Summary
Atomkraftsmikroskopiets indragningsprotokoll erbjuder möjligheten att dissekera rollen för de fysikaliska egenskaperna hos cellväggen hos en viss cell i en vävnad eller ett organ under normal eller begränsad tillväxt (dvs. under vattenunderskott).
Abstract
En metod beskrivs här för att karakterisera de fysikaliska egenskaperna hos cellväggen hos epidermala celler från levande Arabidopsis-rötter genom nanoindragningar med ett atomkraftmikroskop (AFM) i kombination med ett optiskt inverterat fluorescensmikroskop. Metoden består i att applicera kontrollerade krafter på provet samtidigt som man mäter dess deformation, vilket möjliggör kvantifiering av parametrar såsom den uppenbara Youngs modul av cellväggar vid subcellulära upplösningar. Det kräver en noggrann mekanisk immobilisering av provet och korrekt urval av indenters och indragningsdjup. Även om den endast kan användas i yttre vävnader, tillåter denna metod att karakterisera mekaniska förändringar i växtcellväggar under utveckling och möjliggör korrelationen mellan dessa mikroskopiska förändringar och tillväxten av ett helt organ.
Introduction
Växtceller är omgivna av en cellvägg som är en komplex struktur som består av interagerande nätverk av polysackarider, proteiner, metaboliter och vatten som varierar i tjocklek från 0,1 till flera μm beroende på celltyp och tillväxtfas 1,2. Cellväggsmekaniska egenskaper spelar en viktig roll i växternas tillväxt. Låga styvhetsvärden för cellväggen har föreslagits som en förutsättning för celltillväxt och cellväggsutvidgning, och det finns ökande bevis för att alla celler känner av mekaniska krafter för att utföra sina funktioner. Det diskuteras dock fortfarande om förändringar i cellväggens fysikaliska egenskaper avgör cellens öde 2,3,4. Eftersom växtceller inte rör sig under utvecklingen beror den slutliga formen på ett organ på hur långt och i vilken riktning en cell expanderar. Således är Arabidopsisrot en bra modell för att studera effekterna av cellväggsfysikaliska egenskaper vid cellutvidgning eftersom olika typer av expansion förekommer i olika regioner av roten. Till exempel är anisotrop expansion uppenbar i förlängningszonen och särskilt märkbart i epidermala celler5.
Metoden som beskrivs här användes för att karakterisera de fysikaliska egenskaperna hos cellväggen hos epidermala celler på nanoskalan hos levande Arabidopsis-rötter med hjälp av ett atomkraftmikroskop (AFM) i kombination med ett inverterat fluorescensfasmikroskop6. För en omfattande revidering av AFM-tekniken, läs 7,8,9.
Detta protokoll beskriver en grundläggande provberedningsmetod och en allmän metod för AFM-baserade elasticitetsmätningar av växtcellväggar.
Figur 1: Schematisk översikt över kraftindragningsexperiment i Arabidopsis-rötter med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM). Schemat ger en översikt över stegen i ett Force-Indentation-experiment från beredningen av substratet för att immobilisera rotprovet ordentligt (1-2), rotviabilitetsbekräftelse genom propidiumjodidfärgning (3), cantileverpositionering på ytan av en långsträckt epidermal cell i den primära roten (4-5), kraftkurvmätning (6) och kraftkurvbearbetning för att beräkna den uppenbara Youngs modul (7-8). EZ: förlängningszon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av växtmaterialet och tillväxtförhållandena
- För att generera det nödvändiga växtmaterialet, sterilisera frön av Arabidopsis vild typ och mutantlinjer av intresse.
OBS: I detta protokoll använde vi följande: ttl1: T-DNA-insättningslinjer Salk_063943 (för TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) vildtyp; Procuste1 (prc1-1) mutanten, som består av en knock-out-mutation (Q720stop) i CESA6-genen (AT5G64740), som tidigare beskrivits i10,11; och TTL1 x PRC1-1 dubbelmutant.- Lägg en ungefärlig volym på 50 μL frön i ett mikrorör. Tillsätt 500 μl 70% etanol + 0,01% tweenlösning vid rumstemperatur. Blanda och inkubera i 7 min.
- Häll etanollösningen och tillsätt 500 μl 20% natriumhypoklorit. Blanda och inkubera i 7 min.
- Häll natriumhypokloritlösningen och tvätta fröna tre till fyra gånger med sterilt vatten.
