Summary
在这里，我们描述了使用反射共聚焦显微镜（RCM）和RCM和光学相干断层扫描（OCT）组合的新型无创成像设备获取高质量图像的协议。我们还让临床医生熟悉他们的临床应用，以便他们可以将这些技术整合到常规的临床工作流程中，以改善患者护理。
Abstract
皮肤癌是全球最常见的癌症之一。诊断依赖于肉眼检查和皮肤镜检查，然后进行活检以确认组织病理学。虽然皮肤镜检查的敏感性很高，但较低的特异性导致 70%-80% 的活检在组织病理学上被诊断为良性病变（皮肤镜检查呈假阳性）。
反射共聚焦显微镜（RCM）和光学相干断层扫描（OCT）成像可以无创地指导皮肤癌的诊断。RCM 可视化 面层 中的细胞形态。与皮肤镜检查相比，它使黑色素瘤和色素性角质形成细胞性皮肤癌的诊断特异性提高了一倍，使良性病变的活检数量减少了一半。RCM在美国获得了计费代码，现在正在整合到诊所中。
然而，成像深度浅 （~200 μm）、非色素性皮肤病变对比度差以及面 层 成像等局限性导致检测非色素基底细胞癌 （BCC） 的特异性相对较低，即与基底细胞层相邻的浅表基底细胞癌和更深的浸润性基底细胞癌。相比之下，OCT缺乏细胞分辨率，但在垂直平面上对组织进行成像，深度为~1毫米，这允许检测基底细胞癌的浅表和深层亚型。因此，这两种技术本质上是互补的。
“多模态”组合RCM-OCT设备同时以 面部 和垂直模式对皮肤病变进行成像。它有助于基底细胞癌的诊断和管理（浅表基底细胞癌的非手术治疗与深层病变的手术治疗）。与单独使用 RCM 相比，检测小的、无色素的基底细胞癌的特异性显著提高。RCM和RCM-OCT设备正在为皮肤癌的诊断和管理带来重大的范式转变;然而，它们的使用目前仅限于学术三级护理中心和一些私人诊所。本文使临床医生熟悉这些设备及其应用，解决常规临床工作流程中的转化障碍。
Introduction
传统上，皮肤癌的诊断依赖于对病变的目视检查，然后使用称为皮肤镜的放大镜仔细观察可疑病变。皮肤镜提供地下信息，与用于诊断皮肤癌的目视检查相比，该信息提高了灵敏度和特异性1，2。然而，皮肤镜检查缺乏细胞细节，通常需要活检以确认组织病理学。皮肤镜检查 3 的特异性低且可变（67%-97%），导致假阳性和活检，结果显示病理学上的良性病变。活检不仅是一种导致出血和疼痛的侵入性手术4 ，而且由于疤痕而在美容敏感区域（例如面部）也是非常不希望的。
为了通过克服现有的局限性来改善患者护理，正在探索许多非侵入性体内成像设备5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18.RCM和OCT设备是用于诊断皮肤病变，尤其是皮肤癌的两种主要的光学非侵入性设备。RCM已在美国获得当前程序术语（CPT）计费代码，并越来越多地用于学术三级护理中心和一些私人诊所7，8，19。RCM 以近组织学（细胞）分辨率对病变进行成像。然而，图像位于面部平面（一次一层皮肤的可视化）中，成像深度限制在~200μm，足以仅到达浅表（状）真皮。RCM成像依赖于皮肤中各种结构的反射对比度。黑色素具有最高的对比度，使色素病变明亮且易于诊断。因此，与色素性病变（包括黑色素瘤）的皮肤镜检查相比，RCM 联合皮肤镜检查显著改善了诊断（敏感性为 90%，特异性为 82%）20。然而，由于粉红色病变中缺乏黑色素对比，尤其是对于基底细胞癌，RCM的特异性较低（37.5%-75.5%）21。传统的OCT设备是另一种常用的无创设备，可对皮肤内深度达1毫米的病变进行成像，并在垂直平面上可视化（类似于组织病理学）9。然而，OCT缺乏细胞分辨率。OCT 主要用于诊断角质形成细胞病变，尤其是基底细胞癌，但特异性仍然较低9。
因此，为了克服这些器件的现有局限性，已经构建了多模态RCM-OCT器件22。该设备将RCM和OCT集成到单个手持式成像探头中，可以同时采集病变的共配准面部RCM图像和垂直OCT图像。OCT提供病变的结构细节，并且可以在皮肤内更深（深度可达~1毫米）成像。与手持式RCM设备（~0.75 mm x 0.75 mm）相比，它还具有~2 mm22的更大视场（FOV）。RCM图像用于提供OCT上识别的病变的细胞细节。该原型尚未商业化，正在诊所23，24，25中用作研究设备。
尽管它们在改善皮肤癌的诊断和管理方面取得了成功（如文献所支持的那样），但这些设备尚未在临床中广泛使用。这主要是由于缺乏能够读取这些图像的专家，但也是由于缺乏训练有素的技术人员，他们可以在床边有效地（在临床时间范围内）获得诊断质量的图像8。在本手稿中，目标是促进这些设备在诊所的意识和最终采用。为了实现这一目标，我们让皮肤科医生、皮肤病理学家和莫氏外科医生熟悉使用 RCM 和 RCM-OCT 设备获取的正常皮肤癌和皮肤癌的图像。我们还将详细介绍每种设备在皮肤癌诊断中的效用。最重要的是，本手稿的重点是为使用这些设备采集图像提供分步指导，这将确保临床使用的高质量图像。
