Denne protokollen beskriver hvordan man bygger et kontinuerlig strømningspolymerasekjedesystem basert på en mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et kapillærelektroforesesystem i laboratoriet. Den presenterer en enkel metode for analyse av nukleinsyrer i laboratoriet.
Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en tradisjonell metode som brukes til amplifisering av et målgen som har spilt en viktig rolle i biomolekylær diagnostikk. Tradisjonell PCR er imidlertid svært tidkrevende på grunn av variasjonseffektiviteten ved lave temperaturer. Dette arbeidet foreslår et kontinuerlig flow-PCR (CF-PCR) system basert på en mikrofluidisk chip. Forsterkningstiden kan reduseres kraftig ved å kjøre PCR-løsningen inn i en mikrokanal plassert på varmeovner som er satt til forskjellige temperaturer. Dessuten, da kapillær elektroforese (CE) er en ideell måte å skille mellom positive og falske positive PCR-produkter, ble et CE-system bygget for å oppnå effektiv separasjon av DNA-fragmentene. Dette papiret beskriver prosessen med forsterkning av Escherichia coli (E. coli) av CF-PCR-systemet innebygd internt og påvisning av PCR-produktene ved CE. Resultatene viser at målgenet av E. coli ble vellykket amplifisert innen 10 minutter, noe som indikerer at disse to systemene kan brukes til rask amplifisering og påvisning av nukleinsyrer.
Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en molekylærbiologisk teknikk som brukes til å amplifisere spesifikke DNA-fragmenter, og derved forsterke spormengder av DNA hundrevis av millioner ganger. Det har blitt mye brukt i klinisk diagnose, medisinsk forskning, mattrygghet, rettsmedisinsk identifikasjon og andre felt. PCR-prosessen består hovedsakelig av tre trinn: denaturering ved 90-95 °C, glødning ved 50-60 °C og forlengelse ved 72-77 °C. Termisk sykling er en viktig del av PCR-prosessen; Den tradisjonelle PCR-termiske syklisten er imidlertid ikke bare klumpete, men også ineffektiv, og krever omtrent 40 minutter for å fullføre 25 sykluser. For å overvinne disse begrensningene ble et kontinuerlig PCR-system (CF-PCR) bygget internt, basert på en mikrofluidisk brikke. CF-PCR kan i stor grad spare tid ved å kjøre PCR-løsningen inn i mikrokanaler plassert på varmeovner ved forskjellige temperaturer 1,2,3,4,5.
Siden kapillær elektroforese (CE) har mange fordeler, for eksempel høy oppløsning, høy hastighet og utmerket reproduserbarhet 6,7,8,9,10,11, har det blitt et populært verktøy i laboratoriet for analyse av nukleinsyrer og proteiner. Imidlertid har de fleste laboratorier, spesielt laboratorier i utviklingsland, ikke råd til denne teknologien på grunn av den høye prisen på CE-instrumentet. Her har vi skissert protokoller for hvordan man fremstiller CF-PCR mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et allsidig CE-system i laboratoriet. Vi demonstrerer også prosessen med forsterkning av E. coli ved dette CF-PCR-systemet og påvisning av PCR-produktene av CE-systemet. Ved å følge prosedyrene beskrevet i denne protokollen, bør brukerne kunne fremstille mikrofluidiske chips, forberede PCR-løsninger, bygge et CF-PCR-system for nukleinsyreamplifikasjon og sette opp et enkelt CE-system, selv med begrensede ressurser, for å skille DNA-fragmenter.
Både PCR og CE er to populære bioteknologier i analysen av nukleinsyrer. Dette papiret beskriver forsterkningen av E. coli og påvisning av PCR-produktene ved hjelp av CF-PCR- og CE-systemene, begge innebygd internt. Målgenet til E. coli ble vellykket forsterket innen 10 minutter på grunn av de høye varmeoverføringshastighetene. DNA-fragmentene mindre enn 1 500 bp ble separert innen 8 minutter (figur 5). Den store fordelen med disse to teknikkene er at det i stor grad…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr. 19ZR1477500 og No.18441900400). Vi anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN | Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |