Summary
原子力显微镜压痕方案提供了剖析组织或器官的特定细胞的细胞壁在正常或受限生长期间（即缺水）的物理性质的作用的可能性。
Abstract
这里描述了一种通过原子力显微镜（AFM）与光学倒置荧光显微镜耦合的纳米压痕来表征活拟南芥根表皮细胞细胞壁的物理特性的方法。该方法包括在测量其变形的同时对样品施加受控力，允许量化参数，例如亚细胞分辨率下的细胞壁表观杨氏模量。它需要仔细地机械固定样品，并正确选择压头和压痕深度。虽然它只能用于外部组织，但这种方法允许表征发育过程中植物细胞壁的机械变化，并使这些微观变化与整个器官的生长相关联。
Introduction
植物细胞被细胞壁包围，细胞壁是由多糖，蛋白质，代谢物和水的相互作用网络组成的复杂结构，其厚度从0.1到几μm不等，具体取决于细胞类型和生长阶段1，2。细胞壁的机械性能在植物的生长中起着至关重要的作用。细胞壁的低刚度值已被提出作为细胞生长和细胞壁扩张的先决条件，并且越来越多的证据表明，所有细胞都感觉到机械力来执行其功能。然而，细胞壁物理性质的变化是否决定了细胞命运2，3，4仍然存在争议。由于植物细胞在发育过程中不会移动，因此器官的最终形状取决于细胞扩张的距离和方向。因此，拟南芥根是研究细胞壁物理性质对细胞扩张影响的良好模型，因为不同类型的扩张发生在根的不同区域。例如，各向异性扩张在伸长区很明显，在表皮细胞中尤其明显5。
这里描述的方法用于使用原子力显微镜（AFM）与倒置荧光相位显微镜6相结合，在活拟南芥根的纳米尺度上表征表皮细胞细胞壁的物理性质。有关AFM技术的广泛修订，请阅读7，8，9。
该协议概述了基于AFM的植物细胞壁弹性测量的基本样品制备方法和通用方法。
图1：使用原子力显微镜（AFM）在拟南芥根中力压痕实验的示意图。 该方案概述了力压痕实验的步骤，从制备底物到牢固地固定根样品（1-2），通过碘化丙啶染色确认根系活力（3），悬臂定位在初级根的细长表皮细胞表面上（4-5），力曲线测量（6）和力曲线处理以计算表观杨氏模量（7-8）。EZ：伸长区。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
1. 植物材料和生长条件的制备
- 为了产生所需的植物材料，对拟南芥野生型和感兴趣的突变系的种子进行灭菌。
注意：在此协议中，我们使用了以下内容： ttl1： T-DNA插入线Salk_063943（用于 TTL1;AT1G53300） - 哥伦比亚-0 （ Col-0 ） 野生型; Procuste1 （prc1-1 ） 突变体，由 CESA6 基因 （AT5G64740） 中的敲除突变 （Q720stop） 组成，如前所述 10，11;和 TTL1 x PRC1-1 双突变体。- 将大约体积的 50 μL 种子放入微管中。在室温下加入 500 μL 70% 乙醇 + 0.01% 吐温溶液。混合并孵育7分钟。
- 倒入乙醇溶液并加入 500 μL 20% 次氯酸钠。混合并孵育7分钟。
- 倒入次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子三到四次。
- 电镀
- 提前准备基础Murashige和Skoog（MS）培养基12 + 1.5%蔗糖+ 1%琼脂（pH 5.7）（见 材料表）。高压灭菌介质。准备一个层流罩，在无菌环境中工作，并标记实验所需的方形培养皿。将培养基倒入培养皿中，让培养基凝固。
- 使用无菌移液器吸头将灭菌的种子铺到含有培养基的方形培养皿上。将种子均匀地分布在两行中。种子干燥后，盖上盖子并密封板。将种子在4°C的黑暗中分层4天。
注意：需要分层以同步发芽。 - 将板垂直放置在生长室中，以25μmolm2 s - 1 光强度和23°C（日/夜）的长日照状态（16小时光照/ 8小时黑暗）。将幼苗种植7天。
2. 渗透应激处理（可选）