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Protocol
下面描述的所有协议都遵循机构人类研究伦理委员会的指导方针。
1. RCM设备及成像协议
注意：有两种市售的 体内 RCM设备：宽探针RCM（WP-RCM）和手持式RCM（HH-RCM）。WP-RCM集成了数字皮肤镜。这两种设备可单独使用或作为组合单元提供。以下是使用最新一代（第 4 代）WP-RCM 和 HH-RCM 设备的图像采集协议及其临床适应症。
- 病变选择和临床适应证
- 寻找以下类型的病变：皮肤镜下模棱两可的粉红色（基底细胞癌，鳞状细胞癌[SCC]，光化性角化病[AK]，其他良性病变）或色素性病变（痣和黑色素瘤，色素性角质形成细胞病变）;最近在临床或皮肤镜检查中发生变化的痣;炎症病变以确定炎症模式。
- 对恶性雀斑病 （LM） 边缘进行定位以确定病变范围，并绘制和选择具有亚临床扩展的疾病（例如乳外佩吉特病 （EMPD） 和 LM）的活检部位。
- 对局部药物（咪喹莫特）、放疗、光动力治疗和激光消融等非手术治疗进行无创监测。
- 对于设备选择，对于位于相对平坦的皮肤表面（躯干和四肢）上的病变，使用 HH-RCM 设备处理曲面（鼻子、耳垂、眼睑和生殖器）上的病变。
注意：成像设备的选择主要取决于病变的位置。 - 对于成像，将患者放在完全倾斜的椅子或带有枕头或扶手支撑的平坦检查台上，并获得平坦的成像表面。
注意：老一代（第 3 代）WP-RCM 设备每个病变需要 ~30 分钟。使用目前正在诊所使用的新一代（第 4 代）WP-RCM 设备，单个病变成像可能需要 ~15 分钟。尽管采集时间有所改善，但舒适地定位患者将确保最小的运动伪影，并有助于采集高质量的图像。以下步骤可能有助于正确定位患者： - 为准备影像学检查，请用酒精湿巾清洁病变和周围皮肤，以消除任何污垢、化妆水或化妆品。在连接组织窗口之前，请剃除毛茸茸的皮肤表面，以避免气泡阻碍组织微观结构的可视化。
注意：要去除大量化妆品或防晒霜，请在用酒精清洁之前用温和的肥皂和水清洁场地。 - 使用 WP-RCM 设备（图1, 图2, 补充图S1, 补充图S2和 补充图S3)
注意：WP-RCM 设备能够捕获堆栈、马赛克、实时单帧视频和单帧图像。- 要将一次性塑料窗帽连接到病变处（图1），请将探头垂直于病变放置以获得最佳图像。有关附件的示例，请参阅图 1A-F。在塑料窗口的中心添加一滴矿物油，小心地将其铺在窗口宽度上（图1A）。从塑料窗口的粘合剂侧取下纸背。轻轻拉伸皮肤以避免起皱并安装窗户。
注意：使用安全且粘度高的食品级矿物油。确保病变居中并完全覆盖。对于大于 8 mm x 8 mm 的病变，可根据皮肤镜检查对关注区域进行成像，或进行单独的影像学检查以覆盖整个病变。 - 获取皮肤镜图像（图1C，D）
注意：获取皮肤镜图像以作为在病变内导航的指南。应使用以下步骤来确保皮肤镜检查图像和共聚焦图像之间的完美配准。- 将WP-RCM探头悬停在塑料窗盖上，并接近探头的最佳插入角度（图1C）。找到位于探头侧面的白色小箭头（图1C），并将其与皮肤镜相机侧面的箭头对齐（图1C）。
- 将皮肤镜相机插入塑料窗盖（图1D）。按下相机上的扳机键以获取图像。取下皮肤镜。在开始成像之前，请确保皮肤镜图像覆盖整个病变表面。
- 要将RCM探头连接到塑料一次性盖（图1E，F），请将豌豆大小的超声凝胶放入一次性塑料窗盖内（图1E）。将探头插入盖子内，直到听到尖锐的咔嗒声（图1F）。
注意：为获得最佳图像，请将探头垂直（以 90° 角）插入塑料窗口。可以提高检查椅的高度，以实现更平坦的表面，减少运动伪影，排出气泡（图3 和 图4），并确保牢固地附着在皮肤上。 - 采集RCM图像（图2、补充图S1和补充图S2）
- 使用皮肤镜图像（步骤5.2）指导RCM图像采集（补充图S1）。选择病变的中心并确定皮肤的最顶层（最亮）——角质层的无核层（补充图S1）。
- 在此级别将 成像深度 设置为 零 （补充图S1）。
注意：此深度可作为确定病变内后续层的实际z深度的参考点。 - 通过按堆栈图标获取病变中心的堆栈（图2和补充图S1）。从下拉菜单中选择一个解剖部位：面部或身体。设置 4.5 μm 步长和 250 μm 深度。
