि में, जो एक एडिपोसाइट समृद्ध स्ट्रोमा में एम्बेडेड है, यह बहुत मूल्यवान है। इसके अलावा, बदली ढक्कन विशिष्ट रूप से चिकित्सीय, विभिन्न सेल प्रकार, लेबलिंग रंगों, छवि-निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन, या आईवीएम प्रयोग को समाप्त करने की आवश्यकता के बिना ऊतक के किसी अन्य स्थानीय हेरफेर के स्थानीय प्रशासन को सक्षम कर सकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर दीक्षा का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट कैंसर सेल आबादी को एक निर्धारित आईवीएम समय-बिंदु और सटीक स्तन ग्रंथि स्थान पर सीधे डक्टल पेड़ या स्ट्रोमा में इंजेक्ट किया जा सकता है, जब तक कि यह आरओआई आर.एम.आईडब्ल्यू रिंग के माध्यम से सुलभ हो। ट्यूमर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट कैंसर सेल आबादी (एक विशिष्ट स्थान पर, एक विशिष्ट सूक्ष्म वातावरण में, या एक विशिष्ट व्यवहार के साथ) को आईवीएम सत्र के दौरान फोटो-चिह्नित किया जा सकता है और बाद में आर.एमआईडब्ल्यू के उद्घाटन के बाद फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोडिसेक्ट किया जा सकता है। पृथक कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है, जैसे (एकल-कोशिका) एमआरएनए अनुक्रमण। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, कोई आणविक अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए विवो सेल व्यवहार में जोड़ सकता है। आर.एमआईडब्ल्यू द्वारा सक्षम स्थानीय दवा प्रशासन का लाभ ऊतक को उपचार से पहले और सीधे बाद में चित्रित करने की अनुमति देता है। इमेजिंग बॉक्स से माउस को हटाने और बाद में आर.एमआईडब्ल्यू ढक्कन खोलने के बाद स्थानीय दवा प्रशासन करने के लिए आवश्यक अंतराल मिनटों में किया जा सकता है, जो तेजी से अभिनय करने वाली दवाओं के तत्काल चरण कैप्चर की अनुमति देता है।

हम दिखाते हैं कि आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से स्तन ग्रंथि का आईवीएम कई अलग-अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल के साथ संगत है। वसा समृद्ध वातावरण छवि के लिए चुनौतीपूर्ण है, और इसलिए उज्ज्वल फ्लोरोफोरस के उपयोग की सिफारिश की जाती है। हालांकि, जैसा कि यहां दिखाया गया है, एमसीएफपी जैसे कम उज्ज्वल फ्लोरोफोरस को इष्टतम इमेजिंग स्थितियों में आर.एमआईडब्ल्यू के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। अनिवार्य रूप से, वसा पैड गहरी नलिका संरचनाओं की इमेजिंग को रोक देगा, और इमेजिंग को अधिक सतही नलिकाओं तक सीमित कर देगा। प्रत्येक आईवीएम प्रयोग की शुरुआत में एक कम-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन छवि ब्याज की डक्टल संरचनाओं की पहचान करने में मदद करेगी जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से सतही हैं। स्थानीय ऊतक हेरफेर, संयोजी ऊतक को हटाने, या आरएमआईडब्ल्यू खोलने के बाद वसा ऊतक की पुनर्स्थापना विशिष्ट आरओआई के लिए आईवीएम का अनुकूलन कर सकती है जो वसा ऊतक द्वारा मढ़ा जाता है। यह पिछले सभी विंडो डिज़ाइनों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो इन जोड़तोड़ को करने की अनुमति नहीं देते हैं और खिड़की को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होगी। विशेष रूप से, वंक्षण लिम्फ नोड के दृश्य के लिए, धीरे-धीरे अतिरंजित फैटी ऊतक को हटाने की सिफारिश की जाती है, जो प्रकाश बिखरने को कम करता है और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है। ऊतक में हेरफेर करते समय, हमेशा सड़न रोकनेवाला स्थितियों को रखें और ऊतक को रक्तस्राव या गंभीर क्षति को रोकें, क्योंकि वे आईवीएम प्रयोग के दौरान अध्ययन की जा रही प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं।

