Summary
Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.
Abstract
O tráfico de proteínas de membrana regula a incorporação e remoção de receptores e canais de íons na membrana plasmática. Esse processo é fundamentalmente importante para a função celular e a integridade celular dos neurônios. As células fotorreceptoras de drosophila tornaram-se um modelo para estudar o tráfico de proteínas de membrana. Além da rodopsina, que após a iluminação torna-se internalizada a partir da membrana fotorreceptora e é degradada, o canal de íons de íons potencial-semelhante ao receptor transitório (TRPL) em Drosophila exibe uma translocação dependente da luz entre a membrana fotorreceptora rabdomeral (onde está localizada no escuro) e o corpo celular fotorreceptor (para o qual é transportado após a iluminação). Este transporte intracelular de TRPL pode ser estudado de forma simples e não invasiva expressando TRPL marcado pelo EGFP em células fotorreceptoras. A fluorescência eGFP pode então ser observada tanto no pseudopupil profundo quanto por microscopia de imersão hídrica. Esses métodos permitem a detecção de fluorescência no olho intacto e, portanto, são úteis para ensaios de alto rendimento e telas genéticas para mutantes de Drosophila defeituosos na translocação TRPL. Aqui, a preparação de moscas, as técnicas microscópicas, bem como os métodos de quantificação utilizados para estudar esta translocação acionada pela luz de TRPL são explicados em detalhes. Esses métodos podem ser aplicados também para estudos de tráfico em outras proteínas fotorreceptoras de Drosophila , por exemplo, rhodopsina. Além disso, utilizando proteínas rabdomerais marcadas pelo eGFP, esses métodos podem ser usados para avaliar a degeneração de células fotorreceptoras.
Introduction
Ao fornecer e remover proteínas de e para a membrana plasmática, o tráfico de proteínas de membrana nos neurônios controla o equipamento de membrana plasmática com receptores, bem como canais de íons e, como resultado, regula a função neuronal. A má regulação ou defeitos no tráfico de proteínas normalmente têm efeitos prejudiciais sobre as células e resultam em degeneração neuronal. Em humanos, isso pode causar doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Mal de Parkinson ou Retinite pigmentosa1. Fotorreceptores no olho composto de Drosophila melanogaster tornaram-se um sistema modelo in vivo para estudar o tráfico de proteínas de membrana2. Isso não se deve apenas à versatilidade genética da Drosophila que permite telas genéticas eficazes, mas também porque todos os componentes essenciais da membrana fotorreceptora absorvente da luz são caracterizados em grande detalhe e técnicas microscópicas eficientes estão disponíveis que podem ser aplicadas ao olho mosca. Essas técnicas são o foco deste artigo.
Nas células fotorreceptoras de Drosophila, a membrana plasmática apical forma uma pilha densamente embalada de microvilli ao longo de um lado da célula, chamada rabdomero. Os rabdomeres das células fotorreceptoras R1-6 são dispostos em um padrão trapezoidal característico, enquanto as células fotorreceptoras R7 e R8 formam um único rabdomero no centro deste trapezoide3. O tráfico de proteínas de membrana é necessário para uma rotatividade regulamentada de proteínas de membrana rabdomeral, como a rodopsina e os canais de íons TRP ativados pela luz (potencial do receptor transitório) e TRPL (semelhante ao TRP) para garantir a quantidade adequada dessas proteínas de fototransdução no rabdomere. As proteínas da membrana fotorreceptora são sintetizadas no ânticulo endoplasmático e transportadas através do aparelho Golgi para o rabdomiô. Após a ativação da rodopsina pela luz, uma molécula de rodopsina pode ficar inativada pela absorção de um segundo fóton ou pode ser removida do rabdomero por endocitose mediada por clathrin. A rodopsina endocitada ou se degrada no lysosome ou é reciclada de volta ao rabdomere 4,5. O canal de íonS TRPL também é internalizado após a ativação da cascata de fototransdução e passa por uma translocação dependente da luz entre o rhabdomere (onde está localizado quando as moscas são mantidas no escuro) e um compartimento de armazenamento enriquecido em ER no corpo celular (para o qual é transportado dentro de várias horas após a iluminação)6,7, 8, 9,10 . Em contraste com a rodopsina endocitada, apenas pequenas quantidades de TRPL são degradadas através da via endolíssóica, e a maioria é armazenada intracelularmente em vez disso e reciclada de volta ao rabdomero após a adaptação escura6. Assim, o TRPL pode ser usado para analisar o tráfico de proteínas de membrana plasmática. As células fotorreceptoras de drosophila também são empregadas para estudar a degeneração neuronal. A degeneração celular fotorreceptora é frequentemente determinada pela avaliação da estrutura dos rabdomiados, que se desintegram como resultado dos processos degenerativos5.
Para estudar a localização subcelular de TRPL e rhodopsina em células fotorreceptoras ou degeneração celular fotorreceptora, dois métodos de microscopia de fluorescência que diferem em relação à velocidade e resolução da análise foram aplicados aqui. Um método muito rápido e não invasivo que pode ser usado para telas genéticas, mas com uma resolução espacial limitada é a detecção de fluorescência no pseudopupil profundo (DPP). O DPP é um fenômeno óptico de olhos compostos artrópodes cuja origem geométrica foi explicada em detalhes por Franceschini e Kirschfeld em 197111. Em suma, em vários planos ópticos abaixo da sobreposição de retina imagens de rabdomeros de ommatidia adjacentes podem ser observados. Em um plano focal através do centro da curvatura do olho, essas projeções sobrepostas formam uma imagem que se assemelha ao layout trapezoidal de rabdomeres em um único ommatidium apenas ordens de magnitude maior. Este fenômeno também pode ser observado independentemente da expressão exógena de proteínas de fluorescência (por exemplo, TRPL:::eGFP8), que, no entanto, tornam o DPP mais fácil de detectar (Figura 1A-A'')12. Um segundo método não invasivo é a microscopia de imersão hídrica que se baseia em proteínas fluorescentes marcadas por imagens após neutralizar o aparelho dicótrico dos olhos com água (Figura 1B-C'')12. Utilizando o método de imersão em água, a quantidade relativa de TRPL::eGFP nos rabdomers ou corpo celular pode ser avaliada quantitativamente para células fotorreceptoras individuais. Além disso, proteínas não translocantes marcadas por fluorescência podem ser utilizadas para avaliar a integridade rabdomeral e determinar o curso temporal de uma potencial degeneração de forma quantitativa, conforme descrito aqui.
