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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Le présent protocole décrit le développement d’un modèle de colite semblable à celui de Crohn chez les rongeurs. L’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS et un élargissement mécanique est observé dans le segment proximal de la sténose. Ces changements permettent d’étudier le stress mécanique dans la colite.

Abstract

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) telles que la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal affectant environ 20 pour 1 000 000 en Europe et aux États-Unis. La MC se caractérise par une inflammation transmurale, une fibrose intestinale et une sténose luminale. Bien que les thérapies anti-inflammatoires puissent aider à contrôler l’inflammation, elles n’ont aucune efficacité sur la fibrose et la sténose dans la MC. La pathogenèse de la MC n’est pas bien comprise. Les études actuelles se concentrent principalement sur la délimitation des mécanismes de réponse immunitaire intestinale dérégulés. Alors que l’inflammation transmurale associée à la MC, la fibrose intestinale et la sténose luminale représentent toutes un stress mécanique à la paroi intestinale, le rôle du stress mécanique dans la MC n’est pas bien défini. Pour déterminer si le stress mécanique joue un rôle pathogène indépendant dans la MC, un protocole de modèle de colite de type CD induite par TNBS chez les rongeurs a été développé. Ce modèle d’inflammation transmurale et de fibrose induit par le TNBS ressemble aux caractéristiques pathologiques de la MC dans le côlon. Elle est induite par instillation intracolononique de TNBS dans le côlon distal des rats Sprague-Dawley adultes. Dans ce modèle, l’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS (site I). Une distension mécanique est observée dans la portion proximale au site d’instillation (site P), représentant un stress mécanique mais pas d’inflammation visible. La partie colique distale à l’inflammation (site D) ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements distinctifs de l’expression des gènes, de la réponse immunitaire, de la fibrose et de la croissance musculaire lisse à différents sites (P, I et D) ont été observés, soulignant un impact profond du stress mécanique. Par conséquent, ce modèle de colite de type CD nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogènes de la MC, en particulier le rôle du stress mécanique et de l’expression des gènes induits par le stress mécanique dans la dérégulation immunitaire, la fibrose intestinale et le remodelage tissulaire dans la MC.

Introduction

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC), se caractérisent par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal (GI). Il affecte ~ 1-2 millions d’Américains1. Les coûts annuels estimés des soins des MII aux États-Unis sont de 11,8 milliards de dollars. Contrairement à la CO, la MC est caractérisée par une inflammation transmurale et la formation de sténoses 2,3. La formation de sténoses (sténose) survient chez jusqu’à 70 % des patients atteints de la MC3 et peut être causée par une inflammation transmurale (sténose inflammatoire) ou une fibrose intestinale (sténose fibrotique)4,5. La fibrose intestinale est caractérisée par un dépôt excessif de collagène et d’autres matrices extracellulaires (ECM) avec des cellules musculaires lisses (SMC) comme l’un des principaux types de cellules mésenchymateuses impliquées dans le processus 3,4. L’hyperplasie musculaire lisse associée à l’hypertrophie est un autre changement histologique important de la sténose fibrotique dans laCD 6. Bien que la formation de sténoses dans la MC soit associée à une inflammation chronique, aucun traitement anti-inflammatoire n’est efficace, à l’exception du traitement chirurgical 2,6. Cependant, les récidives post-opératoires sont presque de 100%, avec suffisamment de temps 2,7. En tant que réponse inflammatoire, la fibrose et l’hyperplasie SMC peuvent également se développer dans des conditions non inflammatoires (c.-à-d. occlusion intestinale) dans l’intestin 8,9; on pense que des mécanismes dépendants de l’inflammation et indépendants sont impliqués dans la formation desténoses 3,4. Étant donné que des recherches approfondies sur les mécanismes dépendants de l’inflammation ne se sont pas traduites par un traitement efficace pour la formation de sténoses, des études sur le rôle possible des mécanismes indépendants de l’inflammation dans la fibrose intestinale sont nécessaires.

