Summary
Этот протокол описывает новое окно визуализации молочной железы со сменной крышкой (R.MIW). Прижизненная микроскопия после имплантации R.MIW позволяет проводить продольную и многодневную визуализацию здоровой и больной молочной железы с клеточным разрешением на разных стадиях развития.
Abstract
Разветвленная структура молочной железы очень динамична и проходит несколько фаз роста и ремоделирования после рождения. Прижизненная микроскопия в сочетании с хирургией лоскута кожи или имплантацией визуальных окон была использована для изучения динамики здоровой молочной железы на разных стадиях развития. Большинство технологий визуализации молочной железы ограничены временными рамками от нескольких часов до дней, тогда как большинство процессов ремоделирования молочных желез происходят во временных рамках от дней до недель. Для изучения ремоделирования молочных желез требуются методы, позволяющие оптический доступ к интересующей ткани в течение длительных временных рамок. Здесь описана улучшенная версия титанового окна визуализации молочной железы со сменной крышкой (R.MIW), которая позволяет визуализировать молочной железы с высоким разрешением с клеточным разрешением на срок до нескольких недель. Важно отметить, что R.MIW обеспечивает доступ к тканям в течение всего эксперимента по прижизненной визуализации и, следовательно, может использоваться для местных манипуляций с тканями, маркировки, введения лекарств или микродиссекции с визуальным контролем. Взятый вместе, R.MIW позволяет характеризовать клеточную динамику с высоким разрешением во время развития молочных желез, гомеостаза и заболеваний.
Introduction
Эпителий молочной железы является уникальным секреторным органом, присутствующим у млекопитающих, который производит и выделяет молоко для питания потомства. На протяжении всей жизни молочная железа претерпевает множественные раунды развития и роста, которые сопровождаются структурно-функциональными изменениями ткани1. В зависимости от стадии развития различаются типы клеток, способствующие ремоделированию тканей, а также расположение внутри протокового дерева.
Многофотонная прижизненная микроскопия (IVM) позволяет изучать динамику клеток молочной железы in vivo в нативной и минимально возмущенной обстановке 2,3,4. Для получения визуального доступа к молочной железе было опубликовано несколько временных методов визуализации ex vivo или кожного лоскута на разных стадиях развития молочной железы, включая половое созревание 4,5,6,7, взрослую жизнь 2,8, лактацию 9,10,11,12 и динамику опухоли 13,14 ,15. Хотя эти методы приводят к высокой пространственной и временной визуализации динамики клеток молочной железы, временные рамки ограничены часами, тогда как большинство процессов ремоделирования молочной железы занимают от нескольких дней до недель. Поэтому требуются методы, позволяющие оптический доступ к интересующей ткани в течение длительных временных рамок. На протяжении многих лет было разработано несколько постоянных окон визуализации для визуализации опухолей молочной железы 15,16,17,18, включая титановое окно визуализации молочной железы (MIW)2,3,19. Хотя это очень полезно для изучения роста опухоли молочной железы, визуализация здоровой структуры молочной железы оставалась ограниченной несколькими днями. Недавно было разработано гибкое кремниевое окно визуализации, которое позволяет визуализировать пубертатную молочную железу в течение нескольких недель20. Однако молочная железа встроена в богатую адипоцитами жировую прокладку, что приводит к обширному рассеянию света и, как следствие, к ограничению видимости структур протоков молочной железы. Поэтому для визуализации динамики тканей в течение длительных периодов времени в молочной железе всегда требуются превосходные условия визуализации. Ни классический MIW, ни гибкое кремниевое окно не позволяют манипулировать тканями или оптимизировать физическое расположение тканей перед визуализацией, поскольку окно образует закрытую систему после операции и имплантации. В результате оптимальный оптический доступ к подлежащей ткани молочной железы, вероятно, будет исключен в течение более длительных периодов времени. Напротив, техника кожного лоскута позволяет оптимизировать и переместить ткань во время сеанса визуализации, и кожный лоскут может быть повторен несколько раз2. Тем не менее, повторные сеансы визуализации через кожный лоскут возможны только тогда, когда между операциями выделяется достаточное время (не менее 7 дней), чтобы обеспечить восстановление кожи, и поэтому в основном подходит для изучения процессов в более длительных временных масштабах. Более того, желательно не выполнять эту процедуру много раз из-за ее инвазивного характера и большого риска инфекций и рубцевания при закрытии раны.
Чтобы преодолеть эти ограничения, т.е. обеспечить оптимальные условия визуализации в течение длительного периода времени на высокой частоте и в то же время позволить манипулировать тканями, была разработана улучшенная титановая версия MIW со сменной крышкой (R.MIW) для визуализации здоровой и больной молочной железы в течение нескольких дней до недель2 (Рисунок 1A, B). R.MIW был специально разработан для обеспечения оптимального доступа к тканям, что позволяет осуществлять прямые манипуляции с тканями в течение всего эксперимента IVM и, таким образом, позволяет визуализировать молочную железу в нужное время и в нужном месте в течение длительных периодов времени. В закрытом состоянии R.MIW образует герметичную систему, сравнимую с классической MIW (рисунок 1C). При вскрытии в асептических условиях R.MIW позволяет проводить локальные манипуляции с тканями для улучшения оптического доступа, а также позволяет локально вводить вещества, такие как ингибиторы или агонисты путей, вводить различные типы клеток, представляющих интерес, такие как популяции раковых клеток или иммунных клеток, или добавлять красители для маркировки тканей. Крышка может быть открыта в любой момент между сеансами визуализации, не вызывая повреждения подлежащей ткани.
