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Neuroscience

Intracerebroventrikuläre Abgabe von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in frei beweglichen Mäusen

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Aus dem Darm stammende mikrobielle Metaboliten haben vielfältige Wirkungen, die zu komplexem Verhalten bei Tieren führen. Unser Ziel ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm im Gehirn über die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung über eine Führungskanüle zu beschreiben.

Abstract

Der Einfluss der Darmmikrobiota und ihrer Metaboliten auf die Physiologie und das Verhalten des Wirts wurde in diesem Jahrzehnt umfassend untersucht. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Darmmikrobiota-abgeleitete Metaboliten hirnvermittelte physiologische Funktionen durch komplizierte Darm-Hirn-Bahnen im Wirt modulieren. Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die wichtigsten bakteriellen Metaboliten, die während der Ballaststofffermentation durch das Darmmikrobiom produziert werden. Sekretierte SCFAs aus dem Darm können an mehreren Stellen in der Peripherie wirken und die Immun-, endokrinen und neuronalen Reaktionen aufgrund der großen Verteilung von SCFAs-Rezeptoren beeinflussen. Daher ist es schwierig, die zentralen und peripheren Wirkungen von SCFAs durch orale und intraperitoneale Verabreichung von SCFAs zu unterscheiden. Dieser Artikel stellt eine videobasierte Methode vor, um die funktionelle Rolle von SCFAs im Gehirn über eine Führungskanüle in frei beweglichen Mäusen zu hinterfragen. Die Menge und Art der SCFAs im Gehirn kann durch Kontrolle des Infusionsvolumens und der Infusionsrate eingestellt werden. Diese Methode kann Wissenschaftlern eine Möglichkeit bieten, die Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu schätzen.

Introduction

Der menschliche Magen-Darm-Trakt beherbergt verschiedene Mikroorganismen, die auf den Wirt 1,2,3 einwirken. Diese Darmbakterien können Darmmetaboliten während ihrer Verwendung von Nahrungsbestandteilen absondern, die vom Wirt verbrauchtwerden 4,5. Interessanterweise können die Darmmetaboliten, die nicht in der Peripherie metabolisiert werden, über den Kreislauf zu anderen Organen transportiertwerden 6. Bemerkenswert ist, dass diese sezernierten Metaboliten als Mediatoren für die Darm-Hirn-Achse dienen können, definiert als die bidirektionale Kommunikation zwischen dem zentralen Nervensystem und dem Darm7. Frühere Studien haben gezeigt, dass Darmmetaboliten komplexes Verhalten und Emotionen bei Tieren modulieren können 8,9,10,11.

Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die Hauptmetaboliten, die von Darmmikrobiota während der Fermentation von Ballaststoffen und unverdaulichen Kohlenhydraten produziertwerden 6. Acetat, Propionat und Butyrat sind die häufigsten SCFAs im Darm12. SCFAs dienen als Energiequelle für Zellen im Magen-Darm-Trakt. Nicht metabolisierte SCFAs im Darm können durch die Pfortader zum Gehirn transportiert werden, wodurch Gehirn und Verhalten moduliertwerden 6,12. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCFAs eine entscheidende Rolle bei neuropsychiatrischen Störungen spielen könnten 6,12. Zum Beispiel rettete die intraperitoneale Injektion von Butyrat in BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) Mäusen, einem Tiermodell der Autismus-Spektrum-Störung (ASD), ihre sozialen Defizite13. Mit Antibiotika behandelte Ratten, die Mikrobiota von depressiven Probanden erhielten, zeigten eine Zunahme von angstähnlichen Verhaltensweisen und fäkalen SCFAs14. Klinisch wurden Veränderungen der fäkalen SCFAs-Spiegel bei Menschen mit ASD im Vergleich zu typischerweise entwickelnden Kontrollen beobachtet15,16. Menschen mit Depressionen haben niedrigere fäkale SCFAs-Werte als gesunde Probanden17,18. Diese Studien deuteten darauf hin, dass SCFAs das Verhalten von Tieren und Menschen auf verschiedenen Wegen verändern können.

Mikrobielle Metaboliten üben vielfältige Wirkungen auf mehrere Stellen im Körper aus und beeinflussen die Physiologie und das Verhalten des Wirts 4,19, einschließlich des Magen-Darm-Trakts, des Vagusnervs und des Sympathikus. Es ist schwierig, die genaue Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu bestimmen, wenn die Metaboliten über periphere Wege verabreicht werden. Dieser Artikel stellt ein videobasiertes Protokoll vor, um die Auswirkungen von Darmmetaboliten im Gehirn einer sich frei bewegenden Maus zu untersuchen (Abbildung 1). Wir haben gezeigt, dass SCFAs während Verhaltenstests akut durch die Führungskanüle verabreicht werden können. Die Art, das Volumen und die Infusionsrate der Metaboliten können je nach Zweck modifiziert werden. Der Ort der Kanülierung kann angepasst werden, um den Einfluss von Darmmetaboliten in einer bestimmten Gehirnregion zu untersuchen. Unser Ziel ist es, Wissenschaftlern eine Methode zur Verfügung zu stellen, um die möglichen Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm auf das Gehirn und das Verhalten zu untersuchen.

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Protocol

Alle Versuchsprotokolle und die Pflege der Tiere wurden vom National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Vorbereitung für das Versuchstier

  1. Besorgen Sie sich 6-8 Wochen alte männliche Wildtyp-Mäuse C57BL/6JNarl von einem Händler.
  2. Unterbringung der Mäuse in einem Standard-Mäusekäfig mit Standard-Mausfutter und sterilisiertem Wasser ad libitum.
    HINWEIS: Die Unterbringungsbedingungen für das Laboratory Animal Center der NCKU sind 22 ± 1 °C Temperatur, 55% ± 10% Luftfeuchtigkeit und ein 13 h / 11 h Hell-Dunkel-Zyklus.