注意：从角质层开始堆叠，到真皮中最深的可见层结束。 补充图 S1 显示了如何获取堆栈的示例，而 图 2 给出了堆栈的示例。 - 获取马赛克：在真皮-表皮交界处（DEJ）取第一个马赛克（补充图S2）。识别采集的堆栈中的DEJ层，然后使用鼠标选择一个8 mm x 8 mm的正方形来覆盖整个病变。按马赛克图标完成操作（补充图S2）。在不同深度获取至少 5 个马赛克：角质层、棘层、基底上层、DEJ 和浅表真状。
- 打开 DEJ 马赛克以指导后续马赛克的获取。单击 DEJ 马赛克上的任何结构，以在实时取景成像中调出该区域。向下滚动以获取真皮处的马赛克，然后向上滚动（从 DEJ）获取表皮中的马赛克。
- 让床边的专家RCM阅读器评估采集的马赛克，以确定感兴趣的区域并取堆。在床边没有专家的情况下，捕获5个堆栈：每个象限一个，一个在病变中心，皮肤镜检查上具有均匀的模式（步骤1.5.2）。对于异质性病变，应获取额外的堆栈以覆盖所有皮肤镜特征。
注意：“堆栈”（图2）是从表皮的最顶层到表层真皮（~200μm）深度采集的高分辨率，单帧，小视场（FOV）图像（0.5mm x 0.5 mm）的连续集合。“马赛克”（补充图S2）是通过在“X-Y”（水平 面 平面）中将单个500μm x 500μm图像拼接在一起而获得的图像的大FOV。
- 完成映像会话
- 单击 完成成像。
- 将显微镜从塑料窗口上拆下。轻轻拉紧患者的皮肤并处理掉塑料窗。用酒精棉签擦去皮肤上的油脂。
- 拆下显微镜镜头周围的保护锥。用酒精棉签清洁物镜尖端以去除超声凝胶。用纸巾擦干物镜。将塑料锥体重新连接到显微镜探头上。
注意：可以读取图像，并且可以由训练有素的医生在床边生成和签名报告。在没有专家阅读器的情况下，可以通过云传输图像或通过实时远程共聚焦会话26来咨询远程专家。
- 生成 共聚焦诊断评估 报告（补充图S3）
- 单击“ 新建评估”。从下拉菜单中的预选选项中输入诊断。
- 如果需要另一个映像会话，请选择 不足且需要重新捕获的图像。如果需要描述性诊断，请选择“ 其他” 并在表单末尾的自由文本框中进行描述。输入计费7 的 CPT 代码（补充图 S3A）。从报告清单中选择成像过程中看到的适用特征（补充图S3B）。从清单中选择适用的管理。
注意：没有计费代码适用于 HH-RCM 映像。 - 单击 完成并签名。将报告生成为 PDF 并打印。获取由医生签名的报告，并将其添加到患者的图表中以进行计费。
- 要将一次性塑料窗帽连接到病变处（图1），请将探头垂直于病变放置以获得最佳图像。有关附件的示例，请参阅图 1A-F。在塑料窗口的中心添加一滴矿物油，小心地将其铺在窗口宽度上（图1A）。从塑料窗口的粘合剂侧取下纸背。轻轻拉伸皮肤以避免起皱并安装窗户。
- 使用 HH-RCM 设备采集图像（图 5）
注意：HH-RCM 设备能够捕获堆栈、实时单帧视频和单帧图像。- 用纸环包围医生确定的病变。使用第 3 节中详述的步骤。用于定位患者和清洁病变部位。
注意：根据病灶大小选择纸环的尺寸（5-15毫米），以定义病灶的边界并确保在病灶内进行成像。如果没有纸环，请使用纸带确定病变。 - 取下覆盖显微镜镜头的塑料盖。将豌豆大小的超声凝胶涂在HH-RCM的物镜上，并用塑料盖盖住（补充图S3A）。在塑料盖的侧面添加大量矿物油，该塑料盖将接触皮肤。
注意：如果需要，请增加非常干燥的皮肤的油量。 - 用力按压将探针按压到皮肤上的病变部位。使用 HH-RCM 设备上的 z 深度控件在病变内的不同深度上下移动（补充图 S3B）。在感兴趣区域中获取多个单帧图像和堆栈。按照步骤 1.5.4.3 中所述获取堆栈。
- 对于无法连接WP-RCM设备的大病变，通过将HH-RCM探头在整个病变表面上移动，在各个层拍摄连续视频。单击 视频捕获符号 以执行此操作。如果需要，记录血管内血细胞的运动。
注意：这些视频可以在以后使用软件进行拼接，以提供类似于马赛克的大型FOV图像。 - 成像会话完成后按 完成成像 。用酒精棉签清洁病变以去除油。用酒精湿巾清洁超声凝胶并重新安装塑料盖，从探头的物镜上取下超声凝胶。
注意：与可由技术人员操作的WP-RCM设备不同，HH-RCM应由RCM阅读器操作，该阅读器可以实时解释图像以在病变内导航并得出正确的诊断。
- 用纸环包围医生确定的病变。使用第 3 节中详述的步骤。用于定位患者和清洁病变部位。
2. RCM-OCT组合器件和成像协议
注：RCM-OCT 设备只有一个原型。该设备具有手持式探头，可用于所有身体表面，类似于HH-RCM设备。它获取RCM堆栈（类似于RCM设备）和OCT栅格（连续横截面图像的视频22）。RCM 和 OCT 图像均为灰度。RCM 图像的 FOV 为 ~200 μm x 200 μm，而 OCT 图像的 FOV 为 2 mm（宽度）x 1 mm（深度）。以下是使用RCM-OCT设备的图像采集方案及其临床适应症。图 6 显示了 RCM-OCT 器件的图像，而 图 7 显示了 RCM-OCT 器件的软件系统。