Рисунок 1: Конструкция окна визуализации молочной железы со сменной крышкой. (A) Вид сверху и вид сбоку сменной крышки окна визуализации молочной железы с 10-миллиметровым покровным стеклом, приклеенным к кольцу. (B) Вид сверху и сбоку окна для визуализации молочной железы, которое состоит из наружного кольца и внутреннего кольца с канавкой между ними для закрепления окна в коже мыши с помощью шва из кошелька. Внешнее кольцо имеет небольшую канавку, которая подходит к четырем выступам (плечам) крышки. (C) Карикатура и изображения, демонстрирующие механизмы открытия и закрытия крышки. Наклонные выступы обеспечивают фиксацию крышки внутри оконной рамы. Этот рисунок был изменен из Messal et al. 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол описывает проектирование и процедуру имплантации R.MIW, а также продольную стратегию IVM для повторного посещения тех же молочных протоков и их визуализации с клеточным разрешением. R.MIW позволяет отслеживать деление клеток и морфологические изменения во время различных фаз развития молочной железы в различных флуоресцентных репортерных моделях мышей. Взятый вместе, R.MIW облегчает характеристику клеточной динамики с высоким разрешением во время развития молочной железы, гомеостаза и заболевания.
Protocol
Все процедуры, описанные в настоящем документе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами IACUC и KU Leuven и были выполнены в контексте утвержденной проектной заявки P160/2020. Перед выполнением этого протокола, пожалуйста, ознакомьтесь со стратегией анальгезии с институциональным ветеринаром и проводите пред- и послеоперационную анальгезию в соответствии с институциональными руководящими принципами.
1. Подготовка R.MIW (ориентировочные сроки: 2 ч)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для строительства R.MIW желательно найти местного производителя, который специализируется на работе с твердыми материалами, такими как титан, так как для этого требуются специальные инструменты и опыт. Мастерские, специализирующиеся на проектировании и производстве титановых протезов, обычно имеют оборудование и опыт для производства деталей R.MIW.
- Поместите крышку R.MIW на стерильную поверхность, при этом внешняя сторона крышки обращена вверх (а рычаги крышки наклонены вниз; Рисунок 1А).
- Нанесите цианоакрилатный клейкий клей вокруг всего края крышки и аккуратно поместите 10-миллиметровую круглую стеклянную крышку поверх крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте запасную крышку со стеклянным чехлом в качестве резервной копии во время хирургической процедуры. - Используйте стерильную деревянную палочку, чтобы расположить стеклянную крышку и приложить некоторую силу, чтобы подтолкнуть ее вниз, чтобы обеспечить герметичное уплотнение между стеклянным чехлом и рамой крышки. Убедитесь, что отверстия в рукавах крышки не закрыты стеклом.
- Дезинфицируйте крышки и R.MIW, погружая в 80% этанол в течение не менее 30 минут в закрытую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте крышки дольше 1 ч в 80% этаноле, чтобы избежать растворения цианоакрилатного клеевого клея. - Удалите излишки цианоакрилатного клеевого клея со стеклянной крышки с помощью хлопкового наконечника, пропитанного ацетоном.
- Храните крышки и R.MIW в стерильной среде до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рама и крышки R.MIW могут храниться в стерильной трубке или пакете в течение максимум 1 недели. При возобновлении эксперимента всегда проверяйте, правильно ли прикреплен стеклянный покров к крышке, прежде чем приступать к протоколу.
2. Подготовка к операции (ориентировочные сроки: 15 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры имплантации R.MIW могут использоваться самки мышей (>3,5 недели) любого штамма.
- Поддерживайте стерильность, используя стерильные перчатки, и стерилизуйте все предметы, которые будут контактировать с мышью. Вымойте хирургические инструменты водой с мягким мылом, высушите на воздухе, оберните в алюминиевую фольгу без открытых углов или краев и стерилизуйте с помощью автоклава в течение цикла 20 мин при 120 °C до операции.
- Подготовьте стерильную хирургическую платформу и стерилизуйте поверхности 80% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения стерильности операция может быть выполнена в проточном шкафу. - Включите грелку и накройте коврик стерильной драпировкой. Расположите стерильные инструменты на стерильной драпировке и поместите R.MIW и минимум две стеклянные крышки в стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) в чашку Петри (закройте крышку, чтобы избежать внешнего загрязнения).
- Обезболивают мышь в индукционной камере, используя смесь 3% изофлуран/О2 . Убедитесь, что животное достаточно расслаблено, чтобы им можно было легко манипулировать и переносить на маску носа без каких-либо усилий.
- Переведите мышь из индукционной камеры на анестезирующую маску для носа и уменьшите уровень изофлурана до 1,5% - 2% смеси изофлуран/О2 . Проверьте полную анестезию, выполнив тест на вывод лапы.
- Чтобы выполнить тест на вывод лапы, крепко ущипните лапу животного с помощью ногтей или тупых концевых щипцов. При отсутствии какого-либо мышечного рефлекса считают животное бессознательным и приступают к хирургической подготовке. Выполняйте этот тест перед манипуляциями на животных и регулярно повторяйте его во время анестезирующих и хирургических процедур для подтверждения анестезии.
