Summary
脱髓鞘发生在多种中枢神经系统疾病中。可靠的 体内 药物递送技术对于髓鞘重洗药物检测是必要的。该协议描述了一种基于渗透泵的方法，该方法允许将药物长期直接输送到脑实质中并提高药物的生物利用度，在髓鞘再生研究中具有广泛的应用。
Abstract
脱髓鞘不仅在多发性硬化症（MS）中被鉴定出来，而且在其他中枢神经系统疾病中，如阿尔茨海默病和自闭症。由于有证据表明髓鞘再生可以有效地改善疾病症状，因此人们越来越关注药物开发以促进髓鞘再生过程。因此，需要一种区域可选且结果可靠的药物递送技术来测试这些药物 在体内的效率和特异性。该协议在溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘小鼠模型中引入了渗透泵植入物作为新的药物递送方法。渗透泵是一种小型植入式装置，可以绕过血脑屏障（BBB），并将药物稳定地直接输送到小鼠大脑的特定区域。它还可以有效地提高半衰期短的肽和蛋白质等药物的生物利用度。因此，该方法对中枢神经系统髓鞘再生研究领域具有重要价值。
Introduction
渗透泵是一种小型的植入式溶液释放装置。当皮下或腹腔植入时，它可用于全身输送。渗透泵的表面是半透膜，其内侧是透水层。渗透泵的工作原理是利用渗透层和泵植入的组织环境之间的渗透压差。渗透层的高渗透压使组织中的水通过泵表面的半透膜流入渗透层。渗透层膨胀并压缩泵内的柔性储层，从而以一定的速度将溶液从柔性储层中移出，持续时间很长1。该泵有三种不同的储液槽体积，分别为 100 μL、200 μL 和 2 mL，其输送速率从 0.11 μL/h 到 10 μL/h 不等。根据所选的泵类型，该设备可以运行 1 天到 6 周2。在该方案中，使用转移速率为0.25μL / h的100μL渗透泵，可运行14天。
早在20世纪70年代，渗透泵就被用于神经科学研究3，4。例如，Wei等人在药物成瘾的研究中采用渗透泵方法将阿片类肽注射到心室3中。经过不断改进，渗透泵现已用于研究数千种药物的受控递送，包括肽，生长因子，成瘾药物，激素，类固醇，抗体等。此外，附加了特殊的导管（脑输液试剂盒），可用于对特定组织或器官进行靶向输注，包括脊髓，脑，脾和肝脏5，6，7。
在髓鞘再生的研究中，许多药物已被证明 可以促进髓鞘在体外再生，但其中大多数 在体内没有达到显着效果，可能是由于缺乏适当的给药方法。传统的给药方法，如腹膜内注射，皮下注射和胃内给药在药物的生物利用度方面存在局限性。此外，一些药物的血脑屏障通透性差，这破坏了它们获得脑实质的机会。总之，这些限制需要一种新颖的高效交付方法。与脑输液试剂盒结合使用，渗透泵可以绕过血脑屏障，将药物直接输送到胼胝体，有效提高了药物的生物利用度，特别是对于一些半衰期较短的多肽和蛋白质药物。因此，渗透泵作为一种新型药物输送技术，对中枢神经系统髓鞘再生研究领域具有重要价值。下面将详细介绍该技术的应用。
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Protocol
所有动物程序均根据第三军医大学动物福利和伦理委员会批准的机构指南和协议进行。
1. 溶血卵磷脂诱导脱髓鞘小鼠模型的建立
- 用无菌PBS制备1%赖索卵磷脂（也称为L-α-溶血磷脂酰胆碱）溶液。
- 通过高压灭菌器对剪刀、镊子、弯曲止血器和其他手术器械进行灭菌。对手术区域进行消毒并铺设无菌床单。用于手术的所有材料和试剂均应无菌制备。在整个手术过程中保持手术区域无菌是很重要的。
- 麻醉产后第56天（P56）C57BL6小鼠，如下所示。
- 将小鼠置于小动物麻醉机的异氟醚室中。将O2 流量调节至300-500 mL / min，将异氟醚调节至3%-4%。充分麻醉后，当鼠标变得不动且呼吸缓慢而稳定时，将鼠标转移到带有加热垫的立体定位装置中。
- 将腔室的气体输出切换到麻醉面罩，并将异氟醚调节至1%-1.5%，以保持小鼠处于麻醉状态。等到小鼠完全麻醉，腹腔注射酮洛芬（3-5mg / kg）以缓解疼痛。手术前，捏住小鼠的脚趾并检查其反应以确认麻醉成功8。
- 当鼠标被麻醉时，它不能调节体温。因此，在手术过程中监测和调节小鼠的体温。为了在麻醉下保持小鼠的眼球湿润，用红霉素眼膏覆盖眼球表面。
- 使用齿条和耳杆将鼠标头固定在立体定位器中。（图 1A）。
- 使用剃须刀从头顶上去除毛发。用三个周期的倍他定和75%乙醇消毒头部皮肤。出于道德考虑，请覆盖除手术部位以外的动物身体。使用手术刀，从颈部底部到眼睛之间对皮肤进行1厘米长的中矢状面切口，以暴露颅骨（图1B）。
- 用含有30%过氧化氢的无菌棉签轻轻擦拭颅骨表面，以观察颅骨缝合线（图1C）。调整牙条和耳杆的高度，将λ点和前凸点放置在相同的高度（即，当针尖接触这些点时具有相同的z轴坐标），使矢状缝合线水平。
- 轻轻地将微升注射器针头（10μL，33 G）的尖端放在前凸点，并将x，y和z坐标重置为0（图1D）。根据数字读数的提示，将注射器移动到注射部位（x：1.04;y：1.0，即中线外侧1.04 mm，后部到前凸点1.0mm）（图1E）。
- 在注射部位的颅骨上缓慢钻一个小毛刺孔，而不用1 mL注射器针头（26 G，0.45 mm）穿透硬脑膜（图1F）。通过孔将微升注射器针头缓慢插入脑组织，直到达到一定深度（对于大多数P56小鼠，z = -1.62mm）（图1G）。
注意：经验上，-1.62mm的插入深度允许针尖到达大多数P56小鼠胼胝体的中间，以便溶血卵磷脂可以直接输送到胼胝体中以诱导脱髓鞘。 - 以0.3μL / min的速度注入1.5μL的1%赖索铁脂。注射后，等待5分钟，然后缓慢拉出微升注射器，以防止液体沿注射针路径泄漏。
- 用5-0个手术缝合线缝合皮肤（图1H）。
- 将鼠标放在加热垫上，以避免体温下降。每24小时皮下注射5mg / kg卡洛芬以缓解疼痛。每天将红霉素软膏涂抹在切口上，以确保伤口正常愈合。将经过手术的小鼠单独放在笼子里，并用湿润的食物喂食，直到完全恢复。手术后每天监控鼠标。
图1：建立溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘小鼠模型。 （A）将小鼠固定在立体定位装置中。（B）打开1厘米的矢状中位切口，露出颅骨。（C）可视化颅骨缝合线。（D） 将布雷格玛点上的 x、y 和 z 坐标重置为 0。（E）将注射器移动到注射部位。（F）在注射部位的颅骨上钻一个洞。（G）将针头缓慢插入脑组织并注射溶卵磷脂。（H）缝合皮肤。 请点击此处查看此图的大图。
2. 渗透泵的制备
注：泵的关键部件如图 2A所示。
- 确定脑输液套管插入大脑的深度。确保所使用的脑输液套管的针头长3毫米，每个深度调整垫片为0.5毫米。为了达到1.5mm的注射深度（靠近胼胝体），用组织粘合剂将三个深度调节垫片连接到脑输液套管的针头上（图2B，C）。
- 要填充渗透泵，请将泵包随附的注射器针头连接到1 mL注射器上并吸出药物。直立握住泵，将注射器插入泵顶部的开口，然后缓慢注射药物，小心不要产生气泡9 （见 图2D）。当液体从开口流出时，慢慢拉出注射器。
- 用剪刀或钳子从流量调节器上取下白色法兰，小心不要弯曲或压碎流量减速器。然后，将流量减速器插入泵中（图2E）。要确定渗透泵中是否存在气泡，请在填充前后分别称量渗透泵。
- 根据动物的大小将导管修剪到一定长度（P56小鼠的导管为20-25mm，重约25g）。将导管连接到脑输液套管上。
- 使用注射器在不引入空气的情况下用药物填充导管（图2F）。
- 将导管连接到流量慢化器。连接后，确保导管覆盖暴露的流量慢化器约4mm（图2G）。