- Plätering
- Förbered i förväg basal Murashige och Skoog (MS) medium12 + 1,5% sackaros + 1% agar (pH 5,7) (se materialtabell). Autoklavera mediet. Förbered en laminär flödeshuv för att arbeta i en steril miljö och märk de fyrkantiga petriskålarna som behövs för experimentet. Häll mediet i petriskålarna och låt mediet stelna.
- Platta de steriliserade fröna med sterila pipettspetsar på fyrkantiga petriskålar som innehåller mediet. Fördela fröna jämnt i två rader. När fröna är torra, stäng locken och försegla plattorna. Stratifiera fröna vid 4 °C i mörkret i 4 dagar.
OBS: Stratifiering behövs för att synkronisera spiring. - Placera plattorna vertikalt i tillväxtkammaren i en långdagsregim (16 h ljus/8 h mörkt) med 25 μmol m2 s−1 ljusintensitet och 23 °C (dag/natt). Växa plantorna i 7 dagar.
2. Osmotisk stressbehandling (valfritt)
OBS: Detta avsnitt ger detaljer om tillväxten av Arabidopsis-rötter i osmotisk potential på -1,2 MPa enligt uppskattning av kryoskopisk osmometer (materialtabell). Denna del kan utelämnas eller ändras beroende på den aktuella experimentella frågan.
- Förbered basal MS-medium + 1,5% sackaros + 400 mM mannitol + 1% agar (pH 5,7). Autoklavera mediet. Häll mediet i fyrkantiga petriskålar i den laminära flödeshuven och låt mediet stelna.
- Med pincett (materialtabell), placera 5-dagars gamla plantor förvuxna i basal MS + 1,5% sackarosmedium i fyrkantiga petriskålar som innehåller mediet kompletterat med 400 mM mannitol. Placera plattorna vertikalt i tillväxtkammaren under samma förhållanden som i steg 1.2.3. Växa plantorna under detta osmotiska stresstillstånd i 7 dagar.
OBS: För att utvärdera rottillväxtanpassning av den primära roten under svår osmotisk stress föreslås att plantor används 5 dagar efter spiring odlad under kontrollerade förhållanden för att säkerställa att rotmeristemstorleken redan är etablerad13. Alternativt kan analysen utföras vid varje utvecklingsstadium för att bestämma utvecklingseffekten av osmotisk stressverkan.
3. Atomkraftsmikroskopi (AFM) nanoindentationsexperiment
- Beredning av provet för nanoindentationsexperiment
OBS: Detta är ett viktigt steg för att tillämpa AFM på studier av levande biologiska prover. Provet måste vara ordentligt fäst vid substratet för att vara mekaniskt stabilt under indragningsmätningar. Samtidigt bör provets strukturella egenskaper bevaras. En effektiv strategi för att stabilisera ett stort prov för AFM är att använda lim. Limet måste torka snabbt och får inte vara giftigt eller reaktivt med det omgivande mediet. I detta protokoll användes polystyren petriskålar som substrat och icke-surt silikonlim (materialtabell) användes för att binda Arabidopsis-plantorna.- Sprid ett tunt lager silikonlim i petriskålen med en täckglas. Låt limet ligga i luften i 45 s.
- Placera plantan på limet med pincett och orientera den i en riktning som undviker kontakt mellan plantans utskjutande delar och cantilever. Tryck sedan roten försiktigt mot silikonlimskiktet för att binda det ordentligt. Låt plantan komma i kontakt med limet i 45 s innan du fortsätter med nästa steg i protokollet.
- Inkubera de bifogade plantorna med 2 μg/ml propidiumjodid (PI; Tabell över material) i 5 min i mörker och tvätta dem försiktigt tre gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (Materialtabell).
- Placera de PI-inkuberade plantorna i ett inverterat fluorescensmikroskop i kombination med AFM. För att observera fluorescens, ställ in excitations- och emissionsvåglängderna vid 572 nm respektive 617 nm. Frånvaron av fluorescens inuti epidermala celler bekräftar rötternas livskraft.
- Täck plantan med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Indragningsprotokoll
OBS: Utför alla AFM-mätningar inom 1 h efter immobilisering av provet på dess stöd vid rumstemperatur. Rummet där AFM är beläget bör hållas vid 25 °C med luftkonditionering. PBS-lösningen ska ha samma temperatur.- Montera en standard kiselnitridutskjutare med en pyramidspets (se materialtabell) i AFM-sondhållaren för vätska (materialtabell).