- Применяют глазную мазь для предотвращения обезвоживания роговицы.
- Побрейте область вокруг4-й молочной железы с помощью лезвия бритвы (рисунок 2А). Используйте4-й сосок в качестве ориентира. Удалите распущенные волоски с помощью липкой ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, крем для депиляции может быть использован для удаления волос. - Продезинфицируйте открытую кожу 80% этанолом или повидон-йодом и поместите мышь в стерильную хирургическую область на спине мордой в анестезирующую маску для носа с использованием смеси 1,5% изофлурана / O2 .
- Закрепите передние и задние конечности мыши с помощью бумажной ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте обезболенную и восстанавливающуюся мышь на грелке как можно больше, во время и после операции. - Используйте предварительно нарезанную стерильную хирургическую драпировку или марлю, чтобы покрыть мышь, оставляя хирургическую область открытой.
3. Имплантация R.MIW (ориентировочное время: 30 мин)
- Проверьте, адекватно ли животное обезболено, выполнив тест на изъятие лап. Аккуратно подтяните кожу с помощью тонких щипцов Graefe и сделайте разрез по диагонали 10-15 мм с помощью небольших пружинных ножниц в коже поверх4-й жировой подушки молочной железы, используя4-й сосок в качестве ориентировочной точки (рисунок 2A). Убедитесь, что вы не порезали и не повредили брюшину или молочную железу.
- Определите интересующую область (ROI) на основе макроскопических особенностей ткани молочной железы, включая расположение лимфатического узла или опухолевого поражения, и постарайтесь сохранить ROI центральным в отношении разреза.
- Отделите кожу от жировой прокладки молочной железы и нижележащих слоев тканей с помощью тупого рассечения до 5-8 мм по всей линии разреза, чтобы создать карман, соответствующий раме R.MIW (рисунок 2BI).
- Возьмите R.MIW с помощью стерильных щипцов и проверьте, достаточно ли велик разрез, чтобы вставить окно. При необходимости немного увеличьте разрез до тех пор, пока R.MIW не впишется.
- Снимите R.MIW и поместите шов из кошелька вокруг разреза с помощью шелкового шва 5-0 (плетеного, нерассасывающегося). Наложите шов на 1-2 мм от края разреза снаружи к внутренней части кожи, начиная с каудального конца разреза.
- Пройдите примерно на 5 мм вверх вдоль разреза и пропустите шовную нить через кожу изнутри наружу. Повторите эту процедуру по краю разреза, тем самым создав круговой шов, состоящий из 5-6 петель (рисунок 2BII). Окончательный выход шовной нити должен располагаться примерно на расстоянии 2-5 мм от первого входа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не поместить шов слишком близко к краю разреза, так как это увеличивает риск разрыва кожи. Размещение шва слишком далеко от края разреза увеличивает риск заражения между избытком кожи и бороздкой R.MIW. - Поместите R.MIW внутрь разреза и используйте щипцы Graefe, чтобы аккуратно поместить кожу в канавку R.MIW. Обязательно оставьте петли шва снаружи.
- Натяните петли шовного шва и затяните шов в канавке R.MIW, осторожно потянув за оба конца шва (рисунок 2BIII). Завяжите хирургическими узлами и отрежьте лишнюю нить.
- Нанесите вазелин на внутренний край R.MIW с помощью зубочистки, избегая при этом подлежащей ткани. Осторожно надавите на оконную раму вниз стерильными щипцами или двумя кончиками пальцев и поместите крышку в раму R.MIW (рисунок 1B). Это позволит избежать объема воздуха между тканью молочной железы и веком R.MIW.
- Поместите кончики тонких щипцов через отверстия в плечах крышки и затяните крышку, скручив крышку по часовой стрелке (примерно на 5°) (рисунок 1C и рисунок 2BIV).
- Если после затягивания крышки R.MIW остается немного воздуха, используйте стерильную инсулиновую иглу для удаления лишнего воздуха. Ввести иглу через кожу в полость между тканью молочной железы и веком и медленно вытащить поршень, тем самым создав вакуум между тканью молочной железы и веком R.MIW.
- Вводят, после операции, анальгезию, такую как бупренорфин (0,1 мг/ кг, разбавленный в стерильном 0,9% NaCl) путем подкожной инъекции. Повторяют подкожную инъекцию с бупренорфином через 8 ч и 16 ч после операции.
- Поместите мышь обратно в клетку, чтобы восстановиться и внимательно следить за ней, пока она полностью не проснется, или перейдите к шагу 4 для немедленного получения изображения.
- На этом послеоперационном этапе внимательно следите за мышами на предмет признаков дискомфорта или осложнений на основе жизненно важных параметров, таких как дыхание, реактивность, поведение, осанка и масса тела. Внимательно следите за кожей, окружающей окно, на наличие признаков воспаления и некроза. Если осложнений не возникнет, R.MIW позволит проводить повторные сеансы IVM в течение нескольких недель после имплантации.
Рисунок 2: Обзор хирургической процедуры и имплантации окна. (А) Диагональный разрез делается возле4-го соска женской мыши, а кожа и подлежащая ткань разъединяются тупым рассечением. (B) Паховый лимфатический узел и форма жировой подушки могут быть использованы для правильной ориентации ткани (I). В кожу вокруг разреза (II) помещается пуговой шов, а после встраивания в оконную раму шов затягивается в паз для закрепления оконной рамы, и закрепляется хирургическими узлами (III). Последним этапом является вставка и запирание крышки в оконную раму (IV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Повторная прижизненная микроскопия через R.MIW
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь повторяющаяся стратегия IVM была оптимизирована для перевернутой многофотонной конфокальной системы, оснащенной моторизованной ступенью и темной климатической камерой при 35,8 °C.