- 为确保渗透泵在植入后可以立即工作，将填充的泵浸入无菌的0.9%盐水或PBS中，在37°C下至少4至6小时（最好延长至过夜），用与组织环境具有相同渗透压的溶液预润泵表面上的半透膜（图2H）。
- 装入泵中的所有溶液都应是无菌的。ALZET 泵在暴露于 60Co 的灭菌剂量后以无菌方式供应。但是，如果发生外部污染，可以通过用异丙醇（70%的水）擦拭泵的表面来清洁泵的表面。
图2：渗透泵的制备， （A）渗透泵的关键部件。（乙、丙）将深度调节垫片连接到脑输液套管的针头上。（D）使用1 mL注射器填充渗透泵。（E）将流量减速器插入泵中。（F）使用注射器填充导管。（G）将导管连接到流量慢化器。（H）将填充的泵浸入无菌的0.9%盐水或37°C的PBS中 。请点击此处查看此图的大图。
3. 渗透泵的植入
- 在建立胼胝体脱髓鞘模型后等待3天。打开小动物麻醉系统。对剪刀、镊子和止血钳进行消毒，并将其浸泡在75%的酒精溶液中。将无菌片放在手术区域。
- 再次麻醉并固定在立体定位器上。用眼药膏覆盖眼球表面，以防止干燥。
- 用75%的酒精对原始伤口进行消毒。打开先前缝合的手术切口（图3A）并将切口扩展到肩胛骨（图3B）。
- 用肩胛骨处的止血钳或镊子将皮肤与皮下结缔组织分开以打开腔（图3C）。将渗透泵放入腔中（图3D，E）。
- 用棉签轻轻擦拭并露出建立脱髓鞘模型时产生的头骨表面上的针孔（见步骤1.8）。将脑输液套管垂直插入该针孔，并用组织粘合剂将其快速固定在颅骨上（图3F）。
- 用一把剪刀取下脑输液套管上方的可拆卸标签（图3G，H）。或者，在插入插管之前先取下卡舌，以避免在此过程中晃动。
- 缝合切口或用组织粘合剂将其固定（图3I）。
- 手术后，将鼠标放在加热垫上以避免体温下降。每24小时皮下注射5mg / kg卡洛芬以缓解疼痛。每天将红霉素软膏涂抹在切口上，以确保伤口正常愈合。将动物单独放在笼子里，用湿润的食物喂养，直到完全恢复。每天监测小鼠，检查脑输液套管是否牢固附着。
- 手术后11天通过腹膜内注射150-200mg / kg戊巴比妥钠，然后用4%甲醛经心灌注来安乐死小鼠。
- 为了验证溶液是否正常输送，在脑解剖之前，小心地取出渗透泵并测量泵储液器中的残留量。
- 为了测量残余体积，取出脑输液套管，将1mL注射器连接到导管上，然后吸出剩余的溶液以确定其体积。将实际残余体积与理论残余体积（初始体积 - 平均泵送速率*输注时间）进行比较。
注意：残余容量过多表明输注不成功，这可能是由于导管阻塞或泵故障。
- 为了测量残余体积，取出脑输液套管，将1mL注射器连接到导管上，然后吸出剩余的溶液以确定其体积。将实际残余体积与理论残余体积（初始体积 - 平均泵送速率*输注时间）进行比较。
图3：渗透泵的植入。 （A）打开手术切口。（B）将切口扩大到肩胛骨。（C）将皮肤与皮下结缔组织分开，形成蛀牙。（D，E）将渗透泵放入腔中。（F）将脑输液套管插入颅骨表面的针孔中，将其牢固地固定在颅骨上。（G，H）从套管中取出可移动选项卡。（一）缝合切口。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
为了验证渗透泵在髓鞘再生研究中的作用，在P56小鼠中创建了溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘模型，然后植入含有UM206（1mg在1.5mL 0.9%盐水中）的渗透泵，这是一种半衰期短且BBB通透性差的肽，最近报道可促进髓鞘再生10.使用0.9%盐水作为对照。模型建立后14天，小鼠经心灌注4%甲醛分离大脑进行切片，然后 进行原位 杂交和透射电子显微镜检查，以评估髓鞘再生水平。
DAPI染色揭示了白质正上方的脑组织中的针孔，表明渗透泵的脑输液套管成功植入（图4A）。在 原位 杂交实验中，使用成熟的少突胶质细胞标志物MAG探针标记新分化的少突胶质细胞，如先前研究10，11，12所示。结果显示，UM206治疗在脱髓鞘区域比对照组产生更多的MAG阳性细胞（图4B）。脱髓鞘区域的透射电子显微镜检查也显示，与对照组相比，UM206治疗组的髓鞘轴突数量增加（图4C），提示UM206诱导更高水平的髓鞘化。这些结果表明，在髓鞘再生研究中，渗透泵可以有效地将药物输送到胼胝体。
图4：代表性结果。（A）DAPI染色切片的代表性图像，显示脑组织中的针孔。比例尺：1，000 μm.（B）代表性图像显示MAG在脱髓鞘区域的原位杂交，如DAPI染色所示。UM206治疗增加了MAG标记的少突胶质细胞的数量。比例尺：100 μm.（C）脱髓鞘区域的代表性透射电子显微镜图像。UM206治疗增加了髓鞘轴突的数量。比例尺：10 μm。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议将渗透泵描述为髓鞘再生研究的一种新型药物递送技术，该技术可以将药物直接输送到治疗部位，并允许长时间的持续药物递送，在整个实验时间内在中枢神经系统的微环境中产生稳定的药物浓度。与其他药物递送方法相比，渗透泵更有利于维持脱髓鞘病变13中的药物浓度。例如，对于某些神经营养因子，由于病变部位的药物浓度低，全身用药不能达到任何效果。但如果剂量增加，副作用会更显著14.在这种情况下，通过渗透泵施用到特定部位可以有效地减少外周副作用15.此外，许多髓鞘再生相关药物具有较差的血脑屏障（BBB）通透性，或者由于对蛋白水解降解的易感性而显示出较短的 体内 半衰期。这些问题可以通过渗透泵很好地解决。
然而，渗透泵方法并非没有警告和局限性。首先，作为一种侵入性药物递送系统，它不可避免地会在脑输液插管插入部位引起脑组织损伤和神经炎症，这可能会掩盖药物的作用。因此，必须建立适当的纯溶剂对照组。其次，有些药物需要二甲基亚砜（DMSO）、N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）等溶剂溶解，但这些溶剂与储液器材料不相容，可导致泵的明显故障。例如，高浓度的二甲基亚砜（DMSO）和PEG400已被证明会对泵的释放产生不利影响，并且可能不适合在渗透泵中使用16，17，18。第三，在37°C下不稳定的药物可能不适合使用渗透泵长期输注。如果计划应用渗透泵，所有这些问题都值得注意。
在实验过程中，该协议中的几个步骤需要特别注意。对于渗透泵的正常运行，研究人员必须确保渗透泵组装正确，并且没有气泡引入泵中，否则将大大破坏输液效率。此外，导管闭塞或渗透泵故障19可能导致输液失败，这可以通过实验后测量泵储液器中的残余体积来确定。对于渗透泵在脑尺寸较小的年轻小鼠中的应用，建议进行试验实验以确保合适的插入深度。此外，脑输液套管必须牢固地固定在颅骨上，以尽量减少输液过程中的运动。
目前，许多 体外 研究都发现了多种可以促进髓鞘再生的药物，但由于BBB通透性差，半衰期短等问题，这些药物很难 在体内成功验证。因此，渗透泵对中枢神经系统髓鞘再生研究领域具有重要价值，特别是与那些半衰期短、BBB通透性差、外周副作用明显的药物有关。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（NSFC 32070964，31871045）和深圳市基础研究基金会（JCYJ20210324121214039）向Y.S.的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
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