Summary
Här presenterar vi tillverkningsmetoden för ett optrodsystem med optiska fibrer för ljusleverans och en elektroduppsättning för neural inspelning. In vivo-experiment med transgena möss som uttrycker channelrhodopsin-2 visar systemets genomförbarhet för samtidig optogenetisk stimulering och elektrofysiologisk registrering.
Abstract
Under det senaste decenniet har optogenetik blivit ett viktigt verktyg för undersökning av neural signalering på grund av dess unika förmåga till selektiv neural modulering eller övervakning. Eftersom specifika typer av neuronala celler kan modifieras genetiskt för att uttrycka opsinproteiner, möjliggör optogenetik optisk stimulering eller hämning av de valda neuronerna. Det har skett flera tekniska framsteg inom det optiska systemet för optogenetik. Nyligen föreslogs att kombinera den optiska vågledaren för ljusleverans med elektrofysiologisk inspelning för att samtidigt övervaka de neurala svaren på optogenetisk stimulering eller hämning. I denna studie utvecklades en implanterbar optroduppsättning (2x2 optiska fibrer) med inbäddade flerkanaliga elektroder.
En lysdiod (LED) användes som ljuskälla, och en mikrofabricerad mikrolinsuppsättning integrerades för att ge tillräcklig ljuskraft vid spetsen av de optiska fibrerna. Optrode array-systemet består av engångsdelen och den återanvändbara delen. Engångsdelen har optiska fibrer och elektroder, medan den återanvändbara delen har LED och elektroniska kretsar för ljusstyrning och neural signalbehandling. Den nya designen av det implanterbara optrod-arraysystemet introduceras i den medföljande videon utöver proceduren för optrodimplantationskirurgi, optogenetisk ljusstimulering och elektrofysiologisk neural inspelning. Resultaten av in vivo-experiment visade framgångsrikt tidslåsta neurala spikar som framkallades av ljusstimuli från hippocampus excitatoriska neuroner hos möss.
Introduction
Inspelning och kontroll av neural aktivitet är avgörande för att förstå hur hjärnan fungerar i ett neuralt nätverk och på cellulära nivåer. Konventionella elektrofysiologiska inspelningsmetoder inkluderar patchklämman 1,2,3,4 med användning av en mikropipett och extracellulär inspelning med mikroneuralelektroder 5,6,7,8. Som en neuromoduleringsmetod har elektrisk stimulering ofta använts för att direkt stimulera en fokal hjärnregion genom direkt eller indirekt depolarisering av neuronala celler. Den elektriska metoden kan emellertid inte skilja neuronala celltyper för inspelning eller stimulering eftersom de elektriska strömmarna sprids i alla riktningar.
Som en framväxande teknik har optogenetik inlett en ny era för att förstå hur nervsystemet fungerar 9,10,11,12,13,14,15,16. Kärnan i optogenetiska tekniker är att använda ljus för att kontrollera aktiviteten hos ljuskänsliga opsinproteiner uttryckta av genetiskt modifierade celler. Optogenetik möjliggör således sofistikerad modulering eller övervakning av genetiskt utvalda celler i komplicerade neurala kretsar14,17. Den bredare användningen av det optogenetiska tillvägagångssättet har krävt samtidig neural inspelning för att direkt bekräfta optisk neuromodulering. Därför skulle en integrerad enhet med ljusstyrnings- och inspelningsfunktioner vara extremt värdefull 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Det finns begränsningar för konventionell, laserbaserad optogenetisk stimulering, vilket kräver ett skrymmande och dyrt ljusleveranssystem 26,27,28,29,30. Därför använde vissa forskargrupper μLED-baserade kiselprober för att minimera storleken på ljusleveranssystemet 31,32,33,34. Emellertid, Det finns en risk för termisk hjärnskada orsakad av direktkontakt med μLEDs på grund av lysdiodernas låga enomvandlingseffektivitet. Lätta vågledare, såsom optiska fibrer, SU-8 och kiseloxynitrid (SiON), har applicerats för att undvika termisk skada 30,35,36,37,38,39. Emellertid, denna strategi har också en nackdel på grund av dess låga kopplingseffektivitet mellan ljuskällor och vågledarna.
