Summary
يحدث إزالة الميالين في العديد من أمراض الجهاز العصبي المركزي. تعد تقنية توصيل الدواء الموثوقة في الجسم الحي ضرورية لإعادة الميالين لاختبار المخدرات. يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على المضخة الأسموزية تسمح بتوصيل الدواء على المدى الطويل مباشرة إلى حمة الدماغ وتحسن التوافر البيولوجي للدواء ، مع تطبيق واسع النطاق في أبحاث إعادة الميالين.
Abstract
تم تحديد إزالة الميالين ليس فقط في التصلب المتعدد (MS) ، ولكن أيضا في أمراض الجهاز العصبي المركزي الأخرى مثل مرض الزهايمر والتوحد. كما تشير الأدلة إلى أن إعادة الميالين يمكن أن تخفف بشكل فعال من أعراض المرض ، هناك تركيز متزايد على تطوير الأدوية لتعزيز عملية تجديد المايلين. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنية توصيل الأدوية التي يمكن اختيارها في المنطقة والتي يمكن الاعتماد عليها من حيث النتائج لاختبار كفاءة وخصوصية هذه الأدوية في الجسم الحي. يقدم هذا البروتوكول غرسة المضخة الأسموزية كنهج جديد لتوصيل الدواء في نموذج فأر إزالة الميالين الناجم عن الليسوليسيثين. المضخة الأسموزية هي جهاز صغير قابل للزرع يمكنه تجاوز الحاجز الدموي الدماغي (BBB) وتوصيل الأدوية بشكل مطرد ومباشر إلى مناطق محددة من دماغ الفأر. كما يمكن أن يحسن بشكل فعال التوافر البيولوجي للأدوية مثل الببتيدات والبروتينات ذات عمر النصف القصير. لذلك ، هذه الطريقة ذات قيمة كبيرة في مجال أبحاث تجديد المايلين في الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
المضخة الأسموزية هي جهاز صغير قابل للزرع لإطلاق المحلول. يمكن استخدامه للتوصيل الجهازي عند زرعه تحت الجلد أو في تجويف البطن. سطح المضخة الأسموزية عبارة عن غشاء شبه نافذ ، وجانبه الداخلي عبارة عن طبقة قابلة للنفاذ. تعمل المضخة الأسموزية باستخدام فرق الضغط الأسموزي بين الطبقة التناضحية وبيئة الأنسجة حيث يتم زرع المضخة. تجعل الأسمولية العالية للطبقة الأسموزية الماء الموجود في الأنسجة يتدفق إلى الطبقة الأسموزية من خلال الغشاء شبه القابل للنفاذ على سطح المضخة. تقوم الطبقة الأسموزية بتوسيع وضغط الخزان المرن داخل المضخة ، وبالتالي إزاحة المحلول من الخزان المرن بمعدل معين لمدة طويلة1. تحتوي المضخة على ثلاثة أحجام مختلفة من الخزانات ، 100 ميكرولتر ، 200 ميكرولتر ، و 2 مل ، مع معدلات تسليمها التي تتراوح من 0.11 ميكرولتر / ساعة إلى 10 ميكرولتر / ساعة. اعتمادا على نوع المضخة المحدد ، يمكن أن يعمل الجهاز من 1 يوم إلى 6 أسابيع2. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مضخة تناضحية 100 ميكرولتر بمعدل نقل 0.25 ميكرولتر / ساعة يمكن أن تعمل لمدة 14 يوما.
مرة أخرى في 1970s ، تم استخدام المضخة الاسموزي في أبحاث علم الأعصاب 3,4. على سبيل المثال ، اعتمد Wei et al. نهج المضخة الأسموزية لحقن الببتيدات الأفيونية في البطين في دراسة عن إدمان المخدرات3. بعد التحسين المستمر ، تم استخدام المضخة الأسموزية الآن في دراسة التسليم المراقب لآلاف الأدوية ، بما في ذلك الببتيدات وعوامل النمو والأدوية المسببة للإدمان والهرمونات والمنشطات والأجسام المضادة وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، مع القسطرة الخاصة (مجموعات تسريب الدماغ) المرفقة ، يمكن استخدامها للتسريب المستهدف إلى أنسجة أو أعضاء معينة ، بما في ذلك الحبل الشوكي والدماغ والطحال والكبد5،6،7.
