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Neuroscience

एक साथ ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन और इलेक्ट्रिकल न्यूरल रिकॉर्डिंग के लिए ऑप्ट्रोड ऐरे

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम प्रकाश वितरण के लिए ऑप्टिकल फाइबर और तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए एक इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक ऑप्ट्रोड सिस्टम की निर्माण विधि प्रस्तुत करते हैं। चैनलरोडोप्सिन -2 व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के साथ विवो प्रयोगों में एक साथ ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सिस्टम की व्यवहार्यता दिखाई देती है।

Abstract

पिछले दशक के दौरान, ऑप्टोजेनेटिक्स चयनात्मक तंत्रिका मॉडुलन या निगरानी की अपनी अनूठी क्षमता के कारण तंत्रिका सिग्नलिंग की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गया है। चूंकि विशिष्ट प्रकार की न्यूरोनल कोशिकाओं को ऑप्सिन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है, ऑप्टोजेनेटिक्स चयनित न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल उत्तेजना या निषेध को सक्षम बनाता है। ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए ऑप्टिकल सिस्टम में कई तकनीकी प्रगति हुई है। हाल ही में, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना या निषेध के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ प्रकाश वितरण के लिए ऑप्टिकल वेवगाइड को संयोजित करने का प्रस्ताव किया गया था। इस अध्ययन में, एम्बेडेड मल्टीचैनल इलेक्ट्रोड के साथ एक प्रत्यारोपण योग्य ऑप्ट्रोड सरणी (2x2 ऑप्टिकल फाइबर) विकसित किया गया था।

एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) को प्रकाश स्रोत के रूप में नियोजित किया गया था, और ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर पर्याप्त प्रकाश शक्ति प्रदान करने के लिए एक माइक्रोफैब्रिकेटेड माइक्रोलेंस सरणी को एकीकृत किया गया था। ऑप्ट्रोड सरणी प्रणाली में डिस्पोजेबल भाग और पुन: प्रयोज्य भाग शामिल हैं। डिस्पोजेबल भाग में ऑप्टिकल फाइबर और इलेक्ट्रोड होते हैं, जबकि पुन: प्रयोज्य भाग में प्रकाश नियंत्रण और तंत्रिका सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए एलईडी और इलेक्ट्रॉनिक सर्किटरी होती है। प्रत्यारोपण योग्य ऑप्ट्रोड सरणी प्रणाली का उपन्यास डिजाइन ऑप्ट्रोड प्रत्यारोपण सर्जरी, ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तंत्रिका रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया के अलावा वीडियो में पेश किया गया है। इन विवो प्रयोगों के परिणामों ने चूहों के हिप्पोकैम्पस उत्तेजक न्यूरॉन्स से प्रकाश उत्तेजनाओं द्वारा उत्पन्न समय-बंद तंत्रिका स्पाइक्स को सफलतापूर्वक दिखाया।

Introduction

तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करना और नियंत्रित करना यह समझने के लिए आवश्यक है कि मस्तिष्क तंत्रिका नेटवर्क में और सेलुलर स्तरों पर कैसे कार्य करता है। पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग विधियों में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पैच क्लैंप 1,2,3,4 और माइक्रोन्यूरल इलेक्ट्रोड 5,6,7,8 का उपयोग करके बाह्य रिकॉर्डिंग शामिल है। न्यूरोमॉड्यूलेशन विधि के रूप में, विद्युत उत्तेजना का उपयोग अक्सर न्यूरोनल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष विध्रुवण के माध्यम से फोकल मस्तिष्क क्षेत्र को सीधे उत्तेजित करने के लिए किया जाता है। हालांकि, विद्युत विधि रिकॉर्डिंग या उत्तेजना के लिए न्यूरोनल सेल प्रकारों को अलग नहीं कर सकती है क्योंकि विद्युत धाराएं सभी दिशाओं में फैलती हैं।

एक उभरती हुई तकनीक के रूप में, ऑप्टोजेनेटिक्स ने यह समझने में एक नए युग की शुरुआत की है कि तंत्रिका तंत्र कैसे काम करता है 9,10,11,12,13,14,15,16. ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों का सार आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त प्रकाश-संवेदनशील ऑप्सिन प्रोटीन की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश का उपयोग करना है। इस प्रकार, ऑप्टोजेनेटिक्स जटिल तंत्रिका सर्किट14,17 में आनुवंशिक रूप से चयनित कोशिकाओं के परिष्कृत मॉडुलन या निगरानी को सक्षम बनाता है। ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के व्यापक उपयोग ने ऑप्टिकल न्यूरोमॉड्यूलेशन की सीधे पुष्टि करने के लिए एक साथ तंत्रिका रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रकाश नियंत्रण और रिकॉर्डिंग कार्यों के साथ एक एकीकृत उपकरणअत्यंत मूल्यवान होगा 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

पारंपरिक, लेजर-आधारित ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना की सीमाएं हैं, जिसके लिए भारी और महंगी प्रकाश वितरण प्रणाली 26,27,28,29,30 की आवश्यकता होती है। इसलिए, कुछ शोध समूहों ने प्रकाश वितरण प्रणाली 31,32,33,34 के आकार को कम करने के लिए μLED-आधारित सिलिकॉन जांच को नियोजित किया। हालांकि, एलईडी की कम ऊर्जा रूपांतरण दक्षता के कारण μLEDs के साथ सीधे संपर्क के कारण थर्मल मस्तिष्क क्षति का खतरा है। थर्मल क्षति30,35,36,37,38,39 से बचने के लिए ऑप्टिकल फाइबर, एसयू -8 और सिलिकॉन ऑक्सीनाइट्राइड (सियोन) जैसे हल्के वेवगाइड लागू किए गए हैं। हालांकि, प्रकाश स्रोतों और वेवगाइड के बीच इसकी कम युग्मन दक्षता के कारण इस रणनीति में एक खामी भी है।

