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Biology

Méthodes d’élevage du parasitoïde Ganaspis brasiliensis, un agent de lutte biologique prometteur pour la drosophile suzukii envahissante

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63898
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 4, 5, 4, 6, 1,3, 2
1Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, 2Beneficial Insects Introduction Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 3Center for Agriculture, Food and Environment, University of Trento, 4Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California Berkeley, 5Department of Agriculture, Food and Environment, University of Catania, 6Systematic Entomology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Ganaspis brasiliensis - un parasitoïde larvaire de Drosophila suzukii (un ravageur envahissant mondial des cultures fruitières) - a été approuvé ou est envisagé pour l’introduction en Europe et aux États-Unis pour la lutte biologique contre ce ravageur. Cet article fournit des protocoles pour l’élevage à petite et à grande échelle de ce parasitoïde.

Abstract

Originaire d’Asie de l’Est, la drosophile à ailes tachetées, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), s’est largement établie dans les Amériques, en Europe et dans certaines parties de l’Afrique au cours de la dernière décennie, devenant un ravageur dévastateur de divers fruits à peau douce dans ses régions envahies. La lutte biologique, en particulier au moyen de parasitoïdes auto-entretenus et spécialisés, devrait être une option viable pour la gestion durable à l’échelle de la zone de ce ravageur hautement mobile et polyphage. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) est un parasitoïde larvaire qui est largement distribué en Asie de l’Est, et s’est avéré être l’un des parasitoïdes les plus efficaces de D. suzukii.

Après des évaluations rigoureuses avant l’introduction de son efficacité et des risques potentiels non ciblés, l’un des groupes génétiques les plus spécifiques à l’hôte de cette espèce (G1 G. brasiliensis) a récemment été approuvé pour l’introduction et la libération sur le terrain aux États-Unis et en Italie. Un autre groupe génétique (G3 G. brasiliensis), qui a également été couramment trouvé pour attaquer D. suzukii en Asie de l’Est, pourrait être envisagé pour l’introduction dans un proche avenir. Il y a actuellement un énorme intérêt pour l’élevage de G. brasiliensis à des fins de recherche ou de production de masse pour la libération sur le terrain contre D. suzukii. Ce protocole et l’article vidéo associé décrivent des méthodes d’élevage efficaces pour ce parasitoïde, à la fois à petite échelle pour la recherche et à grande échelle pour la production de masse et la libération sur le terrain. Ces méthodes pourraient bénéficier à d’autres recherches à long terme et à l’utilisation de ce parasitoïde originaire d’Asie comme agent de lutte biologique prometteur pour ce ravageur envahissant mondial.

Introduction

Originaire d’Asie de l’Est, la drosophile à ailes tachetées, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), s’est largement établie dans les Amériques, en Europe et dans certaines parties de l’Afrique 1,2. La mouche est extrêmement polyphage, étant capable d’utiliser divers fruits cultivés et sauvages à la peau douce et fine dans ses régions indigènes et envahies 1,2,3. Les stratégies actuelles de lutte contre ce ravageur reposent fortement sur l’utilisation fréquente d’insecticides qui ciblent les mouches adultes dans les champs de culture lorsque les fruits sensibles mûrissent. Des pulvérisations répétées sont souvent utilisées, peut-être en raison du débordement constant des populations de mouches des réservoirs provenant d’habitats non cultivés et du manque d’ennemis naturels efficaces résidant dans les régions envahies 1,4. La lutte biologique, en particulier au moyen de parasitoïdes spécialisés auto-entretenus, peut aider à supprimer les populations de mouches au niveau du paysage et jouer un rôle essentiel pour la gestion durable à l’échelle de la zone de ce ravageur hautement mobile et polyphage 4,5,6.

Au cours de la dernière décennie, les chercheurs ont concentré leurs efforts pour découvrir des parasitoïdes co-évolués de Drosophila suzukii dans les aires de répartition indigènes de la mouche en Asie de l’Est 7,8,9, ainsi que des parasitoïdes efficaces mais nouvellement associés dans les régions envahies par la mouche en Amérique et en Europe 4,5,6. Dans les régions nouvellement envahies de la mouche, les larves parasitoïdes drosophiles courantes, telles que Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) et L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), sont incapables de se développer ou ont de faibles niveaux de parasitisme sur D. suzukii en raison de la forte résistance immunitaire de la mouche10. Seuls quelques parasitoïdes nymphaux cosmopolites et généralistes tels que Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hyménoptères: Pteromalidae) et Trichopria drosophilae (Perkins) (Hyménoptères: Diapriidae) en Amérique du Nord et en Europe, et Trichopria anastrephae Lima en Amérique du Sud peuvent facilement se développer à partir de cette mouche4. En revanche, des explorations en Asie de l’Est ont découvert un certain nombre de parasitoïdes larvaires de D. suzukii 4,5,6. Parmi eux, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering et Leptopilina japonica Novković & Kimura sont les parasitoïdes larvaires dominants 7,8,9,11. En particulier, les deux figitidés (L. japonica et G. brasiliensis) étaient les principaux parasitoïdes que l’on trouve principalement dans les fruits frais infestés par D. suzukii et/ou d’autres drosophiles étroitement apparentés dans la végétation naturelle 7,8,9. Ces trois parasitoïdes larvaires asiatiques ont été importés dans des installations de quarantaine aux États-Unis et en Europe, et évalués pour leur efficacité relative 12,13,14,15,16,17, leur adaptabilité climatique 18, leurs interactions concurrentielles interspécifiques potentielles19 et, surtout, leur spécificité de l’hôte 8,20,21 ,22.