في دراسة إعادة الميالين ، ثبت أن العديد من الأدوية تعزز تجديد المايلين في المختبر ، لكن معظمها لم يحقق تأثيرات كبيرة في الجسم الحي ، ربما بسبب عدم وجود طريقة إدارة مناسبة. طرق الإدارة التقليدية مثل الحقن داخل الصفاق ، والحقن تحت الجلد ، والإدارة داخل المعدة لها قيود في التوافر البيولوجي للأدوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الأدوية لها نفاذية ضعيفة للحاجز الدموي الدماغي ، مما يقوض وصولها إلى حمة الدماغ. وتستدعي هذه القيود مجتمعة طريقة جديدة فعالة للإيصال. بالاقتران مع مجموعات ضخ الدماغ ، يمكن للمضخات التناضحية تجاوز حاجز الدم في الدماغ وتوصيل الأدوية مباشرة إلى الجسم الثفني ، مما يحسن بشكل فعال التوافر البيولوجي للأدوية ، خاصة بالنسبة لبعض أدوية الببتيد والبروتين ذات عمر النصف القصير. لذلك ، فإن المضخة الأسموزية كتقنية جديدة لتوصيل الدواء لها قيمة كبيرة في مجال أبحاث تجديد المايلين في الجهاز العصبي المركزي. سيتم تقديم تطبيق هذه التقنية بالتفصيل أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات بموجب المبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة.
1. إنشاء نموذج فأر إزالة الميالين الناجم عن الليسوليسيثين
- تحضير محلول 1٪ lysolecithin (وتسمى أيضا L-α-Lysophosphatidylcholine) مع PBS معقمة.
- تعقيم المقص والملقط والمرقئ المنحني والأدوات الجراحية الأخرى عن طريق تعقيم الأوتوكلاف. تعقيم المنطقة الجراحية ووضع أوراق معقمة. يجب تحضير جميع المواد والكواشف المستخدمة في الجراحة بشكل معقم. من المهم الحفاظ على المنطقة الجراحية معقمة طوال العملية.
- تخدير يوم ما بعد الولادة 56 (P56) C57BL6 الماوس على النحو التالي.
- ضع الماوس في غرفة الأيزوفلوران في آلة تخدير الحيوانات الصغيرة. اضبط تدفق O2 على 300-500 مل / دقيقة و isoflurane إلى 3٪ -4٪. بعد التخدير الكافي ، عندما يصبح الماوس غير متحرك مع نفس بطيء ومستقر ، انقل الماوس إلى جهاز التاكسي المجسمة باستخدام وسادة تدفئة.
- قم بتبديل خرج الغاز من الغرفة إلى قناع التخدير واضبط الأيزوفلوران على 1٪ - 1.5٪ للحفاظ على الماوس في حالة التخدير. انتظر حتى يتم تخدير الماوس بالكامل ، وحقن الكيتوبروفين (3 - 5 ملغ / كغ) داخل الصفاق لتخفيف الألم. قبل العملية ، قرصة أصابع القدم من الماوس والتحقق من رد فعله لتأكيد التخدير الناجح8.
- عندما يتم تخدير الفأر ، لا يمكنه تنظيم درجة حرارة جسمه. لذلك ، راقب ونظم درجة حرارة جسم الفأر أثناء الجراحة. للحفاظ على رطوبة مقل عيون الفأر أثناء وجوده تحت التخدير ، قم بتغطية سطح مقل العيون بمرهم العين بالإريثروميسين.
- قم بتأمين رأس الماوس في الجهاز المجسمة باستخدام شريط الأسنان وقضبان الأذن. (الشكل 1 ألف).