Mikrolinsarrayen introducerades tidigare för att förbättra ljuskopplingseffektiviteten mellan lysdioder och optiska fibrer40. Ett optrodsystem utvecklades baserat på mikroelektromekaniska system (MEMS) för optisk stimulering och elektrisk inspelning på mikroskala40. Mikrolensuppsättningen mellan en LED och optiska fibrer ökade ljuseffektiviteten med 3,13 dB. Som visas i figur 1 är en 2x2 optisk fibermatris inriktad på 4x4 mikrolens array, och lysdioden är placerad under mikrolens array. De 2x2 optiska fibrerna är monterade istället för 4x4 för att minska hjärnskador. En volframelektroduppsättning är placerad intill optrodmatrisen med användning av kisel via hål för elektrofysiologisk inspelning (figur 1B).
Systemet består av en övre engångsdel och avtagbara bottendelar. Den övre engångsdelen, som inkluderar den optiska fiberuppsättningen, mikrolensuppsättningen och volframelektroduppsättningen, är utformad för att implanteras permanent i hjärnan för in vivo-experiment . Den nedre delen innehåller en LED-ljuskälla och en extern strömförsörjningsledning, som lätt kan tas bort och återanvändas för ett annat djurförsök. Ett fästbart plastlock skyddar engångsdelen när den avtagbara delen tas bort.
Systemets genomförbarhet verifieras genom implantation i hjärnan hos transgena möss som uttrycker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/kalmodulinberoende proteinkinas II-positiva nervceller (CaMKIIα::ChR2 mus). Inspelningselektroder användes för att registrera neurala aktiviteter från enskilda neuroner under optisk stimulering av neuronerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvården och kirurgiska ingrepp godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Ewha Womans University (nr 20-029).
1. Beredning av en optrodmatris (figur 1 och figur 2)
- Fäst optiska fibrer med mikrolinsarrayen.
- Ta bort passiveringsbeläggningen på den optiska fibern och skär den i 5 mm långa bitar med en optisk precisionsfiberklyvare.
- Doppa den optiska fibern i det klara UV-hartset och placera de optiska fibrerna på mikrolensuppsättningen.
- Härda hartset med en UV-lampa.
- Fäst mikrolinsarrayen på det 3D-tryckta huset med epoxi.
- Rikta in perfluoralkoxi (PFA) -belagda volframtrådar.
- Löd de 4 bitarna av 30 mm långa PFA-volframtrådar och 1 silvertråd till den 5-poliga, 1,27 mm tonhöjds honkontakten. Använd silvertråd som referenselektrod.
- Anslut 1,27 mm stigningshandtaget till huvudstegsförförstärkaren.
- Sätt försiktigt volframtrådar genom kiseln via hålen (figur 1B) för att hjälpa till att finjustera inriktningen av volframelektroderna.
- Skär de inriktade volframtrådarna 1 mm kortare än den optiska fiberlängden.
- Fäst kontakten på det 3D-tryckta huset med epoxi.
- LED-placering
- Placera lysdioden i det 3D-tryckta höljet.
- Anslut lysdioden till drivkretsen som genererar pulsbreddsmodulering (PWM).
OBS: PWM-pulsen genereras av mikrokontrollern. - Med tanke på bullret som induceras av LED-körkretsen, se till att inspelningselektroderna är 50 mm från LED-körkretsen.
- Mät ljusintensiteten i slutet av den optiska fiberspetsen med en fotodiod.
- Sänk ner volframelektroderna och de optiska fibrerna i alkohol i 15 minuter. Sänk sedan ner systemet i sterilt D.I-vatten och sterilisera med etylenoxidgas.
2. Implantationskirurgi (figur 3 och figur 4)
OBS: Steril teknik måste följas under operationen.