Les évaluations de quarantaine ont montré que Ganaspis brasiliensis était plus spécifique à l’hôte de Drosophila suzukii que d’autres parasitoïdes larvaires asiatiques testés, bien qu’il se compose probablement de différents biotypes ou espèces cryptiques avec une spécificité d’hôte variable 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 ont regroupé des individus Ganaspis de différentes régions géographiques en cinq groupes génétiques (nommés G1-G5) sur la base d’analyses moléculaires du fragment du gène de la cytochrome oxydase I mitochondriale. Les groupes G2 et G4 ne sont signalés que dans quelques endroits tropicaux d’Asie du Sud, et le groupe G5 a été signalé en Asie et dans d’autres régions (p. ex., Argentine, Brésil, Hawaï et Mexique) à partir d’hôtes inconnus (Buffington, observation personnelle). Des collections sur le terrain de fruits sauvages infestés par D. suzukii en Corée du Sud7, en Chine8 et au Japon 9,23,25 ont trouvé G1 seul ou un mélange de spécimens représentant les groupes G1 et G3. Les deux groupes semblent sympatriques et coexistent sur les mêmes plantes hôtes habitées par D. suzukii et d’autres mouches hôtes étroitement apparentées. Néanmoins, certaines différences ont été observées entre les deux groupes, G1 ayant apparemment un degré plus élevé de spécificité de l’hôte ou de l’habitat de l’hôte à D. suzukii que G3, bien qu’ils attaquent tous deux un certain nombre d’espèces étroitement apparentées dans les tests de quarantaine21,22. D’autres analyses moléculaires détaillées peuvent aider à déterminer le statut de l’espèce, en particulier pour les groupes G1 et G3. Cette étude les désigne sous le nom de G1 G. brasiliensis et G3 G. brasiliensis. Certaines des premières études ont également nommé le G1 G. brasiliensis G. cf. brasiliensis 14,21,22. Le G1 G. brasiliensis a récemment été approuvé pour la libération sur le terrain contre D. suzukii aux États-Unis et en Italie (plusieurs autres pays européens envisagent également son introduction), tandis que le G3 G. brasiliensis pourrait être envisagé pour une libération sur le terrain dans un proche avenir. Des enquêtes récentes ont également révélé des populations adventives de L. japonica et de G1 G. brasiliensis en Colombie-Britannique, Canada26, et dans l’État de Washington, États-Unis (Beers et al., données non publiées), et des populations adventives de L. japonica dans la province de Trento, en Italie27.

Compte tenu de l’intérêt considérable suscité par l’élaboration de programmes de lutte biologique pour la prise en charge de Drosophila suzukii et du potentiel considérable de lutte biologique des introductions adventives et délibérées de Ganaspis brasiliensis, il est nécessaire de mettre au point des méthodes d’élevage efficaces pour ce parasitoïde larvaire en vue de futures recherches à long terme et/ou d’une libération sur le terrain. Ce protocole et l’article vidéo associé décrivent deux ensembles de méthodes d’élevage pour ce parasitoïde: (1) l’élevage en laboratoire à petite échelle dans des flacons en utilisant un mélange de fruits hôtes (myrtille) et un régime artificiel pour la culture de D. suzukii. Les méthodes ont été développées à l’aide de matériel G3 collecté à l’origine à Kunming, en Chine8. (2) Élevage en masse pour la libération en plein champ dans de grandes cages utilisant des fruits hôtes (myrtille) pour la culture de D. suzukii. Le groupe génétique utilisé pour l’élevage à grande échelle était le stock G1 originaire de Tokyo, au Japon 9,22. D’autres échelles de méthodes d’élevage, telles que l’utilisation de flacons ou de petits conteneurs pour les deux groupes, sont également brièvement discutées.