- استخدم ماكينة حلاقة لإزالة الشعر من أعلى الرأس. تعقيم جلد الرأس بثلاث دورات من البيتادين والإيثانول بنسبة 75٪. بالنسبة للمخاوف الأخلاقية ، قم بتغطية جسم الحيوان باستثناء موقع الجراحة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق منتصف السهمي بطول 1 سم من الجلد من قاعدة الرقبة إلى ما بين العينين لكشف الجمجمة (الشكل 1B).
- امسح سطح الجمجمة بلطف باستخدام قطعة قطن معقمة تحتوي على 30٪ من بيروكسيد الهيدروجين لتصور خيوط الجمجمة (الشكل 1C). اضبط ارتفاع شريط الأسنان وقضبان الأذن لوضع نقطة لامدا ونقطة بريجما على نفس الارتفاع (أي بنفس إحداثيات المحور z عندما يلمس طرف الإبرة النقاط) ، بحيث يكون الخيط السهمي أفقيا.
- ضع بلطف طرف إبرة حقنة الميكرولتر (10 ميكرولتر ، 33 جم) عند نقطة البريجما وأعد تعيين إحداثيات x و y و z إلى 0 (الشكل 1D). انقل المحقنة إلى موقع الحقن (x: 1.04؛ y: 1.0، أي 1.04 مم أفقيا إلى خط الوسط و1.0 مم خلفيا إلى نقطة bregma) وفقا لموجه القراءة الرقمية (الشكل 1E).
- قم بحفر ثقب صغير ببطء عبر الجمجمة في موقع الحقن دون اختراق الجافية باستخدام إبرة حقنة 1 مل (26 جم ، 0.45 مم) (الشكل 1F). أدخل إبرة حقنة الميكرولتر ببطء في أنسجة المخ من خلال الثقب حتى يتم الوصول إلى عمق معين (z = -1.62 مم لمعظم الفئران P56) (الشكل 1G).
ملاحظة: من الناحية التجريبية، يسمح عمق الإدخال البالغ -1.62 مم لطرف الإبرة بالوصول إلى منتصف الجسم الثفني لمعظم الفئران P56 بحيث يمكن توصيل الليسوليسيثين مباشرة إلى الجسم الثفني للحث على إزالة الميالين. - حقن 1.5 ميكرولتر من 1٪ ليسوليسيثين بسرعة 0.3 ميكرولتر / دقيقة. بعد الحقن ، انتظر لمدة 5 دقائق قبل سحب حقنة الميكرولتر ببطء لمنع تسرب السائل على طول مسار إبرة الحقن.
- غرز الجلد مع 5-0 خيوط جراحية (الشكل 1H).
- ضع الماوس على وسادة التدفئة لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. إعطاء حقن تحت الجلد من 5 ملغ / كغ كاربروفين كل 24 ساعة لتخفيف الألم. ضع مرهم الاريثروميسين على الشق كل يوم لضمان شفاء الجرح بشكل صحيح. ضع الفأر الذي خضع لعملية جراحية في قفص بمفرده وأطعمه بالطعام الرطب حتى يتعافى تماما. راقب الماوس يوميا بعد العملية.
الشكل 1: إنشاء نموذج فأر إزالة الميالين الناجم عن الليسوليسيثين . (أ) تأمين الماوس في الجهاز المجسم. (ب) افتح شقا منتصف السهمي طوله 1 سم لكشف الجمجمة. (ج) تصور خيوط الجمجمة. (D) إعادة تعيين إحداثيات x و y و z إلى 0 على نقطة Bregma. (ه) نقل المحقنة إلى موقع الحقن. (و) حفر ثقب في الجمجمة في موقع الحقن. (ز) أدخل الإبرة في أنسجة المخ ببطء وحقن الليسوليسيثين. (ح) غرزة الجلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. إعداد المضخة الاسموزية
ملاحظة: المكونات الرئيسية للمضخة موضحة في الشكل 2A.