- Förbered de transgena djuren, som är genetiskt modifierade för att uttrycka ljuskänsliga opsinproteiner i den specifika typen av neuronala celler.
OBS: En manlig, 2 månader gammal, transgen mus som uttrycker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/kalmodulinberoende proteinkinas II-positiva nervceller (CaMKIIα::ChR2 mus) användes i denna studie41. - Bedöva musen med en ketamin-xylazincocktail - en blandning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) - genom intraperitoneal administrering.
- Kontrollera det sövda djuret var 30: e minut genom att övervaka morrhårens rörelse och reaktion på tass nypa.
- Injicera ketamin-xylazincocktailen vid hälften av den initiala dosen om ytterligare anestesi behövs.
- Raka huvudhuden och placera den sövda musen i den stereotaktiska ramen.
OBS: Utför kirurgisk hudförberedelse och draperingsdjur. Hudberedning innebär hårborttagning följt av rengöring av huden med antimikrobiella medel.- Placera huvudet i den stereotaktiska ramen och sätt in öronstänger i meatus.
- Centrera mushuvudet i den stereotaktiska ramen genom att upprepade gånger lossa och dra åt öronstängerna för exakt positionering.
- Placera framtänderna så att de övre framtänderna hakar över den främre innerkanten.
- Justera framtänderstången för att ställa in höjden på framtänderna och dra åt näsklämman mot nosen.
- Slå på värmedynan inbäddad i den stereotaktiska ramen i förväg för att hålla kroppstemperaturen vid 37 °C under hela operationen.
- Sätt den termiska sonden i musens rektum för homeoterm reglering.
OBS: Öronstångens placering måste kontrolleras genom att försiktigt ta tag i och svänga nosen. Hörselstången måste justeras om nosen kan flyttas mer än ~4 mm i sidled.
- Täck ögonen med vaselin (se materialförteckningen) för att förhindra torrhet.
- Injicera 1% lidokain i hårbotten. Lyft huvudets hud med pincett, säkra ett injektionsutrymme och injicera lidokainen under hårbotten.
- Utför ett sagittalt snitt med en skalpell och fin sax. Håll den snittade huden med en mikroklamp för att bredda synligheten för det kirurgiska området.
OBS: Snittlängden är <1 cm över bregma och kaudal kant på det interparietala benet. - Ta bort periosteum med bomullspinne. Om det blöder, cauterize skallen med en bovie för att försegla blodkärlen.
- Rengör skallen med saltlösning och markera kraniotomiplatserna med en manipulatorarm: hippocampus Anterior-Posterior (AP) −1,8 till −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm och Dorsal-Ventral (DV) −1 till −2 mm.
OBS: Med tanke på tjockleken på musskallen, sätt in optrode-matrisen -1,2 till -2,2 mm från det exponerade hjärnområdet. Med tanke på hippocampusvägen skickar pyramidala celler av CA3 sina axoner till CA1. Därför är optiska fibrer 1 mm längre än inspelningselektroder, så att de optiska fibrerna placeras i CA3 och inspelningselektroderna i CA1. - Borra ett hål ovanför lillhjärnan och sätt in en skruv för marken. Sätt markskruven 0,5 mm djup med en precisionsskruv tills den når toppen av lillhjärnan.
OBS: Se till att skruven sätts in ordentligt, som kommer att användas som en jordelektrod och en bärande struktur för att maximera implantationens långsiktiga stabilitet, eftersom den ökar den tredimensionella ytan för vidhäftning av tandcementet. - Borra det markerade området och ta bort en bit av skallen med pincett.
- Böj en 26 G nålspets till medurs 120 ° och exponera hjärnområdet genom att sätta in den avfasade sidan av nålen uppåt. Var försiktig så att du inte skadar hjärnan och blodkärlen.
- Rengör den exponerade hjärnan med saltlösning för att tvätta bort bendamm och främmande ämnen.
- Fixa optrode-matrisen i manipulatorarmen och flytta nära det exponerade området.