माइक्रोलेंस सरणी को पहले एलईडी और ऑप्टिकल फाइबर40 के बीच प्रकाश युग्मन दक्षता बढ़ाने के लिए पेश किया गया था। माइक्रोस्केल40 पर ऑप्टिकल उत्तेजना और विद्युत रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) प्रौद्योगिकियों के आधार पर एक ऑप्ट्रोड सिस्टम विकसित किया गया था। एक एलईडी और ऑप्टिकल फाइबर के बीच माइक्रोलेंस सरणी ने प्रकाश दक्षता में 3.13 डीबी की वृद्धि की। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एक 2x2 ऑप्टिकल फाइबर सरणी 4x4 माइक्रोलेंस सरणी पर गठबंधन किया गया है, और एलईडी माइक्रोलेंस सरणी के नीचे तैनात है। मस्तिष्क क्षति को कम करने के लिए 4x4 के बजाय 2x2 ऑप्टिकल फाइबर लगाए जाते हैं। एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड सरणी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 बी) के लिए छेद के माध्यम से सिलिकॉन का उपयोग करके ऑप्ट्रोड सरणी से सटे स्थित है।

सिस्टम में एक शीर्ष डिस्पोजेबल भाग और वियोज्य निचले हिस्से होते हैं। शीर्ष डिस्पोजेबल भाग, जिसमें ऑप्टिकल फाइबर सरणी, माइक्रोलेंस सरणी और टंगस्टन इलेक्ट्रोड सरणी शामिल है, को विवो प्रयोगों के लिए मस्तिष्क में स्थायी रूप से प्रत्यारोपित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। निचले हिस्से में एक एलईडी प्रकाश स्रोत और एक बाहरी बिजली आपूर्ति लाइन शामिल है, जो किसी अन्य पशु प्रयोग के लिए आसानी से हटाने योग्य और पुन: प्रयोज्य है। एक संलग्न प्लास्टिक कवर डिस्पोजेबल भाग की रक्षा करता है जब वियोज्य भाग को हटा दिया जाता है।

सिस्टम की व्यवहार्यता को ट्रांसजेनिक चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपण द्वारा सत्यापित किया जाता है जो सीए 2 + / शांतोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज द्वितीय-पॉजिटिव न्यूरॉन्स (सीएएमकेआईआईआई:: सीएचआर2 माउस) में चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) व्यक्त करते हैं। न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल उत्तेजना के दौरान व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से तंत्रिका गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था।

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Protocol

पशु देखभाल और सर्जिकल प्रक्रियाओं को ईवा महिला विश्वविद्यालय (नंबर 20-029) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. एक ऑप्ट्रोड सरणी की तैयारी (चित्रा 1 और चित्रा 2)

  1. माइक्रोलेंस सरणी के साथ ऑप्टिकल फाइबर संलग्न करें।
    1. ऑप्टिकल फाइबर की निष्क्रियता कोटिंग को हटा दें और एक सटीक ऑप्टिकल फाइबर क्लीवर का उपयोग करके इसे 5 मिमी लंबे टुकड़ों में काट लें।
    2. ऑप्टिकल फाइबर को स्पष्ट यूवी राल में डुबोएं और ऑप्टिकल फाइबर को माइक्रोलेंस सरणी पर रखें।
    3. एक यूवी दीपक का उपयोग करके राल का इलाज करें।
    4. एपॉक्सी का उपयोग करके 3 डी मुद्रित आवास में माइक्रोलेंस सरणी संलग्न करें।
  2. पेरफ्लोरोअल्कॉक्सी (पीएफए) -लेपित टंगस्टन तारों को संरेखित करें।
    1. 30 मिमी लंबे पीएफए टंगस्टन तारों के 4 टुकड़ों और 5-पिन, 1.27 मिमी पिच महिला कनेक्टर के लिए 1 चांदी के तार को मिलाप करें। संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में चांदी के तार का उपयोग करें।
    2. 1.27 मिमी पिच महिला कनेक्टर को हेडस्टेज प्रीएम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
    3. टंगस्टन इलेक्ट्रोड के ठीक संरेखण में मदद करने के लिए छेद (चित्रा 1 बी) के माध्यम से सिलिकॉन के माध्यम से टंगस्टन तारों को सावधानीपूर्वक रखें।
    4. ऑप्टिकल फाइबर लंबाई से 1 मिमी छोटे संरेखित टंगस्टन तारों को काटें।
    5. एपॉक्सी का उपयोग करके कनेक्टर को 3 डी मुद्रित आवास में संलग्न करें।
  3. एलईडी प्लेसमेंट
    1. एलईडी को 3 डी मुद्रित आवास में रखें।
    2. एलईडी को ड्राइविंग सर्किट से कनेक्ट करें जो पल्स चौड़ाई मॉडुलन (पीडब्ल्यूएम) उत्पन्न करता है।
      नोट: पीडब्ल्यूएम पल्स माइक्रोकंट्रोलर द्वारा उत्पन्न होता है।
    3. एलईडी ड्राइविंग सर्किट द्वारा प्रेरित शोर को देखते हुए, सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एलईडी ड्राइविंग सर्किट से 50 मिमी अलग हैं।
    4. एक फोटोडायोड का उपयोग करके ऑप्टिकल फाइबर टिप के अंत में प्रकाश की तीव्रता को मापें।
  4. 15 मिनट के लिए शराब में टंगस्टन इलेक्ट्रोड और ऑप्टिकल फाइबर विसर्जित करें। फिर बाँझ डीआई पानी में सिस्टम को विसर्जित करें और एथिलीन ऑक्साइड गैस के साथ निष्फल करें।

2. आरोपण सर्जरी (चित्रा 3 और चित्रा 4)

