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Neuroscience

ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर में फोटोपिगमेंट स्तर को मापने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीके

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रूप से द्वि-स्थिर फोटोपिगमेंट्स की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: (i) फोटॉन-अवशोषण के बाद फोटोपिगमेंट अणुओं के भीतर चार्ज विस्थापन का शोषण करना और फोटोरिसेप्टर्स में उनकी भारी मात्रा, और (ii) रोडोप्सिन और मेटारोडोप्सिन फोटोपिगमेंट राज्यों के अवशोषण-स्पेक्ट्रा मतभेदों का शोषण करना। ये प्रोटोकॉल द्वि-स्थिर फोटोपिगमेंट सिस्टम को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्तन के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोगी हैं।

Abstract

ड्रोसोफिला जी-प्रोटीन-युग्मित फोटोपिगमेंट रोडोप्सिन (आर) एक प्रोटीन (ऑप्सिन) और एक क्रोमोफोर से बना है। रोडोप्सिन की सक्रियण प्रक्रिया क्रोमोफोर के फोटॉन अवशोषण-उत्प्रेरण आइसोमराइजेशन द्वारा शुरू की जाती है, जो ऑप्सिन के विरूपण परिवर्तनों को बढ़ावा देती है और जिसके परिणामस्वरूप दूसरा अंधेरा-स्थिर फोटोपिगमेंट राज्य (मेटारोडोप्सिन, एम) होता है। यादृच्छिक उत्परिवर्तन का उपयोग करके इस द्वि-स्थिर फोटोपिगमेंट की जांच के लिए उत्परिवर्ती मक्खियों की स्क्रीनिंग के लिए सरल और मजबूत तरीकों की आवश्यकता होती है। इसलिए, कार्यात्मक फोटोपिगमेंट स्तरों में कटौती को मापने के लिए कई तरीके डिजाइन किए गए हैं। ऐसी ही एक विधि फोटॉन अवशोषण के बाद फोटोपिगमेंट के भीतर चार्ज विस्थापन और फोटोरिसेप्टर में व्यक्त फोटोपिगमेंट अणुओं की भारी मात्रा का शोषण करती है। प्रारंभिक रिसेप्टर क्षमता (या प्रारंभिक रिसेप्टर वर्तमान) नामक यह विद्युत संकेत, विभिन्न प्रकार के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों (जैसे, इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम और पूरे सेल रिकॉर्डिंग) द्वारा मापा जाता है और कार्यात्मक फोटोपिगमेंट स्तरों के रैखिक रूप से आनुपातिक होता है। इस पद्धति के फायदे उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, फोटोपिगमेंट स्तरों का प्रत्यक्ष रैखिक माप, और रोडोप्सिन या मेटारोडोप्सिन सक्रियण के लिए नीचे की ओर फोटोट्रांसडक्शन तंत्र की स्वतंत्रता है। लंबे समय तक विध्रुवण आफ्टरपोटेंशियल (पीडीए) नामक एक अतिरिक्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि ड्रोसोफिला फोटोपिगमेंट की द्वि-स्थिरता और फ्लाई आर और एम वर्णक राज्यों के अवशोषण-वर्णक्रमीय मतभेदों का शोषण करती है। पीडीए तीव्र नीली रोशनी से प्रेरित होता है, रोडोप्सिन की संतृप्त मात्रा को मेटारोडोप्सिन में परिवर्तित करता है, जिसके परिणामस्वरूप अंधेरे में विस्तारित समय के लिए प्रकाश-प्रतिक्रिया समाप्ति की विफलता होती है, लेकिन इसे तीव्र नारंगी प्रकाश का उपयोग करके रोडोप्सिन रूपांतरण के लिए मेटारोडोप्सिन द्वारा समाप्त किया जा सकता है। चूंकि पीडीए एक मजबूत संकेत है जिसके लिए बड़े पैमाने पर फोटोपिगमेंट रूपांतरण की आवश्यकता होती है, इसलिए फोटोपिगमेंट के बायोजेनेसिस में भी छोटे दोष आसानी से असामान्य पीडीए का पता लगाते हैं। दरअसल, दोषपूर्ण पीडीए म्यूटेंट ने फोटोट्रांसडक्शन के लिए महत्वपूर्ण उपन्यास सिग्नलिंग प्रोटीन की पहचान की।

Introduction

प्रकाश-सक्रिय रोडोप्सिन (आर), जो एक जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) है, 7 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (ऑप्सिन) और एक क्रोमोफोर से बना है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फल मक्खी) में, फोटॉन अवशोषण 11-सीआईएस-3-ओएच-रेटिना क्रोमोफोर के आइसोमेराइजेशन को ऑल-ट्रांस-3-ओएच-रेटिना1 में प्रेरित करता है, जो रोडोप्सिन के विरूपण परिवर्तन को मेटारोडोप्सिन (एम, चित्रा 1 ए) में बढ़ावा देता है। कशेरुक रोडोप्सिन के विपरीत, अकशेरुकी क्रोमोफोर का प्रमुख अंश ऑप्सिन से अलग नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप शारीरिक रूप से सक्रिय अंधेरे-स्थिर वर्णक राज्य एम। बदले में, ऑल-ट्रांस-3-ओएच-रेटिना क्रोमोफोर द्वारा अतिरिक्त फोटॉन अवशोषण क्रोमोफोर 2,3 के आइसोमेराइजेशन को प्रेरित करता है, जिससे 11-सीआईएस-3-ओएच-रेटिना क्रोमोफोर के साथ आर वर्णक राज्य उत्पन्न होता है। आर राज्य एक अंधेरा, स्थिर और शारीरिक रूप से गैर-सक्रिय फोटोपिगमेंट है। क्रोमोफोर4 के बेहद तेज़ फोटॉन पुनर्जनन मार्ग के अलावा, कशेरुक फोटोपिगमेंट्स की तरह, क्रोमोफोर पुनर्जनन के लिए एक वैकल्पिक एंजाइमेटिक धीमा मार्ग अकशेरुकी में मौजूद है, जिसमें कुछ चरण फोटोरिसेप्टर्स कोशिकाओं 5,6 के आसपास रेटिना कोशिकाओं में किए जाते हैं।

ड्रोसोफिला अकशेरुकी फोटोरिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में महान फायदे पर जोर देता है। विशेष रूप से, तैयारी की पहुंच और आणविक आनुवंशिकी को लागू करने की क्षमता ने ड्रोसोफिला को एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली7 बना दिया है। इसलिए, सामान्य रूप से फोटोट्रांसडक्शन और विशेष रूप से फोटोपिगमेंट स्तरों का अध्ययन करने के लिए विवो और पूर्व विवो प्रयोगात्मक तरीकों में कई स्थापित किए गए हैं। सबसे सरल इन-विवो विधि ड्रोसोफिला आंख के प्रकाश के लिए अपेक्षाकृत बड़े बाह्य रूप से दर्ज वोल्टेज प्रतिक्रिया का शोषण करती है। तदनुसार, प्रकाश उत्तेजना पूरी आंख में एक विद्युत वोल्टेज प्रतिक्रिया पैदा करती है जिसे बाह्य इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मापा जा सकता है, जो कशेरुक आंखों 8,9 के प्रकाश के लिए ईआरजी प्रतिक्रिया से बड़े परिमाण के ~ 3 आदेश हैं। ड्रोसोफिला ईआरजी प्रतिक्रिया मजबूत और आसानी से प्राप्त की जाती है, जो इसे उत्परिवर्तन के कारण प्रकाश प्रतिक्रिया में असामान्यताओं की पहचान करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका बनाती है। प्रकाश के लिए ईआरजी प्रतिक्रिया मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर, वर्णक (ग्लिया) कोशिकाओं और लैमिना के माध्यमिक न्यूरॉन्स से उत्पन्न होती है (चित्रा 1 बी देखें)। ईआरजी के मुख्य घटक हैं (i) फोटोरिसेप्टर्स की बाह्य वोल्टेज प्रतिक्रिया, (ii) प्रकाश उत्तेजना की शुरुआत और अंत में "चालू" और "बंद" क्षणिक जो लैमिना न्यूरॉन्स (चित्रा 2 ए, इनसेट, ऑन, ऑफ) से उत्पन्न होते हैं, (iii) ग्लिया कोशिकाओं की धीमी प्रतिक्रिया (चित्रा 2 ए, इनसेट, तीर), और (iv) संक्षिप्त और क्षणिक प्रतिक्रिया, फोटोपिगमेंट सक्रियण के दौरान चार्ज विस्थापन के परिणामस्वरूप जो ऑन क्षणिक10 (चित्रा 2 सी [इनसेट], डी, ई) से पहले होता है। यह संक्षिप्त प्रतिक्रिया दो चरणों (एम 1 और एम 2, चित्रा 2 सी [इनसेट]) से बना है और केवल बेहद मजबूत प्रकाश उत्तेजना से प्रेरित हो सकती है, जो एक साथ लाखों फोटोपिगमेंट अणुओं को सक्रिय करती है। यह न तो नीले उत्तेजना (चित्रा 2 डी, नीले ट्रेस) के तहत मनाया जाता है और न ही अत्यधिक कम फोटोपिगमेंट स्तर (चित्रा 2 ई, लाल ट्रेस) के साथ म्यूटेंट में मनाया जाता है, लेकिन इसका आयाम पीएलसी गतिविधि (चित्रा 2 ई, नारंगी ट्रेस) को समाप्त करने वाले उत्परिवर्ती में हल्के ढंग से बढ़ाया जाता है। एम 1 चरण फोटोरिसेप्टर में एम की सक्रियता से उत्पन्न होने वाली मक्खी का एक विशिष्ट ईआरपी है। एम 1 चरण, जिसमें एक सकारात्मक ध्रुवीयता (इंट्रासेल्युलर रूप से) होती है, साइन-इनवर्टिंग सिनैप्स में सामान्य तरीके से एक न्यूरोट्रांसमीटर जारी करता है और लैमिना न्यूरॉन्स को सक्रिय करता है, जो सिनैप्टिक रूप से प्रवर्धित एम 2 चरण उत्पन्न करके फोटोरिसेप्टर विध्रुवण का जवाब देता है। इस प्रकार, एम 1 और एम 2 चरण दोनों एम सक्रियण10,11 को दर्शाते हैं।

फोटोरिसेप्टर का विध्रुवण कॉर्नियल-पॉजिटिव "ऑन" क्षणिक उत्पन्न करता है, जो फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु और लैमिना10,11 (चित्रा 1 बी) के मोनोपोलर न्यूरॉन्स के बीच साइन-इनवर्टिंग सिनैप्स से उत्पन्न होता है। ईआरजी की धीमी वृद्धि और क्षय वर्णक कोशिकाओं (चित्रा 2 ए, इनसेट, तीर) के विध्रुवण से उत्पन्न होता है, मुख्य रूप से क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी) और टीआरपी-जैसे (टीआरपीएल)चैनलों 13,14,15 के माध्यम से फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं12 से के + प्रवाह के कारण होता है। ये धीमी गति से गतिज घटक काफी हद तक प्रकाश 9,10 के लिए फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया के इंट्रासेल्युलर या पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तुलना में फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया के तरंग को मुखौटा और विकृत करते हैं। इसके अलावा, बहुत मजबूत रोशनी पर, एक अतिरिक्त क्षणिक प्रतिक्रिया, जो "ऑन" क्षणिक के साथ पहले और आंशिक रूप से फ़्यूज़ होती है, देखी जा सकती है (चित्रा 2 सी [इनसेट], डी, ई)। यह संकेत सीधे फोटोपिगमेंट10 के बड़े पैमाने पर सक्रियण से उत्पन्न होता है।

तटस्थ घनत्व (एनडी) और रंग फिल्टर का उपयोग करके कई प्रकाश शासन प्रोटोकॉल, साथ ही साथ मजबूत रोशन चमक, सामान्य रूप से आंख और विशेष रूप से फोटोट्रांसडक्शन कैस्केड की जांच करने के लिए विकसित किए गए हैं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग फोटोपिगमेंट के गुणों की जांच के लिए भी किया गया है।

तीव्रता-प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल प्रकाश तीव्रता (चित्रा 2 ए, बी) बढ़ाने के लिए पूरी आंख की ईआरजी वोल्टेज प्रतिक्रिया के शिखर आयाम को मापता है। यह प्रोटोकॉल प्रकाश9 करने के लिए फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की संवेदनशीलता में परिवर्तन का पता लगाने में सहायता करता है।

लंबे समय तक विध्रुवण आफ्टरपोटेंशियल (पीडीए) प्रोटोकॉल रोडोप्सिन और मेटारोडोप्सिन के अवशोषण स्पेक्ट्रा में अंतर का शोषण करता है जो ड्रोसोफिला में, आर के एक बड़े पैमाने पर फोटोपिगमेंट रूपांतरण को शारीरिक रूप से सक्रिय और अंधेरे-स्थिर मध्यवर्ती एम राज्य2 में अनुमति देता है। ईआरजी वोल्टेज प्रतिक्रिया में, संतृप्त प्रकाश की अपेक्षाकृत छोटी नाड़ी दी जाती है, और परिणामस्वरूप वोल्टेज प्रतिक्रिया दर्ज की जाती है। इस स्थिति के तहत, विध्रुवण संकेत द्वारा एक छत (उत्क्रमण क्षमता) तक पहुंच जाता है क्योंकि रोडोप्सिन अणुओं (~ 1 x 108) की भारी मात्रा के एक प्रतिशत के एक अंश की सक्रियता छत तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है। बहुतायत में फोटोट्रांसडक्शन घटकों की उपस्थिति यह सुनिश्चित करती है कि इस छत को फोटोट्रांसडक्शन घटकों की एकाग्रता या सूक्ष्म खराबी में महत्वपूर्ण कमी के साथ म्यूटेंट में भी पहुंचा जाएगा। यह स्थिति इन म्यूटेंट के अलगाव को रोकती है। पाक एट अल ने दृश्य म्यूटेंट को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और खुलासा परीक्षण की मांग करते हुए पीडीए स्क्रीनिंग7 पेश किया। ड्रोसोफिला में, पीडीए प्रतिक्रिया आनुवंशिक रूप से लाल स्क्रीनिंग वर्णक को हटाकर लाई जाती है, जो फोटोपिगमेंट रूपांतरण की अनुमति देती है, और नीली रोशनी का अनुप्रयोग, जो अधिमानतः रोडोप्सिन (चित्रा 3 ए) द्वारा अवशोषित होता है और इस प्रकार, एम फोटोपिगमेंट राज्य में आर का एक बड़ा शुद्ध रूपांतरण होता है। फोटोट्रांसडक्शन समाप्ति आर से एम के एक बड़े शुद्ध रूपांतरण द्वारा फोटोपिगमेंट के स्तर पर बाधित होती है, जो बदले में, प्रकाश बंद होने के बाद लंबे समय तक निरंतर उत्तेजना का परिणाम देती है (चित्रा 2 सी, चित्रा 4 ए [शीर्ष])। पीडीए अवधि के दौरान, फोटोरिसेप्टर बाद की परीक्षण रोशनी के प्रति कम संवेदनशील होते हैं और आंशिक रूप से असंवेदनशील (निष्क्रिय) होते हैं। पीडीए रोडोप्सिन बायोजेनेसिस में भी मामूली दोषों का पता लगाता है और विस्तारित अवधि के लिए उत्तेजना बनाए रखने के लिए फोटोरिसेप्टर सेल की अधिकतम क्षमता का परीक्षण करता है। चूंकि यह रोडोप्सिन की उच्च सांद्रता की उपस्थिति पर सख्ती से निर्भर करता है, इसलिए यह आसानी से फोटोट्रांसडक्शन घटकों की कमी की भरपाई के लिए स्कोर करता है। उल्लेखनीय रूप से, पीडीए स्क्रीन ने कई नए और बहुत महत्वपूर्ण दृश्य म्यूटेंट (पाक एट अल 7 में समीक्षा की गई) का उत्पादन किया है। इस प्रकार, पाक एट अल .7 द्वारा पृथक पीडीए म्यूटेंट अभी भी ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली का विश्लेषण करने के लिए बेहद उपयोगी हैं।

पीडीए को नीली रोशनी को संतृप्त करके ड्रोसोफिला में प्रेरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश ऑफसेट (चित्रा 4 ए [शीर्ष]) के बाद लंबे समय तक निरंतर विध्रुवण होता है। पीडीए-उत्प्रेरण नीली रोशनी को संतृप्त करने के बाद, परिधीय फोटोरिसेप्टर (आर 1-6) अपनी अधिकतम क्षमता पर अंधेरे में लगातार सक्रिय रहते हैं, संतृप्ति तक पहुंचते हैं। पीडीए के दौरान अतिरिक्त संतृप्त नीली रोशनी कई सेकंड के लिए आर 1-6 कोशिकाओं में कोई अतिरिक्त प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करती है, लेकिन आर 7-8 कोशिकाओं में प्रतिक्रिया को प्रेरित करती है जो पीडीए पर आरोपित होती है। अध्यारोपित प्रतिक्रियाओं को इन कोशिकाओं (आर 7-8) 16 में व्यक्त फोटोपिगमेंट्स के विभिन्न अवशोषण स्पेक्ट्रा द्वारा समझाया गया है। पीडीए को नारंगी प्रकाश (चित्रा 4 ए [शीर्ष]) संतृप्त करने के साथ एम के फोटोकनवर्जन द्वारा आर में दबाया जा सकता है। फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को उनकी अधिकतम सक्रिय क्षमता में लाने के लिए पीडीए की क्षमता, एक ऐसी स्थिति जिसे तीव्र सफेद रोशनी द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है, बताती है कि यह ड्रोसोफिला के दृश्य म्यूटेंट के लिए स्क्रीन करने के लिए एक प्रमुख उपकरण क्यों रहा है। ऐसा इसलिए है क्योंकि यह सामान्य फोटोपिगमेंट स्तर17,18 के बायोजेनेसिस में शामिल प्रोटीन में भी मामूली दोषों का पता लगाने की अनुमति देता है। पीडीए दोषपूर्ण म्यूटेंट के दो समूहों को अलग किया गया है: न तो निष्क्रियता और न ही आफ्टरपोटेंशियल (नीना) म्यूटेंट और निष्क्रियता लेकिन आफ्टरपोटेंशियल (आईएनए) म्यूटेंट नहीं। पूर्व का फेनोटाइप एक पीडीए की कमी और फोटोपिगमेंट स्तरों (चित्रा 4 ए [मध्य]) में बड़ी कमी से उत्पन्न होने वाली संबंधित निष्क्रियता है। उत्तरार्द्ध का फेनोटाइप निष्क्रियता दिखाता है लेकिन सामान्य रोडोप्सिन स्तरों के साथ उत्परिवर्ती में अभी भी अज्ञात तंत्र के कारण नीली रोशनी के बाद कोई अंधेरा विध्रुवण नहीं होता है, लेकिन टीआरपी चैनलों (चित्रा 4 ए [नीचे]) के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन की कमी होती है।

पीडीए अरेस्टिन (एआरआर 2) के सापेक्ष फोटोपिगमेंट की मात्रा में अंतर से उत्पन्न होता है, जो एम गतिविधि 19,20,21 (चित्रा1 ए) को बांधता है और समाप्त करता है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर्स में, फोटोपिगमेंट की मात्रा एआरआर 219 की मात्रा से लगभग पांच गुना अधिक है। इस प्रकार, एआरआर 2 स्तर आर से एम के एक बड़े शुद्ध फोटोकनवर्जन द्वारा उत्पन्न सभी एम अणुओं को निष्क्रिय करने के लिए अपर्याप्त हैं, जिससे अंधेरे 17,19,20,22,23 में लगातार सक्रिय एम की अधिकता हो जाती है। यह तंत्र उत्परिवर्तन द्वारा या कैरोटीनॉयड अभाव24,25 द्वारा पीडीए प्रतिक्रिया के उन्मूलन की व्याख्या करता है, जिससे फोटोपिगमेंट स्तर में कमी आती है, लेकिन अरेस्टिन के स्तर को प्रभावित नहीं करता है। इसके अलावा, यह स्पष्टीकरण शून्य एआरआर 2 (एआरआर 23) उत्परिवर्ती एलील21 के फेनोटाइप के लिए भी जिम्मेदार है, जिसमें पीडीए ~ 10 गुना मंद नीली रोशनी तीव्रता 19,20,21 (चित्रा 4 बी, सी) पर प्राप्त किया जा सकता है। पीडीए फ्लाई फोटोरिसेप्टर्स की एक अनूठी विशेषता नहीं है, और यह प्रत्येक परीक्षण की गई प्रजातियों में दिखाई देता है जिसमें आर राज्य से अलग अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ अंधेरे स्थिर एम होते हैं, जिससे आर से एम राज्य में फोटोपिगमेंट के पर्याप्त फोटोकन्वर्जन की अनुमति मिलती है। एक अच्छी तरह से जांच की गई प्रजाति जिसमें पीडीए घटना विज्ञान की खोज की गई थी, वह बार्नकल (बालनस) फोटोरिसेप्टर है, जिसमें आर राज्य का अवशोषण स्पेक्ट्रम एम राज्य2 (चित्रा 3 बी) की तुलना में लंबे तरंग दैर्ध्य में है। तदनुसार, मक्खी में स्थिति के विपरीत, बार्नकल में, नारंगी-लाल बत्ती एक पीडीए को प्रेरित करती है, जबकि नीली रोशनी पीडीए2 को दबा देती है।

प्रारंभिक रिसेप्टर क्षमता (ईआरपी) प्रोटोकॉल आर या एम सक्रियण के दौरान होने वाले चार्ज विस्थापन का शोषण करता है। दृश्य वर्णक कशेरुक और अकशेरुकी झिल्ली दोनों के सिग्नलिंग डिब्बे की सतह झिल्ली का एक अभिन्न अंग है3. तदनुसार, सक्रियण प्रक्रिया जिसमें फोटोपिगमेंट अणु एक मध्यवर्ती अवस्था से दूसरे में बदलते हैं, एक चार्ज विस्थापन 4,26 के साथ होता है। चूंकि फोटोपिगमेंट अणुओं को झिल्ली समाई4 के समानांतर विद्युत रूप से संरेखित किया जाता है, इसलिए एक तेजी से सिंक्रनाइज़ विरूपण परिवर्तन सतह झिल्ली का तेजी से ध्रुवीकरण परिवर्तन उत्पन्न करता है, जो मक्खियों में, ~ 30,000-50,000 माइक्रोविली के ढेर से बना सिग्नलिंग डिब्बे में होता है जिसे रैबडोमेर कहा जाता है। यह ध्रुवीकरण तब तक कोशिका शरीर की झिल्ली समाई के माध्यम से निष्क्रिय रूप से निर्वहन करता है जब तक कि कोशिका झिल्ली समान रूप से ध्रुवीकृत न हो जाए। ईआरपी चार्ज विस्थापन की बाह्य रिकॉर्डिंग है। इंट्रासेल्युलर रूप से दर्ज ईआरपी कोशिका झिल्ली 4,27,28 के समय स्थिरांक द्वारा एकीकृत बाह्य ईआरपी को प्रकट करता है। दृश्य वर्णक चार्ज विस्थापन द्वारा सक्रिय वर्तमान को पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग29,30 (चित्रा 5 ए-डी) में भी मापा जा सकता है, सिग्नल के कैनेटीक्स पर झिल्ली समाई के प्रभाव को कम करने के प्रमुख लाभ (प्रारंभिक रिसेप्टर वर्तमान (ईआरसी) रिकॉर्डिंग में)।

प्रोटोकॉल अनुभाग वर्णन करता है कि ड्रोसोफिला आंख9 से ईआरजी माप कैसे करें और ड्रोसोफिला पृथक ओम्मेटिडिया31,32 से पूरे सेल रिकॉर्डिंग द्वारा ईआरसी माप कैसे करें। हम विशिष्ट प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं जिनका उपयोग सामान्य रूप से फोटोट्रांसडक्शन और विशेष रूप से फोटोपिगमेंट की जांच के लिए किया जाता है।

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Protocol

1. तीव्रता प्रतिक्रिया संबंध को मापना, इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम का उपयोग करके लंबे समय तक विध्रुवण आफ्टरपोटेंशियल (पीडीए), और प्रारंभिक रिसेप्टर क्षमता (ईआरपी)

  1. मेलानोगास्टर तैयारी के लिए उपयुक्त पालन की स्थिति
    1. मेलानोगास्टर 24 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखा एक इनक्यूबेटर में भोजन युक्त मानक पीले मकई युक्त बोतलों में मक्खियों और एक 12 घंटे अंधेरे /
    2. प्रयोग से कम से कम 24 घंटे पहले मक्खी की बोतलों को अंधेरे में रखें।
  2. सामान्य सेटअप
    1. 1 मिमी x 0.58 मिमी (ओडी एक्स आईडी) फाइबर से भरे बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (चित्रा 6 एल, ओ) को खींचकर रिकॉर्डिंग पिपेट तैयार करें। पिपेट का प्रतिरोध 5-10 एमΩ होना चाहिए; किसी भी उपयुक्त खींचने वाले का उपयोग किया जा सकता है।
    2. एजीसीएल2 के साथ दो चांदी के तारों को कोट करें, कस्टम-निर्मित 5 वी बिजली की आपूर्ति से जुड़े 3 एम केसीएल समाधान में 0.25 मिमी चांदी के तार डालें।
    3. इलेक्ट्रोड धारकों (चित्रा 6 एन) में प्रत्येक लेपित चांदी के तार डालें।
    4. एक लम्बी टिप सिरिंज (चित्रा 6 एम) का उपयोग करके फ़िल्टर्ड रिंगर के समाधान (तालिका 1 देखें) के साथ ग्लास केशिका भरें।
    5. कांच केशिका में तार इलेक्ट्रोड डालें। सुनिश्चित करें कि केशिका के भीतर समाधान चांदी के तार के संपर्क में है।
    6. इलेक्ट्रोड धारकों (चित्रा 7 पी, एन) को दो इलेक्ट्रोड माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 7 जी) में डालें।
  3. विद्युत रिकॉर्डिंग के लिए मक्खी तैयार करने की प्रक्रिया
    नोट: अंधेरे अनुकूलित परिस्थितियों में मक्खी रखने के लिए, निम्नलिखित चरणों के दौरान केवल मंद लाल बत्ती रोशनी का उपयोग करें।
    1. फ्लाई स्लीपर सिस्टम (चित्रा 6 ए, बी) का उपयोग करके सीओ2 गैस के साथ बोतल में मक्खियों को संवेदनाहारी करें और उन्हें स्लीपर कंटेनर में डालें।
    2. एक मक्खी चुनें और ध्यान से एक तेज चिमटी का उपयोग कर अपने पंख से पकड़. पेट्री डिश के साथ मक्खियों के बाकी हिस्सों को कवर करें।
    3. मक्खी धारक पर मक्खी को उचित अभिविन्यास में रखें- इसकी तरफ झूठ बोलना, हाथ की ओर इसकी पीठ के साथ (चित्रा 6 पी)।
    4. टांका लगाने वाले लोहे की बिजली आपूर्ति चालू करें। वर्तमान को ~ 2.25 ए पर सेट करें। यह वर्तमान ~ 55-56 डिग्री सेल्सियस ( पूरक फ़ाइल देखें) के लिए 0.25 मिमी प्लैटिनम-इरिडियम फिलामेंट को गर्म करना चाहिए।
    5. टांका लगाने वाले लोहे (चित्रा 6 एफ) पर कम पिघलने वाले तापमान (~ 55-56 डिग्री सेल्सियस) के साथ मोम की एक बूंद रखें।
    6. चिमटी का उपयोग करके, अपने पंखों से मक्खी को उठाएं और टांका लगाने वाले लोहे का उपयोग करके फ्लाई होल्डर (चित्रा 6 आई) को अपने पंखों को ठीक करें।
    7. टांका लगाने वाले लोहे का उपयोग करके, मोम (चित्रा 6 पी) के साथ स्टैंड सतह पर मक्खी की पीठ को कनेक्ट करें।
    8. पैरों के जुड़ने के बिंदु पर टांका लगाने वाले लोहे की नोक को कम करें और सभी पैरों को एक साथ कवर करने के लिए मोम को पिघलाएं (चित्रा 6 पी)।
    9. गर्दन क्षेत्र (चित्रा 6 पी) में सिर और पीठ के बीच मोम की एक छोटी बूंद रखें।
      नोट: फ्लाई हेड को गर्म करने से बचने के लिए विशेष ध्यान रखें। सुनिश्चित करें कि मक्खी ठीक से तय है और प्रयोग के दौरान स्थानांतरित करने में असमर्थ है; मामूली आंदोलनों रिकॉर्डिंग में कलाकृतियों बना सकते हैं. सुनिश्चित करें कि वक्ष और पेट में श्वासनली के उद्घाटन (श्वास इनलेट) मोम से ढके नहीं हैं।
    10. एक चुंबक ब्लॉक (चित्रा 7I) पर एक अंधेरे फैराडे पिंजरे में मक्खी धारक (चित्रा 7क्यू) रखें और सुनिश्चित करें कि मक्खी प्रकाश गाइड (चित्रा 7 एल) के अंत से ~ 5 मिमी है।
    11. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (चित्रा 7 पी) मक्खी की आंख के ऊपर और जमीन इलेक्ट्रोड (चित्रा 7 एन) माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग कर मक्खी की ऊपरी पीठ पर रखें।
    12. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके मक्खी के पीछे जमीन इलेक्ट्रोड डालें।
    13. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को मक्खी की आंख की बाहरी परिधि में डालें, अधिमानतः, माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके।
      नोट: इलेक्ट्रोड को आंखों में डालने के बाद, एक छोटा डिंपल मनाया जाएगा; इलेक्ट्रोड को आंख से हटाए बिना ऊपर की ओर खींचें जब तक कि डिंपल गायब न हो जाए। इलेक्ट्रोड को धड़ और आंख पर लागू इलेक्ट्रोड जेली की छोटी बूंदों में भी डुबोया जा सकता है।
  4. तीव्रता-प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल
    1. उच्च दबाव क्सीनन दीपक के सामने एक नारंगी फिल्टर (590 एज फिल्टर) रखें। तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्टर को क्षीण करने वाले एक बड़े (परिमाण के छह आदेश) का उपयोग करें।
    2. अंधेरे में 60 सेकंड प्रतीक्षा करें और 5 एस हल्की नाड़ी दें।
    3. परिमाण वृद्धि के एक क्रम में कम क्षीणन एनडी फिल्टर के साथ एनडी फ़िल्टर को बदलें।
    4. अंधेरे में 60 सेकंड प्रतीक्षा करें और दूसरी 5 एस हल्की नाड़ी दें।
    5. चरण 1.4.1.-1.4.4 दोहराएं, धीरे-धीरे कम क्षीणन एनडी फिल्टर का उपयोग करके प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि (अंतिम नाड़ी को बिना किसी एनडी फिल्टर के उत्पन्न किया जाना चाहिए)। उचित दिशा में एनडी फिल्टर की श्रृंखला का उपयोग करना सुनिश्चित करें, बड़े क्षीणन से शुरू करें और कम क्षीणन तक पहुंचें।
  5. पीडीए प्रोटोकॉल (यह प्रोटोकॉल केवल सफेद आंखों वाली मक्खियों पर किया जा सकता है)
    1. नारंगी फिल्टर (590 एज फिल्टर, अधिकतम फोटोपिगमेंट को आर राज्य में परिवर्तित करने के लिए) का उपयोग करके अधिकतम तीव्रता की 5 एस हल्की नाड़ी दें।
    2. नारंगी फिल्टर को ब्रॉड-बैंड ब्लू (बीपी 450/40 एनएम) फिल्टर के साथ बदलें और अधिकतम तीव्रता पर तीन 5 एस प्रकाश दालें दें।
      नोट: एक स्थिर-राज्य वोल्टेज प्रतिक्रिया तक पहुंचने तक एक लंबी निरंतर अधिकतम तीव्रता नीली रोशनी नाड़ी देना भी संभव है।
    3. अंधेरे में 60 एस प्रतीक्षा करें, नीले फिल्टर को पिछले नारंगी फिल्टर के साथ बदलें, और 60 एस अंतराल के साथ दो 5 एस प्रकाश दालें दें।
  6. एम के फोटो संतुलन स्पेक्ट्रम को मापने के लिए ईआरपी / एम-संभावित प्रोटोकॉल (यह प्रोटोकॉल केवल सफेद आंखों वाली मक्खियों10,25 पर किया जा सकता है)
    1. स्थिर-राज्य वोल्टेज प्रतिक्रिया तक पहुंचने तक एक निरंतर नीला (बैंडपास (बीपी) 450/40 एनएम) प्रकाश पल्स दें, जो आर राज्य से फोटोपिगमेंट की अधिकतम मात्रा को आर 1-6 कोशिकाओं के एम राज्य में परिवर्तित करता है।
    2. संकीर्ण (~ 20 एनएम) बैंडपास फिल्टर का उपयोग करके 350-700 एनएम (आर 1-6 कोशिकाओं फोटोपिगमेंट का ज्ञात अवशोषण स्पेक्ट्रम) के बीच तरंग दैर्ध्य का एक संक्षिप्त (<3 एमएस) तीव्र प्रकाश फ्लैश दें और एम संभावित प्रतिक्रिया के एम 1 चरण के शिखर आयाम को मापें (जो फोटो-संतुलन10,25 पर इस विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर मेटारोडोप्सिन अवशोषण को दर्शाता है)।
      नोट: फोटोपिगमेंट अणुओं के एक बड़े पूल के तुल्यकालिक सक्रियण के लिए, प्रकाश की एक संक्षिप्त, तीव्र फ्लैश की आवश्यकता होती है ताकि फोटॉन सामग्री को कम अवधि में पैक किया जा सके। एम क्षमता दो घटकों से बना है: एम 1 (कॉर्नियल नकारात्मक चरण), जो फोटोरिसेप्टर में मेटारोडोप्सिन के चार्ज विस्थापन को दर्शाता है, और एम 2 (कॉर्नियल पॉजिटिव चरण11,33), जो लामिना 9,10,11 में फोटोरिसेप्टर की प्रवर्धित एम 1 प्रतिक्रिया को दर्शाता है . इन घटकों में से प्रत्येक की पहचान और मापा जा सकता है। हालांकि, एम 1 क्षमता को मापना बेहतर है क्योंकि यह एम स्तरों की प्रत्यक्ष रैखिक अभिव्यक्ति है। यदि एम 2 का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि इसका आयाम हल्के कैरोटीनॉयड अभाव24,25 का उपयोग करके रैखिक सीमा में है।
    3. एक निरंतर नीला (बीपी 450/40 एनएम) प्रकाश पल्स फिर से दें, इसके बाद एक अलग तरंग दैर्ध्य का एक संक्षिप्त (<1 एमएस) तीव्र प्रकाश फ्लैश हो।
    4. फोटो संतुलन पर एम के पूरे अवशोषण स्पेक्ट्रम कवर किया जाता है जब तक इस प्रोटोकॉल को दोहराएँ।

2. पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके आर 1-6 कोशिकाओं के आर और एम राज्यों के एक्शन स्पेक्ट्रम को मापने के लिए ईआरसी प्रोटोकॉल

नोट: पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, काट्ज़ एट अल देखें। एम-पोटेंशियल ईआरजी का उपयोग एम राज्य की सक्रियता को मापने के लिए करता है क्योंकि आर राज्य का योगदान झिल्ली समाई द्वारा दबा दिया जाता है। इसके विपरीत, ईआरसी आर (सकारात्मक ईआरसी) और एम (नकारात्मक ईआरसी) दोनों राज्यों की सक्रियता को मापता है क्योंकि वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग झिल्ली समाई के प्रभाव को हटा देती है (परिचय देखें)।

  1. फोटोपिगमेंट को वांछित स्थिति (आर या एम) में परिवर्तित करें। आर से एम रूपांतरण के लिए, सबसे पहले, एक संक्षिप्त (<1 एमएस) अनुकूली नीले (बीपी 450/40 एनएम) फ्लैश द्वारा मक्खियों को अनुकूलित करें। एम से आर रूपांतरण के लिए, एक छोटा अनुकूली नारंगी (ओजी 590 एज फिल्टर) फ्लैश दें।
  2. 350-700 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य का एक संक्षिप्त प्रकाश फ्लैश (<1 एमएस) दें और ईआरसी प्रतिक्रिया के अधिकतम नकारात्मक या सकारात्मक आयाम को मापें, जो इस विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर एम /
    नोट: फोटोपिगमेंट अणुओं के एक बड़े पूल के तुल्यकालिक सक्रियण के लिए, फोटॉन सामग्री को कम अवधि में पैक करने के लिए प्रकाश का एक संक्षिप्त, तीव्र फ्लैश आवश्यक है। नीले फ्लैश द्वारा आर से एम तक अधिकतम फोटोपिगमेंट रूपांतरण आर और एम (चित्रा 3 ए) के अवशोषण स्पेक्ट्रम में ओवरलैप के कारण कुल फोटोपिगमेंट अणुओं के ~ 80% तक पहुंच सकता है। इसलिए, ~ 550 एनएम से नीचे तरंग दैर्ध्य पर, ईआरसी के दो घटक हैं: एक नकारात्मक चरण जो मेटारोडोप्सिन की प्रतिक्रिया को दर्शाता है, और एक सकारात्मक चरण जो शेष रोडोप्सिन की प्रतिक्रिया को दर्शाता है। ईआरसी प्रकाश तीव्रता (चित्रा 5 डी) पर रैखिक रूप से निर्भर करता है। तदनुसार, आर और एम राज्यों की वर्णक्रमीय संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, ईआरसी के प्रत्येक चरण को समान ऊर्जा29 के लिए विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर सामान्यीकृत करने की आवश्यकता होती है।
  3. चरण 2.1.-2.2 दोहराएँ। विभिन्न तरंग दैर्ध्य की चमक का उपयोग करना।
  4. तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत सकारात्मक और नकारात्मक ईआरसी प्लॉट करें।
    नोट: प्रकाश का मजबूत फ्लैश प्रकाश-संवेदनशील चैनलों के माध्यम से एक बड़े पैमाने पर वर्तमान को प्रेरित करता है जिससे फोटोरिसेप्टर पर चयापचय तनाव होता है, जो बदले में, प्रकाश-स्वतंत्र चैनल खोलने का कारण बनता है। ईआरसी को इस संवैधानिक धारा पर अध्यारोपित किया जाता है।

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Representative Results

चित्रा 2 ईआरजी तकनीक का उपयोग करने की मजबूती और आसानी का उदाहरण देता है। यह मजबूत है क्योंकि यह बाह्य वोल्टेज रिकॉर्डिंग की एक सरल तकनीक द्वारा वस्तुतः बरकरार मक्खी में दर्ज किया गया है जिसके लिए एक साधारण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप की आवश्यकता होती है। मजबूती अपेक्षाकृत बड़े आयाम (मिलीवोल्ट रेंज में) के साथ प्रकाश प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग प्राप्त करके प्रकट होती है, भले ही उत्परिवर्तन प्रकाश प्रतिक्रिया को दृढ़ता से कम या विकृत करते हैं। इसलिए, यहां तक कि एक अनुभवहीन प्रयोगकर्ता अत्यधिक सरल प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग कर सकता है और सीख सकता है कि कुछ दिनों में सार्थक परिणाम कैसे प्राप्त करें। फोटोपिगमेंट स्तरों को मापने के लिए डिज़ाइन की गई तकनीक का प्रमुख उद्देश्य पीडीए (चित्रा 2 सी) और ईआरपी (चित्रा 2 सी-ई) के बेहद सरलीकृत तरीकों से प्राप्त किया जाता है। विकल्प, अर्थात् माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, महंगे ऑप्टिकल उपकरण और काफी प्रशिक्षण और कौशल (चित्रा 3 बी) की आवश्यकता होती है। ईआरसी (चित्रा 5 ए-डी), हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, सेल संरक्षण के प्रति कम संवेदनशील है; यह एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और झिल्ली समाई के उन्मूलन की विशेषता है।