OBS: När du placerar enheten kan omräkning av målområdet igen från bregma öka placeringens noggrannhet. - Sätt långsamt in optrode-matrisen och anslut jordskruven till silvertråden som är ansluten till systemet42.
OBS: I denna process måste matrisen vara ordentligt fastsatt på manipulatorarmen för att minimera wobbling för att förhindra hjärnskador från mikrorörelse under insättning. Insättning måste utföras långsamt, med vila i 10 minuter för att ta hänsyn till svullnad i hjärnan som kan ha pressats efter insättning. Insättningshastighet under 1 μm/s i hjärnvävnaden rekommenderas för den höga kvaliteten på signal-brusförhållandet och antalet separerbara enskilda enheter42. - Om det blöder, applicera direkt tryck på blödningar med en torr bomullspinne eller använd cautery. Gå inte vidare till nästa steg förrän blödningen är helt stoppad.
- Sätt in gelskum mellan den exponerade hjärnan och enheten för att skydda kemikalier från direktkontakt med hjärnan.
OBS: Gelskum hjälper också hemostas och håller hjärnan fuktig. - Torka av skallen med bomullspinne för att ta bort fukt så mycket som möjligt och fortsätt till nästa fixeringssteg.
- Applicera försiktigt tandcement på skallen för att fixera enheten och täck gelskummet. Innan tandcementet är helt härdat, separera hårbotten om det är fäst vid tandcement. Dra i den snittade huden med pincett för att täcka den härdade tandcementen och suturera hårbotten. Släpp sedan enheten från manipulatorarmen.
OBS: Se till att tandcementet inte fastnar på huden och bara täcker skalleområdet. När huden växer kan den skjuta bort cementet och så småningom kommer enheten att falla av. Detta kommer att orsaka ett kritiskt problem för långsiktiga in vivo-experiment .
3. Återhämtning och implantatvård
- Ta musen ur den stereotaktiska ramen.
- Administrera Carprofen-lösningen med en 26 G nål. Injicera en gång före operationen och 12 timmar (nästa morgon vid eftermiddagskirurgi) och 24 timmar efter operationen för att minska smärta.
OBS: Läkemedelskoncentrationen i flaskan är 50 mg/ml och förvaras vid 4 °C. Carprofen är viskös och måste spädas i sterilt vatten 1:10. Om steriliteten bibehålls kan lösningen förvaras i upp till 4 veckor. För att bibehålla läkemedlets effektiva varaktighet, injicera Carprofen-lösningen med 12 timmars intervall. - Placera musen på värmedynan och kontrollera om den återhämtar sig väl från anestesin.
NOTERA: Djuret lämnas inte utan uppsikt förrän det återfår tillräckligt medvetande. - Ta bort suturtrådarna 7 - 10 dagar efter operationen.
- Låt djuret återhämta sig i 1 vecka. Övervaka mat- och vattenintag under återhämtningstiden. Administrera smärtstillande medel och kontrollera om det finns tecken på obehag eller smärta.
OBS: De djur som har opererats kan inte stanna hos de andra djuren förrän de återhämtar sig helt.- Under återhämtningsperioden väger du musen varje dag för att kontrollera om det finns viktförändringar. Offra musen (se avsnitt 6) om det finns 20% viktminskning jämfört med ålder och kön matchade kontrolldjur.
4. Optogenetisk stimulering och elektrofysiologisk registrering
- Bedöva musen och placera den sövda musen i den stereotaktiska ramen.
- Ställ in stimuleringsparametrarna.
- Ställ in ljuspulsreceptet på 4% arbetscykel och 10 Hz frekvens43. Ställ in ljusstimuleringen i 2 s (20 pulser) under neural inspelning.
- Använd en ström på 50 mA för att driva 3 mW/mm2 ljusintensitet vid den optiska fiberspetsen. Mät ljuseffekten med hjälp av en fotodiod- och effektmätare och dela ljuseffekten med det optiska fiberfasettområdet.
- Ta av plastkåpan och fäst den övre delen som innehåller ljustillförselsystemet med den återanvändbara lysdioden och kretsarna.