- 病变选择
- 寻找皮肤镜下模棱两可的粉红色或色素性病变，以排除基底细胞癌。
- 评估基底细胞癌的深度以进行管理，并评估处理后的残留基底细胞癌。
- 定位患者进行影像学检查：使用 RCM-OCT 设备对单个病变进行成像可能需要长达 20 分钟的时间。该装置也是类似于HH-RCM装置的手持式探头，因此可以在病变处自由移动。有关患者定位的详细信息，请参阅第 1.4 节。以上。
- 准备成像部位：使用此探头时，请确保病变边界没有过多的毛发和局部杂质，并且清晰界定。请参阅步骤 1.4.1。以上了解更多详情。
- 使用 RCM-OCT 器件采集图像（图 6 和 图 7）
- 准备探头，类似于用于 HH-RCM 的探头（步骤 1.6.1-1.6.2）。
- 在线 成像 模式和 光栅 模式下获取图像。
- 单击 成像设置 （图7A）。选择 线成像 模式以获取RCM图像（蜂窝分辨率）（图7B）。将步 长 设置为 5μm ， 将步数 设置为 40 （图7A）。
- 点击 抓取。按照步骤 1.5.4.3 获取堆栈。完成后，单击 冻结 按钮。
- 单击 成像设置。选择 光栅模式 以获取病变结构的相关OCT视频（图7B）。切换到 技术人员 选项卡（图 7C）。完成后，单击 抓取 按钮（图 7A），然后立即按 保存 按钮。
- 根据医生的兴趣获取多个堆栈和视频。
- 按照步骤1.6.5所述清洁病灶和机器。
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Representative Results
反射式共聚焦显微镜 （RCM）
RCM上的图像解释：
RCM图像的解释方式模仿组织病理学载玻片的评估。首先评估马赛克以获得整体建筑细节并确定关注区域，类似于在扫描放大率（2x）上评估组织学部分。然后放大马赛克以评估细胞细节，类似于在高放大倍率（20x）下评估幻灯片。 图 8 显示了图像分析的这种模式。
图像质量：
在皮肤相关深度获得的没有任何明显伪影的高质量图像对于正确诊断至关重要。 图4A显示了一张这样的图像。无法解释图像的主要原因与伪影或获取图像的经验不足有关。 图3 和 图4B 显示了带有气泡、表面碎屑和运动伪影等伪影的图像，这些伪影阻碍了诊断评估。除了掌握图像采集的技术方面外，RCM操作员还应熟悉各种皮肤层的形态，以便在相关深度进行图像采集。
RCM上正常皮肤层的外观：
使用RCM设备从表皮的最顶层到皮肤的浅表状真皮的不同深度采集面部（水平面）“近组织学”质量的图像。RCM有自己的术语，能够识别皮肤中的各种层5，27。图2显示了从堆栈中以不同深度采集的五张单帧图像。
RCM上各种细胞的外观：
RCM上的图像以灰度显示，由于皮肤不同细胞的大小和折射率可变，从非常明亮的结构到深色结构。黑色素、角蛋白和胶原蛋白是皮肤中反射率最高的来源28，29。因此，含有黑色素的细胞，如黑色素细胞（平庸和恶性）、黑色素化角质形成细胞和噬黑细胞，显得明亮。同样，富含角蛋白的细胞，如角质层和角蛋白囊肿，看起来很明亮。颗粒层角质形成细胞中存在的角膜透明颗粒也呈现明亮。高反射率的另一个可能来源是朗格汉斯细胞30 和炎症细胞28，29中的Birkbeck颗粒。相比之下，核内内容物缺乏反射率，在共聚焦31上显得很暗。粘蛋白分泌也是如此。血管位于真皮中。它们表现为水平或垂直低反射结构。白细胞在这些低反射血管内表现为明亮、高反射、圆形的小细胞32。白细胞运输在活体成像期间很突出。 图 9 显示了 RCM 上正常皮肤层的外观。 视频 1 显示了 RCM 上白细胞贩运的示例。
RCM的肿瘤特异性特征：
肿瘤特异性特征已明确，有助于区分良性和恶性病变。例如，具有外周栅栏和“裂隙样”间隙的肿瘤结节是BCC33的特定特征。同样，表皮中的页状有核细胞、DEJ 处的非典型细胞和表皮模式紊乱提示黑色素瘤的诊断34。非典型和错乱的蜂窝模式是在RCM上诊断SCC33 的关键特征。 图10 显示了RCM图像中BCC、黑色素瘤和SCC的示例。
组合式 RCM-OCT 设备
RCM-OCT上的图像解释：
对于 RCM-OCT 影像的解释，需要评估堆栈和栅格。堆栈提供细胞水平和病变不同深度的信息，而光栅提供病变的垂直视图并提供有关病变整体结构的信息。这种垂直视图对于检测基底细胞癌至关重要，尤其是浅表的密件抄送，它们有时在RCM上显示为暗影，可能会被遗漏25。在OCT图像的垂直视图中，BCC肿瘤结节与上覆表皮的连续性以及通过裂隙的黑暗区域与真皮分离是清晰可辨的。 图 11 显示了皮肤镜检查、RCM、OCT 和 BCC 的组织学相关性的示例。