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Protocol

1. Méthodes d’élevage en laboratoire à petite échelle de G3 Ganaspis brasiliensis

  1. Préparez le régime alimentaire de l’hôte.
    1. Ajouter 600 mL d’eau distillée dans un récipient en verre de 1 500 mL et chauffer l’eau sur une plaque chauffante.
    2. Ajouter 88,6 g de régime sec disponible dans le commerce (à base d’agar, de levure de bière, de farine de maïs, de méthylparabène et de saccharose) ou préparer un régime alimentaire en utilisant la formule publiée par Dalton et al.28 (voir l’étape 2.1.2).
    3. Ajouter 300 ml d’eau distillée dans le régime sec et bien mélanger le mélange alimentaire.
    4. Ajouter le mélange à l’eau bouillante.
    5. Laissez bouillir le régime liquide sur la plaque chauffante pendant 10 minutes tout en remuant périodiquement le mélange pour l’empêcher de brûler.
    6. Laissez le régime refroidir à température ambiante pendant 30 minutes tout en le remuant de temps en temps pour répartir uniformément la chaleur et empêcher le régime de se solidifier à la surface.
    7. Mesurer 6,7 mL d’EtOH à 95 % dans un récipient et 3,5 mL de solution d’acide propionique 1 M dans un autre récipient.
    8. Une fois le régime refroidi, ajoutez l’EtOH puis la solution d’acide propionique, en remuant abondamment après chaque ajout.
    9. Préparez les bleuets (achetés sur le marché local) en les rinçant à l’eau froide, puis dans une solution d’eau de Javel à l’hypochlorite de sodium (diluée à 5%) et à l’eau froide à nouveau.
    10. Séchez les fruits avec une serviette en papier et écrasez-les manuellement jusqu’à ce que la peau de chaque fruit soit cassée et que le jus et la chair du fruit soient exposés.
    11. Ajouter 25 à 30 g de purée de bleuets dans chaque flacon de 250 ml. Tapotez les côtés de la fiole pour vous assurer que le fond intérieur de la fiole est recouvert d’une couche uniforme de purée de bleuets.
    12. Versez le régime préparé dans chaque flacon afin qu’il ne couvre que le dessus de la purée de bleuets.
    13. Ajouter des bouchons en mousse au cou des flacons et permettre au régime alimentaire de se solidifier à température ambiante (Figure 1).
    14. Une fois que le régime s’est solidifié, utilisez-le immédiatement ou conservez-le à 5 °C jusqu’à 3 semaines.
  2. Hôte arrière Drosophila suzukii.
    1. Retirez le régime conservé du réfrigérateur et laissez-le s’équilibrer à la température ambiante ambiante ou utilisez un régime fraîchement préparé.
    2. Coupez un morceau d’essuie-tout absorbant (par exemple, 5 cm x 20 cm) et tordez-le au centre. Placez la section centrale torsadée de l’essuie-tout dans la fiole (Figure 1).
    3. Mouillez l’essuie-tout et la surface du régime avec de l’eau distillée pour retenir l’humidité.
    4. Transférer les mouches adultes sexuellement matures des flacons de mouches de la colonie actuelle vers une nouvelle fiole de régime en retirant soigneusement le bouchon de l’ancienne fiole et en inversant rapidement la fiole et en alignant l’ouverture de l’ancienne fiole avec la nouvelle fiole.
    5. Tapotez doucement sur le côté de l’ancienne fiole pour inciter les mouches à tomber dans la nouvelle fiole. Assurez-vous qu’il y a environ 25 à 30 paires d’accouplement de D. suzukii dans la nouvelle fiole. Une fois qu’il y a suffisamment de mouches dans la nouvelle fiole, retournez rapidement l’ancienne fiole à la verticale et remplacez les bouchons des deux fioles.
    6. Répétez les transferts de mouches jusqu’à ce qu’il ne reste plus de mouches dans les vieilles fioles. Si nécessaire, combinez ou ramassez les mouches de plus d’une vieille fiole dans une nouvelle fiole pour vous assurer qu’il y a suffisamment de mouches (20 à 30 paires) par flacon.
    7. Maintenir les nouvelles fioles après une semaine d’exposition aux mouches adultes dans des conditions appropriées (21 °C, 16 L : photopériode de 8 D, humidité relative de 60 % à 80 % [HR %]) dans une chambre environnementale pendant 3 semaines pour l’émergence des mouches.
  3. Exposer les larves hôtes à des parasitoïdes.
    1. Prenez une fiole (voir l’étape 1.2.7) contenant des œufs de mouches et des larves après avoir retiré les mouches adultes et l’essuie-tout tordu de la fiole.
    2. Pliez un morceau d’essuie-tout absorbant en deux et mettez-le dans la fiole comme substrat de nymphose pour les larves parasitées.
    3. Aspirer six paires femelles et mâles de G3 G. brasiliensis dans chaque flacon (Figure 1). Strier une fine couche de miel sur le fond du bouchon en mousse.
    4. Laissez les parasitoïdes dans la fiole pendant 5 jours.
    5. Après une exposition de 5 jours, retirez les parasitoïdes et maintenez les flacons dans les conditions décrites ci-dessus dans une chambre environnementale pendant 35 jours jusqu’à l’émergence prévue des guêpes.
  4. Collectez et stockez les parasitoïdes adultes.
    1. Au cours des deuxième et troisième semaines d’incubation, vérifiez chaque semaine la présence d’hôtes précoces dans les flacons et retirez les mouches adultes.
    2. Une fois que les parasitoïdes adultes commencent à émerger, aspirez-les trois fois par semaine et maintenez-les dans des flacons de drosophiles (p. ex. 2,5 cm x 9,5 cm) (figure 1).
    3. Placez un petit morceau d’essuie-tout humidifié, mais non saturé, avec de l’eau distillée au fond du flacon.
    4. Ajouter ~ 60 parasitoïdes à chaque flacon et étiqueter le flacon avec les dates d’émergence. Strier une fine couche de miel sur le fond du bouchon de mousse, deux fois par semaine. Conservez les flacons avec des parasitoïdes adultes dans les conditions décrites ci-dessus dans la chambre environnementale jusqu’à un mois s’ils ne sont pas utilisés plus tôt.
    5. Réhumidifiez le papier dans le flacon une fois tous les 4 à 7 jours ou remplacez l’essuie-tout s’il y a des signes de moisissure.