नोट: सर्जरी के दौरान बाँझ तकनीक का पालन किया जाना चाहिए।

  1. ट्रांसजेनिक जानवरों को तैयार करें, जिन्हें विशिष्ट प्रकार की न्यूरोनल कोशिकाओं में प्रकाश-संवेदनशील ऑप्सिन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जाता है।
    नोट: एक पुरुष, 2 महीने पुराना, ट्रांसजेनिक माउस व्यक्त चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) सीए2 + / शांतोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज द्वितीय-सकारात्मक न्यूरॉन्स (सीएएमकेआईआईआई:: सीएचआर 2 माउस) में इस अध्ययन41 में इस्तेमाल किया गया था।
  2. इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन द्वारा केटामाइन-ज़ाइलाज़िन कॉकटेल-केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के साथ माउस को संवेदनाहारी करें।
    1. मूंछ आंदोलन और पंजा चुटकी की प्रतिक्रिया की निगरानी करके हर 30 मिनट में संवेदनाहारी जानवर की जांच करें।
    2. यदि अतिरिक्त संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है तो प्रारंभिक खुराक के आधे हिस्से में केटामाइन-ज़ाइलाज़िन कॉकटेल इंजेक्ट करें।
  3. सिर की त्वचा दाढ़ी और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में संवेदनाहारी माउस जगह।
    नोट: सर्जिकल त्वचा की तैयारी और ड्रेप जानवर करें। त्वचा की तैयारी में रोगाणुरोधी एजेंटों के साथ त्वचा की सफाई के बाद बालों को हटाना शामिल है।
    1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के भीतर सिर की स्थिति और मीटस में कान सलाखों को डालें।
    2. सटीक स्थिति के लिए कान सलाखों को बार-बार ढीला और कसकर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस सिर को केंद्र में रखें।
    3. चीरा बार रखें ताकि ऊपरी कृन्तक सामने के अंदर के किनारे पर हुक करें।
    4. चीरा बार की ऊंचाई निर्धारित करने के लिए चीरा बार समायोजित करें, और थूथन के खिलाफ नाक क्लैंप को कस लें।
    5. सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए अग्रिम में स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में एम्बेडेड थर्मल हीटिंग पैड चालू करें।
    6. होमियोथर्मिक विनियमन के लिए माउस के मलाशय में थर्मल जांच रखो।
      नोट: कान बार प्लेसमेंट धीरे से लोभी और थूथन लहराते हुए की जाँच की जानी चाहिए। कान बार को समायोजित किया जाना चाहिए यदि थूथन को ~ 4 मिमी से अधिक पार्श्व में स्थानांतरित किया जा सकता है।
  4. सूखापन को रोकने के लिए पेट्रोलियम जेली ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ आंखों को कवर करें।
  5. खोपड़ी में 1% लिडोकेन इंजेक्ट करें। संदंश के साथ सिर की त्वचा लिफ्ट, एक इंजेक्शन अंतरिक्ष सुरक्षित, और खोपड़ी के नीचे लिडोकेन इंजेक्ट।
  6. स्केलपेल और महीन कैंची का उपयोग करके धनु चीरा लगाएं। सर्जिकल क्षेत्र की दृश्यता को व्यापक बनाने के लिए एक माइक्रोक्लैंप के साथ छिद्रित त्वचा को पकड़ो।
    नोट: चीरा लंबाई इंटरपेरिटल हड्डी के ब्रेग्मा और पुच्छल किनारे से <1 सेमी ऊपर है।
  7. कपास झाड़ू का उपयोग करके पेरीओस्टेम निकालें। यदि रक्तस्राव होता है, तो रक्त वाहिकाओं को सील करने के लिए बोवी का उपयोग करके खोपड़ी को कॉटराइज़ करें।
  8. नमकीन के साथ खोपड़ी को साफ करें और मैनिपुलेटर बांह का उपयोग करके क्रैनियोटॉमी साइटों को चिह्नित करें: हिप्पोकैम्पस पूर्वकाल-पीछे (एपी) -1.8 से -2.8 मिमी, औसत दर्जे का-पार्श्व (एमएल) 0.5-2.5 मिमी, और पृष्ठीय-उदर (डीवी) -1 से -2 मिमी।
    नोट: माउस खोपड़ी की मोटाई को ध्यान में रखते हुए, उजागर मस्तिष्क क्षेत्र से ऑप्ट्रोड सरणी -1.2 से -2.2 मिमी डालें। हिप्पोकैम्पस मार्ग को देखते हुए, सीए 3 की पिरामिड कोशिकाएं अपने अक्षतंतु को सीए 1 में भेजती हैं। इसलिए, ऑप्टिकल फाइबर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की तुलना में 1 मिमी लंबे होते हैं, ताकि ऑप्टिकल फाइबर को सीए 3 और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को सीए 1 में रखा जा सके।
  9. सेरिबैलम के ऊपर एक छेद ड्रिल करें और जमीन के लिए एक पेंच डालें। एक सटीक पेंच के साथ जमीन पेंच 0.5 मिमी गहरी रखो जब तक कि यह सेरिबैलम के शीर्ष तक नहीं पहुंच जाता।
    नोट: पेंच के तंग सम्मिलन को सुनिश्चित करें, जिसका उपयोग आरोपण की दीर्घकालिक स्थिरता को अधिकतम करने के लिए ग्राउंड इलेक्ट्रोड और एक सहायक संरचना के रूप में किया जाएगा, क्योंकि यह दंत सीमेंट के पालन के लिए तीन आयामी सतह को बढ़ाता है।
  10. चिह्नित क्षेत्र ड्रिल और संदंश के साथ खोपड़ी का एक टुकड़ा हटा दें।
  11. दक्षिणावर्त 120 ° के लिए एक 26 जी सुई टिप मोड़ो, और ऊपर की ओर सामना की सुई के बेवल पक्ष को सम्मिलित करके मस्तिष्क क्षेत्र का पर्दाफाश करें। सावधान रहें कि मस्तिष्क और रक्त वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचे।
  12. हड्डी की धूल और बाहरी पदार्थ को धोने के लिए नमकीन के साथ उजागर मस्तिष्क को साफ करें।
  13. मैनिपुलेटर बांह में ऑप्ट्रोड सरणी को ठीक करें और उजागर क्षेत्र के करीब जाएं।
    नोट: डिवाइस रखते समय, ब्रेग्मा से लक्ष्य क्षेत्र को फिर से परिकलित करने से प्लेसमेंट की सटीकता बढ़ सकती है।
  14. धीरे-धीरे ऑप्ट्रोड सरणी डालें और ग्राउंड स्क्रू को सिस्टम42 से जुड़े चांदी के तार से कनेक्ट करें।
    नोट: इस प्रक्रिया में, सम्मिलन के दौरान माइक्रोमोशन से मस्तिष्क क्षति को रोकने के लिए डगमगाहट को कम करने के लिए सरणी को मैनिपुलेटर बांह पर कसकर तय किया जाना चाहिए। सम्मिलन धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, मस्तिष्क की सूजन के लिए खाते में 10 मिनट के लिए आराम के साथ जो सम्मिलन के बाद दबाया जा सकता है। मस्तिष्क के ऊतकों में 1 μm / s के तहत सम्मिलन गति सिग्नल-टू-शोर अनुपात की उच्च गुणवत्ता और विभाज्य एकल इकाइयों की संख्या42 के लिए अनुशंसित है।
  15. यदि रक्तस्राव हो रहा है, तो सूखे कपास झाड़ू के साथ ब्लीडर पर सीधा दबाव लागू करें या कॉटरी का उपयोग करें। रक्तस्राव पूरी तरह से बंद होने तक अगले चरणों पर न जाएं।
  16. मस्तिष्क के साथ सीधे संपर्क से रसायनों की रक्षा के लिए उजागर मस्तिष्क और डिवाइस के बीच जेल फोम डालें।
    नोट: जेल फोम भी हेमोस्टेसिस में मदद करता है और मस्तिष्क को नम रखता है।
  17. जितना संभव हो सके नमी को हटाने के लिए कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी को पोंछें, और अगले निर्धारण चरण पर आगे बढ़ें।
  18. डिवाइस को ठीक करने और जेल फोम को कवर करने के लिए खोपड़ी पर दंत सीमेंट सावधानीपूर्वक लागू करें। दंत सीमेंट पूरी तरह से कठोर होने से पहले, दंत सीमेंट से जुड़े होने पर खोपड़ी को अलग करें। कठोर दंत सीमेंट को कवर करने और खोपड़ी को सीवन करने के लिए संदंश के साथ चीरा त्वचा खींचें। फिर, मैनिपुलेटर आर्म से डिवाइस को छोड़ दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि दंत सीमेंट त्वचा से चिपक नहीं जाता है और केवल खोपड़ी क्षेत्र को कवर करता है। जब त्वचा बढ़ती है, तो यह सीमेंट को दूर धकेल सकती है और अंततः, डिवाइस गिर जाएगी। यह विवो प्रयोगों में दीर्घकालिक के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या पैदा करेगा।