Figure 1
चित्रा 1: फोटोकेमिकल चक्र: फोटोपिगमेंट की सक्रियता और निष्क्रियता( ए) संतृप्त नीली रोशनी (लहराती नीली तीर) फोटोकन्वर्ट्स रोडोप्सिन (आर) को मेटारोडोप्सिन (एम)। रोडोप्सिन किनेज द्वारा एम के एकाधिक फॉस्फोराइलेशन और अरेस्टिन 2 (एआरआर 2) के बाद के बंधन एम ऑरेंज लाइट (लहराती लाल तीर) फोटोकन्वर्ट्स गैर-फॉस्फोराइलेटेड एम को आर में वापस कर देता है। गैर-फॉस्फोराइलेटेड एम हेटरोट्रिमेरिक जी-प्रोटीन (जीक्यूαβγ) को सक्रिय करता है, जिससे जीक्यूβγ से जीक्यूα का पृथक्करण होता है और साइटोप्लाज्मेटिक जीटीपी के साथ बाध्य जीडीपी का आदान-प्रदान होता है। जीक्यूα-जीटीपी तब फॉस्फोलिपेज सी (पीएलसी) को सक्रिय करता है, जो पीआईपी2 को डायसिलग्लिसरॉल (डीएजी) और इनोसिटोल ट्रिस्फॉस्फेट (आईपी3) में हाइड्रोलाइज करता है, इस प्रकार टीआरपी / सीए2 + शांतोडुलिन-निर्भर किनेज (सीएएमकेआईआई) एमपीपी-एआरआर 2 कॉम्प्लेक्स को फॉस्फोराइलेट करता है और क्लैथ्रिन-निर्भर एंडोसाइटोसिस और गिरावट से गुजरता है। नारंगी प्रकाश (लहराती लाल तीर) के साथ रोशनी एमपीपी-एआरआर 2 कॉम्प्लेक्स को फॉस्फोराइलेटेड आर (आरपीपी) में बदल देती है, साइटोसोल को एआरआर 2 जारी करती है। फॉस्फोराइलेटेड आर (आरपीपी) रोडोप्सिन फॉस्फेट (आरडीजीसी) द्वारा डिफॉस्फोराइलेशन से गुजरता है, जिससे फोटोपिगमेंट के एक और चक्र के लिए तैयार आर का उत्पादन होता है। (बी) सफेद आंखों वाले मक्खी के ईआरजी की गहराई प्रोफ़ाइल 1 एस सफेद उत्तेजना (केंद्र स्तंभ) या एक सफेद स्ट्रोब फ्लैश (दाहिने हाथ के स्तंभ) के लिए। उत्तेजनाओं को निशान के नीचे सलाखों या बिंदुओं द्वारा इंगित किया जाता है। निशान गहराई के क्रम में लंबवत व्यवस्थित होते हैं, कॉर्निया के नीचे ~ 10 μm दर्ज किए गए शीर्ष ट्रेस के साथ, प्रत्येक बाद की रिकॉर्डिंग पिछले की तुलना में 25 μm गहरी होती है। बाईं ओर एक और आंख के माध्यम से एक संबंधित खंड का एक कैमरा ल्यूसिडा ड्राइंग है, जो रेटिना, तहखाने झिल्ली (बीएम), लामिना का छिलका, लामिना कारतूस (तिरछा खंडित), और मज्जा छिलका दर्शाता है। इस आंकड़े को स्टीफेंसन और पाक11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) सफेद आंखों वाले जंगली प्रकार (डब्ल्यू1118) और उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला की प्रकाश प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग तीव्रता-प्रतिक्रिया संबंध, लंबे समय तक विध्रुवण आफ्टरपोटेंशियल (पीडीए), और मेटारोडोप्सिन क्षमता (एम-पोटेंशियल) दिखा रही है। (ए) नारंगी रोशनी (ओजी 590 एज फिल्टर, नारंगी फिल्टर का उपयोग करके प्रकाश गाइड के किनारे से उत्सर्जित कुल ऊर्जा 4 मेगावाट थी) की एक श्रृंखला द्वारा प्राप्त डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) फ्लाई की तीव्रता-प्रतिक्रिया संबंध -लॉग स्केल में इंगित प्रकाश तीव्रता में वृद्धि के साथ। इनसेट तेजी से टाइमस्केल पर संकेतित प्रतिक्रिया दिखाता है। इनसेट: ईआरजी के मुख्य घटक फोटोरिसेप्टर (रिसेप्टर क्षमता) की बाह्य वोल्टेज प्रतिक्रिया, प्रकाश उत्तेजना की शुरुआत और अंत में "चालू" और "बंद" क्षणिक (चालू, बंद प्रतिक्रिया) और ग्लिया कोशिकाओं (तीर) की धीमी प्रतिक्रिया है। (बी) ईआरजी प्रतिक्रियाओं के औसत शिखर आयाम को सापेक्ष प्रकाश तीव्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया है। (सी) डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) फ्लाई का ईआरपी संतृप्त नीले (बीपी 450/4 एनएम) के आवेदन द्वारा प्राप्त किया गया था, नीले फिल्टर का उपयोग करके प्रकाश गाइड के किनारे से उत्सर्जित कुल ऊर्जा 1 मेगावाट थी) प्रकाश जो शुरू में पीडीए को प्रेरित करता है। ईआरपी (इनसेट) निम्नलिखित तीव्र (~ 70 जे, 2 एमएस अवधि) ग्रीन फ्लैश (तीर, ब्रॉडबैंड 550 एनएम हस्तक्षेप फिल्टर) द्वारा प्राप्त किया गया था, जिसने पीडीए को दबा दिया था। इनसेट: ईआरपी के विभिन्न घटकों में कॉर्नियल नकारात्मक एम 1 क्षमता और सकारात्मक एम 2 क्षमता शामिल है, जैसा कि संकेत दिया गया है। क्षणिक ("ऑन" प्रतिक्रिया) पर एक अवशिष्ट भी इंगित किया गया है। (डी-ई) एम क्षमता के प्रेरण के लिए फोटोपिगमेंट रूपांतरण की आवश्यकता होती है: (डी) एम क्षमता नीले अनुकूलन के बाद एक हरे (ब्रॉड बैंड 550 एनएम हस्तक्षेप फिल्टर) फ्लैश द्वारा प्राप्त की गई थी, लेकिन डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) फ्लाई में नीले अनुकूलन के बाद नीले (बीपी 450/4 एनएम) फ्लैश द्वारा नहीं। (ई) डी का प्रोटोकॉल डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118, ब्लैक ट्रेस) और दो उत्परिवर्ती मक्खियों (पीएलसी शून्य उत्परिवर्ती, नॉरपापी 24, नारंगी ट्रेस, और हाइपोमॉर्फिक रोडोप्सिन उत्परिवर्ती, नीनाई पी 318, लाल ट्रेस) में दोहराया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मक्खी और बार्नकल फोटोपिगमेंट का अवशोषण स्पेक्ट्रा ( ए) मक्खी रोडोप्सिन (आर) और मेटारोडोप्सिन (एम) के सापेक्ष अवशोषण स्पेक्ट्रा अंतर स्पेक्ट्रम और फोटो-संतुलन स्पेक्ट्रम के फोटोमेट्रिक माप से गणना की जाती है। इस आंकड़े को सेलिंगर और मिंके35 से संशोधित किया गया है। (बी) क्रमशः 1.63: 1 के शिखर अवशोषण के अनुपात के साथ 492 एनएम और 532 एनएम पर चोटी तरंग दैर्ध्य के साथ दो डार्टनॉल नोमोग्राम। इन वक्रों के बीच का अंतर मोनोक्रोमैटिक ब्लू (442 एनएम) और नारंगी (596 एनएम) अनुकूलन को संतृप्त करने के बाद 400-650 एनएम की सीमा में ट्रांसमिशन माप द्वारा प्राप्त बार्नकल बैलानस एबोर्नस के ओसेली से मापा गया अंतर स्पेक्ट्रम के लिए सबसे अच्छा फिट देता है। इस आंकड़े को मिंके और किर्शफेल्ड36 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: नीना, आईएनए और एआरआर 2 म्यूटेंट का पीडीए फेनोटाइप। (ए) ड्रोसोफिला में पीडीए के प्रेरण और दमन का प्रोटोकॉल। पीडीए प्रेरण प्रोटोकॉल अधिकतम तीव्रता नारंगी प्रकाश पल्स (590 किनारे फिल्टर, नारंगी फिल्टर का उपयोग करके प्रकाश गाइड के किनारे से उत्सर्जित कुल ऊर्जा 4 मेगावाट, नारंगी बार था) का उपयोग करके एक प्रारंभिक रोशनी से बना है, इसके बाद अधिकतम तीव्रता नीली रोशनी के तीन दालों का आवेदन होता है(2 और 3 दालें अधिकतम पीडीए तक पहुंचने के सत्यापन के लिए हैं, बीपी 450/40 एनएम फिल्टर, नीले फिल्टर का