- Rikta in lasern på utskjutaren nära spetsens läge. Flytta sedan fotodioden för att placera laserpunkten i mitten av detektorn.
- För att kalibrera avböjningskänsligheten, placera en polystyren petriskål med 1x PBS under AFM.
OBS: Detta steg behövs för att beräkna indragningen. När en kraftmätning görs på en hård yta finns det ingen indragning i ytan, så varje förändring i z-skannerns förskjutning motsvarar den utskjutande avböjningen. Därför är det mycket viktigt att kalibrera avböjningskänsligheten på en hård yta. Att använda en mjuk yta kommer att överskatta avböjningskänsligheten, vilket kommer att resultera i fjäderkonstanter som är för låga. - Justera fotodetektorn så att den beröringsfria avböjningen är nära 0 V. Kalibrera avböjningskänsligheten genom att utföra en indragning (kraftkurva), med en rampstorlek på 3 μm, en indragnings- och indragningshastighet på 0,6 μm/s och en utlösningströskel på 0,5 V.
- För att kalibrera fjäderkonstanten på frigöraren, använd verktyget Thermal Tune i AFM-programvaran (Materialtabell) som rekommenderas för sonder med fjäderkonstanter mindre än cirka 5 N/m eller använd den metod som beskrivs i referens14. Innan du aktiverar Thermal Tune i programvaran, se till att sonden inte interagerar med provet.
- Ange utskjutande temperatur. Klicka på Kalibrera > termisk inställning eller på ikonen Thermal Tune i NanoScope-verktygsfältet . Välj ett frekvensområde (1-100 Hz).
- Klicka på Hämta data i panelen Thermal Tune. Vänta tills AFM hämtar data och klicka sedan på knappen Simple Harmonic Oscillator (Fluid).
- Justera medianfilterbredden till 3. Justera PSD-binbredden för att minska bruset i de förvärvade data genom medelvärde. Sätt passningsgränser runt den första resonanstoppen.
- Klicka på Beräkna vårkonstant k och klicka sedan på Ja i popup-fönstret och fråga om användaren vill använda detta värde.
- Upprepa stegen som beskrivs ovan tre gånger och ta manuellt ett genomsnitt av fjäderkonstantvärden. Ange det här medelvärdet i rutan Spring Constant i listan Rampparameter i PicoForce-vyn . Kalibreringen slutar vid denna punkt.
- Använd det inverterade optiska mikroskopet vid 10x, 20x och 40x okularförstoring, placera AFM-sonden på ytan av den fjärde långsträckta epidermala cellen i den primära roten och se till att placera den i mitten av cellen.
- Med det beräknade konstanta fjädervärdet (steg 3.2.5.5), erhåll kraftkurvor med en rampstorlek på 3 μm, en utlösningströskel på 11 nN och en indragnings- och indragningshastighet på 0,6 μm/s vid utvalda punkter.
OBS: Tidigare arbete15,16 fann att låg frekvens av indragning och indragning hjälper till att minimera hysteres och dragkraft. - Få kraftkurvor från tre celler per rot för varje behandling (använd tre biologiska replikat per behandling). Fånga minst 150 kraftkurvor för varje rot.
4. Mät den uppenbara Youngs modul
- Anpassa varje kraftkurva till följande modell för pyramidala indenters17:
, där E är den uppenbara Youngs modul för provet, 
är provets Poisson-modul och α är halvvinkeln mot vertexen. Kassera passningarna med en korrelationskoefficient (r2) < 0,99. Tänk på Poissons förhållande för helt inkompressibelt material: = 0,5 och geometrin hos indentern som ges av tillverkarna.
OBS: Använd de första 100 nm från kontaktpunkten för belastningskurvan för att monteringen ska vara så känslig som möjligt för cellväggsmekanik och för att minska påverkan av turgortryck på den uppenbara Youngs modulvärden8. Monteringen har gjorts med hjälp av ett anpassat MATLAB-program (tillgängligt på personlig begäran genom att skriva till J. C. B) som gör det möjligt att ställa in ett specifikt indragningsdjup från laddningskurvans kontaktpunkt. - Skapa ett normaliserat histogram med den uppenbara Youngs moduldata och passa den med en Gaussisk fördelning. Kassera datapunkter utanför 95 % konfidensintervall och beräkna om både histogrammet och den gaussiska passformen. Beräkna och rapportera medelvärdet och standardavvikelsen för den uppenbara Youngs modul.
