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Neuroscience

자유롭게 움직이는 마우스에서 장 유래 미생물 대사 산물의 뇌실 내 전달

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

장 유래 미생물 대사 산물은 동물에서 복잡한 행동으로 이어지는 다면적 효과가 있습니다. 우리는 가이드 캐뉼러를 통한 뇌실 내 전달을 통해 뇌에서 장 유래 미생물 대사 산물의 효과를 설명하는 단계별 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

Abstract

장내 미생물총과 그 대사 산물이 숙주 생리학 및 행동에 미치는 영향은 지난 10년 동안 광범위하게 조사되었습니다. 수많은 연구에 따르면 장내 미생물총에서 파생된 대사 산물은 숙주의 복잡한 장-뇌 경로를 통해 뇌 매개 생리 기능을 조절합니다. 단쇄 지방산(SCFA)은 장내 마이크로바이옴에 의해 식이 섬유 발효 중에 생성되는 주요 박테리아 유래 대사 산물입니다. 장에서 분비된 SCFA는 말초의 여러 부위에서 작용하여 SCFA 수용체의 광대한 분포로 인해 면역, 내분비 및 신경 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 SCFA의 경구 및 복강 내 투여를 통해 SCFA의 중추 및 말초 효과를 구별하는 것은 어렵습니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 마우스에서 가이드 캐뉼러를 통해 뇌에서 SCFA의 기능적 역할을 조사하는 비디오 기반 방법을 제시합니다. 뇌에서 SCFA의 양과 유형은 주입량과 속도를 조절하여 조정할 수 있습니다. 이 방법은 과학자들에게 뇌에서 장 유래 대사 산물의 역할을 이해하는 방법을 제공 할 수 있습니다.

Introduction

인간의 위장관에는 숙주 1,2,3에 영향을 미치는 다양한 미생물이 있습니다. 이 장내 박테리아는 숙주 4,5가 소비하는식이 성분을 활용하는 동안 장 유래 대사 산물을 분비 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 말초에서 대사되지 않은 장 대사 산물은 순환을 통해 다른 기관으로 운반 될 수 있습니다6. 참고로, 이러한 분비 된 대사 산물은 중추 신경계와 장7 사이의 양방향 통신으로 정의되는 장-뇌 축의 매개체 역할을 할 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 장 유래 대사 산물은 동물의 복잡한 행동과 감정을 조절할 수 있습니다 8,9,10,11.

단쇄 지방산 (SCFA)은식이 섬유와 소화되지 않는 탄수화물의 발효 과정에서 장내 미생물에 의해 생성되는 주요 대사 산물입니다6. 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트는 장12에서 가장 풍부한 SCFA입니다. SCFA는 위장관에서 세포의 에너지 원 역할을합니다. 장에서 대사되지 않은 SCFA는 문맥을 통해 뇌로 운반되어 뇌와 행동을 조절할 수 있습니다 6,12. 이전 연구에서는 SCFA가 신경 정신 장애에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했습니다 6,12. 예를 들어, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)의 동물 모델인 BTBR T+ Itpr3tf/J(BTBR) 마우스에서 부티레이트를 복강 내 주사하여 사회적 결핍을 구제했습니다13. 우울증 피험자로부터 미생물총을 투여받은 항생제 처리된 쥐는 불안과 유사한 행동과 대변 SCFA의 증가를 보였다14. 임상 적으로, 대변 SCFA 수준의 변화는 일반적으로 발달하는 대조군15,16과 비교하여 ASD 환자에서 관찰되었습니다. 우울증이 있는 사람들은 건강한 피험자보다 대변 SCFA 수치가 낮습니다17,18. 이 연구는 SCFA가 다양한 경로를 통해 동물과 인간의 행동을 바꿀 수 있음을 시사했습니다.