RCM-OCT 上正常皮肤层的外观：
皮肤层看起来类似于使用 HH-RCM 设备获取的 RCM 图像。“共聚焦上各种皮肤层的外观”和“共聚焦上各种细胞的外观”部分和 图9提供了更多详细信息。
与 RCM 一样，OCT 光栅图像是灰度的。然而，OCT 栅格显示的垂直视图类似于传统的组织学幻灯片，但缺乏细胞分辨率。OCT 映像的外观与市售的传统 OCT 设备映像相似。角质层表现为一条细而亮（高反射）的线，下面的表皮呈灰色（低反射性）。状真皮看起来比表皮亮，网状真皮的最深处由于信号丢失而显得最暗（非反射）35.DEJ可以识别为灰色表皮和明亮的状真皮之间的过渡区。 图12 显示了从健康志愿者手上的正常皮肤获得的RCM和OCT图像。
虽然细胞分辨率是不可能的，但在OCT上可以看到许多结构。 在真皮中可以很容易地看到血管为反射（无信号），水平或垂直，管状结构。毛囊通常是真皮中的低反射，圆形或管状结构。在实时光栅成像过程中，可以看到它们的漏斗（毛囊的最顶部）从真皮中出现并以一定角度突出表皮。它们经常在表皮表面投射信号阴影36。有时，可以看到毛干从毛囊中冒出来，使其易于识别。 图 11 提供了这些结构的视图。
BCC 在 RCM-OCT 上的出现：
RCM中BCC的出现将在RCM的“肿瘤特异性特征”一节中讨论。在OCT中，BCC肿瘤结节可以很容易地检测为灰色，圆形，低反射性结节，周围是反射性的，黑暗的“裂缝”区域。在浅表基底细胞癌中，可以看到该结节附着在表皮的灰色带上。BCC肿瘤结节通常被高反射，白色，增厚的胶原蛋白束包围23。其他亚型（如浸润性或硬斑病状基底细胞癌）很难用 OCT 进行诊断。 图 11 提供了 OCT 栅格捕获的 BCC 视图。
图 1：WP-RCM 附件：第 4 代 WP-RCM 设备。 （A） 将一滴矿物油放在塑料窗口的中心。（B）将塑料窗口居中于病变处。（C）将显微镜头上的箭头（绿色虚线圆圈）与皮肤镜上的箭头（黄色虚线圆圈）相匹配。（D）将皮肤镜插入塑料窗口，然后单击以正确方向拍摄皮肤镜图像。（E）取下皮肤镜，在塑料窗口内添加超声凝胶。（F）将显微镜头完全连接到塑料窗口上，与病变成90°角。缩写：WP-RCM = 宽探头反射共聚焦显微镜。请点击此处查看此图的大图。
图 2：堆栈示例。 显示从正常皮肤以连续 z 深度获取的单帧图像集合的堆栈。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：低质量图像。 （A）表皮水平的低质量图像显示一些气泡（黄色箭头），外部材料（黄色圆圈），很可能是纸纤维和塑料盖的边缘（红色框），表明显微镜与皮肤的附着不正确。（乙，丙）面板 A 的放大区域。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：高质量与低质量共聚焦图像的比较。 （A）表皮水平的高质量马赛克（来自图6），没有任何伪影。（B）表皮水平的低质量马赛克显示几个大气泡（蓝色箭头），这可能会影响评估。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用第 4 代 HH-RCM 设备的 HH-RCM 附件。 （A）取下塑料盖，在镜片顶部添加超声凝胶。（B）将塑料盖（绿色箭头）重新连接到设备上，并将其放在病变上以进行成像。缩写：HH-RCM = 手持式反射式共聚焦显微镜。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：RCM-OCT 设备。 （A） 组合式 RCM-OCT 设备的手持式探头（黄色箭头）。（B） 具有实时成像窗口的 RCM-OCT 设备，同时显示 OCT 图像（黑色箭头）和 RCM 图像（绿色箭头）。缩写：RCM = 反射式共聚焦显微镜;OCT = 光学相干断层扫描。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：RCM-OCT 软件平台。 来自实时成像窗口的快照同时显示 （A） 具有蜂窝分辨率的 OCT 图像（蓝色菱形）和 RCM 图像（黄色星号）。步长、步数和 z 深度均由滑动刻度系统（黑框;黑色箭头）控制。（B） 在“线成像”和“光栅”模式之间切换（黄色箭头）;（C）用于保存光栅图像的按钮（黑色圆圈）。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：表皮水平的图像分析模式。 （A）首先在马赛克水平（8 mm x 8 mm）分析图像，这相当于组织学中大约4倍的放大倍率。