- تحديد عمق إدخال قنية ضخ الدماغ في الدماغ. تأكد من أن إبرة قنية تسريب الدماغ المستخدمة يبلغ طولها 3 مم وأن كل فاصل لتعديل العمق هو 0.5 مم. لتحقيق عمق حقن يبلغ 1.5 مم (بالقرب من الثف) ، قم بإرفاق ثلاثة فواصل لضبط العمق بإبرة قنية تسريب الدماغ باستخدام لاصق الأنسجة (الشكل 2B ، C).
- لملء المضخة الأسموزية ، قم بتوصيل إبرة المحقنة التي تأتي مع حزمة المضخة بحقنة 1 مل وقم بشفط الدواء. امسك المضخة في وضع مستقيم ، وأدخل المحقنة في الفتحة الموجودة أعلى المضخة ، وحقن الدواء ببطء ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات9 (انظر الشكل 2D). عندما يتدفق السائل من الفتحة ، اسحب المحقنة ببطء.
- قم بإزالة الشفة البيضاء من منظم التدفق باستخدام مقص أو كماشة مع الحرص على عدم ثني أو سحق وسيط التدفق. ثم أدخل مشرف التدفق في المضخة (الشكل 2E). لتحديد ما إذا كانت هناك فقاعات في المضخة الأسموزية ، قم بوزن المضخة التناضحية بشكل منفصل قبل وبعد التعبئة.
- قم بتقليم القسطرة إلى طول معين وفقا لحجم الحيوان (قسطرة 20-25 مم للفئران P56 التي تزن حوالي 25 جم). نعلق القسطرة على قنية تسريب الدماغ.
- املأ القسطرة بالعقاقير باستخدام المحقنة دون إدخال الهواء (الشكل 2F).
- قم بتوصيل القسطرة بوسيط التدفق. بعد المرفق، تأكد من أن القسطرة تغطي حوالي 4 مم من وسيط التدفق المكشوف (الشكل 2G).
- للتأكد من أن المضخة الأسموزية يمكن أن تعمل على الفور بعد الزرع، اغمر المضخات المملوءة في محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ أو PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 6 ساعات على الأقل (يفضل أن تمتد إلى ما بين عشية وضحاها) لتبلل الغشاء شبه النافذ مسبقا على سطح المضخة بمحاليل لها نفس الضغط الاسموزي مثل بيئة الأنسجة (الشكل 2H).
- يجب أن تكون جميع المحاليل المحملة في المضخات معقمة. يتم تزويد مضخات ALZET معقمة ، بعد أن تعرضت لجرعة تعقيم من 60Co. ومع ذلك ، في حالة حدوث تلوث خارجي ، يمكن تنظيف سطح المضخة عن طريق مسحها بكحول الأيزوبروبيل (70٪ في الماء).
الشكل 2: تحضير المضخة التناضحية. (أ) المكونات الرئيسية للمضخة التناضحية. (ب، ج) إرفاق فواصل تعديل العمق إلى إبرة قنية تسريب الدماغ. (د) املأ المضخة الأسموزية باستخدام حقنة 1 مل. (ه) أدخل وسيط التدفق في المضخة. (و) املأ القسطرة باستخدام المحقنة. (ز) قم بتوصيل القسطرة بوسيط التدفق. (ح) اغمر المضخات المملوءة في محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ أو PBS عند 37 درجة مئوية.
3. زرع المضخة الاسموزية
- انتظر لمدة 3 أيام بعد إنشاء نموذج إزالة الميالين من الجسم الثفني. قم بتشغيل نظام تخدير الحيوانات الصغيرة. قم بتطهير المقص والملقط والكماشة المرقئة ونقعها في محلول كحولي بنسبة 75٪. ضع صفائح معقمة في المنطقة الجراحية.
- تخدير وتأمين الفئران على جهاز التجسيم مرة أخرى. قم بتغطية سطح مقل العيون بمرهم العين لمنع الجفاف.