2. Stereotaktische Chirurgie

  1. Bereiten Sie das stereotaktische Instrument, chirurgische Instrumente und verwandte Gegenstände vor und sterilisieren Sie es.
    HINWEIS: Alle Gegenstände, die direkt mit der Operationsstelle in Kontakt kommen, sollten sterilisiert werden, um eine Infektion zu vermeiden.
  2. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1% -5% Isofluran in Sauerstoff legen.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
  3. Nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer. Rasieren Sie die Operationsstelle (Mauskopf) mit einem Haustiertrimmer. Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Mausschneidezähne an der Schneideleiste im stereotaktischen Schneidezahnhalter befestigen. Bedecken Sie die Nase mit der Nasenkonusmaske.
  4. Betäuben Sie die Maus während der stereotaktischen Operation mit 1% -2,5% Isofluran in Sauerstoff. Beurteilen Sie die Nozizeption der Maus über den Zehenklemmreflex und stellen Sie eine konstante Atemfrequenz sicher, bevor Sie die Operationsstelle einschneiden.
  5. Legen Sie ein Heizkissen (37,0 °C) unter die Maus auf den stereotaktischen Rahmen, um die Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten. Alternativ können Sie die Kerntemperatur mit Hilfe einer rektalen Wärmesonde halten, die den programmierten Wärmer und das Heizkissen verbindet.
  6. Entfernen Sie das beschnittene Fell am Kopf mit Klebeband. Injizieren Sie der Maus das Analgetikum Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan, um Schmerzen zu lindern. Tragen Sie Augensalbe auf, um trockene Augen zu vermeiden.
  7. Führen Sie den spitzen Ohrbügel in den Gehörgang ein, um den Kopf zu fixieren.
  8. Zentrieren Sie den Kopf, indem Sie die Skala der Ohrleiste anpassen.
  9. Ziehen Sie die Nasenklemme am Schneidezahnhalter fest, um vertikale Bewegungen zu vermeiden. Drücken Sie den Kopf vorsichtig, um zu überprüfen, ob der Kopf fixiert ist, und vermeiden Sie, dass sich der Kopf während der nachfolgenden Operation lockert.
  10. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings Chlorhexidin mit einem Wattestäbchen. Beginnen Sie jedes Peeling von der Mitte zur Außenseite (vom am meisten desinfizierten zentralen Bereich zum am wenigsten desinfizierten Bereich).
    HINWEIS: Die Verwendung von Peelings von der Mitte nach außen könnte Wissenschaftlern helfen, Infektionen und Verunreinigungen durch das Fell zu minimieren. Der äußere Bereich liegt in der Nähe der unrasierten Kopfregion, die noch viel Fell hat und nicht leicht gründlich zu desinfizieren ist.
  11. Schneiden Sie die Kopfhaut anterior/posterior (<1 cm) mit einer chirurgischen Klinge. Öffnen Sie den Schnitt und wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das von einer Mikrosezierzange gehalten wird.
    HINWEIS: Die Mikrosezierzange, die chirurgische Klinge und die Wattestäbchen müssen vor der Operation autoklaviert werden. Während des chirurgischen Prozesses sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s vor und nach jedem Tier. Bereiten Sie ein sterilisiertes Becherglas vor, um die chirurgische Klinge und die Pinzette während des chirurgischen Prozesses und zwischen den Tieren zu halten.
  12. Identifizieren Sie die Bregma und Lambda auf dem Schädel. Verwenden Sie die Bregma als Referenz, um die Region von Interesse zu lokalisieren.
    1. Optional: Montieren Sie den stereotaktischen Bohrer auf dem stereotaktischen Bohrerhalter und verwenden Sie die Spitze des Bohrers, um Bregma als Referenz zu zeigen. Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit dem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s.
  13. Kalibrieren und richten Sie die flache horizontale Schädelebene in links/rechts und vorderen/hinteren Ebenen mit Bregma/Lambda aus.
    HINWEIS: Wenn sich die Maus nicht in einer korrekten horizontalen Ebene befindet, montieren Sie die Maus wieder auf dem stereotaktischen Instrument.

3. Kommerzielle kundenspezifische Führungskanülenimplantation

  1. Identifizieren und markieren Sie die Position des rechten lateralen Ventrikels basierend auf den stereotaktischen Koordinaten: Abstand zu Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm 20.
    HINWEIS: Die Koordinaten können basierend auf der interessierenden Region geändert werden. Die Koordinaten für den lateralen Ventrikel basierten auf erwachsenen C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewichtsbereich von 26-30 g. Wenn jüngere Mäuse verwendet werden, lesen Sie die Diskussion.
  2. Bohren Sie ein Loch (Durchmesser = 1,5 mm) durch den Schädel an der markierten Stelle mit einem stereotaktischen Bohrer zur Implantation einer handelsüblichen Führungskanüle.
  3. Bohren Sie zwei bis vier weitere Löcher (Durchmesser = 1,5 mm) mit einem stereotaktischen Bohrer zur Befestigung von Edelstahlschrauben auf den Schädel.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s vor und nach jedem Tier.
  4. Wischen Sie die Knochenreste ab und stoppen Sie die Blutung mit einem Wattestäbchen.
  5. Wischen Sie den Schädel mit Lidocain (1 mg / kg) mit einem Wattestäbchen ab, um eine lokalanästhetische, juckreizstillende und schmerzlindernde Wirkung zu erzielen. Wenn die Blutung nach dem Bohren nicht aufhört, legen Sie vorsichtig ein Wattestäbchen auf das Loch für die Hämostase.
  6. Montieren Sie zwei bis vier rostfreie Schrauben an den Löchern, um Anker für Dentalacryl bereitzustellen.
  7. Legen Sie die handelsübliche Führungskanüle auf den stereotaktischen Kanülenhalter und desinfizieren Sie sie mit dem Glasperlensterilisator (150 °C).
    HINWEIS: Die handelsübliche Führungskanüle, der handelsübliche Dummy und der kommerzielle Injektor (Abbildung 2A) wurden mit den Spezifikationen in der Materialtabelle angepasst.
  8. Bewegen Sie den stereotaktischen Kanülenhalter in das für den Seitenventrikel gebohrte Loch und führen Sie die handelsübliche Führungskanüle langsam in das Loch ein, bis die gewünschte Tiefe (2,5 mm) erreicht ist.
    HINWEIS: Die dorsale/ventrale Koordinate kann definiert werden, indem die Spitze der handelsüblichen Führungskanüle als Referenz festgelegt wird, wenn die Spitze kaum in das Loch eingeführt wird.
  9. Tragen Sie 10 μL n-Butylcyanacrylatkleber (Gewebekleber) auf, um die handelsübliche Führungskanüle im Bohrloch zu fixieren, und warten Sie 3-4 min. Lösen Sie die handelsübliche Führungskanüle vorsichtig vom stereotaktischen Kanülenhalter und entfernen Sie den Halter.
  10. Tragen Sie das Zahnacryl auf die eingeschnittene Kopfhaut auf, um die handelsübliche Führungskanüle zu fixieren, und warten Sie mindestens 5 Minuten. Implantieren Sie den handelsüblichen Dummy in die handelsübliche Führungskanüle, um ein Verstopfen der Kanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit zu vermeiden (Abbildung 2B).
  11. Lösen Sie den Ohrbügel vom Gehörgang und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
  12. Setzen Sie die Maus in einen neuen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um sich von der Anästhesie zu erholen, und beobachten Sie kontinuierlich, bis die Maus vollständig erwacht.
    HINWEIS: Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das sternale Liegen aufrechtzuerhalten. Ein Tier, das operiert wurde, sollte nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückkehren, bis es vollständig genesen ist.
  13. Setzen Sie die Maus je nach institutionellem IACUC-Protokoll und Versuchsaufbau wieder in ein Einzelgehäuse oder ein Gruppengehäuse ein. Stellen Sie bei Gruppenunterkünften sicher, dass weniger Mäuse in einem Käfig untergebracht sind, um unerwünschte Verletzungen oder das Ablösen der Kanüle zu minimieren.
  14. Verabreichen Sie Ibuprofen (0,2 mg / ml) im Trinkwasser für mindestens 3 Tage zur postoperativen Behandlung und überwachen Sie zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen und Stress für mindestens 3 Tage.
    1. Während der postoperativen Pflege tragen Sie Roxithromycin-Salbe um die Haut auf, um Entzündungen und Infektionen bei den Mäusen zu verhindern.
    2. Überwachen Sie den Zustand des Tieres und geben Sie rechtzeitig eine intraperitoneale Injektion von 5% Glukose und / oder 0,9% Natriumchlorid, um genügend Energie bereitzustellen.
    3. Wenn sich der Zustand von Schmerzen, Stress oder Infektion stetig verschlechtert, euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Inhalation.
  15. Warten Sie 1 Woche nach der Operation, bis die Maus für die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung von SCFAs und Verhaltenstests bereit ist.