2. Méthodes d’élevage à grande échelle de G1 Ganaspis brasiliensis

  1. Mettre en œuvre un élevage à grande échelle de l’hôte Drosophila suzukii.
    1. D. suzukii arrière dans de grandes cages tricotées recouvertes de mailles (p. ex., 50 cm x 50 cm x 100 cm) contenant chacune 1 500 à 2 000 mouches adultes sexuellement matures (sex-ratio 50:50) (figure 2).
    2. Préparer le milieu standard de la drosophile (SDM) en faisant bouillir tous les ingrédients (6 g de gélose bactériologique, 75 g de semoule de maïs, 17 g de levure nutritionnelle, 15 g de saccharose, 10 g de farine de soja, 10 mL d’acide propionique) dans 1 L d’eau distillée pendant 10 min tout en remuant périodiquement le mélange pour éviter qu’il ne brûle28.
    3. Laisser refroidir le mélange pendant 5 min et ajouter 5 g d’acide ascorbique.
    4. Versez le SDM fraîchement cuit dans des boîtes de Petri de 9 cm et laissez le milieu se solidifier à température ambiante avant de fermer les assiettes.
    5. Empilez les boîtes de Petri SDM, enveloppez la pile avec du papier d’aluminium et conservez les plats à 4 ° C pendant 2 semaines.
    6. À l’intérieur de chaque cage d’élevage, placez une assiette avec du coton imbibé d’eau et quatre à six boîtes de Petri avec du SDM (Figure 2).
    7. Deux fois par semaine, remplacez les boîtes de Petri SDM infestées par des boîtes fraîches.
    8. Placer individuellement les boîtes de Petri SDM infestées sans couvercle dans des gobelets en plastique (13,3 cm de diamètre ou 800 mL), fermer chaque gobelet avec un couvercle de maille fine (<0,5 mm) et incuber pendant 12 à 15 jours à 23 °C et 75 % HR (Figure 2).
    9. Transférez les adultes D. suzukii nouvellement éclos des gobelets en plastique vers les cages d’élevage.
  2. Préparez les larves hôtes.
    1. Rincez les bleuets à l’eau froide pendant 1 min et faites tremper les fruits dans une bassine remplie d’une solution d’eau de Javel (diluée à 5%) pendant 3 min.
    2. Égouttez la solution d’eau de Javel et remplissez le bassin d’eau froide pour rincer les bleuets. Mélanger doucement à la main pendant au moins 30 s.
    3. Répétez l’étape 2.2.2 avec de l’eau douce au moins trois fois pour éliminer les résidus d’eau de Javel et les autres arthropodes (p. ex. acariens, thrips) qui peuvent être présents sur le fruit.
    4. Placez les fruits sur un plateau avec plusieurs couches d’essuie-tout absorbants et inclinez soigneusement le plateau d’avant en arrière, en roulant les baies pour les sécher.
    5. Préparez plusieurs boîtes de Petri de 9 cm (les moitiés supérieure ou inférieure, face vers le haut) et remplissez chacune avec les bleuets lavés (15-25 fruits par assiette selon la taille du fruit).
    6. En fin d’après-midi, exposez les boîtes de Petri à des mouches adultes sexuellement matures dans les cages d’élevage de l’hôte (voir l’étape 2.1) et laissez-les pendant la nuit.
    7. Le lendemain matin, retirez les boîtes de Pétri des cages d’élevage de l’hôte en les soufflant doucement ou en tapotant dessus pour déloger les mouches sur les fruits et utilisez les fruits infestés pour l’élevage des parasitoïdes (voir étape 2.4).
  3. Mettre en œuvre un élevage parasitoïde à grande échelle.
    1. Utilisez deux types de cages pour élever le parasitoïde: une pour le parasitisme et une autre pour l’émergence de guêpes.
    2. Assurez-vous que la cage de parasitisme est cubique (p. ex., 45 cm de chaque côté) avec un panneau en plastique transparent à l’avant pour observer l’activité des insectes, deux ouvertures de manchon de 18 cm dans le panneau avant pour l’ajout ou l’élimination des insectes et le remplacement des aliments, et un filet en polyester fin (p. ex., maille 96 x 26) sur le dessus et les côtés pour la ventilation.
    3. Rendre la cage d’émergence plus petite (p. ex., 30 cm de chaque côté), avec une seule ouverture de manchon sur deux côtés opposés et un panneau en plastique transparent à l’avant pour la visibilité (Figure 2).
    4. Assurez-vous que les deux types de cages ont une fine ficelle suspendue sous le plafond à partir de laquelle suspendre une à plusieurs mangeoires (Figure 2).
      REMARQUE: Un chargeur se compose d’un grand bouchon en mousse cylindrique (9 cm de diamètre) recouvert de gouttelettes de miel dispersées et peut être placé sur le sol de la cage ou suspendu au plafond de la cage (Figure 2).
    5. À l’intérieur de chaque cage, fournissez de l’eau dans un flacon de drosophile à paroi droite (2,5 cm x 9,5 cm) scellé avec un bouchon d’acétate de cellulose (2,5 cm de diamètre) tous les 5 à 7 jours selon l’HR. Suspendez le flacon à l’envers au plafond de la cage (Figure 2).
  4. Exposez les larves hôtes aux parasitoïdes.
    1. Exposer le fruit infesté par l’hôte dans les boîtes de Pétri à G1 G. brasiliensis immédiatement après l’infestation nocturne de D. suzukii (voir l’étape 2.2.7).
    2. Laissez les 10 à 15 boîtes de Petri de fruits infestés dans la cage de parasitisation contenant 1 500 à 2 000 guêpes pendant 2 à 3 jours.
    3. Utilisez des gobelets en plastique (13,3 cm de diamètre ou 800 mL) avec des couches de papier absorbant sur le fond pour recueillir les fruits contenant les hôtes parasites (Figure 2).
    4. Placer les gobelets ouverts dans la cage d’éclosion et incuber pendant au moins 28 jours à 21 °C et 65 % HR (Figure 2).
    5. Au cours des deuxième et troisième semaines d’incubation, vérifiez chaque semaine l’éclosion précoce de l’hôte dans la cage et retirez les mouches adultes pour faciliter la collecte successive des parasitoïdes.
    6. À la fin de la quatrième semaine d’incubation, ajoutez une mangeoire et une source d’eau à la cage.
  5. Collectez et stockez les parasitoïdes adultes.
    1. Une fois que l’émergence des parasitoïdes commence, collectez une partie (10% à 15%) des adultes et transférez-les dans la cage de parasitisme pour remplacer les anciens individus improductifs.
    2. Recueillir et stocker les parasitoïdes restants dans des gobelets en plastique (13,3 cm de diamètre ou 800 mL) (figure 3A).
    3. Placer un tube (2 mL) rempli d’eau et scellé avec un rouleau de coton dentaire (1 cm x 3,8 cm) au fond de la tasse (Figure 3A).
    4. Fermez la tasse à l’aide d’un couvercle modifié muni d’un bouchon en mousse amovible (3,5 cm de diamètre) comme substrat d’alimentation et d’un trou recouvert de mailles pour la ventilation (figure 3B).
    5. Ajouter jusqu’à 700 adultes à chaque tasse (sex-ratio 50:50), étiqueter la tasse avec la date de levée et la conserver dans une chambre environnementale (17 °C; 65 % HR) jusqu’à ce qu’elle soit utilisée, ou jusqu’à 1 mois (Figure 3B).
  6. Expédiez les parasitoïdes adultes.
    1. Utilisez des tubes coniques (50 ml) pour expédier les parasitoïdes adultes.
    2. Percer un trou de ventilation (8 mm de diamètre) sur le capuchon et le recouvrir d’un filet à mailles fines (Figure 3C).
    3. Ajouter un anneau d’alimentation en acétate de cellulose à l’intérieur du bouchon (Figure 3C).
    4. Préparez une solution de saccharose saturée à l’aide d’eau distillée, appliquez quelques gouttes sur l’anneau d’alimentation et laissez-le absorber le liquide.
    5. Placez un morceau d’essuie-tout absorbant en forme d’éventail dans le tube (Figure 3D).
    6. Ajoutez environ 200 parasitoïdes adultes à chaque tube et placez les tubes dans un conteneur d’expédition isolé avec des sacs de glace.