（B）然后可以通过在图像采集期间放大实时成像窗口在细胞水平上评估感兴趣的区域。此面板显示了面板 A 中橙色框区域的子马赛克放大视图，对应于组织学上大约 20 倍的放大视图。比例尺 = （A） 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：RCM 上正常皮肤层的外观。 （A）角质层：由无核角质形成细胞组成的皮肤最亮的第一层。（B）棘层：由紧密堆积的有核细胞（细胞核为深色）组成，具有明亮的细胞质，形成典型的“蜂窝状图案”。（C）基底层：由基底角质形成细胞的黑色素帽的存在形成的特征性“鹅卵石图案”（黄色圆圈）识别。（D）DEJ：基底层和真皮之间的界面，其特征是明亮的“环状图案”（黄色箭头）。（E）由明亮的胶原纤维（绿色箭头）和血管组成的状真皮。比例尺 = 50 μm。缩写：RCM = 反射式共聚焦显微镜;DEJ = 真皮表皮交界处。 请点击此处查看此图的大图。
图10：来自最常见皮肤癌的共聚焦图像。 （A）基底细胞癌显示肿瘤结节（黄色箭头）与裂缝（蓝色箭头）和栅栏。（B）鳞状细胞癌，呈非典型蜂窝状（黄色星号）和纽扣孔血管（蓝色菱形）。（C）黑色素瘤在表皮中显示明亮，大的圆形页状细胞簇（绿色箭头）。FOV = （A-C） 750 μm x 750 μm。比例尺 = 50 μm。缩写：FOV = 视野。请点击此处查看此图的大图。
图 11：使用 RCM-OCT 设备获得的 BCC 的皮肤镜检查、RCM、OCT 和组织病理学相关性。（A）放疗后胸部出现粉红色丘疹（黄色圆圈）。（B）在RCM上，在DEJ可以看到带有栅栏（红色箭头）和裂隙（黄色箭头）的基底样肿瘤索（蓝色星星）以及增厚的胶原蛋白（绿色星星），但没有明确的肿瘤结节。（C）用RCM-OCT设备捕获的相同病变的OCT图像。可见一个明显的灰色肿瘤结节（蓝色星星）与表皮相连，并伴有裂隙（黄色箭头）。可见增厚的胶原蛋白束（绿星）。（D）H&E染色活检证实浅表基底细胞癌诊断H&E染色显示栅栏（红色箭头），裂缝（黄色箭头）和增厚的胶原束（绿色星形）（10倍放大）。比例尺 = 500 μm。缩写：RCM = 反射式共聚焦显微镜;OCT = 光学相干断层扫描;基底细胞癌=基底细胞癌;DEJ = 真皮表皮交界处;H&E = 苏木精和伊红。请点击此处查看此图的大图。
图 12：来自正常皮肤的 RCM 和 OCT 图像。 这些图像是从健康志愿者手上的正常皮肤上获得的。（A） 在 DEJ 处显示单帧 面部 RCM 图像。（B） 在垂直视图中显示具有所有外观图层的相应 OCT 图像。视场 = （A） 750 微米 x 750 微米;（B） 1.0 毫米 x 2.0 毫米。比例尺= 50 μm。缩写：RCM = 反射式共聚焦显微镜;OCT = 光学相干断层扫描;DEJ = 真皮表皮交界处。 请点击此处查看此图的大图。
视频 1：使用 HH-RCM 设备获取的白细胞运输的 RCM 视频。 这段用RCM设备拍摄的视频显示了白细胞运输的扩张血管。周围的真皮显示明亮的炎症细胞。缩写：HH-RCM = 手持式反射式共聚焦显微镜。 请点击此处下载此视频。
补充图 S1：使用第 4 代 WP-RCM 设备获取“堆栈”。 选择 病变的中心 （绿色菱形），然后单击 堆栈 选项（橙色框）。确保堆叠从角质层（蓝色十字）开始，这是皮肤的第一层也是最亮的一层。在堆栈的第一层开始的位置设置 零 （橙色星形）深度。选择合适的 病变部位 （白十字）、 两层之间的间距和 成像深度 （黄色三角形）。实时取景上方的蓝色框包含与该系统的其他功能相对应的图标。图标（蓝色箭头）从左到右：捕获马赛克、捕获立方体、捕获堆栈、捕获单个帧图像以及捕获视频录制。缩写：WP-RCM = 宽探头反射共聚焦显微镜。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：使用第4代WP-RCM设备获取“马赛克”。 （A）使用实时取景（蓝叉），转到所需的病变深度。选择病变的整个区域（如果小于 8 mm）或要捕获的整个病变部分以进行成像（绿色菱形）。选择马赛克选项（橙色框）开始捕获。（B）从图 A中的病变中在DEJ处捕获的马赛克示例。缩写：WP-RCM = 宽探头反射共聚焦显微镜;DEJ = 真皮-上皮连接处。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：共聚焦诊断评估报告示例。 （A） 通过从下拉菜单 （B）、用于计费的 CPT 代码（黄色箭头）以及共聚焦成像会话期间看到的相关特征（蓝色星号）来填写诊断（黑色箭头）。缩写：CPT = 当前程序术语。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在本文中，我们描述了使用 体内 RCM和RCM-OCT设备进行图像采集的协议。目前，有两种商用RCM设备：宽探头或臂装RCM（WP-RCM）设备和手持式RCM（HH-RCM）设备。了解何时在临床环境中使用这些设备至关重要。癌症类型和位置是决定设备选择的主要因素。