- Bestäm betydelsen av jämförelserna mellan grupper genom flera jämförelsetester som ANOVA.
, där E är den uppenbara Youngs modul för provet, 
är provets Poisson-modul och α är halvvinkeln mot vertexen. Kassera passningarna med en korrelationskoefficient (r2) < 0,99. Tänk på Poissons förhållande för helt inkompressibelt material: Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Force-Indentation experiment
I följande text presenteras några förväntade resultat när ett kraftindragsexperiment utförs för att visa de typiska utdata som kan förväntas när protokollet är väl utfört.
Kurvor för kraftförskjutning
Representativa kraftindragningsdiagram som erhölls indragande levande prover vid en position placerad i mitten av cellen i rotförlängningszonen presenteras i figur 2. När AFM-spetsen börjar dra in cellväggens yta börjar kraften öka (indikeras med 1 i figur 2A) på grund av cellväggens motstånd mot deformationen. Kraftökningen (belastning) fortsätter tills det maximala kraftvärdet uppnås (indikeras av 2 i figur 2A); Efter denna punkt börjar lossningsdelen av indragningen.
Figur 2: Kraftförskjutningskurvor erhållna i indragningsexperiment gjorda i cellväggar i levande rotförlängningszonceller . (A) En typisk kraftförskjutningskurva. Vid den position som markeras med 1 börjar kraften öka; AFM-spetsen börjar dra in cellväggen. Kraftökningen (belastning) fortsätter tills det maximala kraftvärdet uppnås, vilket indikeras med 2; Efter denna punkt börjar lossningsdelen av indragningen. (B) Exempel på en kraftförskjutningskurva där det är omöjligt att detektera cellytans position före indragningen (indikerad med a) och både lastnings- och lossningskurvorna är bullriga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De förväntade kraftförskjutningskurvorna visar i indragningsdelen att kraften växer efter en parabel, vilket förutsägs av modellen (förklaras i steg 4.1) (figur 2A). En annan passande parameter är kontaktpunktens position; den ska motsvara cellväggsytan före indragning och anses vara ursprunget till AFM-spetsförskjutningen. Kraftkurvor där det är omöjligt att upptäcka kontaktpunkten innan indragningen ska kasseras (figur 2B). Lastnings- och lossningskurvan för kraftindragningsförsöket skall vara utan buller. Bullriga kurvor som den som representeras i figur 2B måste kasseras.
Normaliserat histogram av den uppenbara Youngs modul
Histogrammen som visar fördelningen av frekvensen för de erhållna värdena för den uppenbara Youngs modul för en uppsättning av 201 framgångsrika indragningar på nio olika celler av tre olika växter av Col-0 odlade under kontrollförhållanden presenteras i figur 3. Figuren visar ett exempel där medelvärdet och standardavvikelsen för den skenbara Youngs modul (88,12 ± 2,79 KPa) beräknades från histogrammen försedda med en Gaussisk kurva6.
Figur 3: Exempel på ett histogram över uppenbar Youngs modul som möjliggjorde en korrekt statistisk analys av resultaten. Data erhölls från kraftkurvor på nio olika celler av tre olika växter av Col-0 odlade under kontrollförhållanden. Data som erhållits från 201 kraftkurvor anpassades till en gaussisk fördelning. Den relativa frekvensen anger antalet monterade kraftkurvor som motsvarar varje beräknad skenbar Youngs modul. Medelvärdet och standardavvikelsevärdena för detta tillstånd erhölls från Gaussian-passningarna. RF: Relativ frekvens; AEM: uppenbar Youngs modul. Denna siffra ändrades från referens6Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vissa genotyper kan vara mycket svåra att dra in på grund av rotens morfologi. Detta var fallet för prc1-1 mutant och ttl1 prc1-1 dubbelmutant odlad i svår osmotisk stress. I detta tillstånd hade dessa mutanter få långsträckta celler i rotförlängningszonen och utvecklade mycket långa rothår, vilket stör cantilever som producerar provrörelsen. Figur 4 presenterar histogram som visar sannolikhetsfördelningen för de erhållna värdena för den uppenbara Youngs modul på nio olika celler i dubbelmutanten ttl1 prc1-1. Figuren visar ett exempel där de erhållna kraftkurvorna inte tillät korrekt analys. Endast histogram H som motsvarar en cell kan monteras på en Gaussisk fördelning6.