Embora as gravações do DPP sejam de longe os métodos mais fáceis e rápidos de executar, a resolução espacial dos dados que eles geram é limitada. Além disso, existem inúmeras razões pelas quais um DPP pode estar ausente, que não são necessariamente perceptíveis pela própria imagem DPP. Uma vez que o DPP representa uma soma de várias ommatidia, as informações sobre células individuais são perdidas. Assim, a imagem DPP de baixa resolução serve a uma função importante na triagem de um grande número de moscas, mas geralmente deve ser seguida por gravações de maior resolução por meio de microscopia de imersão hídrica. Micrografos de imersão hídrica permitem interpretações sobre células individuais, defeitos de desenvolvimento, morfologia ocular, mislocalização proteica ou degeneração da retina, bem como quantificação desses efeitos. Este Protocolo descreve essas duas técnicas em detalhes.
Figura 1: Visão geral das variações de microscopia para o olho de Drosophila apresentadas neste Protocolo. Representações esquemáticas e micrografias exemplares de (A-A'') imagem de pseudopupil fluorescente (DPP), (B-B'') microscopia letal de imersão em água de rabdominais fluorescentes, e (C-C'') microscopia de gota de água não letal de rabdomeros fluorescentes. Barra de escala (A''): 100 μm. Barras de escala (B''-C''): 10 μm. O valor foi modificado a partir da referência13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Considerações gerais
- Use estoques de Drosophila expressando uma proteína de fluorescência localizada permanentemente para análise morfológica (por exemplo, TRP:::eGFP, eGFP::NINAC) e proteínas translocantes para análises sobre tráfico de proteínas (por exemplo, TRPL:::eGFP, Arr2:::eGFP).
- Condições de exposição à luz pré-dedeterminadas de moscas selecionadas para a abordagem experimental.
- Para adaptação escura, mantenha as moscas em caixas escuras pelo período desejado a 25 °C. Para iluminação de até 16 h em experimentos de translocação (por exemplo, TRPL::eGFP expressando moscas), mantenha moscas sob um tubo fluorescente à temperatura ambiente.
- Em experimentos que avaliam a degeneração do fotorreceptor (por exemplo, moscas expressas TRP::eGFP), mantenha as moscas sob um tubo fluorescente a 25 °C em uma luz de 12 h / ciclo escuro de 12 h para iluminação de longo prazo de até 28 dias com luz branca.
- Para iluminar moscas com luz colorida, use diferentes caixas de plástico transparentes coloridas junto com o tubo fluorescente.
- Se os estoques de moscas com olhos pigmentados são usados, os animais de idade precisamente para análise comparativa, uma vez que a pigmentação dos olhos pode aumentar significativamente com a idade.
NOTA: Para a interpretação dos dados, é importante notar que existe um viés de sinal devido ao efeito óptico de orientação de ondas da estrutura rabdomeral. Assim, o sinal de fluorescência do rabdomero será sempre amplificado até certo ponto em imagens DPP e microscopia de imersão de água em relação aos sinais obtidos do corpo celular. Isso é mais proeminente observado em olhos pigmentados, onde a fluorescência de fora dos rabdomers é absorvida por esses pigmentos e é de particular importância quando proteínas de fusão intracelularmente translocantes devem ser detectadas. Assim, no que diz respeito a passos críticos, este estudo considera separadamente as moscas brancas e de olhos vermelhos. - Quanto à microscopia de imersão hídrica, são descritas duas variações. Uma variação letal mais rápida, bem como uma variação não letal permitindo a recuperação para estudos subsequentes.
2. Imagem DPP
- Prepare o espaço de trabalho com os equipamentos e reagentes necessários, como mostrado na Figura 2. Moscas de anestesizante (1-3 dias de idade) de um genótipo que expressa uma proteína de fluorescência em células fotorreceptoras com CO2 em um flypad. Selecione animais para imagem sob um microscópio estéreo com uma fonte de luz convencional e baixa ampliação (por exemplo, 10x).
Figura 2: Espaço de trabalho de imagem DPP. Os materiais necessários são (A) aparelho de anestesia CO2 , (B) microscópio estéreo com uma lâmpada UV e conjunto de filtro de fluorescência, (C) fonte de luz, (D) câmera montada no microscópio com (E) software, (F) pincel de tinta, (G) papelão preto e (H) frasco de mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para a imagem DPP, mantenha as moscas selecionadas anestesiadas e posicione uma delas no centro do objetivo do microscópio em seu lado para que o olho esquerdo ou direito esteja voltado precisamente para o objetivo (Figura 3A).
NOTA: Uma vez que o layout ommatidial das células fotorreceptoras exibe simetria espelhada na linha média dorsoventral, o DPP é melhor observado ligeiramente acima ou abaixo do equador do olho (Figura 3B).