4. Vorbereitung der SCFAs

  1. Natriumacetat, Natriumbutyrat und Natriumpropionat werden in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) gelöst (siehe Materialtabelle).
  2. Stellen Sie sicher, dass die Chemikalien vollständig aufgelöst sind, stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,4 ein und filtern Sie die SCFAs-Mischung durch einen 0,22-μm-Filter für die Sterilisation.

5. Einrichtung des Infusionssystems für die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung von SCFAs während der Verhaltenstests

  1. Montieren Sie eine Deckenkamera, um das Verhalten aufzuzeichnen. Schließen Sie die Kamera an einen Computer an, um die Videoaufzeichnungssoftware zu steuern (Abbildung 3).
  2. Füllen Sie eine 10-μL-Spritze mit destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen in der Mikroliterspritze.
  3. Verbinden Sie eine Mikroinjektionspumpe mit der Mikroinjektionssteuerung.
  4. Montieren Sie die Mikroliterspritze an der Mikroinjektionspumpe. Um die Spritze zu installieren, drücken Sie den Knopf, um die Klemme zu lösen und die Spritze an der entsprechenden Position zu installieren. Schließen Sie die Klemme, und ziehen Sie die Kolbenhalteschraube an der Mikroinjektionspumpe fest (Abbildung 4A).
  5. Führen Sie den handelsüblichen Injektor in das Polyethylenrohr ein (Abbildung 2A).
  6. Hängen Sie das Polyethylenrohr an die Deckenkamera über der Testarena.
  7. Füllen Sie das Polyethylenröhrchen mit destilliertem Wasser mit einer Insulinspritze. Verbinden Sie die Mikroliterspritze mit dem hängenden Polyethylenschlauch.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Polyethylenschlauch lang genug ist, damit sich die Maus im Testbereich frei bewegen kann.

6. Systemeinstellungen der Mikroinjektionssteuerung

  1. Schalten Sie den Microinjection-Controller ein, und drücken Sie Display All Channels (Alle Kanäle anzeigen), um auf den Bildschirm Command (Command) zuzugreifen (Abbildung 4C). Drücken Sie Configuration (Konfiguration) und stellen Sie Volume Target auf 9.800 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Gießen Sie 9.800 nL destilliertes Wasser aus dem Polyethylenröhrchen, das mit der Mikroliterspritze verbunden ist (drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm von Abbildung 4C).
  2. Drücken Sie Configuration (Konfiguration ) und stellen Sie Volume Target auf 3.000 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Entnehmen Sie 3.000 nL Mineralöl ( drücken Sie Direction , um in den Auszahlungsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm in Abbildung 4C).
    HINWEIS: Am Polyethylenrohr sollte eine klare Öl-Wasser-Phasentrennung eingehalten werden.
  3. Zerlegen Sie den Polyethylenschlauch von der Mikroliter-Spritzennadel. Spucken Sie 3.000 nL destilliertes Wasser aus der Mikroliter-Spritzennadel aus (drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln, und drücken Sie RUN).
  4. Führen Sie die Mikroliterspritze wieder in das Polyethylenröhrchen ein. Drücken Sie Konfiguration und stellen Sie Volume Target auf 9.500 nL mit einer Lieferrate auf 100 nL/s ein. Ziehen Sie 9.500 nL SCFAs ab (drücken Sie Direction, um in den Auszahlungsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN). Beschriften Sie die Öl-SCFAs-Phase, um zu validieren, ob die SCFAs erfolgreich infundiert wurden.
  5. Drücken Sie Konfiguration und stellen Sie das gewünschte Volumenziel mit Lieferrate auf 7 nL/s ein. Drücken Sie Direction, um in den Infuse-Modus zu wechseln (siehe rote Quadrate im Befehlsbildschirm von Abbildung 4C).
    HINWEIS: Bestimmen Sie das Volumen basierend auf der Infusionszeit. Wenn beispielsweise die Infusionszeit 3 min für die Verabreichungsrate von 7 nL / s beträgt, Zielvolumen = 1.260 nL.
  6. Drücken Sie RUN , um die Mikroliterspritze nach vorne zu infundieren, bis die Flüssigkeit am vorderen Ende des handelsüblichen Injektors austritt, bevor Sie den Injektor in die Kanüle für die SCFA-Injektion einführen.