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Representative Results

La figure 4 montre les résultats représentatifs de l’élevage en laboratoire à petite échelle de G3 Ganaspis brasiliensis en utilisant deux densités parasitoïdes différentes (six ou 10 paires) et deux temps d’exposition différents (5 ou 10 jours) à l’installation de quarantaine de l’USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Il y avait 14 répétitions pour chaque combinaison de densité parasitoïde et de temps d’exposition. Au total, les 64 flacons ont produit 4 018 guêpes (71,7 ± 4,9 descendants par flacon) avec 49,5 % ± 1,9 % de progéniture femelle. À 21 °C, les parasitoïdes adultes sont apparus environ 30 à 35 jours après la ponte. La densité parasitoïde et le temps d’exposition n’ont pas affecté de manière significative le nombre total de descendants produits par réplique (flacon) (ANOVA unidirectionnelle, F3,52 = 0,379, P = 0,769) et n’ont eu qu’un effet marginal sur le pourcentage de progéniture femelle (ANOVA unidirectionnelle, les données ont été transformées logit avant l’analyse au besoin pour stabiliser la variation, F3,52 = 2,796, P = 0,049), bien que l’efficacité de la production par habitant féminine (ANOVA unidirectionnelle, F3,52 = 3,576, P = 0,020) ait diminué à la densité élevée de parasitoïdes. Le temps d’exposition de plus de 5 jours ne semblait pas augmenter la productivité. L’augmentation de la densité parasitoïde ne semblait pas non plus augmenter la productivité. Par conséquent, la combinaison de six paires et de temps d’exposition de 5 jours semble être la plus appropriée pour l’élevage en laboratoire.