Figura 3: Posicionamento da mosca sob o estereóquio para imagem DPP. (A) Ilustração da mosca de lado com um olho voltado para o microscópio objetivo radialmente. (B) A cabeça de mosca precisa ser virada ligeiramente para cima ou para baixo de modo que o objetivo se concentre em um ponto ligeiramente acima ou abaixo do equador do olho, conforme indicado pelas setas vermelhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Aumente a ampliação para caber o olho inteiro (por exemplo, 100x) e centralizar a ommatidia central do olho. Diminua a profundidade de campo do microscópio, por exemplo, ajustando o diafragma de íris dupla para um ajuste raso (Figura 4A-B').
- Desligue a fonte de luz convencional e ligue a lâmpada UV do microscópio com intensidade máxima e selecione o conjunto do filtro de fluorescência do microscópio de acordo com a proteína de fluorescência expressa nos olhos (Figura 4C-E). Coloque o caminho da luz em direção à câmera montada no microscópio.
- Use o recurso de imagem ao vivo dentro do software para ajustar o brilho da imagem a uma configuração que detecta apenas sinais específicos do olho, ajustando o tempo de exposição e o valor de ganho (por exemplo, 80 ms e 12x, respectivamente). Reajustar o foco do microscópio "em" o olho (abaixo da córnea) para gerar a imagem sobreposta da DPP (Figura 4C-E').
Figura 4: Ilustração de DPP e imagem fluorescente DPP. Imagens exemplares de olhos de Drosophila sob iluminação convencional e UV com conjunto de filtro GFP, tiradas com diferentes planos focais ilustrados em seções transversais esquemáticas através do olho. (A) Micrografia registrada com configurações brilhantes de uma fonte de luz convencional, tempo de exposição de 30 ms, ganho de 1x, profundidade profunda de campo e plano focal perto da superfície da córnea como ilustrado em (A'). (B) Micrografia registrada com configurações brilhantes de uma fonte de luz convencional, tempo de exposição de 30 ms, ganho de 1x, profundidade rasa de campo e plano focal aproximadamente 180 μm abaixo da superfície da córnea como ilustrado em (B'). DPP indicado. (C-E) Micrografo registrado com configurações de alta intensidade de fonte de luz UV e conjunto de filtro GFP, tempo de exposição de 80 ms, ganho de 12x, profundidade rasa de campo e o plano focal (C') perto, (D') ligeiramente abaixo, ou (E') aproximadamente 180 μm abaixo da superfície da córnea. DPP fluorescente é indicado com uma seta curva. Barra de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Tire uma foto do DPP fluorescente. Mude o microscópio de volta para a luz visível e o caminho de luz de volta para os oculares. Recupere o animal imaged em um frasco de mosca para procedimentos adicionais de acordo com seu fenótipo DPP (por exemplo, cruzes). Continue com o próximo animal na etapa 2.2.
3. Microscopia de imersão hídrica
- Preparação de moscas
- Prepare o espaço de trabalho com os equipamentos e reagentes necessários, conforme mostrado na Figura 5. Transfira moscas com idade predeterminada e condições de iluminação em um tubo de centrífugas pré-resfriado de 15 mL e anestesiar incubando-as no gelo por 15 a 30 minutos.
NOTA: Leve ao longo de 1 dia de idade, moscas de adaptação escura como referência. Geralmente, moscas adaptadas à escuridão devem ser transferidas para uma geladeira com uma tampa no escuro. Moscas adaptadas à luz podem ser transferidas para o gelo à luz da sala.
- Prepare o espaço de trabalho com os equipamentos e reagentes necessários, conforme mostrado na Figura 5. Transfira moscas com idade predeterminada e condições de iluminação em um tubo de centrífugas pré-resfriado de 15 mL e anestesiar incubando-as no gelo por 15 a 30 minutos.
Figura 5: Espaço de trabalho de microscopia de imersão de água. Os materiais necessários são: (A) tubo de centrífuga de 15 mL, (B) flocos de gelo, (C) água destilada resfriada, (D) estereomicroscópio, (E) placa de Petri, (F) plasticina, (G) slide de objeto, (H) pinos de inseto ou pontas de pipeta e bisturi, (I) microscópio de fluorescência com (J) software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Selecione a preparação adequada dos dois descritos abaixo (variação letal de 3.1.3 ou variação não letal de 3,1,7) e sempre que a diferenciação entre olhos pigmentados e não pigmentados for feita, siga os respectivos passos.
- Prepare moscas para a variação letal da seguinte forma.
- Adere a um pedaço de plasticine em um slide de objeto e outra peça no centro de uma placa de Petri (por exemplo, 94 mm Ø) e mantenha-os separados por enquanto. Encha a placa de Petri com água destilada gelada e alguns flocos de gelo (Figura 6A).
- Coloque uma mosca anestésica sob um estereómico em cima do slide de objeto revestido de plasticina. Vire a mosca de costas e perfure um pino de inseto pelo centro do tórax (Figura 6B). Fixar o pino horizontalmente no slide do objeto revestido de plasticina e orientar o olho esquerdo ou direito da mosca para cima (Figura 6C).
- Fixar cuidadosamente o slide do objeto, com seu lado sem plasticina voltado para baixo, na placa de Petri impedindo a rotação da mosca. Certifique-se de que o olho de mosca está coberto de água (Figura 6D). Use uma agulha de preparação para remover cuidadosamente quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado ao redor do olho, e proceda imediatamente à aquisição de imagens para melhores resultados.
NOTA: Atraso significativo na aquisição de imagens resulta em despertar e movimentos da mosca que podem levar a imagens embaçadas.
Figura 6: Preparação para microscopia letal de imersão em água. Ilustração de (A) slide de objeto revestido de plasticine e placa de Petri, (B) fixando uma mosca através do tórax em solo de plasticina, (C) orientação de mosca no slide do objeto revestido de plasticine e (D) configuração experimental final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Prepare moscas para a variação não letal da seguinte forma.