- Anslut huvudstegsförförstärkaren till den implanterade 5-poliga kontakten.
- Öppna programvaran för att spela in neurala signaler.
- Ställ in programvarufiltren. Använd ett bandpassfilter på 0,1-20 kHz och ett hackfilter på 60 Hz. Ställ in förstärkarens samplingsfrekvens på 20 kHz.
- Innan inspelningen, kontrollera om de neurala spiksignalerna detekteras.
OBS: Brusreducering är viktigt eftersom neurala signaler är för små. Om ljudnivån är för hög kan neurala signaler döljas av brus och bli osynliga. Använd lämplig jordning och elektromagnetisk vågskärmning för att minska bruset. - Efter signalkontrollen registrerar du neurala signaler utan ljusstimulering för baslinjeinspelning.
- Leverera LED-ljus och registrera samtidigt neuronala svar (figur 5 och figur 6).
OBS: När det har stimulerats måste nästa stimuleringsexperiment utföras efter ett intervall på minst 5 minuter så att den neuronala aktiviteten som framkallas av föregående stimulering inte påverkar nästa experiment.
5. Analys av data
- Ladda de förvärvade data med MATLAB-programmet.
- Få enstaka neurala aktiviteter med hjälp av en spiksorteringsalgoritm "Wave-Clus"44,45. Detektera spikarna i varje kanal med en amplitudtröskel som i Eq (1)45.
Tröskelvärde = 5 × median
(1)
Där x är den bandpassfiltrerade signalen.- För att installera "Wave-Clus", se nedladdningslänken i materialförteckningen.
- För att öppna det grafiska användargränssnittet (GUI), skriv wave_clus i kommandotolken för MATLAB.
- Skriv Get_spikes('filnamn.ext') för filtillägg som är förberett för spikidentifiering. Kör sedan Do_clustering('filename_spikes.mat') för spiksortering.
- Räkna de sorterade spikarna före, under och efter ljusstimulering med specifika tidsfack. Använd 0,2 s och 2 s tidsfack för analys.
- Rita antalet spikar från varje inspelningskanal.
OBS: Medelvärdet med standardfel av medelvärdet (SEM) av data från resultaten av 8 upprepade experiment beräknades och plottades.
(1)6. Dödshjälp
- Efter alla experiment, offra musen genom inandning av koldioxid (CO2).
- Utan att förladda kammaren, placera musen i den transparenta eutanasikammaren, utan CO2-tillförsel och / eller läckage.
- Slå på CO2-gasen och förskjut luften med en hastighet av 30 - 50% av volymen eutanasikammarluft per min.
OBS: En flödesmätare måste anslutas till CO 2-gascylindern för att säkerställa att luftförskjutningshastigheten är 30-50% av eutanasikammarens volym per min. - Övervaka den offrade musen för brist på andning och förändrad ögonfärg.
OBS: Den förväntade tiden för dödshjälp är vanligtvis inom 10 till 15 min. - Efter att ha observerat dödsskyltarna, ta bort musen från eutanasikammaren.
- För att slutföra eutanasiproceduren, verifiera döden genom att bekräfta andnings- och hjärtstillestånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optrodsystemet är framgångsrikt tillverkat för att ge tillräcklig ljuskraft för att aktivera målneuronerna. Den fina inriktningen av volframelektroderna uppnås genom det mikrofabricerade kiselt via hålen. Den uppmätta ljusintensiteten är 3,6 mW/mm2 vid den optiska fiberspetsen när 50 mA ström appliceras. Mikrolinserna ökade ljuseffektiviteten med 3,13 dB. På grund av mikrolinsarrayen, som förbättrar ljuskopplingen, är den applicerade strömmen ungefär hälften av den ström som krävs för att uppnå samma ljusintensitet utan mikrolens arraysystem. Eftersom lysdioden genererar mer värme med mer ström är det uppenbarligen fördelaktigt att använda mikrolensuppsättningen för att sänka enhetens värme. Den genomsnittliga impedansen för 4 elektroder var 71, 39 kΩ vid 1 kHz-frekvens, vilket är tillräckligt lågt för detektering av åtgärdspotentialerna. Dessutom består optrode-matrisen av engångs- och återanvändbara delar för att minska kostnaden och minimera implantationens totala vikt. Engångsdelens vikt är ~ 0,58 g.