WP-RCM设备非常适合平坦和轻微起伏的身体表面的病变，例如躯干和四肢，因为它需要与皮肤接触。由于探头很宽，因此不能连接到身体的狭窄区域或角落。然而，HH-RCM是一种更灵活的设备，并且具有更窄的探头。因此，该设备经常用于对身体弯曲和相对起伏的区域（包括鼻子、眼睑、耳垂和生殖器）上的病变进行成像，其中 WP-RCM 无法连接。
这两种设备都可以采集单帧、蜂窝分辨率的图像、堆栈和视频，并可用于对所有皮肤癌进行成像。然而，WP-RCM设备可以通过采集马赛克来可视化测量高达~8 mm x 8 mm的整个病变。马赛克提供了病变结构细节的概述（例如对称性和边界）。WP-RCM设备还配备了数字皮肤镜相机，用于获取病变的皮肤镜图像，在整个成像过程中指导RCM图像采集。这两种独特的功能使WP-RCM设备更适合评估黑色素细胞病变，以区分痣和黑色素瘤。相比之下，手持设备更适合角质形成细胞病变，因为这些病变通常不需要结构评估，但更依赖于小视场高分辨率图像（0.75 mm x 0.75 mm）。然而，HH-RCM 设备对于大病变（测量 >8 mm）成像非常有用，用于黑色素瘤（恶性雀斑病）和基底细胞癌的肿瘤边缘映射以及指导活检部位选择。
RCM 主要用作皮肤镜检查的补充工具，用于对看似恶性且需要活检的皮肤病变进行分诊，同时保留对良性 7，19 个病变进行活检。其他适应证包括对可疑病变进行无创监测，评估对局部或手术治疗的反应19，37，38，描绘恶性雀斑病（LM）大面部病变的手术边缘39，40，41，指导LM和EMPD大病变的靶向活检42，以及诊断炎症病变43，44.使用RCM的一个主要优点是能够在没有任何活检的情况下进行床边诊断45，便于立即管理。此外，与仅分析一小部分病变体积的组织病理学评估不同，RCM能够实时可视化更大体积的病变45，并提供有关动态现象的信息，例如白细胞运输32，46。
RCM 有一些限制。与皮肤镜检查不同，RCM 成像每个病变需要 ~15 分钟，这可能会破坏临床工作流程，图像评估需要病理学专业知识。由于其成像深度有限（高达 ~250 μm），它不适合评估位于真皮或皮下深处的病变。
“多模态”组合RCM-OCT设备旨在克服RCM22的局限性。它提供了RCM细胞分辨率成像和OCT的更深和垂直图像（类似于组织病理学）的好处。 初步研究表明，使用RCM-OCT诊断和管理BCC23，24，25，47（55名患者）有希望的结果。RCM-OCT 在诊断临床可疑、未活检病变中的基底细胞计数方面表现出很高的准确性（100% 灵敏度，75% 特异性），并准确确定病变深度以进行适当管理。它还在检测先前活检病变中的残留基底细胞癌方面显示出 100% 的灵敏度25。最近，Monnier等人在真实世界的临床环境中使用该设备来评估皮肤镜下模棱两可的病变（小的，无色素）的BCC（18名患者）。他们比较了RCM-OCT联合装置与单独RCM装置对同一病变的结果。研究表明，与单独使用RCM设备相比，使用组合设备的特异性从62.5%显着提高到100%，灵敏度从90%提高到100%，从而证明了这两种光学成像设备的优势和互补性。Navarrete-Dechent等人的一项研究也证明了RCM-OCT设备在检测“复杂BCC”患者中残留的BCC方面的效用，而不是单独的RCM设备，这有助于他们的管理和改善患者护理24（10名患者）。在皮肤科诊所之外，RCM-OCT正在研究作为基底细胞癌术前评估的工具，它显示出82.6%的高敏感性和93.8%的高特异性，OCT的深度与组织病理学的最终深度之间存在高度相关性47（35名患者）。因此，该装置主要用于基底细胞癌诊断和管理;其对黑色素瘤和鳞状细胞癌的效用还有待探索。
除了用于BCC评估外，Bang等人还探索了该装置用于检测乳腺癌患者48 （7名患者）的皮肤转移（CM）。他们首次在RCM-OCT上描述了CM的特征，这将有助于他们未来的诊断和管理。结合高分辨率图像和深度评估病变的能力，他们可以在所有六个成像的病变中检测CM，并且可以与良性血管扩张病变区分开来。有必要对更多病变进行大规模研究，以证明该设备对CM的诊断潜力。