7. Infusion von SCFAs in den lateralen Ventrikel durch die kommerzielle Führungskanüle in einer frei beweglichen Maus

  1. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1% -5% Isofluran in Sauerstoff legen.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
  2. Rufen Sie die Maus und führen Sie den handelsüblichen Injektor in die handelsübliche Führungskanüle ein (Abbildung 4B).
    HINWEIS: Wenn die handelsübliche Führungskanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit verstopft ist, lösen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette.
  3. Lassen Sie die Maus vor dem Verhaltenstest 15 Minuten lang in einem Käfig von der Anästhesie erholen.
  4. Für den grundlegenden Fortbewegungstest setzen Sie die Maus in einen neuartigen Käfig und lassen Sie sie 35 Minuten lang frei erkunden. Infusion von SCFAs mit einer Verabreichungsrate von 7 nL/s für ein Zielvolumen von 2.100 nL in den ersten 5 Minuten (drücken Sie Richtung in den Infusionsmodus und drücken Sie RUN).
    HINWEIS: Die Fortbewegung im neuartigen Käfig kann mit der Video-Tracking-Software21,22 für das Verhalten von Tieren analysiert werden.
  5. Betäuben Sie die Maus (wiederholen Sie Schritt 7.1) und entfernen Sie den handelsüblichen Injektor aus der handelsüblichen Führungskanüle.
    HINWEIS: Der Maus können wiederholt verschiedene Kontrollen/Metaboliten injiziert werden, nachdem die entsprechende Zeit zum Auswaschen der vorherigen Injektion gegeben wurde. Solange die Kanüle am Mauskopf befestigt ist, kann die Maus wiederholt mit verschiedenen Metaboliten getestet werden.

8. Wiederherstellung des Mikroinjektionssystems

  1. Zerlegen Sie den Polyethylenschlauch aus der Mikroliterspritze.
  2. Injizieren Sie Luft in das Röhrchen mit der Insulinspritze, um das destillierte Wasser im Polyethylenschlauch zu verwerfen. Entleeren Sie die Mikroliterspritze.
  3. Drücken Sie Reset Pos (Pos zurücksetzen ) im Bildschirm Configuration (Konfiguration ), um den Bildschirm Spritzenstoppdefinition zu öffnen (Abbildung 4C).
  4. Drücken Sie Zurückziehen, bis ein Signalton ertönt, um die Mikroinjektionspumpe in die vollständig zurückgezogene Position zurückzusetzen (Abbildung 4C).
  5. Kehren Sie zum Bildschirm Command (Command) zurück, und schalten Sie den Mikroinjektionscontroller aus, wenn auf diesem Bildschirm das Zeichen **END REACH** angezeigt wird (Abbildung 4C).

9. Optional: Validierung der intrazerebroventrikulären Injektion mittels neuralem Tracer

  1. Infusion von 2.100 nL des neuralen Tracers mit der Verabreichungsrate von 7 nL / s , um die Infusionsstelle zu überprüfen.
    HINWEIS: Lassen Sie den Injektor 5 Minuten in der Führungskanüle, um einen Rückfluss zu verhindern.
  2. Anästhesieren Sie die Maus durch eine Überdosierung von Isofluran (5%) 30 min nach der Infusion von neuralem Tracer.
  3. Überprüfen Sie die Atemfrequenz und den Schwanz-/Pfotenklemmreflex bei der betäubten Maus.
    HINWEIS: Mäuse müssen vor dem nächsten Schritt nicht reagieren.
  4. Machen Sie einen 4-5 cm langen Schnitt durch die Haut, den Muskel und die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs.
  5. Bewegen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell weg.
  6. Schneiden Sie das Zwerchfell ein, um das Herz der Maus freizulegen.
  7. Durchbluten Sie die Maus durch das Herz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS.
  8. Enthaupten Sie die Maus und sezieren Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Mikrosezierzange und einer Mikrosezierschere, um das gesamte Gehirn herauszunehmen23. Die Hirnproben für 3-4 Tage in eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS legen und 3 x 5 min mit PBS waschen.
  9. Schneiden Sie das Gehirn im Gehirnschnitthalter der Maus beim achten Schnitt des Maushirnscheibenhalters (1 mm/Abschnitt) von der vorderen in die hintere Richtung in zwei Teile. Legen Sie das Gehirn in die Einbettungsform und betten Sie die Gehirnproben in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein (4% in PBS).
  10. Kleben Sie das in Agarose eingebettete Gehirn mit Sekundenkleber auf die Bühne des Vibratoms. Schneiden Sie das Gehirn koronal in 50 μm Gehirnschnitte mit dem Vibratom.
  11. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in dem Antikörper, der auf den neuralen Tracer abzielt, der in Blockierpuffer (1:1.000 Verdünnung) verdünnt ist, über Nacht bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Der Blockierpuffer enthielt 10% Pferdeserum, 0,1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid.
  12. Die Scheiben 3 x 5 min mit PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) waschen.
  13. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in fluoreszenzfarbstoffkonjugierten sekundären Antikörpern, verdünnt in Blockierpuffer (1:500 Verdünnung) für 2 h bei Raumtemperatur.
  14. Die Scheiben 3 x 5 min mit PBS waschen.
  15. Montieren Sie die Hirnschnitte auf dem Objektträger mit einem Montagemedium, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält.
  16. Decken Sie den Objektträger mit einem mikroskopischen Deckglas ab.
  17. Tragen Sie Nagellack auf die Objektträgerkante auf, um ein Auslaufen des Montagemediums zu vermeiden.
  18. Nach nächtlicher Inkubation bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, das Fluoreszenzsignal an der Infusionsstelle mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden.

10. Optional: Infusion von Metaboliten durch eine maßgeschneiderte Edelstahl-Führungskanüle in der lateralen Herzkammer bei Mäusen

  1. Befolgen Sie die Protokollabschnitte 1-8 und ersetzen Sie die handelsübliche Führungskanüle durch eine Führungskanüle aus Edelstahl, um Chemikalien durch einen Edelstahlinjektor in der Maus zu infundieren.
    HINWEIS: Die Vor- und Nachteile der verschiedenen kommerziellen und Edelstahlkanülen werden im Diskussionsabschnitt erläutert.
  2. Führen Sie das chirurgische Protokoll auf die in den Protokollabschnitten 2 und 3 beschriebene Weise durch, denken Sie jedoch daran, die handelsübliche Führungskanüle durch eine Führungskanüle aus Edelstahl zu ersetzen (Abbildung 5B).
    HINWEIS: Die Führungskanüle aus Edelstahl, der Edelstahl-Dummy und der Edelstahl-Injektor (Abbildung 5A) wurden mit den Spezifikationen in der Materialtabelle angepasst. Führen Sie die maßgeschneiderte Führungskanüle aus Edelstahl bis zur gewünschten Tiefe (2,0 mm) in das Loch ein.
  3. Infusion von SCFAs über die Führungskanüle aus Edelstahl mit dem Mikroinjektionssystem, bestehend aus Mikroinjektionscontroller und Mikroinjektionspumpe (Abbildung 4B) (identisch mit den Protokollabschnitten 4-7). Für den Edelstahl-Dummy der Edelstahl-Führungskanüle biegen Sie eine Seite des Edelstahl-Injektors vorsichtig, bis die Spitze der anderen Seite 1 mm länger ist als die Edelstahl-Führungskanüle.
  4. Infektion 2.100 nL des neuralen Tracers durch die Edelstahl-Führungskanüle in den lateralen Ventrikel bei Mäusen (wie Protokollabschnitt 9).
  5. Entnehmen Sie die Probe für 30 Minuten nach der neuralen Tracerinfusion (wie Protokollabschnitt 9).
  6. Führen Sie die Bildaufnahme in den mit neuronalen Tracern infundierten Hirnschnitten durch (identisch mit Protokollabschnitt 9).