注意：本节详细介绍了拟南芥根在-1.2MPa渗透压中的生长，由低温渗透压计估计（材料表）。根据手头的实验问题，可以省略或更改此部分。
- 制备基础MS培养基+ 1.5%蔗糖+ 400 mM甘露醇+ 1%琼脂（pH 5.7）。高压灭菌介质。将培养基倒入层流罩中的方形培养皿中，让培养基凝固。
- 用镊子（材料表），将预生长在基础MS + 1.5%蔗糖培养基中的5天龄幼苗置于含有补充有400mM甘露醇的培养基的方形培养皿中。将板垂直放置在生长室中，条件与步骤1.2.3相同。在这种渗透胁迫条件下生长幼苗7天。
注意：为了评估主根在严重渗透胁迫下的根系生长适应性，建议在受控条件下发芽后5天使用幼苗，以确保根分生组织大小已经确定13。或者，可以在发育的每个阶段进行分析，以确定渗透应激作用的发育效果。
3. 原子力显微镜（AFM）纳米压痕实验
- 制备用于纳米压痕实验的样品
注意：这是将AFM应用于活体生物样品研究的关键步骤。样品必须牢固地附着在基板上，以便在压痕测量期间保持机械稳定。同时，应保留样品结构质量。稳定AFM大样品的有效策略是使用粘合剂。粘合剂必须快速干燥，并且不得有毒或与周围介质发生反应。在该方案中，使用聚苯乙烯培养皿作为基质，并使用非酸性硅胶（材料表）结合拟南芥幼苗。- 用盖玻片将一层薄薄的硅胶涂在培养皿中。将胶水在空中放置45秒。
- 用镊子将幼苗放在胶水上，将其定向到避免幼苗的突出部分与悬臂之间接触的方向。然后，将根轻轻按压在硅胶胶层上以牢固地粘合。让幼苗与胶水接触45秒，然后再继续协议的后续步骤。
- 用 2 μg/mL 碘化丙啶 （PI; 目录）在黑暗中5分钟，并用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（材料表）仔细洗涤三次。
- 将PI孵育的幼苗放入与AFM耦合的倒置荧光显微镜中。要观察荧光，请将激发和发射波长分别设置为 572 nm 和 617 nm。表皮细胞内没有荧光证实了根的活力。
- 用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液覆盖幼苗。
- 缩进协议
注意：在室温下将样品固定在其支架上的1小时内进行所有AFM测量。AFM所在的房间应使用空调保持在25°C。PBS溶液应处于相同的温度。- 将带有锥形尖端的标准氮化硅悬臂（参见材料表）安装到AFM探头支架中以用于流体（材料表）。
- 将悬臂上的激光对准靠近尖端位置的位置。接下来，移动光电二极管，将激光光斑放置在探测器的中心。
- 要校准偏转灵敏度，请将具有 1x PBS 的聚苯乙烯培养皿放置在 AFM 下方。
注意：需要此步骤来计算缩进。当在坚硬的表面上进行力测量时，表面没有压痕，因此z扫描仪位移的任何变化都对应于悬臂挠度。因此，校准硬表面上的偏转灵敏度非常重要。使用柔软的表面会高估挠度灵敏度，从而导致弹簧常数过低。 - 调整光电检测器，使非接触偏转接近0 V.通过执行压痕（力曲线）来校准偏转灵敏度，斜坡尺寸为3μm，压痕和回缩速率为0.6μm/s，触发阈值为0.5 V。
- 要校准悬臂的弹簧常数，请使用AFM软件（材料表）的热调谐实用程序，推荐用于弹簧常数小于约5 N/m的探头，或使用参考文献14中描述的方法。在软件中激活热调谐之前，请确保探头不与样品相互作用。
- 输入悬臂温度。单击校准>热调谐或 NanoScope 工具栏中的热调谐图标。选择频率范围 （1-100 Hz）。
- 单击“热调谐”面板中的“获取数据”。等待AFM获取数据，然后单击简单谐波振荡器（流体）按钮。
- 将 中值过滤器宽度调整为 3。调整 PSD箱宽度 ，通过平均来降低采集数据中的噪声。在第一个共振峰周围设置拟合边界。
- 单击“ 计算弹簧常数 k”，然后在弹出窗口中单击“ 是 ”，询问用户是否要使用此值。