उपयोग करके प्रकाश गाइड के किनारे से उत्सर्जित कुल ऊर्जा 1 मेगावाट, तीन नीली सलाखों थी)। पीडीए दमन नारंगी प्रकाश नाड़ी के आवेदन द्वारा प्राप्त किया गया था, इसके बाद एक अतिरिक्त नारंगी प्रकाश (दो नारंगी सलाखों) के आवेदन के बाद। पीडीए प्रेरण और दमन प्रोटोकॉल आर 1-6 फोटोपिगमेंट, नीनाई पी 318 7 (मध्य) के संरचनात्मक जीन के सफेद आंखों वाले उत्परिवर्ती में दोहराया गया था। पीडीए प्रेरण और दमन प्रोटोकॉल को आंख-विशिष्ट प्रोटीन किनेज सी (पीकेसी32) आईएनएसी पी 20 9 (नीचे) के सफेद आंखों वाले शून्य उत्परिवर्ती में भी दोहराया गया था। (बी) सफेद आंखों वाले डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) और शून्य एआरआर 2 उत्परिवर्ती (एआरआर 23) के बीच पीडीए के प्रेरण के लिए आवश्यक नीली रोशनी की मात्रा के बीच तुलना। बारी-बारी से नारंगी (590 किनारे फिल्टर संतृप्त) और नीले (बीपी 450/40 एनएम) प्रकाश दालों की एक ट्रेन बढ़ती प्रकाश तीव्रता (सापेक्ष -लॉग स्केल में एनडी)। -लॉग 1 तीव्रता की नीली रोशनी पर, एक पीडीए प्रेरित (शीर्ष) है। शीर्ष ट्रेस के प्रतिमान को एआरआर 23 उत्परिवर्ती में दोहराया गया था जिसमें दिखाया गया था कि पीडीए ~ 10 गुना मंद प्रकाश (-लॉग 2) तीव्रता (नीचे) की नीली रोशनी पर प्रेरित था। (सी) निरंतर तीव्रता के मंद (-लॉग 2) नीली रोशनी दालों की एक ट्रेन डब्ल्यू1118 फ्लाई (बाएं) में पीडीए को प्रेरित करने में विफल रही, जबकि मंद नीली रोशनी की एक ही ट्रेन ने एआरआर 23 उत्परिवर्ती (दाएं) में 1प्रकाश नाड़ी द्वारा पीडीए को प्रेरित किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पैच-क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग पृथक ओम्मेटिडिया की प्रकाश प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग, सफेद आंखों वाले डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) से दर्ज की गई, जो प्रारंभिक रिसेप्टर वर्तमान (ईआरसी) की पीढ़ी और इसकी तीव्रता-प्रतिक्रिया संबंध दिखाती है। (ए) उप-माइक्रोसेकंड विलंबता के साथ बिफैसिक ईआरसी प्रतिक्रिया के डब्ल्यूटी फ्लाई (डब्ल्यू1118) के पृथक ओम्मेटिडियम से पैच-क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग। प्रकाश उत्तेजना एक तीव्र (~ 220 जे, 0.8 एमएस अवधि) नीली रोशनी फ्लैश (425 एनएम, तीर पर चोटी अवशोषण के साथ ब्रॉडबैंड फिल्टर) उत्तेजना पीले-हरे (546 एनएम प्रकाश, काले ट्रेस पर चोटी अवशोषण के साथ ब्रॉडबैंड फिल्टर) के मजबूत अनुकूलन के बाद लागू होता है। प्रकाश की शुरुआत में, एक तेजी से नकारात्मक विद्युत विरूपण साक्ष्य मनाया जाता है। नकारात्मक चरण एम की सक्रियता से उत्पन्न होता है, और सकारात्मक चरण आर की सक्रियता से उत्पन्न होता है। प्रकाश-प्रेरित धारा (एलआईसी) की सक्रियता प्रकाश-संवेदनशील चैनलों के उद्घाटन से उत्पन्न होने वाले विलंबित नकारात्मक चरण से प्रकट होती है। नीनाई आई 17 शून्य उत्परिवर्ती ने पृथक ओम्मेटिडियम (लाल ट्रेस) पर लागू एक ही प्रकाश फ्लैश के लिए ईआरसी प्रतिक्रिया की कमी दिखाई। (बी) (ए) के रूप में एक ही सेल से दर्ज आरएच 1 फोटोपिगमेंट्स का ईआरसी माप। ब्लैक ट्रेस नीली रोशनी के मजबूत अनुकूलन के बाद डब्ल्यूटी (डब्ल्यू1118) फ्लाई के नारंगी फ्लैश उत्तेजना के लिए मोनो-फासिक नकारात्मक प्रतिक्रिया (एम राज्य) दिखाता है। (सी) ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला (ओपीएन 4; नीनाईआई 17) के एक एकल फोटोरिसेप्टर सेल से मापा गया बिफैसिक ईआरसी निशान का नमूना सफेद फ्लैश लाइट (एक रिश्तेदार -लॉग आई स्केल में) की बढ़ती तीव्रता के जवाब में आर 1-6 फ्लाई फोटोरिसेप्टर में चूहों मेलानोप्सिन फोटोपिगमेंट (ओपीएन 4) को एक्टोपिक रूप से व्यक्त करता है; एनडी तटस्थ घनत्व फिल्टर इंगित करता है)। फ्लैश की शुरुआत तीर द्वारा इंगित की जाती है। (डी) प्रकाश तीव्रता में वृद्धि ओपीएन 4;नीनाई आई 17 के ईआरसी आयाम में रैखिक वृद्धि से प्रकट हुई थी। सापेक्ष प्रकाश तीव्रता के एक समारोह के रूप में ईआरसी प्रतिक्रियाओं (लॉग स्केल) के नकारात्मक चरण के औसत शिखर आयाम का एक भूखंड (मैं / निरंतर सीधी रेखा एक रैखिक प्रतिगमन वक्र का प्रतिनिधित्व करती है जो प्रयोगात्मक बिंदुओं को सबसे अच्छा फिट करती है (आर2 = 0.99, त्रुटि सलाखों एसईएम, एन = 5 हैं)। इस आंकड़े को यासीन एट अल 29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: मक्खी निर्धारण और रिकॉर्डिंग पिपेट तैयारी के लिए आवश्यक उपकरण और उपकरण। (बी) फ्लाई स्लीपर सिस्टम पेडल; (सी) शीत प्रकाश स्रोत; (डी) स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप; (ई) मोम फिलामेंट हीटर; (एफ) टांका लगाने वाला लोहा; (जी) मोम फिलामेंट हीटर पेडल; (एच) रफ चिमटी; (I) चुंबकीय मक्खी स्टैंड; (जे) कम पिघलने तापमान मोम; (के) नाजुक पोंछे; (एल) ऊर्ध्वाधर विंदुक खींचने वाला; (एम) लम्बी नोक के साथ सिरिंज; (एन) इलेक्ट्रोड धारकों; (ओ) बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाएं; (पी) फिक्स्ड फ्लाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: ईआरजी सेटअप का अवलोकन( ए) पल्स जनरेटर; (बी) कंप्यूटर; (सी) ए / डी कनवर्टर; (डी) एम्पलीफायर; (ई) स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप; (एफ) माइक्रोमैनिपुलेटर (यांत्रिक ठीक); (जी) सिर-चरण के साथ माइक्रोइलेक्ट्रोड प्रीएम्पलीफायर सिस्टम; (एच) विरोधी कंपन तालिका; (I) चुंबक ब्लॉक पर / बंद; (जे) माइक्रोमैनिपुलेटर (यांत्रिक मोटे); (के) फैराडे पिंजरे; (एल) क्सीनन प्रकाश स्रोत से प्रकाश गाइड; (एम) फ्लैश लाइट सिस्टम से लाइट गाइड; (एन) ग्राउंड इलेक्ट्रोड धारक; (ओ) लाइट डिटेक्टर; (पी) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड धारक; (क्यू) चुंबकीय फ्लाई स्टैंड; (आर) क्सीनन लैंप बिजली की आपूर्ति; (एस) रंग और एनडी फिल्टर खड़े हो जाओ; (टी) ऑप्टिकल बेंच; (यू) फ्लैश लैंप प्रणाली; (वी) शटर ड्राइवर; (डब्ल्यू) लैंप बिजली की आपूर्ति; (एक्स) क्सीनन फ्लैश लाइट सिस्टम कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रिंगर का समाधान
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता (एमएम)
एनएसीएल 130
केसीएल 2
एमजीसीएल2 5
सीएसीएल2 2
हेप्स 10
एनएओएच और एचसीएल का उपयोग करके 7.15 तक पीएच अनुमापन