La figure 5 montre une tendance de productivité sur 6 mois de l’élevage à grande échelle de G1 Ganaspis brasiliensis dans l’installation de quarantaine de la Fondation Edmund Mach (Trento, Italie) en 2021. L’élevage a commencé avec 150 guêpes femelles accouplées de trois jours dérivées d’un élevage à petite échelle au laboratoire de quarantaine de CABI à Delémont, en Suisse. Plus de guêpes de l’élevage ont été progressivement ajoutées à la cage de parasitisme, jusqu’à atteindre 1 500-2 000 individus (rapport de masculinité 50:50) à la semaine 5. L’occupation de la cage de parasitisme a ensuite été maintenue au même niveau en ajoutant de nouvelles guêpes produites dans l’élevage à grande échelle lui-même. Pendant toute la période, la cage de parasitisme a été fournie avec des fruits fraîchement infestés tous les 2-3 jours. Le fruit (bleuets) a été offert à G1 G. brasiliensis immédiatement après l’exposition nocturne à Drosophila suzukii. La production de parasitoïdes a commencé 5 semaines après l’exposition initiale de l’hôte (figure 5A). De la semaine 8 à la semaine 22, la production de parasitoïdes était proportionnelle à la quantité de fruits exposés, avec une moyenne de 0,44 ± 0,03 g/parasitoïde (moyenne ± SE; Figure 5B). Au total, 53 736 parasitoïdes ont été collectés, avec une descendance féminine moyenne de 45,9 % (intervalle : 32,4 % à 79,0 %).

Figure 1
Figure 1 : Organigramme des procédures d’élevage en laboratoire à petite échelle de Drosophila suzukii et de G3 Ganaspis brasiliensis. Le côté gauche montre les procédures d’élevage de la mouche hôte tandis que le côté droit illustre le cycle d’élevage des parasitoïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Organigramme des procédures d’élevage à grande échelle de Drosophila suzukii et de G1 Ganaspis brasiliensis. Le côté gauche montre les procédures d’élevage de la mouche hôte tandis que le côté droit illustre le cycle d’élevage des parasitoïdes. Abréviation : SDM = milieu standard de la drosophile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Conteneurs et tubes utilisés pour stocker et expédier G1 Ganaspis brasiliensis de l’élevage à grande échelle. (A) Une vue horizontale du récipient de stockage montrant un tube d’eau à l’intérieur du conteneur, (B) une vue verticale du conteneur montrant un couvercle ventilé et un bouchon en mousse, et (C) un couvercle ventilé et un morceau de papier absorbant pour (D) le tube d’expédition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemple représentatif de l’élevage en laboratoire à petite échelle de G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Nombre de descendants produits par fiole, (B) nombre de descendants produits par guêpe femelle et (C) pourcentage de descendants femelles, sous deux densités parasitoïdes et temps d’exposition différents. Les valeurs sont moyennes ± SE, et les barres portant des lettres différentes sont significativement différentes (ANOVA, HSD de Tukey, P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Tendance de la productivité de l’élevage à grande échelle depuis son début jusqu’à la semaine 23. (A) Les barres indiquent le nombre de descendants de G1 Ganaspis brasiliensis prélevés chaque semaine dans les cages d’éclosion pour remplacer les individus âgés dans la cage de parasitisme (vert foncé) et pour être stockés ou expédiés (vert clair). La ligne orange indique la quantité de fruits infestés par l’hôte (kg de bleuets) fournis chaque semaine aux parasitoïdes dans la cage de parasitisme. (B) Rapport hebdomadaire entre le poids des fruits infestés par l’hôte et le nombre de descendants parasitoïdes produits 5 semaines après l’exposition (c.-à-d. grammes de fruits nécessaires à la production d’un seul parasitoïde adulte). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La recherche à long terme et les rejets ultérieurs sur le terrain d’un agent de lutte biologique dépendent de la disponibilité de techniques d’élevage efficaces et économiques. Les méthodes décrites dans cette étude se sont avérées être des protocoles efficaces pour l’élevage à petite et à grande échelle de Ganaspis brasiliensis. Le protocole d’élevage à petite échelle a été développé sur plusieurs années pour optimiser la quantité de main-d’œuvre et réduire l’équipement spécialisé nécessaire pour maintenir simultanément les colonies parasitoïdes et hôtes. Il convient au maintien d’une colonie pour la recherche en laboratoire ou les essais biologiques. Des méthodes similaires ont été utilisées par les auteurs pour élever ce parasitoïde pour les évaluations de quarantaine de ce parasitoïde. Le protocole d’élevage à grande échelle permettra de produire un grand nombre de guêpes pour la libération sur le terrain, comme cela a été récemment réalisé en Italie. Ces technologies peuvent facilement être transférées à d’autres laboratoires, producteurs ou entreprises pour un élevage à grande échelle dans un avenir proche, tout en servant de base à d’autres améliorations des méthodologies.