- تطهير الجرح الأصلي مع الكحول 75 ٪. افتح الشق الجراحي الذي تم خياطته سابقا (الشكل 3A) وقم بتوسيع الشق إلى شفرات الكتف (الشكل 3B).
- افصل الجلد عن النسيج الضام تحت الجلد باستخدام كماشة مرقئ أو ملاقط في الكتف لفتح تجويف (الشكل 3C). ضع المضخة الأسموزية في التجويف (الشكل 3D ، E).
- باستخدام قطعة قطن، امسح بلطف الثقب الموجود على سطح الجمجمة الذي تم إنشاؤه عند إنشاء نموذج إزالة الميالين (انظر الخطوة 1.8). أدخل قنية تسريب الدماغ من خلال هذا الثقب بشكل عمودي وثبتها على الجمجمة بسرعة باستخدام لاصق الأنسجة (الشكل 3F).
- قم بإزالة علامة التبويب القابلة للإزالة فوق قنية تسريب الدماغ باستخدام زوج من المقصات (الشكل 3G ، H). بدلا من ذلك ، قم بإزالة علامة التبويب أولا قبل إدخال القنية لتجنب الاهتزاز في هذه العملية.
- قم بغرز الشق أو إرفاقه بلاصق الأنسجة (الشكل 3I).
- بعد الجراحة ، ضع الماوس على وسادة تدفئة لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. إعطاء حقن تحت الجلد من 5 ملغ / كغ كاربروفين كل 24 ساعة لتخفيف الألم. ضع مرهم الاريثروميسين على الشق كل يوم لضمان شفاء الجرح بشكل صحيح. ضع الحيوان في قفص بمفرده وتغذى بالطعام الرطب حتى يتعافى تماما. راقب الفئران كل يوم وتحقق مما إذا كانت قنية تسريب الدماغ مرتبطة بإحكام.
- القتل الرحيم للفأر بعد 11 يوما من الجراحة عن طريق حقن 150-200 ملغم / كغم من الصوديوم البنتوباربيتال داخل الصفاق متبوعا باختراق عبر القلب مع 4٪ الفورمالديهايد.
- للتحقق من تسليم المحلول بشكل طبيعي ، قم بإزالة المضخة الأسموزية بعناية وقياس الحجم المتبقي في خزان المضخة قبل تشريح الدماغ.
- لقياس الحجم المتبقي ، قم بإزالة قنية تسريب الدماغ ، وقم بإرفاق حقنة 1 مل بالقسطرة ، ثم استطلع المحلول المتبقي لتحديد حجمه. قارن الحجم المتبقي الفعلي بالحجم المتبقي النظري (الحجم الأولي - متوسط معدل الضخ * مدة التسريب).
ملاحظة: يشير الحجم المتبقي المفرط إلى عدم نجاح التسريب، والذي قد يكون بسبب انسداد القسطرة أو عطل في المضخة.
- لقياس الحجم المتبقي ، قم بإزالة قنية تسريب الدماغ ، وقم بإرفاق حقنة 1 مل بالقسطرة ، ثم استطلع المحلول المتبقي لتحديد حجمه. قارن الحجم المتبقي الفعلي بالحجم المتبقي النظري (الحجم الأولي - متوسط معدل الضخ * مدة التسريب).