- Обезболивают мышь в индукционной камере, используя смесь 3% изофлуран/О2 . Проверьте потерю сознания, выполнив тест на удаление лапы (описанный в шаге 2.6). Нанесите глазную мазь для предотвращения обезвоживания роговицы во время сеанса визуализации.
- Проверьте состояние рамы и крышки R.MIW, включая стабильность швов или любое потенциальное повреждение крышки. В случае повреждения крышки крышка может быть заменена, как описано в шаге 5.
- Перенесите мышь в предварительно нагретую (37 °C) коробку для обработки изображений (рисунок 3A) и поместите мышь с головой в носовой конус. Блок визуализации состоит из рамки, которая помещается в автоматизированную стадию микроскопа. Рама предназначена для удержания изготовленной на заказ инкрустации с отверстием диаметром R.MIW (рисунок 3A).
- Входное отверстие с носовым конусом соединено с передней частью коробки и прикреплено к изофлурановой испарительной станции с использованием смеси 2%-3% изофлурана/O2. Выходное отверстие соединено с блоком очистки анестетика для обеспечения циркуляции и предотвращения накопления изофлунана в коробке. Коробку для визуализации можно закрыть с помощью прозрачной крышки.
- Расположите мышь на инкрустации таким образом, чтобы R.MIW упал в отверстие инкрустации коробки изображений (рисунок 3A). Нанесите парапленку и бумажную ленту на заднюю часть мыши, чтобы стабилизировать мышь и уменьшить движение тканей из-за дыхания.
- Закройте коробку для визуализации крышкой и вставьте коробку для визуализации в стадию микроскопа.
- Снижать дозу изофлурана постепенно в течение сеанса визуализации для поддержания стабильной, но поверхностной анестезии (обычно между 1,5%-0,8% смеси изофлуран/О2 ).
- Обеспечьте правильное питание во время визуализации, как описано ниже.
- Для сеансов визуализации <3 ч вводите мыше подкожно 200-300 мкл стерильной PBS для гидратации.
- Для сеансов визуализации >3 ч выполните действия, описанные ниже.
- Для долгосрочной визуализации наполните мышь питательными веществами. Для этого используют коммерчески доступную стерильную настольную смесь, содержащую аминокислоты и глюкозу. Поместите гибкую иглу подкожно в шейку мыши и закрепите ее бумажной лентой.
- Прикрепите шприц объемом 10 мл с подготовленной питательной смесью к гибкой силиконовой трубке и проталкивайте питательную смесь до тех пор, пока она не достигнет конца трубки.
- Подключите силиконовую трубку к гибкой игле. Возьмите конец трубки и поместите его через одно из отверстий коробки для визуализации (изнутри наружу, оставив сторону крепления иглы в коробке).
- Вводить 50 мкл инфузионного раствора каждые 30 мин.
- Закрепите коробку визуализации в стадии микроскопа и определите интересующую область с помощью режима эпифлуоресценции микроскопа.
- Примените нужные настройки микроскопа в зависимости от модели мыши (рисунок 3B). Сосудистые структуры, коллагеновые узоры (визуализируемые вторым гармоническим поколением) и другие стабильные анатомические структуры, включая паховый лимфатический узел, могут быть использованы в качестве ориентиров. Получайте изображения с помощью перевернутого многофотонного конфокального микроскопа на глубине 12 бит и 25-кратного водного объектива с использованием Z-шага в диапазоне от 1,0 до 4,0 мкм (общий z-стек в диапазоне от 150 до 800 мкм). Применяйте следующие стандартные настройки: формат 1024 x 1024, скорость сканирования 600 Гц, двунаправленный режим.
- Визуализируйте волокна коллагена I, выполняя генерацию второй гармоники с использованием длины волны возбуждения 860 нм и детектирования при 425-435 нм. Длины волн возбуждения и детектирования для различных флуорофоров указаны в таблице 1.
Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
- Используйте функцию Spiral в режиме навигатора программного обеспечения визуализации для создания большого обзорного tilescan для создания эталонной карты ткани (рисунок 3B). Определите рентабельность инвестиций в спиральном обзоре, определите верхнюю и нижнюю плоскости Z, чтобы определить стек Z. Нажмите Start для получения подробных трехмерных (xyz) или четырехмерных Z-стеков (xyzt) ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего эксперимента по визуализации мышь должна находиться под тщательным наблюдением. Для длительных сеансов визуализации рекомендуется пульсоксиметр и температурный зонд. Дыхание мыши должно быть регулярным и в одинаковом темпе. Если мышь начинает проявлять признаки задыхания, количество изофлурана следует уменьшить. - В конце каждого сеанса визуализации держите мышь на грелке до полного бодрствования. Если мышь проявляет признаки дискомфорта или ограниченной подвижности, держите клетку в течение более длительного времени на грелке и обеспечьте питательные гели вместо обычного чау.