- 重复上述步骤三次，并手动取弹簧常数值的平均值。在 PicoForce 视图的渐变参数列表的弹簧常量框中输入此平均值。校准至此结束。
- 使用10倍、20倍和40倍目镜放大倍率的倒置光学显微镜，将AFM探针定位在初级根的第四个细长表皮细胞的表面上，确保将其定位在细胞的中心。
- 使用计算出的弹簧常数值（步骤3.2.5.5），获得斜坡尺寸为3μm，触发阈值为11 nN，所选点的压痕和回缩率为0.6μm/s的力曲线。
注意：以前的工作15，16 发现压痕和缩回的低频率有助于最大限度地减少滞后和阻力。 - 每次处理从每个根的三个细胞获得力曲线（每次处理使用三个生物学重复）。为每个根捕获至少 150 条力曲线。
4. 测量表观杨氏模量
- 将每条力曲线拟合到锥形压头17 的以下模型：
，其中 E 是样品的表观杨氏模量，是样品的泊松模量， 
α 是 顶点的半角。丢弃相关系数 （r2） < 0.99 的拟合。考虑完全不可压缩材料的泊松比： = 0.5和制造商给出的压头的几何形状。
注意：使用距载荷曲线接触点的前 100 nm，以使拟合对细胞壁力学尽可能敏感，并减少膨胀压力对表观杨氏模量值的影响8.拟合是使用定制的 MATLAB 程序完成的（可根据个人要求写信给 J. C. B），该程序允许从加载曲线的接触点设置特定的压痕深度。 - 使用表观杨氏模量数据创建归一化直方图，并将其拟合为高斯分布。丢弃 95% 置信区间之外的数据点，并重新计算直方图和高斯拟合。计算并报告表观杨氏模量的平均值和标准偏差。
- 通过多个比较测试（如方差分析）确定组间比较的显著性。
，其中 E 是样品的表观杨氏模量，是样品的泊松模量， 
α 是 顶点的半角。丢弃相关系数 （r2） < 0.99 的拟合。考虑完全不可压缩材料的泊松比： Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
力压痕实验
以下文本提供了进行力压痕实验时预期的一些结果，以显示协议执行良好时预期的典型输出。
力-位移曲线
图2显示了在根伸长区细胞中心的位置压进活样品获得的代表性力压痕 图。当AFM尖端开始压进细胞壁表面时，由于细胞壁对变形的抵抗，力开始增加（ 图2A中的1表示）。力（载荷）的增加一直持续到达到最大力值（ 图2A中的2表示）;在此之后，开始缩进的卸载部分。
图2：在活根伸长区细胞壁上进行压痕实验中获得的力-位移曲线 。 （A）典型的力-位移曲线。在 1 标记的位置，力开始增加;AFM尖端开始缩进细胞壁。力（载荷）的增加一直持续到达到最大力值，如 2 所示;在此之后，开始缩进的卸载部分。（B）力-位移曲线示例，其中无法检测到压痕前电池表面的位置（用 a表示），并且加载和卸载曲线都是噪声的。 请点击此处查看此图的大图。
预期的力-位移曲线将在压痕部分显示力在抛物线之后增长，正如模型所预测的那样（在步骤 4.1 中解释）（图 2A）。另一个拟合参数是接触点位置;它应与压痕前的细胞壁表面相对应，并被认为是AFM尖端位移的原点。在压痕之前无法检测到接触点的力曲线应丢弃（图2B）。力压痕实验的装卸曲线必须无噪声。必须摒弃图 2B 所示的噪声曲线。
表观杨氏模量的归一化直方图
图3显示了在对照条件下生长的三种不同Col-0植物的九个不同细胞上的一组201个成功压痕的一组201个成功压痕获得的表观杨氏模量频率分布图，如图 3所示。该图显示了一个示例，其中表观杨氏模量（88.12 ± 2.79 KPa）的平均值和标准偏差是根据拟合有高斯曲线6 的直方图计算的。
图 3：表观杨氏模量的直方图示例，可以对结果进行适当的统计分析。数据来自在对照条件下生长的三种不同Col-0植物的九个不同细胞的力曲线。从201条力曲线获得的数据拟合到高斯分布。相对频率表示与每个计算的表观杨氏模量相对应的拟合力曲线的数量。该条件的均值和标准差值是从高斯拟合中获得的。射频：相对频率;AEM：明显的杨氏模量。此图修改自参考文献6请点击此处查看此图的大图。
由于根的形态，某些基因型可能很难缩进。在严重渗透胁迫下生长的prc1-1突变体和ttl1 prc1-1双突变体就是这种情况。在这种情况下，这些突变体在根伸长区几乎没有细长的细胞，并且发育出很长的根毛，这干扰了产生样品运动的悬臂。图 4 显示了在 ttl1 prc1-1 双突变体的九个不同细胞上获得的表观杨氏模量值的概率分布。该图显示了一个示例，其中获得的力曲线不允许进行正确的分析。只有对应于一个单元格的直方图 H 才能拟合到高斯分布6。
图 4：无法进行正确分析的表观杨氏模量的直方图示例。数据来自ttl1prc1-1双突变体的三种不同植物的九个不同细胞的力曲线。相对频率表示与每个计算的表观杨氏模量相对应的拟合力曲线的数量。只有直方图 H 可以拟合到高斯分布。射频：相对频率;AEM：表观杨氏模量。该图修改自参考文献6。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
细胞和细胞壁力学对于深入了解力学如何影响生长过程变得越来越重要。随着物理力在固体组织中传播相当长的距离，研究细胞壁物理性质的变化以及它们如何被感知、控制、调整和影响植物的生长正在成为一个重要的研究领域2，3，8。
本文提出了一种研究拟南芥根伸长区细胞壁物理性质的方法。AFM技术可以很容易地与其他技术（例如生长速率研究）结合使用，以了解细胞壁物理特性对根系生长的影响。
最关键的实验步骤之一是样品的机械固定;样品必须牢固连接，以避免样品在缩进时移动。硅胶层必须足够薄，以便快速干燥。硅胶和样品的操作应小心，以确保硅胶不会覆盖将要测量的样品区域。此外，应快速（一分钟内）完成制备工作，以保持有机硅胶的粘合性能并防止根部脱水。防止组织损伤至关重要;表皮组织的脱水和损伤将产生细胞壁机械性能的不可逆转的变化。其他方法在载玻片上使用1%琼脂糖固定;然而，该方法也存在一个挑战，即需要快速操作和额外的载玻片制备步骤，以防止样品在分析过程中在X轴和Y轴上移动。有关更多信息，请参阅参考文献8，18。该协议的另一个相关点是用具有不同物镜（10x，20x和40x）的落射荧光耦合的光学显微镜计数。这样可以准确选择压痕区域。
该协议的一个具有挑战性的方面是AFM压痕设置的选择。不同的压头和压痕深度呈现不同的分辨率，可用于回答不同的研究问题8.多项研究表明，尖端的尺寸和几何形状是辨别所需结果的重要考虑因素。使用不同的尖端形状获得不同的信息7.例如，圆锥形尖端可以在亚细胞水平上区分机械性能，球形尖端可以更好地表示整个细胞19的机械性能，而锥形尖端允许同时获得高分辨率图像和机械性能7，20。锥形尖端半径（20-60 nm）的选择对于防止尖端下沉非常重要，从而实现适当的压痕过程。对于每种应用，研究人员必须选择更适合样品的悬臂（和尖端）类型以及要执行的测量类型8。
该方法有一些局限性：只能测量器官表面细胞的机械性能，并且难以处理具有可变地形的组织。例如，根毛可能使AFM尖端8，18难以进入表皮细胞。最后，虽然所提出的方法测量弹性，但纳米压痕也已用于报告植物和动物的粘度和膨胀压力8，18。
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Disclosures
作者没有利益冲突。用于拟合数据的 MATLAB 脚本可根据个人要求通过写信给 J. C. B 获得。
Acknowledgments
这项研究由CSIC I + D 2018资助，资助号95（Mariana Sotelo Silveira）。CSIC Grupos（Omar Borsani）和PEDECIBA。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
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