En tant que facteur non inflammatoire, le stress mécanique (SEP) associé à l’œdème, à l’infiltration de cellules inflammatoires, à la déformation tissulaire, à la fibrose et à la sténose 10,11,12,13 est couramment rencontré dans les MII, en particulier la MC, qui se caractérise par une inflammation transmurale. Le stress mécanique est le plus remarquable dans la CD sténotique, où la sténose (inflammatoire ou fibrotique) dans le site de l’inflammation présente un stress mécanique dans le tissu local et conduit à une distension de la lumière dans le segment proximal au site d’obstruction10,14. Des études in vitro antérieures ont démontré que le stress mécanique modifie l’expression génique de médiateurs inflammatoires spécifiques (c.-à-d. COX-2, IL-6)8,14,15 et les facteurs de croissance (c.-à-d. TGF-β) dans les tissus gastro-intestinaux, en particulier les cellules musculaires lisses intestinales (SMC)16. Des études récentes ont également révélé que l’expression de médiateurs pro-fibrotiques spécifiques tels que le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) est très sensible au stress mécanique17,18. On a émis l’hypothèse que le stress mécanique pourrait jouer un rôle pathogène indépendant dans l’inflammation, la fibrose et le remodelage des tissus associés à la MC. Cependant, l’importance pathogène du stress mécanique dans l’inflammation intestinale, la fibrose et l’hyperplasie des muscles lisses dans la MC reste largement inexplorée. Cela peut être dû en partie au fait que l’inflammation est un processus plus visible et mieux étudié que le stress mécanique. Plus important encore, il n’y a pas eu de modèle animal bien défini de MII pour distinguer l’effet du stress mécanique de celui de l’inflammation.

Les travaux actuels décrivent un modèle rongeur de colite de type Crohn induite par injection intracolonique de réactif haptène acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS)19,20, qui pourrait servir à étudier le rôle du stress mécanique dans la MC. Il a été constaté que l’instillation de TNBS induisait une inflammation transmurale localisée (~ 2 cm de longueur) avec rétrécissement de la lumière (sténose) dans le côlon distal. La sténose entraîne une distension intestinale marquée (stress mécanique)14,15 mais une inflammation non visible dans le segment colique proximal du site d’instillation. Au contraire, le segment du côlon distal au site de la sténose ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements significatifs spécifiques au site dans l’expression des gènes, l’inflammation, la fibrose et l’hyperplasie SMC ont été observés dans les trois sites différents. Les résultats suggèrent que le stress mécanique, en particulier l’expression génétique induite par le stress mécanique, peut jouer un rôle essentiel dans le développement de la fibrose et de l’hyperplasie dans la colite de Crohn.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas (#0907051C). Des rats Sprague-Dawley mâles ou femelles, âgés d’environ 8 à 9 semaines, ont été utilisés pour l’étude.

1. Préparation des animaux

  1. Jeûnez les rats pendant 24 heures et traitez-les avec un laxatif (nettoyant pour l’intestin, voir tableau des matériaux) pendant la nuit.
  2. Le lendemain, anesthésiez les rats à l’aide d’un système d’anesthésie (voir Tableau des matériaux) en les exposant à 2% d’isoflurane avec 1 L / min d’oxygène pendant l’administration de TNBS. Vérifiez les réflexes ou pincez les orteils pour confirmer l’anesthésie.
  3. Préparez une solution de TNBS fraîche en fonction du poids corporel.
    NOTE: TNBS - 65 mg / kg de poids corporel dans 250 μL d’éthanol à 40% a été utilisé.
  4. Mettez les rats en position couchée sur la table d’anesthésie. Pour induire la colite, insérez à travers l’anus un cathéter en polyuréthane ouvert de qualité médicale à environ 7-8 cm du bord anal et instillez doucement le TNBS (préparé à l’étape 1.3) dans le côlon19. Administrer les rats témoins simulés avec 250 μL de solution saline seulement.
  5. Après avoir instillé du TNBS ou une solution saline, gardez les rats en décubitus dorsal et légèrement tête baissée (~ 30 °), avec l’anus fermé pendant 2 minutes pour aider à la distribution du TNBS et éviter les déversements.
  6. Fournissez aux rats de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant 7 jours et observez les rats quotidiennement pour le poids corporel, les absorptions de nourriture, les matières fécales et l’état de santé général.

2. Préparations tissulaires

  1. Le jour de l’euthanasie, euthanasier les rats par inhalation de CO2 et confirmer l’euthanasie avec luxation cervicale.
  2. Ouvrez l’abdomen du rat à l’aide de ciseaux et de pinces de qualité chirurgicale.
  3. Retirez soigneusement tout le côlon (au-dessus du canal anal) et transférez immédiatement le côlon dans un tampon HBSS glacé 1x.
  4. Redressez le deux-points dans le tampon et mesurez la longueur du côlon à l’aide d’une règle. Prenez du fil de nylon et un cercle autour du côlon pour mesurer la circonférence externe des segments du côlon en contrôle et des rats traités au TNBS. Prenez des tissus de pleine épaisseur pour l’histologie.
  5. Coupez le côlon le long de la carte mésentérique et nettoyez bien le côlon avec un tampon HBSS. Évaluez le côlon pour le score d’inflammation macroscopique en fonction des critères décrits précédemment19 avec des modifications minimales.
    REMARQUE: 0 = muqueuse normale; 1 = hyperémie localisée mais pas d’érosions ou d’ulcères; 2 = ulcère et sténose (zone touchée < 5 mm); 3 = ulcère grave, cicatrice et sténose (zone touchée > 5 mm).
  6. Prélever des échantillons de tissu colique du site P (portion de 2 à 3 cm avant la marge buccale du site d’inflammation), du site I (site d’inflammation, généralement à 4-6 cm de l’extrémité du côlon, où le TNBS est instillé) et du site D (portion de 1 à 2 cm distale à la marge aborale du site d’inflammation), respectivement chez des rats traités par TNBS.
    REMARQUE: Le tissu du côlon d’environ 1-2 cm de long a été prélevé sur chaque segment. De plus, les tissus du côlon de 2 cm de long (~4-6 cm de l’extrémité du côlon) des rats traités à la solution saline ont été prélevés comme contrôle fictif (S) (Figure 1).
  7. Prélever des échantillons de tissus de chaque site pour une préparation de pleine épaisseur et, si vous le souhaitez, des couches de muqueuse / sous-muqueuse et de muscularis externa, respectivement,ainsi que 21,22.
  8. Congeler d’abord les échantillons de tissus dans de l’azote liquide avant de les stocker à -80 °C pour les entreposer jusqu’à un an et à des fins futures (c.-à-d. préparations d’ARN).

3. Évaluation histopathologique de l’inflammation intestinale et de la fibrose

  1. Fixer les tissus du côlon de pleine épaisseur dans 10% de formol pendant 48 h, puis transférer à 70% d’éthanol pendant 24-48 h.
  2. Utilisez un microtome pour couper des sections de paraffine de 5 μm d’épaisseur pour l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et les taches trichromes de Masson 6,19,23 (voir tableau des matériaux), respectivement.
  3. Acquérir et visualiser des images avec un microscope vertical équipé d’une caméra haute résolution avec logiciel compatible (voir Tableau des matériaux).
  4. Grade des indices d’inflammation et de fibrose par deux investigateurs indépendants, dont un pathologiste chirurgical gastro-intestinal selon les critères décrits précédemment 6,23 avec modifications. Voir le dossier supplémentaire 1 pour les scores.
  5. Mesurez l’épaisseur et le nombre de cellules des couches musculaires circulaires et longitudinales par section transversale dans quatre vues de chaque spécimen coloré H & E et prenez la moyenne des quatre mesures pour chaque spécimen.

4. Extraction de l’ARN et RT-PCR quantitative

  1. Homogénéiser les tissus du côlon excisés obtenus à partir du contrôle fictif et de trois sites (P, I, D) de rats de colite TNBS dans le réactif d’extraction d’un kit d’extraction d’ARN (voir tableau des matériaux).
  2. Isolez l’ARN de chaque échantillon à l’aide du kit. Éluez la pastille d’ARN dans 30 μL d’eau sans RNase.
  3. Quantifier la concentration d’ARN et vérifier la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume (voir tableau des matériaux).
  4. Utilisez 1 μg d’ARN total pour synthétiser l’ADNc21,22 à l’aide du kit de synthèse d’ARN (voir tableau des matériaux).
  5. Analyser et quantifier les niveaux d’expression des gènes en effectuant une PCR en temps réel avec 50 ng d’ADNc comme modèle, des sondes d’IL-6 et du CTGF à l’aide d’un kit pcR commercial pour un système de PCR en temps réel (voir Tableau des matériaux).
  6. Utilisez l’ARNr du gène de contrôle 18S pour normaliser les échantillons et quantifier l’expression relative des gènes en utilisant les valeurs Cq obtenues.

5. Analyse statistique

  1. Utilisez un logiciel d’analyse statistique (voir Tableau des matériaux) pour comparer le contrôle simulé et les rats de colite TNBS.
  2. Considérez que la valeur p < 0,05 est statistiquement significative15,19.
  3. Pour tester les différences entre deux groupes, utilisez l’analyse t-test de Student et effectuez un test ANOVA si les comparaisons sont supérieures à deux groupes15,19.

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Representative Results

Vue macroscopique de la colite de type Crohn induite par l’instillation intracolique du TNBS
Comme le montre la figure 1, l’instillation intracolonique de TNBS chez le rat a induit une inflammation transmurale localisée (~2 cm de longueur) avec une paroi intestinale épaissie et une lumière rétrécie (sténose) dans le site d’instillation dans le côlon distal (figure 1A). Le site d’instillation du TNBS est appelé site I. En raison de l’inflammation transmurale et de la sténose, l’inflammation et le stress mécanique sont présents au site I. La sténose du site I a entraîné une distension lumineuse marquée dans le segment proximal du site d’instillation du TNBS (site P) (Figure 1). La circonférence du côlon a été significativement augmentée dans les sites P et I, par rapport au côlon témoin simulé (p < 0,05 vs contrôle) (Figure 1B). Bien que distendue mécaniquement, le site P ne présentait pas d’inflammation visible. Au contraire, le segment colique distal au site d’instillation du TNBS est le site D et ne présente ni inflammation ni distension mécanique (Figure 1A,B).

Pour aider à distinguer l’effet du stress mécanique de l’inflammation, nous avons suivi une conception unique en recueillant des échantillons de tissus du côlon dans le modèle décrit à l’étape 2.6. Le site P est l’objectif principal de l’étude, car cette partie est distendue mécaniquement dans le modèle CD. Le site D est la maîtrise de soi, car il ne présente pas de contrainte mécanique. Les sites P et D ne présentent aucune inflammation visible (figure 1). Cependant, le site où je ressens une inflammation et un stress mécanique (Figure 1).

Changements spécifiques au site du score d’inflammation dans les sites P, I et D chez les rats colite
Des critères ont été développés pour classer l’inflammation en fonction du score macroscopique des tissus vivants (0-3)19 et du score microscopique des échantillons colorés H & E (0-3) 23 décrits avec des modifications. Les résultats ont montré que le score macroscopique de l’inflammation au site I était de 2,70 ± 0,20 chez les rats traités par TNBS (7 jours après l’induction de l’inflammation), a considérablement augmenté par rapport à celui des témoins simulés (0,30 ± 0,22, p < 0,05) et celui des sites P (0,80 ± 0,26) et D (0,50 ± 0,22) des rats colites (Figure 1C). Les scores d’inflammation dans les sites P et D ne sont pas significativement augmentés par rapport à l’imposture (Figure 1C). L’imagerie microscopique a montré une inflammation transmurale induite par le traitement TNBS chez le rat (Figure 2A). Le score microscopique de l’inflammation au site I était de 2,80 ± 0,27 chez les rats traités par TNBS, encore une fois significativement (p < 0,05, n = 5 par groupe) par rapport à celui des témoins simulés (0,3 ± 0,2) et dans les sites P (1,0 ± 0,31) et D (0,80 ± 0,38) des rats colites. Les scores d’inflammation dans les sites P et D n’ont pas été significativement augmentés par rapport à l’imposture (Figure 2C).

Changements spécifiques au site de la fibrose et de l’hyperplasie et de l’hypertrophie des muscles lisses dans les sites P, I et D chez les rats colites
Le score de fibrose a été déterminé en fonction de la coloration trichrome de Mason (Figure 2B) dans différents sites (P, I, D) (Figure 2A). Le système de classement de la fibrose est décrit dans le dossier supplémentaire 1. Il a été constaté que le score de fibrose est significativement augmenté non seulement au site I (2,60 ± 0,25), mais également au site P (1,60 ± 0,24) des rats colite, par rapport au contrôle simulé (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (Figure 2D). L’épaisseur et le nombre de cellules des couches musculaires lisses circulaires et longitudinales ont été mesurés dans différents sites dans des spécimens colorés H & E (4 vues par spécimen). L’épaisseur et le nombre de cellules des couches musculaires lisses circulaires et longitudinales ont été significativement augmentés dans les sites I et P (figure 2E, F). Le site D chez les rats colites ne montre aucune augmentation significative du score de fibrose, du nombre de cellules musculaires lisses ou de l’épaisseur musculaire (Figure 2).

Expression spécifique au site de gènes mécanosensibles dans les sites P, I et D chez les rats colites
L’IL-6 joue un rôle essentiel dans l’inflammation intestinale, car elle favorise la différenciation des lymphocytes T, endommage la fonction de barrière et affecte la fonction neuromusculaire 8,24. Le CTGF est un médiateur pro-fibrotique bien connu, car son inhibition peut inverser le processus de fibrose17. Plus important encore, des études récentes ont montré que l’expression génique de l’IL-6 et du CTGF est très sensible au stress mécanique 8,14,18. L’expression spécifique au site des ARNm IL-6 et CTGF a été déterminée dans le tissu de pleine épaisseur des rats témoins simulés et de la colite TNBS. Les niveaux d’expression de l’ARNm de l’IL-6 et du CTGF ont été significativement augmentés dans le site de l’inflammation (site I) par rapport aux témoins simulés. Au site P, où il y a distension mécanique mais pas d’inflammation visible, l’expression de l’ARNm de l’IL-6 et du CTGF a également été considérablement augmentée par rapport aux rats témoins (Figure 3A, B). Cependant, les niveaux d’IL-6 et d’ARNm CTGF au site D des rats colite n’étaient pas significativement différents de ceux des témoins fictifs (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Modèle rongeur de colite de type CD induite par le TNBS (7 jours). (A) Vue d’ensemble du contrôle simulé et du côlon traité par TNBS (en haut) et vue macroscopique de la surface muqueuse du côlon distal (en bas). Les cases jaunes indiquent différents sites du tissu du côlon. S, contrôle factice; I, site d’inflammation; P, site du côlon distendu proximal au site de l’inflammation; D, site non distendu distal à l’inflammation. (B) Circonférence du côlon dans le contrôle simulé et différents sites (P, I, D) du côlon traité par TNBS. (C) Score d’inflammation macroscopique du côlon témoin simulé et de différents sites du côlon traité par TNBS. n = 5, *p < 0,05 vs rats simulés du groupe. Les barres représentent le SEM. Veuillez cliquer ici pour l’agrandir.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation histopathologique. Vues microscopiques dans les taches trichromes (B) de H & E et Masson montrant la distribution du collagène dans les simulacres et différents sites de rats colites. L’analyse quantitative montre une augmentation de l’indice d’inflammation microscopique (C), de la fibrose (D) et de l’épaisseur musculaire (hypertrophie) (E) et du nombre de cellules musculaires lisses (hyperplasie) (F) dans les sites I et P, mais pas D, chez les rats traités par TNBS. En (E) et (F), les barres ouvertes sont pour la couche musculaire lisse circulaire, et les barres striées sont pour la couche musculaire lisse longitudinale. n = 5 dans chaque groupe, *p < 0,05 vs. rats simulés du groupe. Les barres dans les graphiques représentent le MEB. Les barres en (A) et (B) = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expression spécifique au site des gènes mécanosensibles (IL-6 et CTGF) dans la colite de type CD. (A) Expression de l’ARNm IL-6 dans le côlon témoin simulé et différents sites (P, I et D) du côlon de la colite traitée par TNBS. (B) Expression de l’ARNm CTGF dans le côlon témoin simulé et différents sites (P, I et D) du côlon de colite traité par TNBS. n = 4 ou 5, *p < 0,05 vs. S (contrôle fictif). Les barres représentent le SEM. Veuillez cliquer ici pour l’agrandir.