Ces protocoles peuvent également être utilisés pour élever Leptopilina japonica, car Ganaspis brasiliensis et L. japonica sont similaires en termes de préférence d’habitat hôte 7,8, de préférence au stade hôte ou de biologie de la reproduction15, de performance thermique18 et d’efficacité de la recherche de nourriture dans les essais biologiques en laboratoire13,15, ainsi que de réponses comportementales aux signaux associés à l’hôte12, sauf que L. japonica semble avoir une gamme d’hôtes plus large que celle de G3 G. brasiliensis20. Les deux parasitoïdes ont été élevés en utilisant des méthodes similaires à celles décrites ici. Pour l’élevage à petite échelle, les deux parasitoïdes peuvent également être élevés dans des flacons de drosophiles, généralement en transférant 20 jeunes larves de Drosophila suzukii âgées (âgées de 1 à 2 jours) dans un flacon de drosophile rempli de 2 cm de régime artificiel, ou en plaçant deux fruits infestés, contenant chacun 5 à 10 jeunes larves de D. suzukii, et en les exposant à deux guêpes femelles accouplées pendant 2-3 jours, les deux produisant ~ 10 descendants par flacon 13,15,22.

Comme indiqué ci-dessus, les Ganaspis brasiliensis G1 et G3 utilisés dans ce protocole peuvent différer légèrement dans certains comportements de recherche d’hôte et spécificité d’hôte21,22. Girod et al.21 rapportent que le G1 japonais G. brasiliensis était plus strictement spécifique à Drosophila suzukii, et ne semblait pas bien fonctionner dans l’alimentation artificielle pure en flacons par rapport à sa performance sur le fruit hôte. Matsuura et al.25 ont également signalé que les populations de G1 G. brasiliensis recueillies auprès de cerises infestées de D. suzukii au Japon se spécialisent sur D. suzukii. La méthode d’élevage à petite échelle utilisant un régime alimentaire mélangé à des bleuets a été développée initialement pour l’élevage de G3 G. brasiliensis parce que G1 G. brasiliensis n’était pas disponible à ce moment-là. Plus tard, cette méthode s’est avérée ne pas bien fonctionner pour l’élevage de G1 G. brasiliensis (Wang et al. données non publiées).

Par conséquent, pour l’élevage à petite échelle de G1 G. brasiliensis, il est suggéré de modifier le substrat de l’hôte en (1) exposant les mouches directement aux bleuets (ou à d’autres fruits hôtes) pour recueillir les larves hôtes dans le fruit, et (2) en transférant les fruits exposés dans un milieu de culture standard de drosophiles pour que les larves se développent dans un environnement de faible concurrence en plaçant les fruits infestés contenant les larves hôtes dans le régime alimentaire dans les flacons pour l’exposition aux parasitoïdes. Cela permettra aux larves parasitées de se nourrir de l’alimentation, en particulier à des densités d’hôtes élevées, et aux pupes hôtes parasites d’être collectées dans l’essuie-tout. Alternativement, G1 G. brasiliensis peut être élevé sur des fruits directement dans des récipients en plastique (différentes tailles) en exposant 5 à 10 guêpes femelles à 10 à 20 bleuets infestés pendant 4 à 5 jours, ce qui a produit jusqu’à 80 descendants par récipient, selon la densité de l’hôte (Wang et al., données non publiées). Pour cette méthode, il est recommandé de placer le fruit infesté sur un treillis métallique surélevé (« tissu de quincaillerie ») pour permettre aux parasitoïdes d’accéder au fruit infesté de toutes les directions, surtout si trop de fruits sont placés dans un récipient. Idéalement, une ou deux couches de fruits infestés devraient être placées dans chaque récipient pour cette méthode d’élevage. Ces méthodes alternatives à petite échelle devraient également bien fonctionner pour l’élevage de G3 G. brasiliensis.

Quelles que soient les méthodes d’élevage et les écailles (flacon, flacon, récipient ou cage), il est essentiel de maintenir une température, une humidité et un temps de contrôle appropriés de l’âge, de la densité et du temps d’exposition des guêpes hôtes ou femelles pour l’élevage de G1 Ganaspis brasiliensis et de G3 G. brasiliensis. Les larves de Drosophila suzukii se sont développées en environ 1 semaine dans des conditions de laboratoire normales (p. ex., 22 ± 2 °C) 15. La femelle G. brasiliensis préférait attaquer les larves hôtes plus jeunes (âgées de 1 à 2 jours) que les larves hôtes plus âgées (âgées de 3 à 4 jours), bien que différents âges des larves hôtes puissent être attaqués15. À 22 ± 2 °C, les femelles de G. brasiliensis ont émergé avec une proportion substantiellement élevée (~ 50%) de leur complément de vie d’œufs matures, et la charge d’œufs matures a atteint un pic après 2-3 jours15. Les femelles adultes ont survécu environ 20 jours lorsqu’elles ont reçu un accès illimité aux hôtes et ont commencé la ponte dans les 2 jours suivant l’émergence, atteignant un pic de ponte dans les 5 à 10 jours et réduisant ensuite progressivement la ponte15. Par conséquent, les jeunes guêpes femelles (âgées de <10 jours) devraient être utilisées dans l’élevage, mais les guêpes femelles pourraient être réutilisées pour l’élevage lorsqu’elles sont en pénurie. Le parasitoïde pouvait facilement se développer à 21-25 °C, mais des températures inférieures à 17,2 °C semblaient déclencher une diapause facultative17. Il est donc recommandé d’utiliser une plage de température de 21-25 °C pour un développement optimal de la mouche et du parasitoïde.