- Transfira uma mosca anestriizada de gelo de cabeça para uma ponta de pipeta de 200 μL e empurre a mosca em direção à ponta cuidadosamente com ar comprimido.
- Corte a ponta da pipeta bem na frente da cabeça usando um bisturi. Usando pinças, empurre cuidadosamente a mosca a poucos milímetros da ponta. Corte a ponta da pipeta novamente e empurre a mosca de volta para a ponta com ar comprimido para que apenas a cabeça da mosca se saliente da ponta da pipeta.
- Adere um pedaço de plasticine em um slide de objeto e pressione a ponta da pipeta nele de modo que o olho esquerdo ou direito da mosca fique para cima (Figura 7A). Logo antes da aquisição da imagem, use uma pipeta de laboratório para aderir a uma grande gota de água gelada na parte inferior de um objetivo de imersão em água (Figura 7B). Imediatamente prossiga para aquisição de imagem para melhores resultados.
NOTA: Atraso significativo na aquisição de imagens resulta em despertar e movimentos da mosca que podem levar a imagens embaçadas.
Figura 7: Preparação para microscopia de gota de água não letal. Ilustração de (A) uma mosca anestinada a frio fixada dentro de uma ponta de pipeta de 200 μL montada no slide do objeto revestido de plasticina e (B) a aplicação de gota de água gelada na parte inferior do objetivo de imersão de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Aquisição de imagens
- Coloque cuidadosamente a placa de Petri (etapa 3.1.3) ou o slide do objeto (passo 3.1.7) com a mosca preparada para o estágio do microscópio e selecione um objetivo de imersão na água.
- Abaixe o objetivo de imersão de água manualmente até que entre em contato com a superfície da água (passo 3.1.3) ou o olho da mosca toque a gota (passo 3.1.7) (Figura 8A,B).
- Ligue a lâmpada UV do microscópio e selecione o conjunto de filtros apropriado. Use as oculares para posicionar a mosca sob o objetivo e concentrar o microscópio na superfície do olho.
- Alterne o caminho da luz em direção à câmera do microscópio e gere uma imagem ao vivo no software correspondente. Reajuste o foco para a câmera e avalie a orientação do olho, considerando que o olho tem que enfrentar o microscópio objetivo radialmente como ilustrado em mais detalhes na Figura 8C-E.
Figura 8: Posicionamento da mosca sob o microscópio de fluorescência para imagens de imersão hídrica. Configuração e orientação final para aquisição de imagens usando os protocolos (A) letais ou (B) de preparação de moscas não letais. (C) Ilustração da orientação de moscas para obtenção dos melhores resultados de imagens de microscopia de imersão em água. O ponto ideal para focar no olho não é o centro exato em relação aos eixos anterior/posterior e dorsal/ventral, mas está ligeiramente acima do equador do olho, como indicado pela seta vermelha. (D) Exemplo de imagem de imersão em água para um olho perfeitamente posicionado. Todos os três eixos de simetria do revestimento ommatidial hexagonal aparecem como linhas retas e a quantidade máxima de ommatidia pode estar em foco ao mesmo tempo. (E) Exemplo de imagem de imersão em água de um olho mal posicionado. A imagem contém eixos curvos e uma profundidade rasa de campo. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Use o LUT apropriado (procure a tabela) dentro do software de imagem para detectar a supersaturação (indicada como pixels vermelhos).
- No caso de moscas não pigmentadas, ajuste o tempo de exposição de modo que os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo do limite de saturação para cada imagem.
- No caso das moscas pigmentadas e da variação letal, ajuste o tempo de exposição de modo que todos os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo do limite de saturação em pelo menos cinco moscas individuais de 1 dia de idade, adaptadas à escuridão. Aplique o tempo médio de exposição calculado a todas as outras condições experimentais (genótipos, condições de iluminação, pontos de tempo, etc.).
- No caso de moscas pigmentadas (por exemplo, olhos vermelhos) e variação não letal, ajuste o tempo de exposição de modo que todos os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo do limite de saturação para cada mosca de 1 dia de idade, adaptada à escuridão individualmente. Aplique este tempo de exposição a todas as outras condições experimentais (condições de iluminação, pontos de tempo, etc.) desta mosca.
- Grave uma imagem e salve-a como um arquivo bruto para arquivar todos os metadados correspondentes da gravação. Exporte a imagem em um formato .tif para a seguinte quantificação.
NOTA: No caso da variação não letal, ilumine as moscas por 5 minutos com luz vermelha (por exemplo, 630 nm) imediatamente após a aquisição da imagem, se elas forem destinadas a serem usadas para outros experimentos. A luz vermelha desativa a cascata de fototransdução que foi ativada excessivamente pela intensa luz de ondas curtas durante a aquisição de imagens.
- Análise de dados e quantificação da fluorescência relativa eGFP nos rabdomers de micrografos de imersão hídrica
- Baixe, instale e execute o software ImageJ/Fiji.
- Ajuste as configurações do ImageJ clicando em Analisar > definir medidas... e verifique apenas a caixa para O Valor Cinza Médio. Importe uma imagem .tif clicando no Arquivo > Aberto... ou arrastando e caindo. Escolha uma região representativa da imagem que esteja em foco e amplie-a para 200%-300% pressionando repetidamente Ctrl e + juntos .
- Selecione a ferramenta Oval e ao pressionar a tecla Shift gere uma seleção circular na imagem significativamente menor que um rabdomero fluorescente. Antes de soltar o botão do mouse, procure o tamanho exato exibido abaixo da barra de ferramentas na janela principal imageJ. Use o mesmo tamanho de seleção circular para todas as análises.
NOTA: O tamanho exato da seleção circular em pixels ou mícrons depende da configuração específica. Use um círculo de aproximadamente 1/3 ou 1/4 do diâmetro rabdomeral de moscas de controle de 1 dia de idade, adaptadas à escuridão. - Mova a seleção circular clicando nele e arrastando ou pressionando as Teclas de Seta no teclado.