3. वसूली और प्रत्यारोपण देखभाल

  1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस को बाहर निकालें।
  2. 26 जी सुई का उपयोग करके कार्प्रोफेन समाधान का प्रशासन करें। दर्द को कम करने के लिए सर्जरी से पहले एक बार और 12 घंटे (दोपहर की सर्जरी के मामले में अगली सुबह) और सर्जरी के बाद 24 घंटे इंजेक्ट करें।
    नोट: बोतल में दवा एकाग्रता 50 मिलीग्राम / एमएल है, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। कार्प्रोफेन चिपचिपा है और बाँझ पानी 1:10 में पतला होने की आवश्यकता है। यदि बाँझपन बनाए रखा जाता है, तो समाधान को 4 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। दवा की प्रभावी अवधि को बनाए रखने के लिए, 12 घंटे के अंतराल पर कार्प्रोफेन समाधान इंजेक्ट करें।
  3. हीटिंग पैड पर माउस रखें और जांचें कि क्या यह संज्ञाहरण से अच्छी तरह से ठीक हो जाता है।
    नोट: जानवर को तब तक लावारिस नहीं छोड़ा जाता है जब तक कि वह पर्याप्त चेतना प्राप्त नहीं कर लेता।
  4. सर्जरी के 7 - 10 दिनों के बाद सिवनी धागे निकालें।
  5. जानवर को 1 सप्ताह के लिए ठीक होने दें। रिकवरी समय के दौरान भोजन और पानी के सेवन की निगरानी करें। एनाल्जेसिक का प्रशासन करें और असुविधा या दर्द के संकेतों की जांच करें।
    नोट: जिन जानवरों की सर्जरी हुई है, वे अन्य जानवरों के साथ तब तक नहीं रह सकते जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक न हो जाएं।
    1. वसूली अवधि के दौरान, वजन परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए हर दिन माउस का वजन। माउस का बलिदान करें (धारा 6 देखें) यदि उम्र और लिंग मिलान नियंत्रण जानवरों की तुलना में 20% वजन घटाने है।

4. ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

  1. माउस को संवेदनाहारी करें और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में संवेदनाहारी माउस रखें।
  2. उत्तेजना मापदंडों को सेट करें।
    1. प्रकाश पल्स नुस्खा को 4% शुल्क चक्र और 10 हर्ट्ज आवृत्ति43 पर सेट करें। तंत्रिका रिकॉर्डिंग के दौरान 2 एस (20 दालों) के लिए प्रकाश उत्तेजना स्थापित करें।
    2. ऑप्टिकल फाइबर टिप पर 3 मेगावाट / मिमी2 प्रकाश तीव्रता ड्राइव करने के लिए 50 एमए वर्तमान का उपयोग करें। एक फोटोडायोड और पावर मीटर का उपयोग करके प्रकाश शक्ति को मापें और ऑप्टिकल फाइबर पहलू क्षेत्र द्वारा प्रकाश शक्ति को विभाजित करें।
  3. प्लास्टिक कवर को उतारें और पुन: प्रयोज्य एलईडी और सर्किट के साथ प्रकाश वितरण प्रणाली वाले ऊपरी हिस्से को संलग्न करें।
  4. प्रत्यारोपित 5 पिन कनेक्टर के लिए हेडस्टेज प्रीम्पलीफायर कनेक्टर कनेक्ट करें।
  5. तंत्रिका संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ़्टवेयर खोलें।
  6. सॉफ़्टवेयर फ़िल्टर सेट करें. 0.1-20 किलोहर्ट्ज़ पर एक बैंडपास फ़िल्टर और 60 हर्ट्ज पर एक पायदान फ़िल्टर का उपयोग करें।
  7. रिकॉर्डिंग से पहले, जांचें कि तंत्रिका स्पाइक संकेतों का पता लगाया गया है या नहीं।
    नोट: शोर रद्द करना महत्वपूर्ण है क्योंकि तंत्रिका संकेत बहुत छोटे हैं। यदि शोर का स्तर बहुत अधिक है, तो तंत्रिका संकेत शोर से अस्पष्ट हो सकते हैं और अदृश्य हो सकते हैं। शोर को कम करने के लिए उपयुक्त ग्राउंडिंग और विद्युत चुम्बकीय तरंग परिरक्षण का उपयोग करें।
  8. सिग्नल चेक के बाद, बेसलाइन रिकॉर्डिंग के लिए प्रकाश उत्तेजना के बिना तंत्रिका संकेतों को रिकॉर्ड करें।
  9. एलईडी प्रकाश वितरित करें और एक साथ न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं (चित्रा 5 और चित्रा 6) रिकॉर्ड करें।
    नोट: एक बार उत्तेजित होने के बाद, अगले उत्तेजना प्रयोग को कम से कम 5 मिनट के अंतराल के बाद किया जाना चाहिए ताकि पिछले उत्तेजना द्वारा उत्पन्न न्यूरोनल गतिविधि अगले प्रयोग को प्रभावित न करे।

5. डेटा विश्लेषण

  1. मैटलैब प्रोग्राम का उपयोग करके अधिग्रहित डेटा लोड करें।
  2. स्पाइक सॉर्टिंग एल्गोरिथ्म "वेव-क्लूस" 44,45 का उपयोग करके एकल तंत्रिका गतिविधियां प्राप्त करें। समीकरण (1)45 के रूप में एक आयाम थ्रेशोल्ड द्वारा प्रत्येक चैनल में स्पाइक्स का पता लगाएं।
    थ्रेशोल्ड = 5 × माध्यिका Equation 1 (1)
    जहां एक्स बैंडपास-फ़िल्टर्ड सिग्नल है।
    1. "वेव-क्लूस" स्थापित करने के लिए, सामग्री की तालिका में डाउनलोड लिंक देखें।
    2. ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (जीयूआई) खोलने के लिए, MATLAB के कमांड प्रॉम्प्ट में wave_clus टाइप करें।
    3. स्पाइक डिटेक्शन Get_spikes लिए तैयार फ़ाइल एक्सटेंशन के लिए Get_spikes ( 'फ़ाइल नाम.एक्सटी') फ़ंक्शन टाइप करें। फिर, स्पाइक सॉर्टिंग के लिए Do_clustering ('filename_spikes.मैट') चलाएं।
  3. विशिष्ट समय डिब्बे के साथ प्रकाश उत्तेजना से पहले, दौरान और बाद में सॉर्ट किए गए स्पाइक्स की गणना करें। विश्लेषण के लिए 0.2 एस और 2 एस समय डिब्बे का उपयोग करें।
  4. प्रत्येक रिकॉर्डिंग चैनल से स्पाइक्स की संख्या प्लॉट करें।
    नोट: 8 दोहराया प्रयोगों के परिणामों से डेटा के साधनों (एसईएम) के मानक त्रुटि के साथ मतलब गणना और साजिश रची गई थी।

6. इच्छामृत्यु

  1. सभी प्रयोगों के बाद, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) साँस लेना द्वारा माउस बलिदान।
  2. कक्ष को प्रीचार्ज किए बिना, माउस को पारदर्शी इच्छामृत्यु कक्ष में रखें, सीओ2 आपूर्ति और /
  3. सीओ2 गैस चालू करें, और प्रति मिनट इच्छामृत्यु कक्ष हवा की मात्रा के 30 - 50% की दर से हवा को विस्थापित करें।
    नोट: एक फ्लोमीटर सीओ2 गैस सिलेंडर से जुड़ा होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वायु विस्थापन दर प्रति मिनट इच्छामृत्यु कक्ष की मात्रा का 30-50% है।
  4. श्वसन की कमी और बदल आंखों का रंग के लिए बलिदान माउस की निगरानी करें।
    नोट: इच्छामृत्यु के लिए अपेक्षित समय आमतौर पर 10 से 15 मिनट के भीतर होता है।
  5. मृत्यु के संकेतों को देखने के बाद, इच्छामृत्यु कक्ष से माउस को हटा दें।
  6. इच्छामृत्यु प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, श्वसन और कार्डियक गिरफ्तारी की पुष्टि करके मृत्यु को सत्यापित करें।

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Representative Results

ऑप्ट्रोड सिस्टम को लक्ष्य न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त प्रकाश शक्ति प्रदान करने के लिए सफलतापूर्वक गढ़ा गया है। टंगस्टन इलेक्ट्रोड का ठीक संरेखण छेद के माध्यम से माइक्रोफैब्रिकेटेड सिलिकॉन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। मापा प्रकाश तीव्रता ऑप्टिकल फाइबर टिप पर 3.6 मेगावाट / मिमी2 है जब 50 एमए वर्तमान लागू किया जाता है। माइक्रोलेंस ने प्रकाश दक्षता में 3.13 डीबी की वृद्धि की। माइक्रोलेंस सरणी के कारण, जो प्रकाश युग्मन को बढ़ाता है, लागू वर्तमान माइक्रोलेंस सरणी प्रणाली के बिना एक ही प्रकाश तीव्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक वर्तमान का लगभग आधा है। चूंकि एलईडी अधिक वर्तमान के साथ अधिक गर्मी उत्पन्न करता है, इसलिए डिवाइस की गर्मी को कम करने के लिए माइक्रोलेंस सरणी को नियोजित करना स्पष्ट रूप से फायदेमंद है। 4 इलेक्ट्रोड की औसत प्रतिबाधा 1 किलोहर्ट्ज आवृत्ति पर 71.39 kΩ थी, जो एक्शन पोटेंशिअल का पता लगाने के लिए काफी कम है। इसके अलावा, ऑप्ट्रोड सरणी में लागत को कम करने और आरोपण के कुल वजन को कम करने के लिए डिस्पोजेबल और पुन: प्रयोज्य भाग शामिल हैं। डिस्पोजेबल भाग का वजन ~ 0.58 ग्राम है।