En CaMKIIα::ChR2-mus användes för att direkt stimulera de ChR2-uttryckande neuronerna, och de framkallade neurala spikarna registrerades framgångsrikt, som visas i figur 6. Vi visade hela de inspelade vågformerna med exakta förhållanden, inklusive 2 s ljusperiod i mitten (figur 6A). Spiksortering från rådatasignalen utfördes med hjälp av en skräddarsydd MATLAB-källkod. Den totala neurala aktiviteten analyserades efter att ha sorterat ut två olika enheter. Antalet framkallade individuella neurala spikar efter varje ljusstimuleringspuls ökade signifikant jämfört med baslinjen (figur 6A,B), med olika tidsfack på 2 s och 0,2 s. Som ett resultat kunde vi identifiera den tydliga effekten av optogenetisk stimulering på neuronerna.
Figur 1: Schematiskt diagram över optrode array och microlens array. (B) SEM-bild av 4X4 mikrolens array och kiselvias. Skalstång = 1 mm (B). Förkortning: LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Enhetsprototyp av optrodesystem. (B) Förstorad vy av optrode-matrisen. Skalstänger = 5 mm (A), 2 mm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Skallen exponeras och rengörs genom att ta bort periosteum. (B) Målhjärnområdet exponerades och markskruven sattes in ovanför lillhjärnan. (C) Optrode array sattes in i hjärnan för att rikta djup. Marken var ansluten elektriskt. (D) Tandcement appliceras för att fixera enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematiskt diagram över tidslinjen för administration, drift och in vivo-experiment.
Figur 5: Experimentell installation av elektrofysiologiskt registreringssystem. Förkortning: LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Elektrofysiologiska inspelningsresultat(A) Representativa vågformer av neural inspelning och förstorad vågform i röd streckad rektangel som indikerar två ljusstimuli (blå staplar) och sorterade spikar (röda och svarta pilspetsar). (B) Spikhistogram för varje kanal före, under och efter ljusstimulering. Infälld figur indikerar platsen för den implanterade optroduppsättningen. (C) Spik histogram med 100 ms tidsfack. Blå stapel indikerar perioden för LED-lampan tänds. Förkortning: LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systemets genomförbarhet för samtidig optogenetisk stimulering och elektrofysiologisk registrering verifierades (figur 6). De stora spikarna under ljusstimulering är fotoelektriska artefakter som uppträder samtidigt som ljusstimuleringen (figur 6A). Detta är tydligt i den zoomade vyn av vågformen i den röda streckade rektangeln (figur 6A). Som visas i figur 6A kunde de fotoelektriska artefakterna tydligt sorteras ut från de inspelade vågformerna, och de neuronala svaren som inducerades av optogenetikstimuleringen av hippocampussignalvägen identifierades tydligt. Figur 6B,C anger antalet spikar, vilket visar stimuleringseffekten tydligt. Figur 6A är en av de vågformer som används för att erhålla histogrammen i figur 6B,C, eftersom inspelningsresultaten erhålls från 8 upprepade inspelningssessioner.
Figur 6A visar den ljusinducerade ökningen av neural aktivitet. Vi har genomfört samma experiment med kontrollmöss utan ChR2-uttryck. I det fallet ökade den optogenetiska stimuleringen inte den neurala aktiviteten. Eftersom de fotoelektriska artefakterna lätt utesluts från registreringsdata ingår inte resultatet från kontrolldjuret i manuskriptet. Dessutom kan skillnaderna i inspelningsresultaten mellan de 4 kanalerna, som visas i figur 6, motiveras genom att överväga att avståndet mellan volframinspelningselektroderna är 300 μm (centrum-till-centrum). Det är troligt att spikaktiviteterna i olika kanaler kommer från olika neuroner. Men eftersom neuronala celler är anslutna, särskilt i den lokala hjärnregionen, var de övergripande mönstren för neuronal spikning liknande men inte exakt samma.