미생물 대사 산물은 신체의 여러 부위에 다양한 효과를 발휘하여 위장관, 미주 신경 및 교감 신경을 포함한 숙주 생리학및 행동 4,19에 영향을 미칩니다. 말초 경로를 통해 대사 산물을 투여 할 때 뇌에서 장 유래 대사 산물의 정확한 역할을 정확히 찾아내는 것은 어렵습니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 마우스의 뇌에서 장 유래 대사 산물의 영향을 조사하기위한 비디오 기반 프로토콜을 제시합니다 (그림 1). 우리는 SCFA가 행동 테스트 중에 가이드 캐뉼러를 통해 급격하게 주어질 수 있음을 보여주었습니다. 대사 산물의 유형, 부피 및 주입 속도는 목적에 따라 변형 될 수 있습니다. 캐뉼라이제이션 부위는 특정 뇌 영역에서 장 대사 산물의 영향을 탐색하도록 조정할 수 있습니다. 우리는 과학자들에게 장 유래 미생물 대사 산물이 뇌와 행동에 미치는 잠재적 영향을 탐구 할 수있는 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

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Protocol

모든 실험 프로토콜과 동물 관리는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 실험동물에 대한 준비

  1. 공급 업체로부터 6-8 주 된 야생형 C57BL / 6JNarl 수컷 마우스를 구하십시오.
  2. 표준 마우스 케이지에 마우스를 수용하고 표준 마우스 차우와 멸균 된 물을 자유롭게 만듭니다.
    참고: NCKU 실험실 동물 센터의 주거 조건은 22 ± 1 ° C 온도, 55 % ± 10 % 습도 및 13 시간 / 11 시간 명암 사이클입니다.

2. 정위 수술

  1. 정위 도구, 수술 도구 및 관련 품목을 준비하고 살균하십시오.
    알림: 수술 부위에 직접 접촉하는 모든 품목은 감염을 피하기 위해 멸균해야합니다.
  2. 마우스를 산소에서 1 % -5 % 이소 플루 란으로 플렉시 글라스 케이지에 넣어 마취하십시오.
    알림: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡 속도가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인하십시오.
  3. 마우스를 마취실에서 꺼냅니다. 애완 동물 트리머로 수술 부위 (마우스 머리)를 면도하십시오. 마우스를 정위 앞니 홀더의 앞니 막대에 마우스 앞니를 고정하여 입체 프레임에 놓습니다. 코 콘 마스크로 코를 가리십시오.
  4. 정위 수술 전반에 걸쳐 산소에서 1%-2.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 통해 마우스의 통각을 평가하고 수술 부위를 절개하기 전에 일정한 호흡 속도를 확인하십시오.
  5. 수술 중 체온을 유지하기 위해 입체 프레임의 마우스 아래에 가열 패드(37.0°C)를 놓습니다. 또는 프로그래밍된 워머와 가열 패드를 연결하는 직장 열 프로브를 사용하여 코어 온도를 유지하십시오.
  6. 접착 테이프를 사용하여 머리에 손질 된 모피를 제거하십시오. 통증을 완화하기 위해 진통제 케토 프로 펜 (5mg / kg)을 피하 주사하십시오. 안구 건조증을 피하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
  7. 뾰족한 이어바를 외이도에 삽입하여 머리를 고정합니다.
  8. 이어 바의 눈금을 조정하여 머리를 중앙에 배치하십시오.
  9. 수직 이동을 피하기 위해 앞니 홀더의 코 클램프를 조입니다. 머리를 부드럽게 눌러 머리가 고정되어 있는지 확인하고 후속 수술 중에 머리가 느슨해지지 않도록하십시오.
  10. 면봉을 사용하여 클로르헥시딘을 세 번 번갈아 가며 문질러 두피를 소독하십시오. 중앙에서 바깥쪽으로(가장 소독된 중앙 영역에서 가장 적게 소독된 영역까지) 각 스크럽을 시작합니다.
    알림: 중간에서 외부로 스크럽을 사용하면 과학자들이 모피의 감염과 오염을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 바깥 쪽 영역은 면도하지 않은 머리 영역에 가깝고 여전히 많은 양의 털이 있고 철저히 소독하기가 쉽지 않습니다.
  11. 수술용 칼날을 사용하여 전/후방 방식(<1cm)으로 두피를 절개합니다. 절개 부위를 열고 미세 해부 집게로 잡은 면봉으로 두개골을 닦으십시오.
    알림: 미세 해부 집게, 수술용 칼날 및 면봉은 수술 전에 오토클레이빙으로 멸균해야 합니다. 수술 과정 동안, 각 동물 전후 최소 5초 동안 유리 비드 멸균기(150°C)를 사용하여 모든 수술 장비를 멸균한다. 수술 과정과 동물 사이에 수술 칼날과 집게를 고정하기 위해 멸균 된 비커를 준비하십시오.
  12. 두개골에서 브레그마와 람다를 식별합니다. Bregma를 참조로 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
    1. 옵션: 정위 드릴 홀더에 정위 드릴을 장착하고 드릴 팁을 사용하여 Bregma를 참조로 지정합니다. 유리 비드 멸균기(150°C)를 사용하여 입체 드릴을 적어도 5초 동안 멸균한다.
  13. Bregma/Lambda를 기준으로 왼쪽/오른쪽 및 전방/후방 평면의 평평한 두개골 수평면을 보정하고 정렬합니다.
    참고: 올바른 수평면에 있지 않은 경우 마우스를 스테레오택시 기기에 다시 장착하십시오.