एक कैमकेआईआई :: सीएचआर 2 माउस का उपयोग सीधे सीएचआर 2-व्यक्त न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने के लिए किया गया था, और विकसित तंत्रिका स्पाइक्स सफलतापूर्वक दर्ज किए गए थे, जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है। हमने सटीक स्थितियों के साथ पूरे रिकॉर्ड किए गए तरंगों को दिखाया, जिसमें बीच में 2 एस लाइट-ऑन अवधि (चित्रा 6 ए) शामिल है। कच्चे डेटा सिग्नल से स्पाइक सॉर्टिंग एक कस्टम-निर्मित मैटलैब स्रोत कोड का उपयोग करके आयोजित की गई थी। दो अलग-अलग इकाइयों को छांटने के बाद कुल तंत्रिका गतिविधि का विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक प्रकाश उत्तेजना नाड़ी के बाद व्यक्तिगत तंत्रिका स्पाइक्स की संख्या बेसलाइन (चित्रा 6 ए, बी) की तुलना में काफी बढ़ गई, जिसमें 2 एस और 0.2 एस के अलग-अलग समय डिब्बे थे। नतीजतन, हम न्यूरॉन्स पर ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के स्पष्ट प्रभाव की पहचान कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्ट्रोड सरणी और माइक्रोलेंस सरणी का योजनाबद्ध आरेख( ए) 3 डी योजनाबद्ध दृश्य और क्रॉससेक्शनल दृश्य; (बी) 4X4 माइक्रोलेंस सरणी और सिलिकॉन विआस की एसईएम छवि। स्केल बार = 1 मिमी (बी)। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ऑप्ट्रोड सिस्टम का डिवाइस प्रोटोटाइप. (ए) सिस्टम का संपूर्ण दृश्य। (बी) ऑप्ट्रोड सरणी का बढ़ा हुआ दृश्य। स्केल बार = 5 मिमी (ए), 2 मिमी (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्यारोपण सर्जरी ( ए) खोपड़ी को पेरीओस्टेम को हटाकर उजागर और साफ किया जाता है। (बी) लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र को उजागर किया गया था, और सेरिबैलम के ऊपर ग्राउंड स्क्रू डाला गया था। (सी) गहराई को लक्षित करने के लिए मस्तिष्क में ऑप्ट्रोड सरणी डाली गई थी। ग्राउंड विद्युत रूप से जुड़ा हुआ था। (डी) डिवाइस को ठीक करने के लिए डेंटल सीमेंट लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: प्रशासन, संचालन और विवो प्रयोग समयरेखा का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग सिस्टम का प्रायोगिक सेटअप( ए) एलईडी लाइट ऑफ, (बी) एलईडी लाइट ऑन। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग परिणाम (ए) लाल धराशायी आयत में तंत्रिका रिकॉर्डिंग और बढ़े हुए तरंग के प्रतिनिधि तरंग दो प्रकाश उत्तेजनाओं (नीली सलाखों) और क्रमबद्ध स्पाइक्स (लाल और काले तीरहेड्स) का संकेत देते हैं। (बी) प्रकाश उत्तेजना से पहले, दौरान और बाद में प्रत्येक चैनल के लिए स्पाइक हिस्टोग्राम। इनसेट आंकड़ा प्रत्यारोपित ऑप्ट्रोड सरणी के स्थान को इंगित करता है। (सी) 100 एमएस टाइम बिन के साथ स्पाइक हिस्टोग्राम। ब्लू बार एलईडी लाइट की अवधि को इंगित करता है। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक साथ ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सिस्टम की व्यवहार्यता सत्यापित की गई थी (चित्रा 6)। प्रकाश उत्तेजना के दौरान बड़े स्पाइक्स प्रकाश उत्तेजना (चित्रा 6 ए) के रूप में एक ही समय में होने वाली फोटोइलेक्ट्रिक कलाकृतियां हैं। यह लाल धराशायी आयत (चित्रा 6 ए) में तरंग के ज़ूम किए गए दृश्य में स्पष्ट है। जैसा कि चित्रा 6 ए में दिखाया गया है, फोटोइलेक्ट्रिकल कलाकृतियों को रिकॉर्ड किए गए तरंगों से स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है, और हिप्पोकैम्पस सिग्नल मार्ग के ऑप्टोजेनेटिक्स उत्तेजना से प्रेरित न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट रूप से पहचाना गया था। चित्रा 6 बी, सी स्पाइक्स की संख्या को इंगित करता है, उत्तेजना प्रभाव को स्पष्ट रूप से दिखाता है। चित्रा 6 ए चित्रा 6 बी, सी में हिस्टोग्राम प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली तरंगों में से एक है, क्योंकि रिकॉर्डिंग परिणाम 8 दोहराए गए रिकॉर्डिंग सत्रों से प्राप्त होते हैं।

चित्रा 6 ए तंत्रिका गतिविधि में प्रकाश प्रेरित वृद्धि को दर्शाता है। हमने सीएचआर 2 अभिव्यक्ति के बिना नियंत्रण चूहों के साथ एक ही प्रयोग किया है। उस स्थिति में, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना ने तंत्रिका गतिविधि में वृद्धि नहीं की। चूंकि फोटोइलेक्ट्रिकल कलाकृतियों को रिकॉर्डिंग डेटा से आसानी से बाहर रखा जाता है, इसलिए नियंत्रण जानवर का परिणाम पांडुलिपि में शामिल नहीं है। इसके अलावा, 4 चैनलों के बीच रिकॉर्डिंग परिणामों में अंतर, जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है, इस बात पर विचार करके उचित ठहराया जा सकता है कि टंगस्टन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी 300 μm (केंद्र-से-केंद्र) है। यह संभावना है कि विभिन्न चैनलों में स्पाइक गतिविधियां विभिन्न न्यूरॉन्स से हैं। हालांकि, क्योंकि न्यूरोनल कोशिकाएं जुड़ी हुई हैं, विशेष रूप से स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्र में, न्यूरोनल स्पाइकिंग के समग्र पैटर्न समान थे लेकिन बिल्कुल समान नहीं थे।