ПРИМЕЧАНИЕ: В перерывах между сеансами визуализации мышь должна тщательно контролироваться на предмет признаков дискомфорта, таких как снижение потребления пищи и воды, учащенное дыхание, снижение движения, тремор, ненормальная осанка тела или необработанная шерсть. В случае явных признаков дискомфорта следуйте институциональным рекомендациям в отношении благополучия животных и прекратите эксперимент, когда будет достигнута гуманная конечная точка. - Повторите шаги 4.1-4.12 для каждого повторного сеанса обработки изображений и используйте обзорное tilescan для отслеживания одной и той же позиции (позиций) в нескольких точках времени (рисунок 3B). Частота визуализации будет зависеть от исследовательского вопроса и сроков изучаемого процесса и обычно варьируется от сеансов визуализации два раза в день до одного раза в неделю.
- В конце желаемого экспериментального периода усыпляют животных с помощью имплантированного R.MIW с использованием глубокой анестезии изофлураном с последующим вывихом шейки матки. При желании рассекните интересующие органы для дальнейшего анализа ex vivo .
- В качестве альтернативы, сохраните животное живым для будущих анализов in vivo . В этом случае снимите шов мешочка, удерживающий R.MIW, разрезав его пружинными ножницами, и аккуратно отсоедините оконное кольцо от кожи мыши тупыми щипцами. Очистите края кожи, которые ранее удерживали окно, и приступайте к простому непрерывному шву (рассасывающийся материал, такой как полигликолевая кислота).
- Как только кожа закроется, завяжите начальную и конечную шовные нити двумя квадратными узлами (4 броска). Чтобы свести к минимуму ишемию тканей, узлы должны быть достаточно свободными, чтобы обеспечить кровоток на краю кожи. Дезинфицируйте рану повидоном-йодом, чтобы предотвратить воспаление и способствовать заживлению кожи.
Рисунок 3: Продольный рабочий процесс IVM. (A) Схематическое изображение типичного многодневного эксперимента IVM. (B) Визуализация опухолевой области в пределах взрослой молочной железы. Перед каждым сеансом визуализации обзорное плиточное сканирование с низким разрешением (верхняя панель) может облегчить идентификацию интересующей области (областей) в течение последующих дней визуализации. Коллагеновый рисунок I (второе поколение гармоник, пурпурный), структура ткани и паттерны дифференциально меченых клеток с флуоресцентными белками (изображенные зеленым, желтым и красным цветом) могут быть использованы для прослеживания одной и той же области ткани. Шкалы представляют собой 1 мм (обзор tilescan) и 100 мкм (нижние панели). (C) Схематическое изображение конструкции репортера R26-Confetti . При тамоксифен-индуцированной cre-рекомбинации конструкт Конфетти стохастически рекомбинирует, что приводит к экспрессии одного из четырех флуорофоров (nGFP, YFP, RFP или mCFP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Открытие и закрытие крышки R.MIW в перерывах между сеансами визуализации
- Поддерживайте стерильность, используя стерильные перчатки, и стерилизуйте все предметы, которые будут контактировать с мышью. Автоклавные хирургические инструменты перед операцией (см. шаг 2 для получения подробной информации).
- Включите грелку и накройте коврик стерильной драпировкой и обезболите мышь в индукционной камере, используя 3% смеси изофлуран/O2 . Проверьте адекватную анестезию, выполнив рефлекторный тест на снятие лап.
- Переведите мышь из индукционной камеры на анестезирующую маску для носа и уменьшите уровень изофлурана до 1,5%-2% смеси изофлуран/О2 .
- Поместите кончики тонких щипцов через отверстия в плечах крышки и ослабьте крышку, скручив крышку против часовой стрелки. При необходимости нанесите на окно предварительно нагретый стерильный PBS (37 °C), чтобы облегчить ослабление крышки.
- Поместите крышку R.MIW в стерильную посуду со стерильным PBS до дальнейшего использования. Очистите крышку крышки полуводной водой, а затем 80% этанолом. Держите крышку в стерильном PBS до дальнейшего использования.
- Предотвратите высыхание открытой ткани, добавив несколько капель стерильного PBS на поверхность ткани.
- Нанесите или введите любое вещество или клетки, представляющие интерес, на открытую ткань, можно использовать максимальный объем 50 мкл. Подождите несколько минут, пока жидкость не впитается тканью. Альтернативно, тканью можно манипулировать или перемещать с помощью стерильных тупых щипцов для оптимизации условий визуализации для конкретных ROI.
- Нанесите вазелин на внутренний край R.MIW, избегая подлежащей ткани. Поместите крышку в раму R.MIW, как описано на этапе 3.9, поместите кончики тонких щипцов через отверстия в плечах крышки и затяните крышку, скручив крышку по часовой стрелке (приблизительно 5°).
Representative Results
Для изучения пролиферативной динамики эпителиальных клеток молочной железы на разных стадиях развития молочной железы был выполнен описанный протокол. Конструкция R.MIW изображена на рисунке 1, а процедура имплантации R.MIW обобщена на рисунке 2. R.MIW хирургически имплантируется между молочной железой и кожей. Шов используется для удержания внутри оконного кольца и предотвращения натягивания мышами швов (рисунок 2). Швы, удерживающие R.MIW, изготовлены из нерассасывающегося шелка, который обладает гипоаллергенными свойствами, мягкой текстурой и прост в обращении. Кольцо R.MIW изготовлено из титана, одного из наиболее биосовместимых материалов, которые не способствуют воспалению или некрозу после имплантации21. Если соблюдаются асептические условия и швы хорошо выполнены, имплантация молочной железы R.MIW представляет низкий риск послеоперационных осложнений. Кроме того, в отличие от имплантации окна абдоминальной визуализации22, имплантация R.MIW не является ограничивающим фактором для выживания мышей, поскольку молочная железа не является жизненно важным органом и позволяет ежедневно визуализировать до предела, указанного в этическом протоколе. Единственным фактором, ограничивающим продолжительность имплантации окна, является гомеостатический оборот кожи, который со временем приведет к выпадению швов через 4 – 6 недель. Поэтому важно регулярно проверять устойчивость швов. При желании швы могут быть сняты и заменены новым швом в асептических условиях (как описано в шагах 3.5 - 3.8) для обеспечения устойчивости окна.