الشكل 3: زرع المضخة الأسموزية. (أ) فتح الشق الجراحي. (ب) توسيع الشق إلى شفرات الكتف. (ج) فصل الجلد عن النسيج الضام تحت الجلد لصنع تجويف. (دال، هاء) ضع المضخة الأسموزية في التجويف. (و) إدخال قنية تسريب الدماغ في الثقب الموجود على سطح الجمجمة وثبوتها بإحكام على الجمجمة. (ز، ح) قم بإزالة علامة التبويب القابلة للإزالة من الكانيولا. (ط) غرزة الشق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقق من تأثير المضخة الأسموزية في أبحاث تجديد المايلين ، تم إنشاء نموذج إزالة الميالين الناجم عن الليسوليسيثين في الفئران P56 ، يليه زرع مضخات تناضحية تحتوي على UM206 (1 ملغ في 1.5 مل 0.9٪ مالحة) ، وهو ببتيد ذو عمر نصف قصير ونفاذية BBB ضعيفة تم الإبلاغ عنها مؤخرا لتعزيز إعادة الميالين10 . تم استخدام 0.9٪ المالحة كعنصر تحكم. بعد أربعة عشر يوما من إنشاء النموذج ، تم دمج الفئران عبر القلب مع الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لعزل الأدمغة للتقسيم ، تليها التهجين في الموقع والمجهر الإلكتروني الناقل لتقييم مستوى إعادة الميالين.
كشف تلطيخ DAPI عن وجود ثقب في أنسجة المخ فوق المادة البيضاء مباشرة ، مما يشير إلى نجاح زرع قنية تسريب الدماغ للمضخة التناضحية (الشكل 4A). في تجربة التهجين في الموقع ، تم استخدام مسبار MAG الناضج لتسمية الخلايا القليلة التغصن المتمايزة حديثا كما هو موضح في الدراسات السابقة10،11،12. أظهرت النتائج أن علاج UM206 أنتج خلايا إيجابية MAG في المنطقة المزيلة للميالين أكثر من المجموعة الضابطة (الشكل 4B). كما أظهر الفحص المجهري الإلكتروني للانتقال في المنطقة منزوعة الميالين أن عدد المحاور العصبية النخاعية قد زاد في مجموعة المعالجة UM206 مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 4C)، مما يشير إلى أن UM206 أدى إلى مستوى أعلى من إعادة الاختلاط. تظهر هذه النتائج أن المضخة الأسموزية يمكنها توصيل الأدوية بكفاءة إلى الجسم الثفني في أبحاث إعادة النخاع.
الشكل 4: النتائج التمثيلية . (أ) صورة تمثيلية لشريحة ملطخة ب DAPI تظهر الثقب في أنسجة المخ. شريط الميزان: 1000 ميكرومتر (B) صور تمثيلية تظهر في الموقع تهجين MAG في المنطقة المزيلة للميالين كما هو موضح في تلطيخ DAPI. زاد علاج UM206 من عدد الخلايا قليلة التغصن التي تحمل علامة MAG. شريط الميزان: 100 ميكرومتر (C) صور المجهر الإلكتروني للإرسال التمثيلي للمنطقة المزيلة للميالين. زاد علاج UM206 من عدد المحاور النخاعية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول المضخة الأسموزية بأنها تقنية جديدة لتوصيل الدواء لأبحاث تجديد المايلين ، والتي يمكن أن توصل الأدوية مباشرة إلى موقع العلاج وتسمح بتوصيل الدواء بشكل متسق لفترة طويلة ، مما يخلق تركيزا مستقرا للدواء في البيئة الدقيقة للجهاز العصبي المركزي طوال المدة التجريبية. بالمقارنة مع طرق توصيل الأدوية الأخرى ، فإن المضخة الأسموزية أكثر ملاءمة للحفاظ على تركيز الدواء في آفة إزالة الميالين13. على سبيل المثال ، بالنسبة لبعض عوامل التغذية العصبية ، لا يمكن للأدوية الجهازية تحقيق أي تأثير بسبب انخفاض تركيز الدواء في موقع الآفة. ولكن إذا تم زيادة الجرعة ، فإن الآثار الجانبية ستكون أكثر أهمية14. في مثل هذه الحالات ، يمكن أن يؤدي الإدارة إلى موقع معين من خلال مضخة تناضحية إلى تقليل الآثار الجانبية الطرفية بشكل فعال15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأدوية المرتبطة بتجديد المايلين لها نفاذية ضعيفة للحاجز الدموي الدماغي (BBB) أو تظهر عمرا نصفيا قصيرا في الجسم الحي بسبب القابلية للتدهور البروتيني. يمكن معالجة هذه المشاكل بشكل جيد بواسطة المضخات التناضحية.