- Para medir as intensidades de fluorescência dentro da seleção circular, mova o círculo para o primeiro rabdomero (r1) e clique em Analisar > Medida ou use o atalho Ctrl + M. Uma janela resultando listando o valor cinza medido aparecerá.
- Continue com medições de r2-r6 como medições repetidas e uma medição do sinal de fundo (b). No caso de moscas não pigmentadas, faça medições adicionais das áreas correspondentes do corpo celular (c1-c6) (Figura 9).
Figura 9: Quantificação da fluorescência rhabdomeral relativa para estudos de translocação. Ilustração sobre quantificação da fluorescência relativa do eGFP nos rabdomers medindo a intensidade de fluorescência de rabdomere (r), corpo celular (c) e fundo (b) de três ommatidia representativas diferentes (círculos brancos) em uma imagem de microscopia de imersão de água; barra de escala: 10 μm. Um ommatidium ampliado é mostrado à direita; barra de escala: 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Repetir as etapas 3.3.5 e 3.3.6 para mais duas ommatidia, resultando em três réplicas técnicas. Marque a ommatidia analisada usando a ferramenta Lápis e salve esta imagem para documentação.
- Selecione e copie os valores de cinza medidos da janela Resultado e cole-os em software de planilha para cálculos adicionais. Classificar os valores da intensidade da fluorescência de acordo com sua origem nas categorias rabdomere (r), corpo celular (c) e fundo (b). Calcular a intensidade média de cada categoria (Ir, Ic, Ib).
- Calcule a quantidade relativa de eGFP presente no rabdomere (R), utilizando a seguinte fórmula (1) para não pigmentado e fórmula (2) para olhos pigmentados:
(1)
(2) - Continue com a próxima imagem na etapa 3.3.3. Recomenda-se o uso de imagens de pelo menos cinco indivíduos de cada grupo experimental como réplicas biológicas para obter uma medição confiável.
(1)
(2)- Análise de dados e quantificação da morfologia ocular por fluorescência eGFP em micrografos de imersão hídrica
- Baixe, instale e execute o software ImageJ/Fiji. Importe uma imagem .tif clicando no Arquivo > Aberto... ou arrastando e soltando. Escolha três ommatidia adjacentes em uma região representativa da imagem que está em foco.
- Avalie os 18 rabdomers da seleção individualmente de acordo com sua intensidade eGFP, nitidez de borda e contraste com relação ao sinal de fundo circundante para gerar um índice de degeneração. Pontuação de rabdomeres claramente visíveis com um valor de 2, rabdomeres fracamente visíveis com um valor de 1, e rabdomeres ausentes com um valor de 0 (Figura 10).
NOTA: Esta forma de quantificação resulta em uma pontuação de 36 para olhos totalmente intactos e uma pontuação de 0 para olhos totalmente degenerados. Recomenda-se definir a pontuação de 36 a 100% no índice de degeneração.
Figura 10: Quantificação via avaliação de rabdomere para estudos de degeneração. Uma ilustração sobre quantificação da morfologia ocular marcando os rabdomeros de três ommatidia representativas diferentes (círculos brancos) em uma imagem de microscopia de imersão de água com valores de 2 (claramente visível; círculo azul), 1 (fracamente visível; círculo laranja) ou 0 (ausente; círculo vermelho). Barra de escala: 10 μm. Um ommatidium ampliado é mostrado à direita; barra de escala: 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Abra a próxima imagem e continue com o passo 3.4.2. Recomenda-se o uso de imagens de pelo menos oito indivíduos de cada grupo experimental como réplicas biológicas para obter uma medição confiável.
NOTA: Uma vez que este método de quantificação é menos objetivo do que o método de quantificação da translocação por intensidade de fluorescência, o número recomendado de réplicas é maior.
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Representative Results
Foram geradas moscas transgênicas de Drosophila expressando uma proteína de fusão TRPL::eGFP sob o controle do promotor de rodopsina 1. Nestas moscas, TRPL::eGFP é expresso em células fotorreceptoras R1-6 do olho composto e exibe uma localização dependente da iluminação. Quando as moscas são mantidas no escuro, TRPL::eGFP é incorporada aos rabdomiôs externos. Após a iluminação por várias horas, o TRPL transloca-se no corpo celular onde é armazenado em um compartimento enriquecido com ER. 8,10 Quando o TRPL::eGFP está localizado nos rabdomeros, sua fluorescência pode ser observada no DPP. No entanto, a fluorescência rabdomeral desaparece à luz como resultado da translocação de TRPL:::eGFP (Figura 11A,B). Este tem sido usado para realizar uma tela genética para mutantes defeituosos na internalização de TRPL::eGFP (Figura 11C,D)14,15. Para permitir o isolamento de mutações letais potencialmente homozigosas, esta tela foi realizada usando o sistema de levedura Flp/FRT para a geração de clones de células somáticas no tecido ocular em desenvolvimento (ou seja, olhos de mosaico). Além da simplicidade do ensaio DPP, outras grandes vantagens deste método de detecção de fluorescência são seu alto rendimento, bem como seu caráter não invasivo que permite a identificação de mutações em moscas vivas e usar essas moscas para a geração de estoques de moscas mutantes estáveis.