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Representative Results

Die Maus wurde 1 Woche nach der Erholung von der Implantation der Führungskanüle mit SCFAs infundiert, um die Bewegungsaktivität in einem neuartigen Käfig zu bewerten. Die Maus wurde in einen neuartigen Käfig gesetzt und in den ersten 5 Minuten mit 2.100 nL SCFAs oder ACSF (Lieferrate von 7 nL / s) in das Gehirn durch die kommerzielle Führungskanüle infundiert, die in den lateralen Ventrikel des Gehirns implantiert wurde. Die Bewegungsaktivität in einem neuartigen Käfig wurde für weitere 30 Minuten nach der Infusion aufgezeichnet. Es wurde kein Unterschied in der Bewegungsaktivität im erfindungsgemäßen Käfig zwischen der Infusion von SCFAs und ACSF beobachtet (n = 2 Mäuse pro Gruppe; die Daten werden als Mittelwert ± s.e.m. dargestellt und mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert).

Um die Genauigkeit der Implantation der Führungskanüle in den Hirnregionen zu validieren, wurde den Mäusen ein fluoreszierender neuraler Tracer über die Führungskanüle mit dem gleichen Volumen und der gleichen Abgaberate wie die SCFAs (2.100 nL in 5 min; 7 nL/s) infundiert. Die Gehirne wurden 30 Minuten später für die Histologie gesammelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wurde im lateralen Ventrikel und den umliegenden Regionen des Mausgehirns nachgewiesen (Abbildung 7A). Eine Führungskanüle aus Edelstahl wurde in den lateralen Ventrikel des Gehirns implantiert, um unter den gleichen Bedingungen einen neuralen Tracer zu injizieren. Ähnlich wie bei der Führungskanüle zeigten die Ergebnisse, dass auch nach der Infusion durch die Edelstahl-Führungskanüle ein fluoreszierendes Farbstoffsignal im lateralen Ventrikel und den umliegenden Regionen des Mausgehirns detektiert wurde (Abbildung 7B).

Figure 1
Abbildung 1: Das Verfahren zur intrazerrebroventrikulären Infusion bei frei beweglichen Mäusen. Das Flussdiagramm für die intrazerrebroventrikuläre Abgabe von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in frei beweglichen Mäusen. Abkürzung: SCFAs = kurzkettige Fettsäuren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Implantation der kommerziellen Führungskanüle bei Mäusen . (A) Das repräsentative Bild von handelsüblicher Führungskanüle, Dummy und Injektor. (B) Das repräsentative Bild einer handelsüblichen Führungskanüle und eines Dummys, die durch Fixierung mit Zahnacryl in das Gehirn von Mäusen implantiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Das intrazerrebroventrikuläre Infusionsgerät für Verhaltenstests. Das Diagramm des Mikroinjektionssystems, des Videoaufzeichnungssystems und der Verhaltensapparatur. Abkürzung: SCFAs = kurzkettige Fettsäuren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Das Mikroinjektionssystem. (A) Einbau der Mikroliterspritze unter Verwendung einer Mikroinjektionspumpe. (B) Das Einführen des handelsüblichen Injektors, der mit einem Polyethylenrohr verbunden ist, in die handelsübliche Führungskanüle (C) Der Touchscreen des Mikroinjektionscontrollers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Implantation einer Führungskanüle aus Edelstahl in den lateralen Ventrikel von Mäusen . (A) Das repräsentative Bild von Edelstahl-Führungskanüle, Dummy und Injektor. (B) Das repräsentative Bild einer Führungskanüle und eines Dummys aus Edelstahl, die durch Fixierung mit Dentalacryl in das Gehirn von Mäusen implantiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Bewegungsaktivität von SCFAs-infundierten Mäusen im neuartigen Käfig . (A) Zeitachsenschema der Implantation von Führungskanülen und der neuartigen Käfiglokomotion nach ACSF- oder SCFAs-Infusion. (B) Zeitachsenschema für die Platzierung der Infusionsspritze, des Infusionsfensters (blauer Schatten) und der neuartigen Käfigverhaltenstests. (C) Gesamtstrecke, die von ACSF- und SCFAs-infundierten Mäusen in einem neuartigen Käfig für 35 Minuten zurückgelegt wurde. Das Zeitfenster für die Infusion wird mit blauem Schatten (0-5 min) angezeigt. (D) Repräsentative Bilder von Flugbahnen für ACSF- und SCFAs-infundierte Mäuse in einem neuartigen Käfig. n = 2 Mäuse pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± s.e.m. dargestellt und mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert. NS: Nicht signifikant. Abkürzungen: SCFAs = kurzkettige Fettsäuren; ACSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Die Histologie von hirninfundiertem Fluoreszenzfarbstoff. Infusion durch die maßgeschneiderte (A) kommerzielle und (B) Edelstahl-Führungskanüle, die in den lateralen Ventrikel (LV) von Mäusen implantiert wird. Maßstabsbalken = 1 mm (links) und 500 μm (rechts). Blau: DAPI-Färbung; Grün: Anti-Fluoreszierende Gold-Markierung. Abkürzungen: LV = lateraler Ventrikel; AC = vordere Kommissur; CPu = caudate putamen; LS = laterales Septum; MS = mediales Septum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Darm-abgeleitete Metaboliten wurden ohne großen präzisen Mechanismus mit hirnvermittelten Erkrankungen in Verbindung gebracht, teilweise aufgrund ihrer multiplen Bindungsstellen im Körper 6,12,24. Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass SCFAs als Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, epigenetische Regulatoren und Quellen für die Energieproduktion an mehreren Stellen im Körper dienen könnten 6,12. Um die Störfaktoren zu umgehen, die aus der Peripherie stammen (wie Immunzellen, Hormone und autonomes Nervensystem), wurde eine Methode entwickelt, bei der intrazerrebroventrikuläre Injektionen von SCFAs in das Gehirn durch eine Führungskanüle in frei bewegliche Mäuse angewendet wurden. Darüber hinaus wurden die Kanülierungs- und Infusionsstellen validiert, um die Gehirnbereiche zu untersuchen, die möglicherweise von SCFAs betroffen sind. Insgesamt stellt dieses Papier eine präzise, sorgfältige und validierte Methode vor, um Darmmetaboliten in das Gehirn für die Darm-Hirn-Achsenforschung zu liefern.