3. 상업용 맞춤형 가이드 캐뉼라 이식

  1. 정위 좌표를 기반으로 우측 측심실의 위치를 식별하고 레이블을 지정합니다: 브레그마까지의 거리, 전방/후방(A/P): 0.26mm, 내측/외측(M/L): -1.0mm, 등/복부(D/V): -2.0mm20.
    참고: 좌표는 관심 영역에 따라 수정할 수 있습니다. 측뇌실의 좌표는 체중 범위가 26-30g인 성인 C57BL/6J 마우스를 기반으로 했습니다. 어린 마우스를 사용하는 경우 토론을 참조하십시오.
  2. 상업용 가이드 캐뉼러의 이식을 위해 정위 드릴을 사용하여 라벨이 붙은 부위의 두개골을 통해 구멍 (직경 = 1.5mm)을 뚫습니다.
  3. 스테인레스 스틸 나사 장착을위한 입체 드릴을 사용하여 두개골에 2-4 개의 구멍 (직경 = 1.5mm)을 더 뚫습니다.
    알림: 각 동물 전후에 최소 150초 동안 유리 비드 살균기(5°C)를 사용하여 입체 드릴을 소독합니다.
  4. 뼈 조각을 닦고 면봉으로 출혈을 멈추십시오.
  5. 국소 마취, 소양증 및 통증 완화 효과를 위해 면봉을 사용하여 리도카인(1mg/kg)으로 두개골을 닦습니다. 드릴링 후 출혈이 멈추지 않으면 지혈을 위해 구멍에 면봉을 부드럽게 놓습니다.
  6. 구멍에 2-4 개의 스테인리스 나사를 장착하여 치과 용 아크릴 용 앵커를 제공합니다.
  7. 상업용 가이드 캐뉼러를 정위 캐뉼라 홀더에 놓고 유리 비드 멸균기 (150 ° C)로 소독합니다.
    알림: 상업용 가이드 캐뉼라, 상업용 더미 및 상업용 인젝터(그림 2A)는 재료 표에 표시된 사양으로 사용자 정의되었습니다.
  8. 정위 캐뉼러 홀더를 측심실용으로 뚫은 구멍으로 옮기고 원하는 깊이(2.5mm)가 될 때까지 상업용 가이드 캐뉼러를 구멍에 천천히 삽입합니다.
    알림: 등쪽 / 복부 좌표는 팁이 구멍에 거의 삽입되지 않은 경우 상업용 가이드 캐뉼러의 팁을 기준으로 설정하여 정의 할 수 있습니다.
  9. 10μL의 n-부틸 시아노아크릴레이트 접착제(조직 접착제)를 적용하여 드릴된 구멍에 상업용 가이드 캐뉼러를 고정하고 3-4분 동안 기다립니다. 상업용 가이드 캐뉼러를 정위 캐뉼라 홀더에서 부드럽게 풀고 홀더를 멀리 옮깁니다.
  10. 절개된 두피에 치과용 아크릴을 바르고 시판 가이드 캐뉼러를 고정하고 최소 5분 동안 기다립니다. 상업용 더미를 상업용 가이드 캐뉼라에 이식하여 혈액이나 체액에 의한 캐뉼러 막힘을 방지합니다(그림 2B).
  11. 외이도에서 이어 바를 풀고 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다.
  12. 마취에서 회복하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 새 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 계속 관찰합니다.
    알림: 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을받은 동물은 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌아 가지 않아야합니다.
  13. 마우스를 단일 하우징 또는 그룹 하우징으로 되돌립니다., 기관 IACUC 프로토콜 및 실험 설계에 따라. 그룹 주택의 경우 원치 않는 부상이나 캐뉼라의 분리를 최소화하기 위해 케이지에 더 적은 수의 생쥐가 수용되도록하십시오.
  14. 수술 후 관리를 위해 최소 3일 동안 식수에 이부프로펜(0.2mg/mL)을 투여하고 최소 3일 동안 통증과 고통의 징후가 있는지 하루에 두 번 모니터링합니다.
    1. 수술 후 관리 중에 마우스의 염증과 감염을 예방하기 위해 피부 주위에 록시스로 마이신 연고를 바르십시오.
    2. 동물의 상태를 계속 모니터링하고 충분한 에너지를 제공하기 위해 5 % 포도당 및 / 또는 0.9 % 염화나트륨을 적시에 복강 주사하십시오.
    3. 통증, 고통, 또는 감염의 상태가 꾸준히 악화되면, 마우스를CO2 흡입으로 안락사시킨다.
  15. 마우스가 SCFA의 뇌뇌실 내 전달 및 행동 테스트를 위해 준비될 때까지 수술 후 1주일 동안 기다립니다.