Основной проблемой при использовании многодневного подхода к визуализации является отслеживание рентабельности инвестиций в последовательные дни. С этой целью можно включить быстрое обзорное сканирование перед выбором ROI(s) (рисунок 3B). Несколько тканевых ориентиров могут быть использованы для отслеживания одной и той же области ткани, включая сигнал коллагеновой сети (визуализируется вторым поколением гармоник), структуру ткани, а также локальные паттерны клеток дифференциально или стохастически меченые красителями или флуоресцентными белками (рисунок 3B). В этом репрезентативном примере R.MIW был имплантирован на 4-ю молочную железу MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet самка мыши в начале пальпируемого опухолевого образования. Впоследствии стохастическая рекомбинация индуцировалась инъекцией 1,5 мг тамоксифена, что приводило к рекомбинации конструкции Конфетти в некоторых клетках (рисунок 3C). За рекомбинированными опухолевыми клетками наблюдали в течение 20 дней (рисунок 3B,C). Если визуализация одной и той же области молочной железы в течение последовательных дней исключена, окно может быть открыто в асептической среде (как описано на этапе 5.1) для дальнейшего очищения и перемещения ткани для улучшения видимости и получения изображения (рисунок 3A).
С помощью этого метода за развивающейся молочной железой в период полового созревания наблюдали на одноклеточном уровне. Повторный IVM через R.MIW проводили с использованием R26-CreERT2het; R26-mTmGhet самки мышей в возрасте 4-6 недель, у которых все клетки помечены мембраной tdTomato (рисунок 4A)23. Мышам вводили низкую дозу тамоксифена (0,2 мг/25 г массы тела), что приводило к спорадической рекомбинации конструкции mTmG, вызывая изменение от красного к зеленому в некоторых клетках во всех тканях, включая молочную железу (рисунок 4B). Те же ROI были пересмотрены в течение нескольких дней для визуализации морфологических изменений в молочной железе, включая удлинение протоков и ветвление протоков (рисунок 4C) при клеточном разрешении. Важно отметить, что эта комбинация стохастической маркировки клеток и многодневного IVM также позволяет визуализировать динамические изменения протоковой среды, такие как динамика одиночных клеток в строме, окружающей удлиняющиеся и ветвящиеся протоки (рисунок 4D), а также клеточную динамику в паховом лимфатическом узле (рисунок 4E).
Рисунок 4: Многодневный IVM пубертатного ветвящегося морфогенеза. (A) Пубертат R26-CreERT2; Мышам R26-mTmG в возрасте от 4 до 6 недель вводили низкую дозу тамоксифена, приводящую к cre-опосредованной рекомбинации аллеля R26-mTmG , и их визуализировали на 1, 3 и 5 днях, чтобы проследить динамические изменения в развивающейся молочной железе. (B) Схематическое изображение мышиной конструкции R26-mTmG , которая в нерекомбинированных условиях приводит к повсеместной экспрессии мембранного tdTomato (mT). При cre-опосредованной рекомбинации mT переключается на экспрессию мембранного eGFP (mG). (C) 3D-рендеринг удлиняющегося и ветвящегося молочного протока в течение нескольких дней, визуализированного через R.MIW в R26-CreERT2; R26-mTmG самка мыши в возрасте 6 недель. (D) Одиночные Z-плоские изображения ветвящегося наконечника (верхние панели) и удлиняющейся ветви (нижние панели). mT изображен красным цветом, а mG в голубом, шкала представляет 100 мкм (A и B). Одиночные клетки в строме выделены белыми звездочками. Обратите внимание, что интенсивность сигнала была увеличена вручную, чтобы выделить отдельные клетки в строме, что привело к слегка переэкспонированному появлению эпителиальных клеток молочной железы. (E) Репрезентативные изображения пахового лимфатического узла R26-CreERT2; Женская мышь R26-mTmG , изображенная через R.MIW, показывает обзорное сканирование плитки (левая панель), масштабирование изображений (правые панели) одной Z-плоскости (вверху) и 3D-рендеринг (внизу). Вторая генерация гармоник (коллаген I) показана зеленым цветом, mT красным цветом и mG в голубом. Шкалы представляют собой 500 мкм (обзор tilescan) и 100 мкм (масштабирование изображений). Фигурные панели C и D изменены по сравнению с Messal et al. 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Аналогичным образом, во взрослой молочной железе предлагаемый подход R.MIW позволяет визуализировать одни и те же проточные структуры в течение нескольких дней с бескомпромиссной видимостью. Даже использование менее ярких флуоресцентных репортерных моделей24, таких как модель мыши Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), позволяет визуализировать стабильность протоков и тонкие морфологические изменения при клеточном разрешении (рисунок 5). Обратите внимание, что видимость между 3 и 5 днем значительно улучшилась после репозиционирования тканей (рисунок 5).