无论使用何种设备，都必须仔细执行以下步骤，以避免伪影并确保高质量图像。为避免运动伪影，患者应舒适地定位。可以提供额外的枕头或脚或扶手来支持成像部位。在成像过程中，通过将手放在探头上，可以最大限度地减少由呼吸引起的运动伪影。为减少任何外部材料引起的伪影，请在成像前用酒精棉签或肥皂和水清洁病变部位。如有必要，修剪病变部位的头发以防止气泡形成。应采取一切预防措施以避免交叉污染。一次性塑料窗口应在每次使用后丢弃，每次使用后应用消毒擦拭彻底清洁成像探头。
无创成像的进步旨在提高诊断准确性并在全球范围内扩大其使用范围。已经探索了对现有HH-RCM设备的补充，例如结合宽视场相机，以实现病变表面形态和病变深处细胞细节的双重视图49。HH-RCM的其他新增功能包括视频马赛克 - 一种将视频转换为马赛克图像的技术，从而扩展了FOV50。为了扩大这些技术的使用，正在开发更便宜，更小，更便携的设备51，52，53，包括更小，更灵活的手持式探头，用于口内成像54。此外，研究人员正在探索靶向荧光探针，以提高肿瘤检测灵敏度和特异性31。有各种基于人工智能的算法通过自动识别捕获DEJ55的最佳深度或去除伪影56来帮助捕获成像。此外，正在开发某些算法来帮助临床医生自动检测皮肤癌57，58。最后，使用实时、远程、体内 RCM成像 26，专家指导的远程技术人员可以捕获高质量图像并指导临床医生进行实时诊断。
市售的竞争设备是线场共聚焦OCT（LC-OCT）15，16和全场OCT（FF-OCT）17，18。这些设备可以在垂直平面（如OCT）和面平面（如RCM）中生成图像。使用这些设备获取的OCT图像比RCM-OCT设备22的~7μmOCT图像具有~1-3μm的横向分辨率。然而，与RCM-OCT器件相比，这种分辨率的提高是以~300-500μm的成像深度降低和~1-2mm至500μm x 500μm的更小FOV为代价的。因此，它们不适合提供任何架构细节。它们已被描述用于成像所有皮肤癌。总之，RCM和RCM-OCT设备都是有价值的无创诊断工具，在皮肤病学中具有独特的临床应用。RCM作为独立设备（尤其是WP-RCM设备）在评估色素性皮肤病变（包括黑色素瘤）方面非常出色，而RCM-OCT设备对于基底细胞癌的诊断和管理更有价值。未来，可以探索在现有的RCM-OCT设备中集成镶嵌功能以传递大FOV图像（对于黑色素瘤的评估至关重要），以提供一种全面的多模态临床使用设备，这将成为所有皮肤癌无创成像的“梦想机器”。
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Disclosures
Ucalene Harris没有竞争性的经济利益。Milind Rajadhyaksha博士是Caliber ID（前身为Lucid Inc.）的前雇员并拥有股权，该公司生产和销售VivaScope共聚焦显微镜。VivaScope是原始实验室原型的商业版本，由Rajadhyaksha博士在哈佛医学院麻省总医院开发。
Acknowledgments
特别感谢Kwami Ketosugbo和Emily Cowen作为成像志愿者。这项研究由美国国家癌症研究所/国立卫生研究院（P30-CA008748）向纪念斯隆凯特琳癌症中心提供的资助资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystal Plus 500FG mineral oil | STE Oil Company, Inc. | A food grade, high viscous mineral oil used with our various devices during in vivo imaging. | |
| RCM-OCT | Physical Science Inc. | - | A “multi-modal” combined RCM-OCT device simultaneously images skin lesions in both horizonal and vertical modes. |
| Vivascope 1500 | Caliber I.D. | - | A wide-probe RCM (WP-RCM) device that attaches to the skin to campture in vivo devices. |
| Vivascope 3000 | Caliber I.D. | - | A hand-held RCM (HH-RCM) device that is moved across the skin to capture in vivo images. |
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