तालिका 1: रिंगर के समाधान की संरचना।

पूरक फ़ाइल 1: मोम पिघल नियामक का सर्किट आरेख। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर तैयारी का उपयोग करने का प्रमुख लाभ इसकी पहुंच, प्रकाश उत्तेजना की आसानी और सटीकता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, आणविक आनुवंशिकी की शक्ति को लागू करने की क्षमता7. व्यापक आनुवंशिक अध्ययनों ने जटिल जैविक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक विच्छेदन के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला की स्थापना कीहै 7. ड्रोसोफिला जीनोम की अपेक्षाकृत सरल संरचना (एक्स और वाई सेक्स गुणसूत्रों, दो बड़े ऑटोसोमल तत्वों, गुणसूत्रों 2 और 3, और छोटे डॉट चौथे गुणसूत्र सहित केवल चार गुणसूत्रों से मिलकर), विकास में आसानी, और तेजी से पीढ़ी का समय (~ 2 सप्ताह 24 डिग्री सेल्सियस पर) ड्रोसोफिला को उत्परिवर्तित व्यक्तिगत मक्खियों की विशाल संख्या की जांच के लिए उपयुक्त बनाता है। इसके अलावा, बैलेंसर गुणसूत्रों की पीढ़ी के कारण किसी भी पृथक उत्परिवर्तन का अलगाव और रखरखाव संभव हो जाता है, जिसमें प्रमुख मार्कर और कई व्युत्क्रम होते हैं, जो देशी गुणसूत्रों के साथ पुनर्संयोजन को रोकते हैं। उपलब्ध आणविक उपकरणों ने अपने मूल सेलुलर वातावरण में कृत्रिम परिवेशीय संशोधित जीन उत्पादों का अध्ययन करने की अनुमति दीहै। इस शक्तिशाली पद्धति ने नए प्रोटीन में दोषों के साथ उत्परिवर्ती मक्खियों की अधिकता का उत्पादन किया है जो अन्यथा7 की भविष्यवाणी करना मुश्किल होता।

फोटोपिगमेंट स्तरों के माप और प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता के लिए ईआरजी का उपयोग करने का प्रमुख लाभ इसकी सादगी और आवेदन में आसानी और बड़े सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। ईआरजी का उपयोग करने का नुकसान इसकी हेटेरोजेनिक सेलुलर उत्पत्ति है, जो फोटोरिसेप्टर्स9 से उत्पन्न प्रकाश प्रतिक्रिया के तरंग को विकृत करता है। वोल्टेज-क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग का प्रमुख लाभ वर्तमान-वोल्टेज (आई-वी) संबंध को मापकर चालकता परिवर्तन प्राप्त करने की क्षमता है। रोशनी के दौरान और बाद में टीआरपी और टीआरपी चैनलों का उद्घाटन और समापन इस माप से परिलक्षितहोता है। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग पिपेट (~ 10 एमΩ) के कम प्रतिरोध और धाराओं के माप के कारण एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त किया जाता है, जिससे क्वांटम धक्कों (एकल-फोटॉन प्रतिक्रियाओं) के विश्वसनीय माप की अनुमति मिलती है, जो प्रभावी प्रकाश तीव्रता38 को कैलिब्रेट करने के लिए उपयोगी है। पैच-क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग का एक बड़ा दोष यह है कि, जबकि ईआरजी रिकॉर्डिंग को अत्यधिक प्रकाश तीव्रता के तहत भी घंटों तक बनाए रखा जा सकता है, 15-30 मिनट से अधिक के लिए विश्वसनीय पैच-क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग करना मुश्किल है, और लंबे समय तक रिकॉर्डिंग के लिए मंद प्रकाश उत्तेजना की आवश्यकता होती है। पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, रिकॉर्डिंग विंदुक और फोटोरिसेप्टर झिल्ली के बीच सीधे संपर्क की आवश्यकता होती है। सीधे संपर्क ओम्माटिडिया34 (चित्रा 1 बी) के आसपास वर्णक (ग्लियाल) कोशिकाओं को हटाकर प्राप्त किया जाता है। वर्णक सेल हटाने चयापचय तनाव का कारण बनता है क्योंकि फोटोरिसेप्टर सेल एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन के लिए आवश्यक चयापचयों को संश्लेषित नहीं कर सकता है, चयापचय आपूर्ति को बाधित करताहै 39. चूंकि टीआरपी और टीआरपी चैनल एनोक्सिया की चपेट में हैं और एटीपी की कमी के कारण अंधेरे में आसानी से अनायास खुल जाते हैं, इसलिए पृथक ओम्मेटिडिया का उपयोग बड़ी कठिनाई40,12 लगाता है। पूरी प्रक्रिया को मंद लाल बत्ती के तहत किया जाना चाहिए क्योंकि प्रकाश प्रतिक्रिया एटीपी34 की एक बड़ी खपत को प्रेरित करती है।

फोटोट्रांसडक्शन कैस्केड में अधिकांश उत्परिवर्तन प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता में कमी को प्रेरित करते हैं। प्रकाश की संवेदनशीलता में इस कमी को तीव्रता-प्रतिक्रिया संबंध को मापने के आधार पर एक स्क्रीन द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है। तीव्रता-प्रतिक्रिया प्रतिमान लघुगणक पैमाने पर बढ़ती तीव्रता के साथ बार-बार प्रकाश उत्तेजनाओं द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। प्रकाश के अनुकूलन को रोकने के लिए नारंगी प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि (और कम नहीं) की आवश्यकता होती है। ईआरजी (एम-पोटेंशियल) और पीडीए फोटोपिगमेंट स्तरों को मापने के अत्यधिक सरल तरीके हैं। विकल्प, अर्थात् माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमेट्री36, महंगे ऑप्टिकल उपकरण और काफी प्रशिक्षण और कौशल की आवश्यकता होती है।

निष्कर्ष निकालने के लिए, ईआरजी लागू करने के लिए एक सरल लेकिन अपेक्षाकृत गलत उपकरण है। पूरे सेल रिकॉर्डिंग31 ईआरसी का उपयोग करके फोटोपिगमेंट स्तरों को मापने के लिए सटीक है, और यह ईआरजी की अशुद्धि और सीमाओं के लिए क्षतिपूर्ति के लिए आवश्यक है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), और यूनाइटेड स्टेट्स-इज़राइल बाइनेशनल साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम मोम फिलामेंट हीटर के निर्माण के लिए श्री अनातोली शापोचनिकोव को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184
<em>ड्रोसोफिला</em> फोटोरिसेप्टर में फोटोपिगमेंट स्तर को मापने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीके
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Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

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