Рисунок 5: Многодневная визуализация взрослой молочной железы. 3D-визуализация структуры протоков молочной железы взрослой самки Cdh1-mCFP (голубой, отмечающий экспрессию экадхерин-положительных просветных клеток) мыши в течение нескольких последовательных дней. Коллагеновый паттерн I (второе поколение гармоник, пурпурный) использовался для отслеживания той же рентабельности инвестиций, а сигнал Cdh1-mCFP использовался для маркировки проточных (просветных) клеток. Отметим, что видимость после 3 дня была улучшена за счет открытия крышки R.MIW и репозиционирования ткани. Шкалы представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Для оценки пролиферативной гетерогенности эпителиальных клеток молочной железы во время гормонального цикла на одноклеточном уровне была использована фотоконвертируемая мышь-репортер Kikume Green-Red (KikGR) модели25,26, которая имеет повсеместную экспрессию белка KikGR. KikGR представляет собой яркий флуорофор, который подвергается зелено-красному преобразованию при воздействии фиолетового света, а соотношение красный/зеленый может быть использовано в качестве прокси для пролиферативной активности клетки2 (рисунок 6A, B). Используя подход R.MIW, мы наблюдали за теми же клетками в протоковом дереве взрослой молочной железы в течение нескольких дней и обнаружили ранее непредвиденную пролиферативную гетерогенность по всему протоковому дереву (рисунок 6C). Высокие и низкие пролиферативные клетки были равномерно распределены по различным преобразованным областям (рисунок 6C,D). Поразительно, что на местном уровне соседние клетки показали большие различия в соотношении красного и зеленого (рисунок 6C, D). Количественная оценка соотношения красный/зеленый различных клеток (в качестве прокси для их пролиферативной активности) через 10 дней после фотопреобразования выявила весьма изменчивые скорости разбавления некоторых клеток в пределах одной и той же микросреды протоков (рисунок 6E). Вместе эти данные показывают замечательную локальную пролиферативную гетерогенность внутри взрослой молочной железы и в то же время глобальную равномерную скорость оборота.
Рисунок 6: Продольное IVM пролиферативной гетерогенности во взрослой молочной железе с использованием мышиной модели KikGR. (A) Мыши KikGR были сфотографированы на 0-й день до и после воздействия фиолетового света. Сеансы визуализации повторялись на 2, 6 и 10 день после преобразования. (B) Схематическое изображение гипотетических результатов при фотопреобразовании эпителиальных клеток молочной железы KikGR после пролиферации (левая панель) и отсутствия пролиферации (правая панель) в зависимости от времени. (C) Одна и та же область молочной железы была сфотографирована с помощью R.MIW в течение 10 дней. Меньшие области были преобразованы на 0-й день и показывают аналогичную скорость разбавления красного сигнала Кикумэ с течением времени, что указывает на равную скорость оборота по всему эпителию. (D) Увеличенные изображения (одиночные Z-плоскости) указанных областей на панели C показывают пролиферативную гетерогенность на клеточном уровне через 6 и 10 дней после фотопреобразования. Шкалы представляют собой 100 мкм (панель C) и 10 мкм (панель D). (E) Количественная оценка соотношения красного/зеленого цветов случайно выбранных ячеек (n = 48 ячеек) в трех фотопреобразованных областях. Высокое соотношение красного/зеленого цветов свидетельствует о низкой скорости разбавления и низкой пролиферативной активности, тогда как низкое соотношение красный/зеленый свидетельствует о высокой скорости разбавления и пролиферации. Фигурные панели C-E были изменены по сравнению с Messal et al. 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
R.MIW позволяет проводить продольную визуализацию здоровой и больной молочной железы в ее родной и минимально нарушенной среде и позволяет повторно визуализировать молочную железу на различных стадиях развития. Конструкция R.MIW позволяет открывать окно в любой момент эксперимента. Долгосрочный визуальный доступ к интересующей ткани может быть затруднен, например, накоплением клеточного мусора на покровном листе. В таких случаях R.MIW может быть открыт до или сразу после сеанса визуализации, чтобы обеспечить очистку всей видимой области тканей и крышки. Съемная крышка также позволяет манипулировать тканью, а также локально применять вещества, такие как специфические ингибиторы и методы лечения, маркировка красителей или конкретные типы клеток, представляющие интерес.