Die intrazerebroventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln und Chemikalien durch eine Führungskanüle in Tiere ist gut etabliert 25,26,27,28,29 für verschiedene Drogentests 29, Krankheitsmodellierung 26,28 und spezifisches Design von Verhaltenstests 27 . Am wichtigsten ist, dass mehrere Studien mikrobielle Darmmetaboliten durch intrazerrebroventrikuläre Injektion in das Gehirn geliefert und ihre Auswirkungen auf physiologische Funktionen getestet haben30,31,32,33. Dieses Protokoll bietet ein Add-on-Attribut bei der akuten Verabreichung von Darmmetaboliten an das Gehirn in Echtzeit, was es Wissenschaftlern ermöglichen würde, die dynamischen Auswirkungen von Darmmetaboliten auf das Gehirn und das Verhalten zu verstehen.

Die Verabreichungsrate für die Metaboliteninfusion ist entscheidend, um den Fluss von Zerebrospinalflüssigkeit in den Hirnventrikeln zu simulieren. Eine Studie zeigte, dass die Liquorproduktionsrate bei Mäusen 5,3 nL / s beträgt34. Um die Flussrate von SCFAs in frei beweglichen Mäusen auf natürliche Weise zu steuern, haben wir die Durchflussrate für dieses Mikroinjektionssystem ausgewertet (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die SCFAs konnten reibungslos und ohne großen Widerstand infundiert werden, selbst wenn das 350 cm lange Polyethylenrohr verwendet wurde, um SCFAs in einer frei beweglichen Maus zu infundieren. Durch die Befüllung von destilliertem Wasser und Mineralöl, um den Flüssigkeitswiderstand im Polyethylenrohr zu verringern (siehe Protokollabschnitte 5 und 6), konnte die Durchflussrate von 100 nL/s auf 7 nL/s gesenkt werden. Die Infusion der SCFAs oder ACSF mit einer Flussrate von 7 nL / s führte zu keinem abnormalen Verhalten der Mäuse.

Die Menge und Dosierung von Darmmetaboliten für die intrazerebroventrikuläre Injektion sind entscheidend. Es bleibt eine Herausforderung, die absoluten Konzentrationen von Darmmetaboliten in verschiedenen Gehirnregionen umfassend zu analysieren. Zum Beispiel haben nur sehr wenige Studien den Nachweis der physiologischen Spiegel von SCFAs im Gehirn gezeigt35,36. Eine Studie zeigte, dass die Konzentrationen von Acetat, Propionat und Butyrat in den Gehirnen von Mäusen ungefähr 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g und 44,036-66,054 μg / g bzw.36 betragen. Eine andere Studie berichtete jedoch über niedrigere SCFA-Spiegel im Gehirn (Acetat 128,1 μg/g, Propionat 0,3883 μg/g und Butyrat 0,1640 μg/g)35. Die in diesem Protokoll angenommenen Mengen an infundiertem Acetat, Propionat und Butyrat betrugen 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g bzw. 2,6124 μg/g. Daher sind die Konzentrationen der in diesem Protokoll infundierten SCFAs mit physiologischen Konzentrationen vergleichbar. Wir konnten jedoch nicht ausschließen, dass die Konzentrationen von SCFAs in verschiedenen Hirnregionen variieren können. Mehrere Studien zeigten, dass die Abgabe von Propionat in den Hirnventrikel durch intrazerrebroventrikuläre Injektion (4 μL 0,26 M Propionsäure in 1 min; ca. 249,756 μg/g) das Sozialverhalten und die Kognition bei Ratten beeinträchtigte30,31. Die Dosierung und die Flussrate des infundierten Propionats waren relativ hoch, wie bei Mäusen35 und Ratten37 berichtet wurde. Daher werden Fortschritte in der Metabolitenanalyse und metabolomischen Profilerstellung im Gehirn und in der Peripherie den Forschern helfen, die räumlichen und zeitlichen dynamischen Veränderungen in Darmmetaboliten besser zu verstehen.

In diesem Protokoll wurden zwei Arten von Führungskanülen zur intrazerrebroventrikulären Injektion in Mäuse vorgestellt - eine handelsübliche Führungskanüle und eine Führungskanüle aus Edelstahl. Die handelsübliche Führungskanüle und der Dummy sind gut für die Implantation konzipiert. Für Mäuse ist es nicht einfach, den angepassten Dummy aufgrund der Kappe zu entfernen. Im Gegenteil, der Edelstahl-Dummy kann von Mäusen während der 1-wöchigen Erholung leicht aus der Edelstahl-Führungskanüle entfernt werden, was zur Gerinnung von Blut / Liquor cerebrospinalis in der Kanüle führt. Die kommerzielle kundenspezifische Kanüle beträgt jedoch 64 mg und der Dummy für diese Kanüle 86 mg. Somit beträgt das Gesamtgewicht der handelsüblichen kundenspezifischen Kanüle und des Dummys 150 mg. Im Gegensatz dazu beträgt die kundenspezifische Führungskanüle aus Edelstahl 18,3 mg und der Dummy für diese Kanüle 8,5 mg. Somit beträgt das Gesamtgewicht der maßgeschneiderten Edelstahl-Führungskanüle 26,8 mg. Theoretisch würde das geringe Gewicht des Edelstahl-Führungskanülensets die Auswirkungen der Kanüle auf die Bewegung des Tieres und das Gehirn minimieren. Darüber hinaus sind die Kosten für die handelsübliche Führungskanüle höher als für die Führungskanüle und den Injektor aus Edelstahl. Daher empfehlen wir die Führungskanüle aus Edelstahl für unerfahrene Forscher, die stereotaktische Operationen an Mäusen durchführen.