4. SCFA의 제조

  1. 아세트산 나트륨, 부티르산 나트륨 및 프로 피오 네이트 나트륨을 인공 뇌척수액 (ACSF)에 녹입니다 ( 재료 표 참조).
  2. 화학 물질이 완전히 용해되었는지 확인한 다음 pH를 7.4로 조정하고 멸균을 위해 0.22μm 필터를 통해 SCFA 혼합물을 여과합니다.

5. 행동 테스트 중 SCFA의 뇌실 내 전달을 위한 주입 시스템 설정

  1. 천장 카메라를 장착하여 동작을 기록합니다. 카메라를 컴퓨터에 연결하여 비디오 녹화 소프트웨어를 제어합니다(그림 3).
  2. 10μL 주사기에 증류수를 채웁니다.
    알림: 마이크로리터 주사기에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
  3. 마이크로 주입 펌프를 마이크로 주입 컨트롤러와 연결하십시오.
  4. 마이크로 주입 펌프에 마이크로 리터 주사기를 장착하십시오. 주사기를 설치하려면 버튼을 눌러 cl을 푸십시오.amp 해당 위치에 주사기를 설치하십시오. 클램프를 닫고 마이크로 주입 펌프의 플런저 고정 나사를 조입니다(그림 4A).
  5. 상업용 인젝터를 폴리에틸렌 튜브에 삽입합니다(그림 2A).
  6. 테스트 경기장 위의 천장 카메라에 폴리에틸렌 튜브를 걸어 놓습니다.
  7. 인슐린 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브를 증류수로 채 웁니다. 마이크로 리터 주사기를 매달린 폴리에틸렌 튜브에 연결하십시오.
    알림: 폴리에틸렌 튜브가 마우스가 테스트 경기장 전체에서 자유롭게 움직일 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.