Figura 11: Resultados representativos de uma tela genética sobre defeitos de translocação TRPL. As moscas machos foram mutagenizadas com metanosetano etílico (EMS) e cruzadas para fêmeas expressando TRPL::eGFP em células fotorreceptoras R1-6. A geração F1 resultante com olhos de mosaico induzidos por Flp/FRT foram examinados por defeitos na translocação TRPL por pseudopupilos profundos fluorescentes (DPP) após um período de adaptação escura (coluna esquerda), bem como adaptação leve (coluna direita). (A,B) Moscas não mutantes foram transportadas como controle para translocação TRPL induzida pela luz regular. O DPP não fluorescente é indicado por uma seta. (C,D) Um resultado exemplar de mutantes isolados defeituosos na translocação TRPL acionada pela luz. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mutantes defeituosos de translocação TRPL (TTD) que foram isolados desta tela genética foram posteriormente identificados e seus defeitos caracterizados em mais detalhes com a ajuda de imagens de imersão na água. A microscopia de imersão hídrica tem sido aplicada para avaliar a localização de proteínas nos rhabdomeres e corpos celulares ou para rastrear defeitos na estrutura rabdomeral devido à degeneração fotorreceptora quantitativamente conforme descrito no Protocolo. Figura 12A,B ilustra quantificação da quantidade de TRPL::eGFP presente nos rabdomers de moscas com olhos de mosaico mutantes não mutantes e lolattd12 na escuridão, na luz, e depois de uma segunda adaptação escura. No controle (não mutante) voa, TRPL::eGFP transloca para fora dos rabdomeros para o corpo celular após 16 horas de iluminação resultando em uma diminuição do TRPL rabdomeral:::eGFP para cerca de 45% em comparação com o estado adaptado à escuridão. A segunda incubação escura eleva a fluorescência rabdomeral novamente para 95% do valor inicial. O mutante LolaTTD12 foi isolado pela triagem do DPP devido ao seu defeito de translocação TRPL. Assim, o padrão de fluorescência TRPL::eGFP em imagens de imersão de água de rabdomeres não parece mudar tão drasticamente após 16 horas de iluminação e posterior adaptação escura por 24 h. No entanto, as imagens também revelam que os mutantes de LolaTTD12 são defeituosos em desenvolvimento, o que é evidenciado pela ocasional ausência de células fotorreceptoras, como descrito anteriormente para outros mutantes lola 16. Esses defeitos morfológicos resultam em uma incapacidade de medir um sinal de fundo válido, impedindo uma quantificação correta usando a fórmula (1). Em contraste, vps35MH20 é um mutante que exibe um defeito de translocação TRPL sem afetar a morfologia ommatifical desta forma10. Neste mutante, o método de quantificação descrito aqui pode detectar um defeito de reciclagem estatisticamente altamente significativo (Figura 12C,D).
Figura 12: Resultados representativos de um defeito translocador TRPL em moscas mutantes lola e vps35 e limites do método de quantificação. (A) TRPL::eGFP-expressing non-mutante and lolattd12 mutante mosaico-eyed moscas foram incubadas no escuro por 3 dias, iluminadas com luz laranja por 16 h, e adaptadas escuras por 24 horas por segunda vez. Imagens de rabdomeros fluorescentes foram tiradas por meio de microscopia de imersão hídrica para registrar a localização subcelular do TRPL:::eGFP, conforme descrito na etapa 3.2.6. (B) Quantificação da fluorescência rabdomeral de animais não mutantes (cinza) e lolattd12 mutantes (verde), conforme descrito na etapa 3.3.9 usando fórmula (1). As barras de erro representam o SEM. (C) TRPL::eGFP-expressing non-mutante and vps35MH20 mutant mosaic-eyed flies foram incubados no escuro por 3 dias, iluminados com luz laranja por 16 h, e adaptados escuros por 24 horas por segundo. Imagens de rabdomeros fluorescentes foram tiradas por meio de microscopia de imersão hídrica para registrar a localização subcelular do TRPL:::eGFP, conforme descrito na etapa 3.2.6. (D) Quantificação da fluorescência rabdomeral de animais não mutantes (cinza) e vps35MH20 (vermelho), conforme descrito na etapa 3.3.9 usando fórmula (1). As barras de erro representam SEM. A significância estatística foi calculada como múltiplas comparações com a correção de Bonferroni após a ANOVA (ns, não significativa; *, p ≤ 0,05; ***, p ≤ 0,001). Barra de escala: 10 μm. Os painéis C e D foram modificados a partir da referência10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como já mencionado no Protocolo, a pigmentação dos olhos influencia significativamente a imagem de imersão hídrica resultante. As moscas de olhos brancos permitem a detecção de sinais de fluorescência tanto do rabdomere quanto do corpo celular, permitindo assim uma determinação bastante precisa da razão de distribuição TRPL::eGFP. Em contraste, em moscas de olhos vermelhos O sinal TRPL::eGFP só é detectável nos rabdomeros, mas não nos corpos celulares (Figura 13A). Isso se deve a moléculas de pigmento absorvendo a luz emitida de TRPL:::eGFP. No entanto, usando a fórmula (2) para olhos pigmentados, a quantificação revela muito bem o comportamento de translocação TRPL:::eGFP em moscas brancas e de olhos vermelhos. Assim, os valores correspondentes de fluorescência de rhabdomere diminuem de 100% no estado adaptado ao escuro para 25% e 5% após a iluminação e aumentam novamente para 80% e 90% como resultado de uma segunda incubação escura (Figura 13B).