För att säkerställa framgången för dessa djurförsök kräver flera kritiska steg hög noggrannhet och ytterligare uppmärksamhet under implantationskirurgin. Först måste blödning från hjärnans blodkärl hanteras noggrant. Fortsätt inte till nästa steg förrän blödningen har slutat helt. Detta möjliggör fast fastsättning av den implanterade enheten på hjärnan och tydlig synlighet under det kirurgiska ingreppet. Cauterizing blödningsfläckarna med en bovie, sterilisering med saltlösning och införande av gelskum kan vara till hjälp för att stoppa blödningen.
För det andra måste mushjärnan skyddas mot torrhet under optrodimplantationen. Saltlösning och gelskum används för att hålla sig fuktiga. Om duramembranet avlägsnas och hjärnan är helt exponerad måste de andra kirurgiska stegen utföras så snabbt som möjligt. För det tredje är optrodens långsamma insättningshastighet också avgörande. Långsammare insättning minskar vävnadsskador och förbättrar implantationens noggrannhet till den riktade platsen46. Eftersom deformationen av hjärnvävnaden är oundviklig under optrodinsättningen är långsam insättning till stor hjälp för den deformerade vävnaden att återställa sin ursprungliga form och volym.
För det fjärde bestämmer fixeringsprocessen långsiktig stabilitet. Det är bra att göra skallytan torr innan du stelnar tandcementet för förbättrad, långsiktig fastsättning. Dessutom måste man se till att undvika att applicera för mycket tandcement eller låta cementet fastna direkt på huden. När den snittade huden regenererar med tiden kan den gradvis trycka och lossa cementen från skallen när huden växer. Dessutom måste direktkontakt av tandcementet med hjärnvävnaden undvikas eftersom tandcement är skadligt för hjärnvävnaden. Detta kan effektivt förhindras genom insättning av gelskum mellan den exponerade hjärnan och enheten.
Förutom de kirurgiska ingreppen måste optrodsystemet kontrolleras noggrant innan experimenten påbörjas. Först måste den implanterbara delen av den optiska fibermatrisen och elektroderna undersökas under ett mikroskop innan de sätts in. Det är nödvändigt att kontrollera om det finns något brott i den optiska fibern eftersom även en liten spricka kan orsaka kritisk ljusförlust. Vidare måste inriktningen mellan de optiska fibrerna och inspelningselektroderna kontrolleras för exakt införande. Fina pincett kan böja volframelektroderna för att rätta till deras felinriktning.
För det andra måste ljusintensiteten kontrolleras före implantationskirurgi för att avgöra om ljuseffekten är över tröskeln och tillräckligt hög för att aktivera opsinerna. I praktiken är det känt att excitationströskeln för ChR2 är ungefär 1 mW/mm247. Emellertid, ljusgenererad vävnadsuppvärmning måste minimeras samtidigt som den ger tillräckligt med ljusintensitet för att excitera neuronala celler. För stark ljusenergi kan skada hjärnvävnaderna på grund av en temperaturökning. En temperaturökning på 6-8 °C i hjärnan kan orsaka omedelbara och irreversibla vävnadsskador12,48. En tidigare studie visade att temperaturökningen vid den optiska fiberspetsen är mindre än 0,5 °C49. En låg arbetscykel för optisk stimulering med kort varaktighet kan vara till hjälp. Jämfört med tidigare studier som rapporterat temperaturproblem med optogenetisk stimulering är vår uteffekt (2 mW/mm2) och protokollet med ljusstimulering med 4 ms vid 20 Hz i 2 sekunder lämpligt och inom det säkra området.