6. 미세 주입 컨트롤러의 시스템 설정

  1. 미세 주입 컨트롤러를 켜고 모든 채널 표시를 눌러 명령 화면에 액세스합니다(그림 4C). 구성을 누르고 볼륨 목표를 9,800nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 마이크로리터 주사기에 연결된 폴리에틸렌 튜브에서 9,800nL의 증류수를 주입합니다(방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 RUN을 누름)(그림 4C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
  2. 구성을 누르고 볼륨 목표를 3,000nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 3,000nL의 광유를 인출합니다(방향을 눌러 인출 모드로 전환하고 RUN을 누름)(그림 4C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
    알림: 폴리에틸렌 튜브에서 명확한 오일-물 상 분리가 관찰되어야 합니다.
  3. 마이크로 리터 주사기 바늘에서 폴리에틸렌 튜브를 분해하십시오. 마이크로리터 주사기 바늘에서 3,000nL의 증류수를 뱉어냅니다( 방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 RUN을 누름).
  4. 마이크로리터 주사기를 폴리에틸렌 튜브에 다시 삽입합니다. 구성을 누르고 볼륨 목표를 9,500nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 9,500nL의 SCFA를 인출합니다(방향을 눌러 인출 모드로 전환하고 RUN을 누름). 오일-SCFA 단계에 라벨을 부착하여 SCFA가 성공적으로 주입되었는지 확인합니다.
  5. 구성을 누르고 전달 속도로 원하는 볼륨 목표를 7nL/s로 설정합니다. 방향을 눌러 주입 모드로 전환합니다(그림 4C의 명령 화면에 있는 빨간색 사각형 참조).
    알림: 주입 시간을 기준으로 볼륨을 결정하십시오. 예를 들어, 주입 시간이 7nL/s의 전달 속도에 대해 3분인 경우 목표 부피 = 1,260nL입니다.
  6. SCFA 주입을 위해 캐뉼러에 주입기를 삽입하기 전에 상업용 인젝터의 앞쪽 끝에서 액체가 나올 때까지 RUN 을 눌러 마이크로리터 주사기를 앞으로 주입합니다.

7. 자유롭게 움직이는 마우스의 상업용 가이드 캐뉼러를 통해 SCFA를 측심실에 주입

  1. 마우스를 산소에서 1 % -5 % 이소 플루 란으로 플렉시 글라스 케이지에 넣어 마취하십시오.
    알림: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡 속도가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인하십시오.
  2. 마우스를 긁고 상업용 인젝터를 상업용 가이드 캐뉼러에 삽입합니다(그림 4B).
    알림: 상업용 가이드 캐뉼러가 혈액이나 체액으로 막힌 경우 핀셋으로 부드럽게 막으십시오.
  3. 행동 테스트 전에 케이지에서 15분 동안 마우스가 마취에서 회복되도록 합니다.
  4. 기본 운동 테스트의 경우 마우스를 새로운 케이지에 넣고 35분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 처음 5분 동안 목표 부피 2,100nL에 대해 7nL/s의 전달 속도를 사용하여 SCFA를 주입합니다(주입 모드로 방향을 누르고 RUN을 누름).
    참고: 신규 케이지 내의 이동은 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어(21, 22)를 사용하여 분석될 수 있다.
  5. 마우스를 마취하고(7.1단계 반복) 상업용 가이드 캐뉼라에서 상업용 인젝터를 제거합니다.
    알림: 마우스는 이전 주사를 씻어 내기 위해 적절한 시간을 준 후 다른 대조군 / 대사 산물을 반복적으로 주사 할 수 있습니다. 캐뉼러가 마우스 머리에 고정되어있는 한, 마우스는 다른 대사 산물로 반복적으로 테스트 될 수 있습니다.

8. 미세 주입 시스템의 복원

  1. 마이크로 리터 주사기에서 폴리에틸렌 튜브를 분해하십시오.
  2. 인슐린 주사기를 사용하여 튜브에 공기를 주입하여 폴리에틸렌 튜브의 증류수를 버립니다. 마이크로리터 주사기를 비우십시오.
  3. 구성 화면에서 Reset Pos를 눌러 주사기 중지 정의 화면을 엽니다(그림 4C).
  4. 신호음이 날 때까지 Withdrawal을 눌러 미세 주입 펌프를 완전히 빼낸 위치로 재설정합니다(그림 4C).
  5. 명령 화면으로 돌아가서 이 화면에 **END REACH** 기호가 있는 경우 마이크로 주입 컨트롤러를 끕니다(그림 4C).