इन पशु प्रयोगों की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, आरोपण सर्जरी के दौरान कई महत्वपूर्ण चरणों को उच्च सटीकता और अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं से रक्तस्राव को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए। अगले चरणों को तब तक जारी न रखें जब तक कि रक्तस्राव पूरी तरह से बंद न हो जाए। यह मस्तिष्क पर प्रत्यारोपित डिवाइस के फर्म लगाव और सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान स्पष्ट दृश्यता की अनुमति देगा। एक बोवी के साथ रक्तस्राव के धब्बों को कॉटराइज करना, खारा के साथ स्टरलाइज़ करना, और जेल फोम डालना रक्तस्राव को रोकने में सहायक हो सकता है।

दूसरा, ऑप्ट्रोड आरोपण के दौरान माउस मस्तिष्क को सूखापन से संरक्षित किया जाना चाहिए। नम रखने के लिए नमकीन और जेल फोम का उपयोग किया जाता है। यदि ड्यूरा झिल्ली को हटा दिया जाता है और मस्तिष्क पूरी तरह से उजागर हो जाता है, तो अन्य सर्जिकल चरणों को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। तीसरा, ऑप्ट्रोड की धीमी सम्मिलन गति भी महत्वपूर्ण है। धीमी प्रविष्टि ऊतक क्षति को कम करती है और लक्षित स्थान46 में आरोपण की सटीकता में सुधार करती है। चूंकि ऑप्ट्रोड सम्मिलन के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों का विरूपण अपरिहार्य है, इसलिए विकृत ऊतक के लिए अपने मूल आकार और मात्रा को बहाल करने के लिए धीमी गति से सम्मिलन बहुत उपयोगी है।

चौथा, निर्धारण प्रक्रिया दीर्घकालिक स्थिरता निर्धारित करती है। बेहतर, दीर्घकालिक लगाव के लिए दंत सीमेंट को जमने से पहले खोपड़ी की सतह को सूखा बनाना सहायक होता है। इसके अलावा, बहुत अधिक दंत सीमेंट लगाने या सीमेंट को सीधे त्वचा पर चिपकने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। जैसे-जैसे त्वचा समय के साथ पुनर्जीवित होती है, यह धीरे-धीरे खोपड़ी से सीमेंट को धक्का और अलग कर सकती है क्योंकि त्वचा बढ़ती है। इसके अलावा, मस्तिष्क के ऊतकों के साथ दंत सीमेंट के सीधे संपर्क से बचा जाना चाहिए क्योंकि दंत सीमेंट मस्तिष्क के ऊतकों के लिए हानिकारक है। यह उजागर मस्तिष्क और डिवाइस के बीच जेल फोम सम्मिलन द्वारा प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है।

सर्जिकल प्रक्रियाओं के अलावा, प्रयोगों को शुरू करने से पहले ऑप्ट्रोड सिस्टम को सावधानीपूर्वक जांचा जाना चाहिए। सबसे पहले, ऑप्टिकल फाइबर सरणी और इलेक्ट्रोड के प्रत्यारोपण योग्य भाग को सम्मिलन से पहले माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जानी चाहिए। यह जांचना आवश्यक है कि क्या ऑप्टिकल फाइबर में कोई टूटना है क्योंकि यहां तक कि एक छोटी सी दरार भी महत्वपूर्ण प्रकाश हानि का कारण बन सकती है। इसके अलावा, ऑप्टिक फाइबर और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच संरेखण को सटीक सम्मिलन के लिए जांचा जाना चाहिए। ठीक संदंश अपने गलत संरेखण को सुधारने के लिए टंगस्टन इलेक्ट्रोड को बारीकी से मोड़ सकते हैं।

दूसरा, आरोपण सर्जरी से पहले प्रकाश की तीव्रता की जांच की जानी चाहिए ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्रकाश शक्ति थ्रेसहोल्ड से ऊपर है और ऑप्सिन को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। व्यवहार में, यह ज्ञात है कि सीएचआर 2 के लिए उत्तेजना सीमा लगभग 1 मेगावाट / हालांकि, न्यूरोनल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त प्रकाश तीव्रता प्रदान करते हुए प्रकाश-जनित ऊतक हीटिंग को कम किया जाना चाहिए। बहुत मजबूत प्रकाश ऊर्जा तापमान में वृद्धि के कारण मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकती है। मस्तिष्क में 6-8 डिग्री सेल्सियस की तापमान वृद्धि तत्काल और अपरिवर्तनीय ऊतक क्षति12,48 का कारण बन सकती है। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि ऑप्टिकल फाइबर टिप पर तापमान वृद्धि 0.5 डिग्री सेल्सियस49 से कम है। एक छोटी अवधि के साथ ऑप्टिकल उत्तेजना का एक कम कर्तव्य चक्र सहायक हो सकता है। ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ तापमान के मुद्दों की रिपोर्ट करने वाले पिछले अध्ययनों की तुलना में, हमारी आउटपुट पावर (2 मेगावाट / मिमी 2) और2 सेकंड के लिए 20 हर्ट्ज पर 4 एमएस के साथ प्रकाश उत्तेजना के साथ प्रोटोकॉल उपयुक्त और सुरक्षित सीमा के भीतर है।

तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए एक बड़ी चुनौती ऑप्टिकल उत्तेजना द्वारा प्रेरित कलाकृतियों को हटाना है। ऑप्टिकल उत्तेजना के साथ तुल्यकालिक कलाकृतियों को कई अलग-अलग पहलुओं में माना जाना चाहिए क्योंकि विद्युत और ऑप्टिकल तंत्र दोनों इन कलाकृतियों को उत्पन्न कर सकते हैं। सबसे पहले, विद्युत कलाकृतियों एलईडी ड्राइविंग विद्युत सर्किट के कारण हो सकता है। जब प्रकाश उत्तेजना को चलाने के लिए एक सर्किट में एक विद्युत प्रवाह प्रवाहित होता है, तो विद्युत कलाकृतियां उत्पन्न हो सकती हैं। एलईडी कनेक्शन के लिए तारों की संख्या को कम करके और प्रकाश उत्तेजना सर्किट और टंगस्टन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से जुड़े तारों के बीच की दूरी को अधिकतम करके इस समस्या को दूर किया जा सकता है। दूसरा, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के दौरान फोटोइलेक्ट्रोकेमिकल प्रभाव द्वारा फोटोइलेक्ट्रिक कलाकृतियों को उत्पन्न किया जा सकता है। उत्तेजना प्रकाश के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के प्रत्यक्ष संपर्क से बचने और ऑप्टिकल फाइबर और इलेक्ट्रोड के बीच रिक्ति को बढ़ाकर इन कलाकृतियों को कम किया जा सकता है। हालांकि, मस्तिष्क के ऊतकों में प्रकाश बिखरने के कारण प्रकाश-प्रेरित कलाकृतियों को खत्म करना मुश्किल है।

प्रस्तावित ऑप्ट्रोड सरणी में अभी भी सीमाएं हैं, जिन्हें भविष्य के अध्ययनों में सुधार किया जा सकता है। यद्यपि ऑप्टिक फाइबर टिप को इस अध्ययन में फ्लैट काट दिया गया था, फाइबर युक्तियों के बेवलिंग या टेपरिंग सम्मिलन के दौरान ऊतक क्षति को कम करेगा और युक्तियों50 से फैलने वाले प्रकाश के कोण को बढ़ाएगा। एक और सीमा कम प्रकाश तीव्रता है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के परिणामों के बावजूद, प्रस्तावित प्रणाली में लेजर-आधारित प्रणाली की तुलना में अपेक्षाकृत कम आउटपुट पावर है। इसलिए, प्रस्तावित एलईडी-आधारित प्रणाली लेजर-आधारित प्रणाली की तुलना में एक छोटे मस्तिष्क क्षेत्र को उत्तेजित कर सकती है। यह मुख्य रूप से है क्योंकि अधिकांश एल ई डी में सामान्य रूप से लेजर की तुलना में बहुत कम शक्ति होती है। हालांकि, जैसा कि एल ई डी की दक्षता और अधिकतम तीव्रता में हाल ही में नाटकीय रूप से सुधार हुआ है, उच्च आउटपुट पावर वाले एलईडी को नई अर्धचालक प्रौद्योगिकियों के साथ विकसित किया जा सकता है। दूसरी सीमा यह है कि एक अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग अध्ययन नहीं किया गया था। हालांकि, यह पुष्टि की गई थी कि डिवाइस एक महीने के लिए चूहों से अच्छी तरह से जुड़ा हुआ था। यह परिणाम इस संभावना को दर्शाता है कि डिवाइस दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए उपयुक्त है। इसलिए, डिवाइस की स्थिरता को सत्यापित करने के लिए विवो परीक्षणों में दीर्घकालिक आयोजित किया जाएगा।

प्रयोगशालाओं में ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए सबसे विशिष्ट तरीका प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर प्रणाली का उपयोग करना है। यद्यपि एक लेजर ऑप्सिन को सक्रिय करने के लिए एल ई डी की तुलना में उच्च आउटपुट शक्ति प्रदान कर सकता है, लेजर-आधारित प्रणाली को आसानी से छोटा नहीं किया जा सकता है और उच्च लागत वाले कार्यान्वयन की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, एलईडी-आधारित ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के कई फायदे हैं, जैसे कि कम सिस्टम जटिलता, लागत-प्रभावशीलता और कम बिजली की खपत, जो वायरलेस सिस्टम के विकास के लिए फायदेमंद हैं। इसलिए, इस अध्ययन में, एलईडी को प्रकाश स्रोत के रूप में नियोजित किया जाता है, और एलईडी की प्रकाश तीव्रता बढ़ाने के लिए माइक्रोलेंस सरणी को अपनाया जाता है।

इसके अलावा, प्रकाश स्रोत और वर्तमान ड्राइविंग सर्किट में सिस्टम के वियोज्य और पुन: प्रयोज्य भाग शामिल हैं। विभिन्न तरंग दैर्ध्य वाले नए एल ई डी को सरल प्रतिस्थापन द्वारा डिवाइस में आसानी से उपयोग किया जा सकता है, और कई प्रयोगों में पुन: उपयोग के कारण सिस्टम लागत को काफी कम किया जा सकता है। पूरे सिस्टम को वायरलेस सिस्टम के रूप में आगे लागू किया जा सकता है, जो ऑप्टोजेनेटिक रूप से छोटे एकीकृत डिवाइस में कम-पावर वायरलेस सिस्टम को अपनाकर टेथर्ड लाइनों के बिना न्यूरोनल सिग्नल को उत्तेजित और रिकॉर्ड करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से मानव संवर्धन के लिए अभिसरण प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (एनआरएफ -2019 एम 3 सी 1 बी 80 9 0805) द्वारा वित्त पोषित था, और कोरिया सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित था (संख्या 2019 आर 1 ए 2 सी 1088909)। हम ट्रांसजेनिक चूहों को प्रदान करने के लिए जैविक विज्ञान विभाग, केएआईएसटी, डेजियोन, कोरिया में सेउंग-ही ली की प्रयोगशाला का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

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तंत्रिका विज्ञान अंक 187
एक साथ ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन और इलेक्ट्रिकल न्यूरल रिकॉर्डिंग के लिए ऑप्ट्रोड ऐरे
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., … More

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

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