ومع ذلك ، فإن طريقة المضخة الأسموزية لا تخلو من المحاذير والقيود. أولا ، كونه نظاما غازيا لتوصيل الأدوية ، فإنه يسبب حتما تلف أنسجة المخ والالتهاب العصبي في موقع إدخال قنية تسريب الدماغ ، مما قد يحجب تأثير الأدوية. وبالتالي ، يجب إنشاء مجموعة تحكم مناسبة للمذيبات فقط. ثانيا ، تتطلب بعض الأدوية مذيبات مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) للذوبان ، لكن هذه المذيبات غير متوافقة مع مادة الخزان ويمكن أن تسبب فشلا كبيرا في المضخات. على سبيل المثال ، ثبت أن التركيزات العالية من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و PEG400 تؤثر سلبا على إطلاق المضخة وقد لا تكون مناسبة للاستخدام في المضخات التناضحية16،17،18. ثالثا ، قد لا تكون الأدوية غير المستقرة عند 37 درجة مئوية مناسبة للتسريب على المدى الطويل باستخدام المضخة الأسموزية. كل هذه القضايا تستحق الاهتمام إذا كنت تخطط لتطبيق المضخة التناضحية.
تتطلب عدة خطوات في هذا البروتوكول مزيدا من الاهتمام أثناء التجارب. من أجل التشغيل العادي للمضخات التناضحية ، يجب على الباحثين التأكد من تجميع المضخة التناضحية بشكل صحيح وعدم إدخال أي فقاعة في المضخة ، مما سيقوض بشكل كبير كفاءة التسريب. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتسبب انسداد القسطرة أو عطل المضخة التناضحية في فشل التسريب19 ، والذي يمكن تحديده من خلال قياس الحجم المتبقي في خزان المضخة بعد التجربة. لتطبيق المضخة التناضحية على الفئران الأصغر سنا ذات أحجام الدماغ الأصغر ، يوصى بإجراء تجربة تجريبية لضمان عمق مناسب للإدراج. علاوة على ذلك ، يجب تثبيت قنية تسريب الدماغ بإحكام على الجمجمة لتقليل حركتها أثناء التسريب.
في الوقت الحاضر ، وجدت العديد من الدراسات في المختبر مجموعة متنوعة من الأدوية التي يمكن أن تعزز تجديد المايلين ، ولكن بسبب ضعف نفاذية BBB ، وعمر النصف القصير ، وغيرها من المشاكل ، يصعب التحقق من صحة هذه الأدوية بنجاح في الجسم الحي. لذلك ، فإن المضخة الأسموزية ذات قيمة كبيرة في مجال أبحاث تجديد المايلين في الجهاز العصبي المركزي ، وخاصة ذات الصلة بتلك الأدوية ذات عمر النصف القصير ، ونفاذية BBB الضعيفة ، والآثار الجانبية المحيطية الواضحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (NSFC 32070964 ، 31871045) إلى J.N. ومؤسسة شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20210324121214039) إلى Y.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Air Pump | RWD | R510-29 | E05818-006 |
| Brain Infusion kit 3 | ALZET | 0008851 | 1-3 mm |
| Carprofen | Macklin | C830557-1g | 5 mg/kg every 24 h |
| Erythromycin eye ointment | Along technology | YCKJ-RJ-024780 | Cover the surface of the eyeballs during anesthesia |
| Erythromycin ointment | pythonbio | RG180 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD | R546W | E05518-002 |
| L-α-Lysophosphatidylcholine | Sigma | L0906 | Dissolve at 1% with sterile PBS |
| Microliter Syringe | Hamilton | 65460-05 | Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge |
| Micro-smotic pump model 1002 | ALZET | 0004317 | 0.25 µL per hour, 14 days |
| PBS (pH = 7.3) | ORIGENE | ZLI-9061 | |
| Pentobarbital sodium | Shanghai Civi | CAS NO: 57-33-0 | 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia |
| Small Animal Anesthesia Machine | RWD | R520IE | E05807-006 M |
| Stereotaxic Equipment | RWD | E06382 | |
| STERI 250 sterilizer | Keller | 31101 | Rapid sterilization of surgical instruments |
| Surgical sutures | Shanghai jinhuan | F504 | 5-0 |
| Syringe needle (1 mL) | Shanghai KDL | 6930197811018 | 26 gauge (0.45 mm x 16 mm) |
| Testing drug and solvent | Experiment dependent | N/A | |
| ThermoStar Homeothermic Monitoring System | RWD | 69026 | Maintain body temperature during anesthesia |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision |
References
- Theeuwes, F., Yum, S. I. Principles of the design and operation of generic osmotic pumps for the delivery of semisolid or liquid drug formulations. Annals of Biomedical Engineering. 4 (4), 343-353 (1976).