9. 선택 사항 : 신경 추적자에 의한 뇌실 내 주사 검증

  1. 2,100nL의 신경 추적기에 7nL/s의 전달 속도를 주입하여 주입 부위를 확인합니다.
    알림: 역류를 방지하기 위해 인젝터를 가이드 캐뉼러에 5분 동안 그대로 두십시오.
  2. 신경 추적자 주입 후 30 분 후에 이소 플루 란 (5 %)의 과다 복용으로 마우스를 마취하십시오.
  3. 마취된 마우스의 호흡률과 꼬리/발 핀치 반사를 확인합니다.
    참고: 마우스는 다음 단계 전에 응답하지 않아야 합니다.
  4. 흉곽 아래의 피부, 근육 및 복벽을 통해 4-5cm 절개를하십시오.
  5. 간을 횡격막에서 조심스럽게 약간 움직입니다.
  6. 다이어프램을 절개하여 마우스의 심장을 노출시킵니다.
  7. 인산염 완충 식염수(PBS)와 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드로 심장을 통해 마우스를 관류합니다.
  8. 마우스를 참수하고 미세 해부 집게와 미세 해부 가위로 뇌를 조심스럽게 해부하여 전체 뇌를 꺼냅니다23. 뇌 샘플을 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드에 3-4일 동안 넣고 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
  9. 마우스 뇌 슬라이스 홀더의 여덟 번째 컷(1mm/섹션)에서 마우스 뇌 슬라이스 홀더의 뇌를 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 두 부분으로 자릅니다. 뇌를 임베딩 몰드에 넣고 뇌 샘플을 저융점 아가로스(PBS에서 4%)에 삽입합니다.
  10. 아가로스에 내장된 뇌를 초강력 접착제를 사용하여 비브라톰 무대에 붙입니다. 비브라톰을 사용하여 뇌를 관상으로 50μm 뇌 조각으로 나눕니다.
  11. 차단 완충액(1:1,000 희석)에 희석된 신경 추적자를 표적으로 하는 항체의 뇌 절편을 실온에서 밤새 배양합니다.
    참고: 블로킹 버퍼에는 10% 말 혈청, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.02% 아지드화 나트륨이 포함되어 있습니다.
  12. 슬라이스를 PBST(0.1% 트리톤 X-100이 있는 PBS)로 3 x 5분 동안 세척합니다.
  13. 뇌 절편을 블로킹 완충액(1:500 희석)에 희석된 형광염료 접합 2차 항체에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션합니다.
  14. PBS로 슬라이스를 3 x 5분 동안 세척합니다.
  15. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이 포함된 장착 매체를 사용하여 뇌 조각을 슬라이드에 장착합니다.
  16. 현미경 커버 슬립으로 슬라이드를 덮으십시오.
  17. 장착 매체의 누출을 방지하기 위해 슬라이드 가장자리에 매니큐어를 바르십시오.
  18. 빛으로부터 보호되는 실온에서 밤새 배양한 후, 형광 현미경을 사용하여 주입 부위의 형광 신호를 이미지화한다.

10. 선택: 쥐에 있는 측심실에 있는 주문을 받아서 만들어진 스테인리스 가이드 캐뉼러를 통해서 대사 산물의 주입

  1. 프로토콜 섹션 1-8을 따르고 상업용 가이드 캐뉼러를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러로 교체하여 마우스의 스테인리스 스틸 주입기를 통해 화학 물질을 주입합니다.
    참고: 다양한 상업용 및 스테인리스 스틸 캐뉼러의 장단점은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
  2. 상용 가이드 캐뉼러를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러로 교체하는 것을 제외하고는 프로토콜 섹션 2 및 3에 설명된 것과 동일한 방식으로 수술 프로토콜을 수행합니다(그림 5B).
    알림: 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라, 스테인리스 스틸 더미 및 스테인리스 스틸 인젝터(그림 5A)는 재료 표에 표시된 사양으로 사용자 정의되었습니다. 맞춤형 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 원하는 깊이(2.0mm)가 될 때까지 구멍에 삽입합니다.
  3. 마이크로주입 컨트롤러와 마이크로주입 펌프(그림 4B)로 구성된 마이크로주입 시스템을 사용하여 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 통해 SCFA를 주입합니다(프로토콜 섹션 4-7과 동일). 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러의 스테인리스 스틸 더미의 경우 다른 쪽의 끝이 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라보다 1mm 더 길어질 때까지 스테인리스 스틸 인젝터의 한쪽을 부드럽게 구부립니다.
  4. 2,100nL의 신경 추적자를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 통해 마우스의 측심실에 주입합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).
  5. 신경 추적자 주입 후 30분 동안 샘플을 수집합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).
  6. 신경 추적기 주입 뇌 조각에서 이미지 획득을 수행합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).