Figur 4: Exempel på histogram av uppenbar Youngs modul som inte tillät en korrekt analys. Data erhölls från kraftkurvor på nio olika celler av tre olika växter av dubbelmutanten ttl1prc1-1 . Den relativa frekvensen anger antalet monterade kraftkurvor som motsvarar varje beräknad skenbar Youngs modul. Endast histogram H kunde anpassas till en gaussisk fördelning. RF: Relativ frekvens; AEM: den uppenbara Youngs modul. Denna siffra ändrades från referens6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell- och cellväggsmekanik blir alltmer relevant för att få insikt i hur mekanik påverkar tillväxtprocesser. När fysiska krafter sprider sig över betydande avstånd i fasta vävnader blir studien av förändringar i cellväggens fysikaliska egenskaper och hur de avkänns, kontrolleras, ställs in och påverkar växtens tillväxt ett viktigt studieområde 2,3,8.
En metod presenteras här för att studera cellväggens fysikaliska egenskaper hos celler i förlängningszonen hos Arabidopsisroten. AFM-tekniken kan lätt kombineras med andra tekniker, såsom tillväxthastighetsstudier, för att förstå effekten av cellväggens fysikaliska egenskaper i rottillväxt.
Ett av de mest kritiska experimentella stegen är den mekaniska immobiliseringen av provet; Provet måste vara ordentligt fastsatt för att undvika provets rörelse medan det är indraget. Silikonlimmets skikt måste vara tillräckligt tunt för att det ska kunna torka snabbt. Manipuleringen av silikonlimmet och provet bör vara noga med att säkerställa att silikonet inte täcker de områden i provet som kommer att mätas. Dessutom bör beredningen slutföras snabbt (inom en minut) för att bibehålla silikonlimmets vidhäftningsegenskaper och förhindra uttorkning av rötter. Det är viktigt att förhindra vävnadsskador; Dehydrering och skada på epidermal vävnad kommer att ge irreversibla förändringar i cellväggens mekaniska egenskaper. Andra metoder använde immobilisering i 1% agaros på en glasskiva; emellertid har denna metod också utmaningen att behöva snabb manipulation och ytterligare ett steg för beredning av glasskivorna för att förhindra att proverna rör sig i X- och Y-axlarna under analysen. För mer information, se referenser 8,18. En annan relevant punkt i detta protokoll är att räkna med ett optiskt mikroskop med epifluorescens kopplat till AFM som har olika mål (10x, 20x och 40x). Detta gör det möjligt att välja indragsområdet korrekt.
En utmanande aspekt av protokollet är valet av AFM-indragningsinställningar. Olika indenters och indragningsdjup ger olika upplösningar och kan användas för att svara på olika forskningsfrågor8. Flera studier har visat att spetsens storlek och geometri är viktiga överväganden för att urskilja de önskade resultaten. Olika information erhålls med olika spetsformer7. Till exempel kan den koniska spetsen diskriminera mekaniska egenskaper på subcellulär nivå, den sfäriska spetsen kan bättre representera de mekaniska egenskaperna hos hela cellen19, och pyramidala spetsar gör det möjligt att få högupplösta bilder och mekaniska egenskaper samtidigt 7,20. Valet av pyramidal spetsradie (20-60 nm) är viktigt för att förhindra att spetsen sjunker, vilket möjliggör en korrekt indragningsprocess. För varje applikation måste forskaren välja vilken typ av cantilever (och spets) som är bättre lämpad för provet och vilken typ av mätningar som ska utföras8.
Metoden har vissa begränsningar: de mekaniska egenskaperna hos endast celler vid organens yta kan mätas, och vävnader med varierande topografier är svåra att arbeta med. Rothår kan till exempel göra det svårt att komma åt epidermala celler med AFM-spetsen 8,18. Slutligen, medan den presenterade metoden mäter elasticitet, har nanoindentation också använts för att rapportera viskositet och turgortryck i växter och djur 8,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter. MATLAB-skriptet som används för att passa data är tillgängligt på personlig begäran genom att skriva till J. C. B.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av CSIC I + D 2018, bidrag nr 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) och PEDECIBA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
| AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
| Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
| Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
| Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
| Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
| Tweezers | Sigma | T4537 |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
- Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
- Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
- Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L.
- Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236 (2021).
- Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
- Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
- Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
- Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711 (2016).
- Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
- Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
- Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
- Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916 (2012).