- Herrlich, S., Spieth, S., Messner, S., Zengerle, R. Osmotic micropumps for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1617-1627 (2012).
- Wei, E., Loh, H.
- Pettigrew, J. D., Kasamatsu, T. Local perfusion of noradrenaline maintains visual cortical plasticity. Nature. 271 (5647), 761-763 (1978).
- Wang, Y., et al. Reduced oligodendrocyte precursor cell impairs astrocytic development in early life stress. Advanced Science (Weinheim). 8 (16), 2101181 (2021).
- Tang, C., et al. Neural stem cells behave as a functional niche for the maturation of newborn neurons through the secretion of PTN. Neuron. 101 (1), 32-44 (2019).
- Watanabe, S., Komine, O., Endo, F., Wakasugi, K., Yamanaka, K. Intracerebroventricular administration of Cystatin C ameliorates disease in SOD1-linked amyotrophic lateral sclerosis mice. Journal of Neurochemistry. 145 (1), 80-89 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50326 (2013).
- Tang, C., Guo, W. Implantation of a mini-osmotic pump plus stereotactical injection of retrovirus to study newborn neuron development in adult mouse hippocampus. STAR Protocols. 2 (1), 100374 (2021).
- Niu, J., et al. Oligodendroglial ring finger protein Rnf43 is an essential injury-specific regulator of oligodendrocyte maturation. Neuron. 109 (19), 3104-3118 (2021).
- Breitschopf, H., Suchanek, G., Gould, R. M., Colman, D. R., Lassmann, H. In situ hybridization with digoxigenin-labeled probes: sensitive and reliable detection method applied to myelinating rat brain. Acta Neuropathologica. 84 (6), 581-587 (1992).
- Cree, B. A. C., et al. Clemastine rescues myelination defects and promotes functional recovery in hypoxic brain injury. Brain. 141 (1), 85-98 (2018).
- Eckenhoff, B., Yum, S. I. The osmotic pump: novel research tool for optimizing drug regimens. Biomaterials. 2 (2), 89-97 (1981).
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature Neuroscience. 5, 1046-1050 (2002).
- Hagg, T.
- Bittner, B., Thelly, T., Isel, H., Mountfield, R. J. The impact of co-solvents and the composition of experimental formulations on the pump rate of the ALZET osmotic pump. International Journal of Pharmaceutics. 205 (1-2), 195-198 (2000).
- Arnot, M. I., Bateson, A. N., Martin, I. L. Dimethyl sulfoxide/propylene glycol is a suitable solvent for the delivery of diazepam from osmotic minipumps. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36 (1), 29-31 (1996).
- Gullapalli, R., et al. Development of ALZET osmotic pump compatible solvent compositions to solubilize poorly soluble compounds for preclinical studies. Drug Delivery. 19 (5), 239-246 (2012).
- White, J. D., Schwartz, M. W. Using osmotic minipumps for intracranial delivery of amino acids and peptides. Methods in Neurosciences. 21, 187-200 (1994).