En stor utmaning för neural inspelning är att ta bort artefakterna som induceras av optisk stimulering. Artefakter synkrona med optisk stimulering måste beaktas i flera olika aspekter eftersom både elektriska och optiska mekanismer kan generera dessa artefakter. För det första kan elektriska artefakter orsakas av den elektriska kretsen som driver lysdioden. När en elektrisk ström flyter i en krets för att driva ljusstimulering kan elektriska artefakter genereras. Detta problem kan övervinnas genom att minimera antalet ledningar för LED-anslutningarna och maximera avståndet mellan ljusstimuleringskretsen och ledningarna som är anslutna till volframinspelningselektroderna. För det andra kan fotoelektriska artefakter genereras av den fotoelektrokemiska effekten under optogenetisk stimulering. Dessa artefakter kan minimeras genom att undvika direkt exponering av inspelningselektroden för stimuleringsljuset och öka avståndet mellan de optiska fibrerna och elektroderna. Det är emellertid svårt att eliminera ljusinducerade artefakter på grund av ljusspridning i hjärnvävnaden.
Det finns fortfarande begränsningar i den föreslagna optrode-matrisen, som kan förbättras i framtida studier. Även om den optiska fiberspetsen skars platt i denna studie, kommer avfasning eller avsmalnande av fiberspetsar att minimera vävnadsskador under insättning och öka ljusvinkeln som sprider sig från spetsarna50. En annan begränsning är låg ljusintensitet. Trots resultaten av den elektrofysiologiska inspelningen har det föreslagna systemet en relativt lägre uteffekt än ett laserbaserat system. Därför, det föreslagna LED-baserade systemet kan optogenetiskt excitera en mindre hjärnregion än det laserbaserade systemet. Detta beror främst på att de flesta lysdioder har mycket lägre effekt än lasrar i allmänhet. Men eftersom effektiviteten och den maximala intensiteten hos lysdioder har förbättrats dramatiskt nyligen kan lysdioder med högre uteffekt utvecklas med ny halvledarteknik. Den andra begränsningen är att en longitudinell inspelningsstudie inte utfördes. Det bekräftades dock att enheten var väl fastsatt på mössen i en månad. Detta resultat visar möjligheten att enheten är lämplig för långsiktiga experiment. Därför kommer långsiktiga in vivo-tester att utföras för att verifiera enhetens stabilitet.
Den mest typiska metoden för optogenetik i laboratorier är att använda ett lasersystem som ljuskälla. Även om en laser kan ge en högre uteffekt än lysdioder för att aktivera opsiner, kan det laserbaserade systemet inte enkelt miniatyriseras och kräver högkostnadsimplementering. Däremot, det LED-baserade optogenetiska systemet har flera fördelar, såsom låg systemkomplexitet, kostnadseffektivitet, och låg strömförbrukning, vilket är fördelaktigt för utvecklingen av det trådlösa systemet. Därför, i denna studie, lysdioden används som ljuskälla, och mikrolensuppsättningen antas för att öka lysdiodens ljusintensitet.
Dessutom utgör ljuskällan och de nuvarande drivkretsarna de avtagbara och återanvändbara delarna av systemet. Nya lysdioder med olika våglängder kan enkelt användas i enheten genom enkel ersättning, och systemkostnaden kan minskas avsevärt på grund av återanvändning i flera experiment. Hela systemet kan implementeras vidare som ett trådlöst system, som optogenetiskt stimulerar och registrerar neuronala signaler utan bundna linjer genom att anta ett trådlöst system med låg effekt i den miniatyriserade integrerade enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation genom National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2019M3C1B8090805), och stöds av ett National Research Foundation of Korea (NRF) -bidrag finansierat av Koreas regering (MSIT) (nr 2019R1A2C1088909). Vi tackar Seung-Hee Lees laboratorium vid Institutionen för biologiska vetenskaper, KAIST, Daejeon, Korea, för att de vänligen tillhandahåller de transgena mössen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
References
- Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
- Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
- Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
- Buzsáki, G.
- Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
- Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
- Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
- Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
- Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
- Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
- Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
- Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
- Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
- Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
- Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
- Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
- Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
- Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
- McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
- Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
- Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
- Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725 (2021).
- Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
- Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
- Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
- Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
- Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
- Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
- Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).