Этот метод преодолевает ограничение ранее описанных процедур 4,7,8,13 молочной железы, которые ограничены одним сеансом визуализации, и может визуализировать такие процессы, как ветвящийся морфогенез (рисунок 5), гомеостатический оборот тканей (рисунок 6) или рост опухоли на клеточном уровне (рисунок 3B). ). Тем не менее, в то же время R.MIW позволяет локально манипулировать тканью в перерывах между сеансами визуализации, что является большим преимуществом R.MIW по сравнению с ранее опубликованным MIW 3,18 и всеми другими окнами визуализации20,22. При открытии R.MIW важно постоянно поддерживать асептические условия, чтобы предотвратить любой источник инфекции. Возможность открытия R.MIW в асептической среде позволяет оптимизировать условия визуализации перед каждым сеансом визуализации, что значительно улучшает долгосрочный визуальный доступ к интересующей ткани. В частности, в молочной железе, которая встроена в богатую адипоцитами строму, это имеет большое значение. Кроме того, заменяемая крышка может уникально обеспечить локальное введение терапевтических средств, различных типов клеток, красителей для маркировки, микродиссекции с визуальным контролем или любых других локальных манипуляций с тканью без необходимости прекращения эксперимента IVM. Например, для изучения инициации опухоли конкретные популяции раковых клеток могут быть введены непосредственно в протоковое дерево или строму в определенной временной точке IVM и точном расположении молочной железы, если эта рентабельность инвестиций доступна через кольцо R.MIW. Для изучения прогрессирования опухоли конкретные популяции раковых клеток (в определенном месте, в определенной микросреде или с определенным поведением) могут быть фотомаркированы во время сеанса IVM и впоследствии микрорассекнуты с использованием флуоресцентного рассеченного микроскопа после открытия R.MIW. Изолированные клетки могут быть дополнительно обработаны для последующего анализа, такого как (одноклеточное) секвенирование мРНК. Используя этот подход, можно связать поведение клеток in vivo с профилями молекулярной экспрессии. Преимущество местного введения препарата, обеспечиваемое R.MIW, позволяет визуализировать ткань до и непосредственно после лечения. Интервал, необходимый для извлечения мыши из коробки визуализации и последующего выполнения местного введения препарата после вскрытия крышки R.MIW, может быть выполнен за считанные минуты, что позволяет мгновенно захватывать фазу быстродействующих препаратов.
Мы показываем, что IVM молочной железы через R.MIW совместим со многими различными моделями флуоресцентных репортерных мышей. Богатая жировой среду сложна для изображения, и поэтому рекомендуется использование ярких флуорофоров. Однако, как показано здесь, еще менее яркие флуорофоры, такие как mCFP, могут быть визуализированы через R.MIW в оптимальных условиях визуализации. Жировая подушка неизбежно будет препятствовать визуализации более глубоких структур протоков и ограничивать визуализацию более поверхностными протоками. Обзорное изображение с низким разрешением в начале каждого эксперимента IVM поможет определить интересующие проточные структуры, которые являются достаточно поверхностными для визуализации с высоким разрешением. Локальные манипуляции с тканями, удаление соединительной ткани или репозиционирование жировой ткани после вскрытия R.MIW могут оптимизировать IVM для конкретных ROI, которые накладываются жировой тканью. Это важное преимущество перед всеми предыдущими оконными конструкциями, которые не позволяют выполнять эти манипуляции и потребуют полного снятия самого окна. В частности, для визуализации пахового лимфатического узла рекомендуется аккуратно удалить вышележащую жировую ткань, что уменьшает рассеяние света и позволяет получать изображения с высоким разрешением. При манипулировании тканью всегда сохраняйте асептические состояния и предотвращайте кровотечение или серьезное повреждение ткани, так как они могут повлиять на процессы, изучаемые во время эксперимента IVM.
R.MIW изготовлен из титана, материала, который обычно используется в клинической практике для замены твердых тканей, таких как суставы или костные пластины. Титан имеет ряд преимуществ перед стальными окнами, в том числе его легкий и инертный характер21. Недавно несколько других материалов были использованы для создания новых типов окон визуализации, включая гибкое кремниевое окно20. В отличие от R.MIW, гибкое окно не требует каких-либо швов для имплантации и подходит практически для любого анатомического положения, особенно в случае мягких и хрупких тканей. Кремниевые окна оказывают минимальное влияние на подвижность животных из-за их легкой и деформируемой природы и, возможно, больше подходят для экспериментов, изучающих быстрое расширение и рост тканей20. Еще одним преимуществом перед титановой версией является то, что кремниевые окна совместимы с другими методами визуализации, включая магнитно-резонансную томографию20,27. Тем не менее, важно иметь в виду, что цели оптимизированы для стеклянных крышек толщиной 0,17 мм. Кроме того, ткань молочной железы восприимчива к дыхательным движениям, которые трудно ограничить с помощью гибкого окна, особенно при использовании инвертированного микроскопа. Дыхательные артефакты сведены к минимуму конструкцией R.MIW и фиксацией R.MIW в инкрустации коробки изображений. В результате изображения, полученные с использованием предлагаемой установки R.MIW, не искажаются из-за дыхательных артефактов. Однако могут возникать незначительные дрейфы в локализации тканей, которые обычно являются постепенными и могут быть исправлены с помощью программного обеспечения28 для коррекции движения после приобретения. С увеличением набора инструментов технологий IVM 2,20 конкретные требования к каждому эксперименту в конечном итоге определят лучший способ визуализации in vivo интересующей ткани. Различные оконные конструкции имеют разные преимущества и недостатки, и в зависимости от вопроса исследования, доступной настройки микроскопии, требуемого пространственного и временного разрешения и общего временного интервала изучаемого процесса необходимо определить оптимальный подход.
Таким образом, R.MIW облегчает характеристику клеточной динамики с высоким разрешением во время развития молочных желез, гомеостаза и заболеваний в течение от нескольких дней до недель.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Flanders (грант PhD фундаментальных исследований 11L7222N для M.C.), Фондом Берингера Ингельхайма (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), постдокторской стипендией EMBO (грант ALTF 1035-2020 для C.L.G.J.S.) и премией доктора Йозефа Штайнера (для J.v.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
- Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
- Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
- Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
- Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
- Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
- Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
- Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
- Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).