Die implantierte Kanüle kann durch Blut und Liquor cerebrospinalis aufgrund von Hirnschäden verstopft sein. Diese Verstopfung der Kanüle könnte bei der Edelstahlkanüle häufiger auftreten als bei der Handelskanüle. Der Dummy kann mit einem Gewinde versehen werden, um die handelsübliche Kanüle sicher festzuziehen (Abbildung 2A), jedoch nicht für die Edelstahlkanüle (Abbildung 5A). Daher würde die Befestigung des Dummys während der Erholungsphase die Verstopfung der Kanüle minimieren. Ein neuer Dummy muss eingefügt werden, wenn während der 1-wöchigen Erholung eine Ablösung auftritt. Darüber hinaus muss ein sterilisierter Einweginjektor mehrmals eingeführt werden, um die Kanüle zu verstopfen, bevor der Injektor montiert wird, der das Polyethylenrohr verbindet.

Die Wahl der Anästhetika wird die Operation und Verhaltenstests stark beeinflussen. Hier wurde das Inhalationsanästhetikum Isofluran gegenüber injizierten Anästhetika gewählt, da die Erholungszeit kürzer ist und es aus humanen Gründen weniger schädlich für die Tiere ist. Die Dosierung für die Isofluran-Inhalation kann jedoch je nach Status und Körpergewicht der Maus variiert werden. Daher muss der Status der Anästhesie während des gesamten chirurgischen Eingriffs genau beobachtet und der Isofluran-Vaporizer entsprechend angepasst werden. Die optimierte Atemfrequenz sollte bei allen Eingriffen einen Atemzug pro Sekunde betragen. Darüber hinaus sollte der mit Aktivkohle gefüllte Gasfilterkanister mit der Anästhesiekammer und der Nasenkonusmaske verbunden werden, um die Isofluran- und Abgasbelastung im Operationsbereich zu beseitigen. Dies schützt den Chirurgen vor der toxischen Wirkung von Isofluran.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass die SCFA-Infusion keine dramatische Wirkung auf die Fortbewegung in einem neuartigen Käfig hatte. Dies könnte daran liegen, dass eine kleine Anzahl von Tieren verwendet wurde, um dieses Ergebnis zu erhalten (Abbildung 6). Darüber hinaus haben wir die SCFAs nur für die ersten 5 Minuten des neuartigen Käfig-Fortbewegungsverhaltenstests infundiert, aber nicht für den gesamten Test, da der größte Teil des Verhaltens innerhalb eines kurzen Zeitfensters (5-15 Minuten) getestet wurde. Das Zeitfenster für die aus dem Darm stammenden mikrobiellen Metaboliten sollte basierend auf der Hypothese der Forscher angepasst werden.

Die Zeit für die Anästhesie und die Wiedererlangung des Bewusstseins durch die Anästhesie sind entscheidend für Verhaltenstests. Hier wurden die Mäuse kurz für die Injektorimplantation und SCFAs-Infusion betäubt und nach 15 min Verhaltenstests durchgeführt. Die Zeit zur Erholung nach Beendigung der Inhalationsanästhesie wurde auf der Grundlage einer früheren Studiebestimmt 38. Eine Pilotstudie stellte sicher, dass die Mäuse 15 Minuten nach der Narkose aktiv, frei beweglich und nicht unangenehm waren. Wir haben den Anästhesieschritt für die Montage des Injektors aus folgenden Gründen eingeführt. Erstens ist die Injektoranzeige 33 G; Es ist sehr schwierig, einen so empfindlichen Injektor in die Kanüle einzuführen, wenn sich das Tier aktiv bewegt. Darüber hinaus kann das Schrubben bewusster Mäuse Stress auf die Mäuseerzeugen 39, was die Verhaltensergebnisse verwirrt. Zweitens ist die Kanüle gelegentlich aufgrund der Gerinnung des Blutes / der Zerebrospinalflüssigkeit verstopft. Das vorsichtige Lösen der Kanüle vor der Montage des Injektors wäre ideal für die Metaboliteninfusion. Aus diesen beiden Gründen wird empfohlen, die Mäuse für die Montage des Injektors kurz zu betäuben. Die Forscher können länger (30 Minuten) warten, wenn Bedenken hinsichtlich der Erholung des Tieres von der Inhalationsnarkose bestehen. Darüber hinaus kann ein separater Satz Infusionsinjektor eingerichtet werden, der das Polyethylenrohr verbindet, um die Experimente zu beschleunigen.

Dieses Protokoll hat mehrere Einschränkungen. Erstens würde die Implantation der Führungskanüle und des Verbindungsrohrs aus Polyethylen den chirurgischen Bereich für die Implantation von optischen Fasern für die optogenetische und Faserphotometrie in dieselbe Koordinate, die Umgebung oder sogar die gleiche Hemisphäre des Gehirns begrenzen. Noch schwieriger wird es, die Linse für die Mikroendoskopie zusammen mit der implantierten Führungskanüle am Mauskopf zu implantieren. Zweitens kann die Implantation der Führungskanüle ein erhebliches Gewicht auf dem Mauskopf erzeugen. Das Gesamtgewicht eines kundenspezifischen Kanülensets beträgt 26,8-150 mg, eine Schraube ist ~ 48 mg und das montierte Dentalacryl ist 450-500 mg. Das gesamte Installationsset kann die Bewegungen der Mäuse einschränken. Neuere Studien haben jedoch ein Miniskop zur Überwachung von Kalziumsignalen in frei beweglichen Mäusen implantiert40,41. Das Gewicht des Miniskops reicht von 1,6 g bis 4,5 g, ohne Schrauben und Dentalacryl. Daher kann das Gewicht der Führungskanüle für Mausverhaltenstests als relativ akzeptabel angesehen werden. Drittens ist der Verbindungsschlauch aus Polyethylen für die Infusion ~ 350 cm lang, was die Bewegung von Mäusen während des Verhaltenstests einschränken kann. Um dieses Problem auszuräumen, kann ein Vortest für die Fortbewegung in einem Freilandtest erforderlich sein, um die Auswirkungen des Verbindungsrohrs aus Polyethylen auf die Motorfunktion der Maus zu bewerten. Viertens kann Zahnacryl eine neurotoxische Wirkung auf die Mäuse haben. Es ist jedoch erforderlich, die Führungskanüle während des Testzeitraums am Mauskopf zu befestigen. Um die potenzielle neurotoxische Wirkung von Zahnacryl auf Mäuse zu verringern, müssen die Bediener mit der Verwendung von Zahnacryl vertraut sein. Zahnacryl wird besser angewendet, wenn die Dentalacrylmischung (Pulver und Flüssigkeit) leicht verfestigt ist, um das Eindringen von Zahnacrylflüssigkeit in das Gehirn zu reduzieren.