Figura 13: Resultados representativos da fluorescência TRPL:::eGFP fluorescência em moscas brancas e de olhos vermelhos. (A) TRPL:::eGFP-expressando moscas brancas e de olhos vermelhos foram incubadas no escuro por 1 dia, iluminadas com luz laranja por 16 h, e adaptadas à escuridão por 24 h a segunda vez. Imagens de rabdomeros fluorescentes foram tomadas por meio de microscopia de gota de água não letal para registrar a localização subcelular TRPL:::eGFP, conforme descrito nas etapas 3.2.6 (moscas de olhos brancos) e 3.2.8 (moscas de olhos vermelhos). (B) Quantificação da fluorescência rabdomeral em moscas de olhos brancos (cinza) e de olhos vermelhos (vermelho). Moscas de olhos brancos foram quantificadas usando fórmula (1) e moscas de olhos vermelhos, usando fórmula (2), conforme descrito na etapa 3.3.9. As barras de erro representam SEM. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para avaliar a degeneração do fotorreceptor, pode ser determinado um índice de degeneração baseado na fluorescência do TRP::eGFP nos rabdomeros (ver Protocolo). Este método de quantificação é ilustrado na Figura 10. Nos resultados representativos aqui, moscas não mutantes e sdhAttd11 mutantes de olhos de mosaico foram mantidas em um ciclo escuro de 12 h / 12 h por 2 semanas e a integridade dos rabdomiados foi investigada a cada 2-4 dias observando TRP::eGFP usando microscopia de imersão de água (Figura 14A). A curva resultante mostra um declínio do índice de degeneração no mutante, mas não em moscas de controle (Figura 14B).
Figura 14: Resultados representativos da degeneração da retina induzida pela luz em moscas mutantes sdhA . (A) TRP::eGFP-expressando não-mutante e sdhAttd11 moscas mutantes de olhos de mosaico foram incubadas por 14 dias em uma luz de 12 h / ciclo escuro de 12 h a 25 °C. Imagens de rabdomeros fluorescentes foram tiradas por meio de microscopia de imersão hídrica em intervalos de tempo regular para registrar a saúde da retina. (B) Quantificação da fluorescência rabdomeral do tipo selvagem (cinza) e sdhAttd11 mutante (laranja) voa como descrito no passo 3.4. As barras de erro representam SEM. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A aplicabilidade das proteínas de fluorescência e a simplicidade da triagem por imagem DPP e microscopia de imersão em água da retina tem sido comprovadamente bem sucedida por muitos grupos12. Estratégias semelhantes às apresentadas aqui têm sido utilizadas em diversas telas genéticas para detectar defeitos nos níveis de expressão de rodopsina, homeostase, organização da retina ou integridade celular com a ajuda de Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. Como explicado acima, a translocação de proteínas de fusão como o TRPL::eGFP pode ser usada para detectar se os processos de tráfico de proteínas de e para o rabdomero são prejudicados, por exemplo, em telas de mutagênese. Por outro lado, proteínas de fusão permanentemente rabdomerais como tRP::eGFP podem ser usadas para investigar a morfologia do rabdomero. DPP e microscopia de imersão em água são considerados excelentes métodos para análises e telas de alto rendimento dentro do modelo do olho de Drosophila. Recomenda-se, no entanto, realizar (imuno)análises histoquímicas de ommatidia isolada ou tecido retiniano crio-seccionado para corroborar os resultados obtidos pela DPP ou microscopia de imersão hídrica. Emparelhadas com microscopia de fluorescência de alta resolução, essas técnicas permitem interpretações para localizaçãos subcelulares precisas. A seguir, são oferecidas algumas orientações sobre como solucionar problemas os processos de imagem da microscopia de imersão em água DPP e retina que é particularmente importante para análises quantitativas corretas.
Em relação ao DPP, se a superposição da fluorescência estiver embaçada ou indistinta, as configurações podem não estar corretas. Uma possibilidade é que o olho não esteja voltado precisamente para o objetivo ou que o foco seja definido para as regiões periféricas do olho. Uma vez que o layout ommatidial das células fotorreceptoras exibe simetria espelhada na linha média dorsoventral, um padrão incomum no DPP pode ser visto, se os sinais forem detectados de ambos os hemisférios do olho. A qualidade do DPP também depende fortemente de uma profundidade rasa de campo para gerar uma seção óptica através do olho composto. Se a superfície do flypad exibir autofluorescência, a mosca pode ser colocada em um pequeno pedaço de papelão preto não fluorescente no topo do flypad. Uma incapacidade de registrar um DPP pode estar ligada a uma variedade de causas subjacentes, incluindo posicionamento de moscas subótimas, baixos níveis de expressão da proteína fluorescente, uma arquitetura de retina desorganizada ou processos degenerativos. Ao fotografar o DPP, deve-se notar também que a fluorescência citoplasmática em moscas de olhos brancos pode difundir as bordas do sinal dos rabdomers, e os níveis de expressão da proteína podem variar significativamente entre os indivíduos e afetar a qualidade da DPP resultante. Assim, no caso da imagem fluorescente DPP, é vantajoso usar moscas com olhos pigmentados. Devido à absorção de sinais de fluorescência dos corpos celulares, o DPP resultante pode parecer mais nítido do que em moscas de olhos brancos.