De plus, un temps d’exposition de plus de 5 jours n’augmentera probablement pas la productivité du parasitoïde. L’augmentation de la densité parasitoïde basée sur l’élevage à petite échelle de G3 G. brasiliensis ne semble pas augmenter la productivité, peut-être en raison de l’interférence mutuelle entre les guêpes femelles butineuses. Six couples mâle-femelle et un temps d’exposition de 5 jours semblent être une combinaison idéale pour l’élevage à petite échelle en laboratoire, bien que les méthodes d’élevage puissent être améliorées à l’avenir en optimisant davantage le rapport hôte/parasitoïde. Un facteur de mortalité majeur pour le parasitoïde semble être lié à une faible humidité, car de nombreux parasitoïdes ont été observés comme étant incapables d’écloser avec des conditions de substrat sec. L’ajout d’un morceau d’essuie-tout absorbant sous le fruit absorbe non seulement les jus à mesure que le fruit se dégrade, mais fournit également un substrat qui peut être humidifié pour augmenter l’humidité ou fournir un substrat de nymphose pour la mouche.

Pour l’élevage à petite échelle, une fiole peut mieux maintenir l’humidité qu’un flacon car le premier a un cou étroit. Il a également été constaté dans cette étude que les bleuets frais recouverts d’un saupoudrage de levure sèche active aidaient à prévenir la formation de moisissures et amélioraient l’attraction du fruit pour les mouches. D’autres aspects de l’élevage de parasitoïdes qui restent à explorer comprennent (1) la possibilité d’élever ce parasitoïde sur des hôtes alternatifs ou des fruits hôtes et comment des hôtes alternatifs ou des fruits hôtes affecteraient l’efficacité du parasitoïde, (2) des facteurs affectant la condition physique et le rapport de masculinité de la progéniture du parasitoïde, (3) la capacité de ce parasitoïde (g1 et G3) à s’adapter aux conditions de régime artificiel, et (4) les changements génétiques ou comportementaux qui pourraient survenir avec l’adaptation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Lukas Seehausen et Marc Kenis (CABI, Suisse) d’avoir aimablement fourni G1 G. brasiliensis. Le financement en Italie a été fourni par provincia autonoma di Trento, Trento, Italie, et aux États-Unis par l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture, le prix USDA Specialty Crops Research Initiative (#2020-5118-32140), le service d’inspection de la santé animale et végétale de l’USDA (Farm Bill, fonds 14-8130-0463) et les fonds de base USDA ARS CRIS (projet 8010-22000-033-00D). L’USDA est un fournisseur et un employeur d’égalité des chances et ne cautionne pas les produits mentionnés dans cette publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active dry yeast Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA None Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies
Bacteriological agar Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy A1296 - 5KG Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Bleach solution Clorox Company, Oakland, CA, USA None Used to disinfect flesh fruit
Blue stopper Azer Scientific, Morgantown, PA, USA ES3837 Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects
Blueberries Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used)
BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E3030 Used for rearing parasitoids (parasitism cage)
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4590 Used for rearing flies
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4545 Used for rearing parasitoids (eclosion cage)
Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) Everbilt, OH, USA 308231EB Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition
Cornmeal Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy 35000 Used for providing water to the parasitoids within the storage container
Drosophila diet Frontier Scientific, Newark, DE, USA TF1003 Custom diet used to rear flies
Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 75813-160 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 89168-886 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Erlenmeyer flask (250 mL) Carolina Biological, Burlington, NC, USA 731029 Used for rearing flies and parasitoids
Falcon-style centrifuge tube (50 mL) VWR International, LLC., Radnor, PA, US VWRI525-0611 Modified to ship adult parasitoids
Foam stopper Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA L800-C Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects
Honey Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as food for parasitoids
Identi-Plug plastic foam stopper Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US 14-127-40E Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container
Industrial paper towel Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture
Micron mesh fabric (250 mL) Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA WN0250-72 Used to make ventilation lid for insects
Nutritional yeast (flakes) Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Paper coaster (10.2 cm) Hoffmaster, WI, USA 35NG26 Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae
Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) Berry Superfos, Taastrup, Denmark Unipak 5134 Modified to store adult parasitoids
Plastic lid (Ø 13.3 cm) Berry Superfos, Taastrup, Denmark PP 2830 Modified to store adult parasitoids
Propionic acid Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy P1386 - 1L Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Saccharose Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Soup cup with lid (475 mL) StackMan, Vietnam DC1648 Used for parasitized larvae to pupate
Soybean flour Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) Quiklok, Lincoln, NH, US WFW/.25 x 5 x 20 mm Used as feeding ring for parasitoids

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References

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Biologie numéro 184 lutte biologique Figitidae ravageur envahissant parasitoïde élevage drosophile à ailes tachetées
Méthodes d’élevage du parasitoïde <em>Ganaspis brasiliensis</em>, un agent de lutte biologique prometteur pour la <em>drosophile suzukii</em> envahissante
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