Mikrobiota und ihre Metaboliten sind mit der Verhaltensfunktion an bestimmten Entwicklungsmeilensteinen verbunden. Obwohl dieses Protokoll auf erwachsenen C57BL/6-Mäusen mit einem Körpergewicht von 26 g bis 30 g basiert, kann es auch auf Mäuse unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Größe angewendet werden. Frühere Studien haben stereotaktische Chirurgie bei jungen Mäusen 42,43,44,45 übernommen. Die Koordinaten für Gehirnregionen können jedoch je nach Größe und Alter der Mäuse variieren. Wir empfehlen, auf den altersentsprechenden Atlas oder die Online-Ressource (http://mouse.brain-map.org/static/atlas) zu verweisen. Darüber hinaus müssen die Koordinaten validiert werden, indem Trypanblau oder Fluoreszenzfarbstoff in die jungen Keulungsmäuse injiziert wird, wodurch die Methode optimiert wird, bevor sie an den Versuchsmäusen ausgeführt wird. Die in diesem Protokoll verwendeten Führungskanülen sind alle kundenspezifisch und können nach Validierung der Koordinaten für verschiedene Mäusegrößen angepasst werden.

Dieses Protokoll wird mit den meisten Verhaltenstests von Nagetieren mit einer offenen Arena auf dem Gerät ohne große Änderungen kompatibel sein. Nagetierverhaltenstests können mit einer Polyethylenrohrverdrahtung auf dem Mauskopf ohne Hindernisse durchgeführt werden, einschließlich Freifeldtest, erhöhtem Plus/Null-Labyrinth, Step-Down-Test, direkter sozialer Interaktion, Ultraschall-Vokalisierung für Erwachsene, erzwungenem Schwimmtest, Schwanzaufhängung, Wasserlabyrinth, T- oder Y-Labyrinth, neuartiger Objekterkennung, Marmorvergraben, Selbstpflegetest, Strahlüberquerung, Poltest und Wasservermeidungsbelastung. Tests mit geschlossenen Kammern oder Röhrchen müssen modifiziert werden, damit sich die Polyethylenröhre frei mit den Mäusen bewegen kann, z. B. Dreikammer-Sozialtest, Hell-Dunkel-Box, Angstkonditionierung, Saccharosepräferenz, Zurückhaltungsstress, Schrecktest und Vorimpulsimpulshemmung. Wir empfehlen, die für das Polyethylenrohr erforderliche Länge vor dem Test an den Keulmäusen vorab zu testen und abzuschätzen.

Es wurde gezeigt, dass mikrobielle Darmmetaboliten das Verhalten des Wirts beeinflussen 8,46,47,48,49. Wissenschaftler können diese Methode anwenden, um die zeitlichen und räumlichen Auswirkungen von Darmmikrobiota-abgeleiteten Metaboliten auf das Gehirn und das Verhalten von Mäusen direkt zu untersuchen. Zum Beispiel war der mikrobielle Metabolit 4-Ethylphenylsulfat (4EPS) in präklinischen Mausmodellen von ASD und Menschen mit ASD46,48,49 erhöht. Die Injektion von 4EPS und die Besiedlung der Bakterien, die 4EPS produzieren, erhöhte das angstähnliche Verhalten und beeinträchtigte die Oligodendrozytenreifung im paraventrikulären Kern des Thalamus (PVT) bei Mäusen46,48. Es wäre faszinierend, die direkte Wirkung von 4EPS auf die PVT von Mäusen während angstähnlicher Verhaltenstests zu bewerten. Die absolute Konzentration von 4EPS im PVT ist jedoch noch unbekannt. Daher könnte ein Dosis-Wirkungs-Test entscheidend sein, um die angemessenen 4EPS-Konzentrationen im PVT zu bestimmen. Ein ähnliches Konzept kann für die Auswirkungen anderer mikrobieller Metaboliten auf das Gehirn und das Verhalten übernommen werden.

Schaltkreisbasierte Neurotechnologien wie Optogenetik, Chemogenetik und In-vivo-Kalziumbildgebung sind kritische Methoden, die es Wissenschaftlern ermöglichen, den neuronalen Schaltkreis bei der Verhaltenskontrolle zu verstehen50,51,52. Die Darm-Hirn-Achse ist eine komplizierte Verbindung, die für die Darmmikroben und ihre Metaboliten entscheidend ist, um das Wirtsverhalten zu vermitteln. Eine wachsende Zahl von Studien hat schaltkreisbasierte Neurotechnologien eingesetzt, um die faszinierenden Überschneidungen zwischen Darm und Gehirn zu verstehen 33,53,54,55,56,57,58,59. Dieses Protokoll bietet eine alternative Möglichkeit, die auf der Gehirnregion basierende Kontrolle des Verhaltens zu verstehen, das durch Darmmetaboliten verursacht wird. Die Kombination dieses Protokolls mit schaltkreisbasierten Neurotechnologien wird es Forschern ermöglichen, Einblicke in die schaltkreisbasierte Kontrolle von Verhalten und Gehirnaktivität zu gewinnen, die von Darmmetaboliten beigetragen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Konzept der Darm-Hirn-Achse in der wissenschaftlichen Gemeinschaft gut akzeptiert ist und die Möglichkeit der Beteiligung von Darmmetaboliten an neuropsychiatrischen Störungen fördert 11,13,60,61,62,63,64,65 . Um zu hinterfragen, wie und welche Darmmetaboliten das Gehirn und das Verhalten von Mäusen beeinflussen, wird eine umfassende und physiologisch basierte Methodik in diesem Bereich benötigt. Dieser Artikel bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Darmmetaboliten direkt in das Gehirn zu bringen, vor allem in einer sich frei bewegenden Maus. Dieses Design kann weiter angepasst werden, um die regionsspezifischen Effekte zu untersuchen, indem die Darmmetaboliten in verschiedene Gehirnregionen abgegeben werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Acknowledgments

Wir danken den Mitarbeitern des Laboratory Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) für die Pflege der Tiere. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Prof. Kun-Yen Huang Education Fund der CHENG-HSING Medical Foundation an C.-W.L. unterstützt; die Mittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) in Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) an T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) bis W.-L.W.; und das Higher Education Sprout Project, Ministry of Education to the Headquarters of University Advancement at NCKU to W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neuroscience Ausgabe 184
Intracerebroventrikuläre Abgabe von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in frei beweglichen Mäusen
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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