आर.एमआईडब्ल्यू टाइटेनियम से बना है, एक ऐसी सामग्री जिसका उपयोग आमतौर पर नैदानिक अभ्यास में जोड़ों या हड्डी प्लेटों जैसे कठोर ऊतकों को बदलने के लिए किया जाता है। टाइटेनियम के स्टील की खिड़कियों पर कई फायदे हैं, जिनमें इसके हल्के और निष्क्रिय चरित्र21 शामिल हैं। हाल ही में, लचीली सिलिकॉन विंडो20 सहित उपन्यास इमेजिंग विंडो प्रकार उत्पन्न करने के लिए कई अन्य सामग्रियों का उपयोग किया गया था। आर.एमआईडब्ल्यू के विपरीत, लचीली खिड़की को आरोपण के लिए किसी भी टांके की आवश्यकता नहीं होती है और लगभग किसी भी शारीरिक स्थिति के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से नरम और नाजुक ऊतकों के मामले में। सिलिकॉन खिड़कियों का उनके हल्के और विकृत प्रकृति के कारण पशु गतिशीलता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है और शायद तेजी से ऊतक विस्तार और विकास का अध्ययन करने वाले प्रयोगों में अधिक अनुकूलहै 20. टाइटेनियम संस्करण पर एक और फायदा यह है कि सिलिकॉन खिड़कियां चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग20,27 सहित अन्य इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ संगत हैं। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण होगा कि उद्देश्यों को 0.17 मिमी ग्लास कवरलिप्स के लिए अनुकूलित किया गया है। इसके अलावा, स्तन ऊतक श्वास आंदोलनों के लिए अतिसंवेदनशील होता है, जो लचीली खिड़की का उपयोग करके प्रतिबंधित करना मुश्किल होता है, खासकर जब एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं। श्वास कलाकृतियों को आर.एमआईडब्ल्यू डिजाइन और इमेजिंग बॉक्स के जड़ना में आर.एमआईडब्ल्यू के निर्धारण द्वारा कम से कम किया जाता है। नतीजतन, प्रस्तावित आर.एमआईडब्ल्यू सेटअप का उपयोग करके अधिग्रहित छवियां श्वास कलाकृतियों के कारण विकृत नहीं होती हैं। हालांकि, ऊतक स्थानीयकरण में मामूली बहाव हो सकते हैं, जो आमतौर पर क्रमिक होते हैं और अधिग्रहण के बाद गति सुधार सॉफ्टवेयर28 का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है। आईवीएम प्रौद्योगिकियों 2,20 के बढ़ते टूलबॉक्स के साथ, प्रत्येक प्रयोग के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं अंततः ब्याज के ऊतक के विवो विज़ुअलाइज़ेशन का सबसे अच्छा तरीका निर्धारित करेंगी। विभिन्न विंडो डिज़ाइनों के अलग-अलग फायदे और नुकसान हैं और अनुसंधान प्रश्न, उपलब्ध माइक्रोस्कोपी सेटअप, आवश्यक स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन और अध्ययन प्रक्रिया की कुल समय अवधि के आधार पर, इष्टतम दृष्टिकोण निर्धारित करने की आवश्यकता है।

सारांश में, आर.एमआईडब्ल्यू स्तन ग्रंथि विकास, होमियोस्टेसिस और बीमारी के दौरान कई दिनों से हफ्तों तक सेलुलर गतिशीलता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एमसी को पीएचडी अनुदान मौलिक अनुसंधान 11 एल 7222 एन), बोहरिंगर इंगेलहेम फाउंडेशन (सीएलजीजेएस को पीएचडी फैलोशिप), एक ईएमबीओ पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (सीएलजीजेएस को अनुदान एएलटीएफ 1035-2020), और डॉक्टर जोसेफ स्टेनर अवार्ड (जेवीआर को) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl BD 306573 Other brands available
10 mm round coverglass Fisher scientific 10696365 Other brands available
5-0 braided silk suturs Ethicon W580
80% Ethanol homemade NA
Anesthesia induction box Kentscientific VetFlo-MSEKIT
Buprenorphine (Vetergesic®) Ecuphar NA
Cotton tips (sterile) Fisher scientific 13113743 Other brands available
Cyanoacrylate adhesive Loctite NA Other brands available
Eye ointment Duratears NA
Flexible butterfly needle Greiner Bio-One 450120 Other brands available
Graefe forceps (blunt) Fine Science Tools 11051-10
Heating pad Kentscientific RightTemp Jr. Other brands available
Imaging box Custom made NA
Infuse nutrient mixture Braun Nutriflex special 70/240
Insulin syringes BD 324911 Other brands available
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane vaporizer Kentscientific VetFlo-1231K
Needle holder Fine Science Tools 12510-14
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 semi-transparent tape
Paper tape tesa Tesa NA
Petroleum Jelly Vaseline NA
Razor blades Fisher scientific 11904325 Other brands available
Silicon tubing Solutions Elastomeres NA Any houseware
Spring scissors (small) Fine Science Tools 15018-10
Sterile PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Syringe (10 ml) BD 305482 Other brands available
Thin forceps Fine Science Tools 11413-11
Titanium lid for mammary imaging window Custom made NA
Titanium mammary imaging window Custom made NA
Wooden sticks toothpicks Fisher scientific NC1678836 Other brands available

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References

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जीव विज्ञान अंक 179
अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी बदली ढक्कन के साथ एक स्तन इमेजिंग विंडो का उपयोग कर
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Mourao, L., Ciwinska, M., van… More

Mourao, L., Ciwinska, M., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid. J. Vis. Exp. (179), e63326, doi:10.3791/63326 (2022).

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