Para evitar imagens embaçadas na microscopia de imersão na água, a aquisição de imagens precisa ser realizada rapidamente após a preparação da mosca para evitar o despertar e os movimentos da mosca. Para imagens de alta qualidade, os sinais de fluorescência mais brilhantes do olho têm que quase alcançar a saturação em todas as imagens se usar moscas de olhos brancos. Isso pode ser alcançado ajustando o tempo de exposição durante a imagem. Uma vez que a pigmentação dificulta a detecção da fluorescência citosolic eGFP, a abordagem descrita para moscas de olhos brancos para ajustar o tempo de exposição sempre resultaria em fortes sinais de fluorescência rabdomeral em olhos pigmentados, distorcendo interpretação e quantificação subsequentes. Além disso, usando olhos pigmentados, o fotobleaching devido à forte exposição à luz azul pode levar a sinais mais fracos e, portanto, má interpretação dos dados. Dependendo do contexto (ou seja, letal ou não letal), dois procedimentos alternativos são apresentados no protocolo para olhos pigmentados. Em geral, a variação não letal deve ser preferida com olhos pigmentados, uma vez que a mesma mosca pode ser medida repetidamente, e a avaliação de um tempo de exposição específico para cada mosca individual resulta em quantificações mais precisas e maior reprodutibilidade do que a determinação de um tempo médio de exposição gerado a partir de uma amostra. No entanto, a variação não letal também exige mais cuidado no manuseio dos animais para garantir sua sobrevivência durante medições repetidas. Isso pode ser alcançado usando apenas ar de baixa pressão para mover moscas na ponta pipeta e usando cuidadosamente pinças para libertar a mosca da ponta da pipeta após a imagem. Uma vez que as moscas não estão submersas em água gelada durante o procedimento, há um risco aumentado de despertar. Como resultado das medições repetidas de espécimes individuais, toda a série de medições só é válida se a mosca permanecer ilesa do início ao fim. Como resultado, a variação não letal é muito trabalhosa e demorada. A variação letal, por outro lado, permite um maior rendimento, uma vez que várias moscas podem ser presas em sucessão no mesmo pino de inseto e registradas sequencialmente em uma rodada de aquisição de imagem. No entanto, várias moscas no mesmo pino também requerem imagens ainda mais rápidas para evitar o despertar e os movimentos. Uma última desvantagem da variação letal é, obviamente, a incapacidade de recuperar os animais após a imagem para aplicações subsequentes (por exemplo, cruzes, medições repetidas).
Em relação à quantificação da translocação, este Protocolo apresenta fórmula (1), que considera sinais de fluorescência do rabdomere, bem como do corpo celular e, portanto, gera uma estimativa muito boa para a distribuição relativa da proteína translocante dentro da célula (Figura 12D). Devido à falta de medidas de fluorescência do corpo celular no caso de olhos pigmentados, é oferecida a fórmula (2), que funciona bem para esta questão frequentemente encontrada (Figura 13B). Além da pigmentação dos olhos, existem outras circunstâncias que impedem a quantificação com qualquer uma dessas fórmulas. Uma dessas instâncias é apresentada na Figura 12A,B na forma do mutante LolaTTD12. Neste mutante, especificamente, a ausência de célula fotorreceptora R7 afeta significativamente a morfologia ommatifical e, portanto, a capacidade de adquirir medidas de intensidade razoáveis da fluorescência de fundo desta região. Se o mesmo método de quantificação de translocação estiver sendo usado apesar desses problemas, os resultados apresentam altas quantidades de variância, são difíceis de comparar com os controles, podendo potencialmente ser mal interpretados. O exemplo do mutante lolattd12 ilustra assim os limites deste método de quantificação que inevitavelmente se baseia em uma morfologia "tipo selvagem" para medições corretas de intensidade. Em casos raros em que os defeitos de translocação de proteínas devem ser quantificados em ommatidia morfologicamente defeituoso, o Protocolo aqui apresentado falha e tem que ser adaptado em conformidade. Isso inclui alterações adequadas na fórmula, a fim de excluir medidas que não podem ser obtidas razoavelmente ou incluir medidas adicionais de outras regiões representativas.
No caso da quantificação dos processos degenerativos, os limiares de intensidade de fluorescência acabaram por não ser um bom indicador, uma vez que há muita variância dentro e entre os rabdomeros. Essa variância é média em todos os 18 rhabdomeres medidos no método de quantificação da translocação. No entanto, devido à avaliação individual de cada rabdomer na avaliação da degeneração, a variância nas intensidades de fluorescência não pode ser mediada. Além disso, a intensidade é apenas uma das características que precisam ser consideradas. Outros aspectos importantes são o contraste e a nitidez das bordas. Consequentemente, este protocolo apresenta um método de quantificação baseado na categorização da morfologia dos rabdomeros de acordo com sua fluorescência por olho. Isso é necessariamente subjetivo até certo ponto. No entanto, dada a experiência suficiente, este protocolo provou ser um método útil, rápido e reprodutível de quantificação para degeneração (Figura 14) e foi publicado várias vezes22,10. Como em todas as avaliações subjetivas, é sempre aconselhável realizá-las em um contexto cego. Protocolos de outros grupos geralmente usam apenas duas categorias para quantificar a degeneração da retina em Drosophila (presença ou ausência de rabdomers), que podem ser menos subjetivas, mas também menos precisas. Além disso, essa forma de quantificação ainda tem a questão de definir um ponto de corte entre as duas categorias, o que pode ser igualmente difícil de definir objetivamente.
No que diz respeito às modificações e aplicações avançadas dos métodos aqui apresentados, também é possível avaliar a quantidade relativa de duas proteínas de fusão fluorescente simultaneamente por imagem de dupla cor. Por exemplo, usando TRPL::HcRed e TRP::eGFP, a translocação de HcRed foi avaliada em consideração à integridade rabdomeral na mesma mosca23. A imagem de cor dupla também é usada no método Tomate/GFP-FLP/FRT, por exemplo, para identificar fatores que induzem apoptose24. Essa variação permite visualizar a degeneração de células fotorreceptoras através de ninaC::eGFP em clones celulares fluorescentes rotulados marcados por ninaC::tdTomato. Outra aplicação da microscopia de imersão hídrica é o monitoramento da rotatividade de fosforinositídeos em fotorreceptores. Para isso, são utilizados domínios fluorescentes de ligação de fosfoinositídeos fluorescentes, como o domínio de escoologia pleckstrina (PH) do PLCδ1. Estas sondas de fluorescência permitem o rastreamento da degradação do fosfoinostito ao longo do tempo, detectando a diminuição da fluorescência rabdomeral causada pela difusão da sonda do rabdomero ao citosol25,26.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos nossos pesquisadores estudantes ao longo dos anos. Em particular, Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim e Laura Jaggy, cujos dados foram utilizados neste protocolo como resultados representativos. A pesquisa do nosso grupo aqui apresentada foi financiada por subvenções da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) para Armin Huber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
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