Dossier supplémentaire 1 : Score d’inflammation et de fibrose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La colite induite par le TNBS a été introduite en 1989 et a été utilisée comme modèle expérimental de la maladie de Crohn depuis lors 19,20,23. Les caractéristiques importantes de ce modèle chez les rongeurs comprennent le développement d’une inflammation transmurale qui ressemble beaucoup aux lésions histopathologiques développées dans la maladie de Crohn humaine19,20. Les études antérieures sur le modèle se sont concentrées principalement sur la réponse immunitaire aberrante dans la couche muqueuse du site de l’inflammation visible (le site I)19,20,23. Peu d’attention a été accordée aux parties intestinales proximales et distales à l’inflammation. La présente étude sur le site de l’inflammation, ainsi que sur le segment proximal distendu et le segment distal non distendu, révèle des changements apparents spécifiques au site dans l’expression des gènes, la réponse inflammatoire et les caractéristiques histopathologiques. Le modèle a été revu pour aborder le rôle pathogène potentiel du stress mécanique dans la fibrose et le remodelage tissulaire dans la maladie de Crohn.

Il a été constaté que l’inflammation aiguë se développe immédiatement après l’exposition muqueuse du TNBS dans l’éthanol et atteint son apogée au jour 3à 19. Une inflammation transmurale et une sténose inflammatoire sont présentes, ce qui est associé à une distension de la lumière au site P chez chaque rat traité par TNBS. Au jour 7, l’inflammation transmurale chronique est bien développée au site I, comme on l’a constaté dans la présente étude et rapporté ailleurs20. Pendant ce temps, des changements fibrotiques sont apparents dans le site, caractérisés par des dépôts excessifs de collagène, comme on le voit dans la présente étude et ailleurs20. L’instillation de TNBS dans l’éthanol dans le côlon distal blesse le tissu cutané local23 et entraîne une inflammation transmurale dans une zone localisée du côlon. L’inflammation transmurale avec infiltration inflammatoire, œdème et déformation tissulaire 10,12,13 dans le site d’instillation présente une inflammation et un stress mécanique14 dans la zone localisée (site I). De plus, l’inflammation transmurale provoque également une sténose luminale au site I10. Il a été constaté que la sténose, une occlusion intestinale partielle, provoque une distension mécanique dans le segment proximal (site P). Cependant, la partie distale au site d’instillation n’est pas distendue (site D). Comme on le trouve dans les systèmes de notation macroscopique et histologique, alors que le site I présente à la fois une inflammation et un stress mécanique, les sites P et D ne présentent pas d’inflammation. De plus, le site P présente une circonférence significativement accrue (et donc une contrainte mécanique, selon la loi de Laplace14), mais pas le site D. Par conséquent, une étude sur les changements spécifiques au site, en particulier le site P, explorera l’importance pathogène du stress mécanique dans le modèle d’inflammation dans l’intestin.

Il a été observé que l’expression des gènes mécanosensibles IL-6 et CTGF était augmentée dans le site I et dans le site P étiré mécaniquement, mais pas dans le site voisin D, où il n’y a pas de distension mécanique. Pour examiner l’hypothèse selon laquelle le stress mécanique peut contribuer au développement de la fibrose et de l’hyperplasie des muscles lisses, les scores de fibrose et le nombre de cellules musculaires lisses mesurées et l’épaisseur musculaire dans les sites P, I et D ont été déterminés séparément. Il a été constaté que la fibrose et l’hyperplasie SMC sont présentes dans les sites I et P. Cependant, la fibrose et l’hyperplasie des muscles lisses ne sont pas détectées au site D. Ces résultats indiquent que le stress mécanique peut jouer un rôle pathogène indépendant dans la synthèse du collagène et la prolifération cellulaire dans l’inflammation intestinale. D’autres études sont justifiées pour déterminer si cet effet peut être médié par l’expression induite par le stress mécanique de facteurs pro-fibrotiques et de croissance tels que le CTGF dans les sites P et I.

Bien que le modèle animal décrit lui-même puisse être utilisé pour traiter le stress mécanique dans la colite sténotique de type CD, il a des limites à long terme pour définir pleinement le rôle pathogène du stress mécanique dans l’inflammation. Par exemple, les effets du stress mécanique et de l’inflammation au site I du modèle décrit ne peuvent pas être différenciés. Bien que l’on suppose que le stress mécanique est présent dans le site I en raison de l’infiltration inflammatoire, de la déformation des tissus, de la sténose et de la distension, il est impossible de déterminer dans quelle mesure le stress mécanique contribue aux changements pathologiques. D’autres études approfondies utilisant des approches in vitro, in vivo et ex vivo pourraient être nécessaires. Par exemple, la prévention de la distension mécanique en nourrissant les animaux de colite exclusivement avec un régime liquide clair25 peut aider à créer un statut de perte de distension mécanique dans le modèle de colite. D’autre part, l’induction d’une distension mécanique pure par la bande d’obstruction15 peut aider à créer un modèle de gain de contrainte mécanique. De plus, le modèle d’étirement mécanique in vitro dans les cellules cultivées14,15 aide à la détermination quantitative des effets du stress mécanique sur l’expression et la fonction des gènes, car le mode et l’étendue du stress mécanique peuvent être finement contrôlés dans le cadre in vitro.

Pour préparer un modèle reproductible d’inflammation transmurale et sténotique dans la colite de type CD telle que décrite dans l’étude, il faut utiliser du TNBS à 65 mg/kg dans 250 μL d’éthanol à 40 %. Le modèle a été testé principalement chez des rats, mâles ou femelles, âgés de 8 à 9 semaines. Après l’instillation de TNBS à la dose, l’inflammation transmurale est constamment développée au site d’instillation local. L’inflammation est associée à l’infiltration des cellules inflammatoires, à l’œdème et à l’épaississement de la paroi intestinale, entraînant un rétrécissement de la lumière au site d’instillation, ressemblant aux caractéristiques pathologiques de la maladie de Crohn20. Des études pilotes en laboratoire ont montré que le TNBS à des doses inférieures à 50 mg / kg dans le même volume d’éthanol à 40% pourrait provoquer une inflammation intestinale, mais pas une sténose fiable au site I. Ainsi, il n’y aurait pas de distension mécanique apparente au site P. D’autre part, le TNBS à des doses supérieures à 80 mg / kg peut provoquer une inflammation grave et des décès. Le protocole actuel utilisant le TNBS à 65 mg/kg dans 250 μL d’éthanol à 40 % ne cause guère de décès (1 rat sur 16 de colite TNBS).

Il a été constaté que le nettoyage de l’intestin la veille de l’instillation du TNBS est une étape importante pour assurer un côlon relativement propre pour un modèle fiable de colite sténotique. Pour cela, les rats doivent jeûner pendant 24 heures et donner un nettoyant pour l’intestin pendant la nuit avant le traitement par TNBS. Il est également important de garder les rats en position couchée et légèrement tête baissée avec l’anus fermé pendant 2 minutes après l’instillation du TNBS. Cela aide à assurer une bonne distribution du TNBS à l’intérieur du côlon distal.

En résumé, il a été constaté que l’instillation intracolononique de TNBS à 65 mg / kg dans 250 μL d’éthanol à 40% induisait systématiquement une colite de type CD chez le rat. L’inflammation transmurale dans le modèle est associée à une sténose au site d’instillation du TNBS. Une distension mécanique, mais pas d’inflammation, est observée dans le segment proximal de la sténose. Ni l’inflammation ni le stress mécanique ne sont présents dans le segment distal à la sténose. Avec ces changements dans différents sites du côlon chez un rat colite, le stress mécanique de l’inflammation dans la colite de type CD peut être distingué.

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Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu en partie par des subventions des NIH (R01 DK124611 à XZS) et du département de la Défense des États-Unis (W81XWH-20-1-0681 à XZS). Le travail d’histologie a été réalisé avec l’aide du laboratoire de pathologie chirurgicale de l’UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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References

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Immunologie et infection numéro 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn
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Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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