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Representative Results

마우스를 가이드 캐뉼라 이식으로부터 회복된 지 1주일 후에 SCFA를 주입하여 신규한 케이지에서 운동 활성을 평가하였다. 마우스를 새로운 케이지에 넣고 뇌의 측면 심실에 이식 된 상업용 가이드 캐뉼라를 통해 처음 5 분 동안 2,100nL의 SCFA 또는 ACSF (7nL / s의 전달 속도)를 뇌에 주입했습니다. 새로운 케이지에서의 운동 활동은 주입 후 추가로 30 분 동안 기록되었습니다. SCFAs와 ACSF의 주입 사이의 신규한 케이지에서 운동 활성에는 차이가 관찰되지 않았다 (그림 6) (n = 그룹당 2 마우스; 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 표시되고 양방향 ANOVA로 분석됨).

뇌 영역에서 가이드 캐뉼라의 이식 정확도를 검증하기 위해 SCFA와 동일한 부피 및 전달 속도(5분에 2,100nL, 7nL/s)로 가이드 캐뉼라를 통해 마우스에 형광 신경 추적자를 주입했습니다. 뇌는 30 분 후에 조직학을 위해 수집되었습니다. 형광 염료는 마우스 뇌실의 측뇌실 및 주변 영역에서 검출되었다 (그림 7A). 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러는 동일한 조건에서 신경 추적자의 주입을 위해 뇌의 측면 뇌실에 이식되었습니다. 가이드 캐뉼라와 유사하게, 결과는 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라를 통해 주입한 후에도 마우스 뇌의 측심실과 주변 영역에서 형광 염료 신호가 검출되었음을 보여주었습니다(그림 7B).

Figure 1
그림 1 : 자유롭게 움직이는 마우스에서 뇌실 내 주입 절차. 자유롭게 움직이는 마우스에서 장 유래 미생물 대사 산물의 뇌실 내 전달을위한 순서도. 약어 : SCFA = 단쇄 지방산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 마우스에 상업용 가이드 캐뉼라의 이식. (A) 상업용 가이드 캐뉼라, 더미 및 인젝터의 대표 이미지. (b) 상업용 가이드 캐뉼라와 더미를 치과용 아크릴로 고정하여 마우스의 뇌에 이식한 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 행동 테스트를 위한 뇌실내 주입 장비. 미세 주입 시스템, 비디오 녹화 시스템 및 행동 장치의 다이어그램. 약어 : SCFA = 단쇄 지방산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 미세 주입 시스템. (A) 미세 주입 펌프를 사용한 마이크로리터 주사기의 설치. (B) 폴리에틸렌 튜브와 연결된 상업용 인젝터를 상업용 가이드 캐뉼라에 삽입 (C) 미세 주입 컨트롤러의 터치 스크린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 생쥐의 측심실에 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러의 이식. (A) 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러, 더미 및 인젝터의 대표 이미지. (b) 치과용 아크릴로 고정하여 마우스의 뇌에 이식한 스테인리스 가이드 캐뉼러와 더미의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 신규 케이지에서 SCFA가 주입된 마우스의 운동 활동 . (A) ACSF 또는 SCFA 주입시 가이드 캐뉼라 이식 및 새로운 케이지 이동의 타임 라인 개략도. (B) 주입 주사기, 주입 창 (파란색 그림자) 및 새로운 케이지 거동 테스트의 배치를위한 타임 라인 개략도. (C) 35 분 동안 새로운 케이지에서 ACSF 및 SCFA가 주입 된 마우스에 의해 이동 된 총 거리. 주입 시간은 파란색 그림자 (0-5 분)로 표시됩니다. (D) 신규한 케이지에서 ACSF 및 SCFA가 주입된 마우스에 대한 궤적의 대표 이미지. n = 그룹당 2 마리의 마우스. 데이터는 평균± s.e.m.으로 표시되고 양방향 분산 분석으로 분석됩니다. NS : 중요하지 않습니다. 약어 : SCFA = 단쇄 지방산; ACSF = 인공 뇌척수액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 뇌 주입 형광 염료의 조직학. 맞춤형 (A) 상업용 및 (B) 마우스의 측심실(LV)에 이식된 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 통한 주입. 스케일 바 = 1mm(왼쪽) 및 500μm(오른쪽). 파란색: DAPI 염색; 녹색: 형광 방지 골드 라벨링. 약어 : LV = 측심실; AC = 전방 교합; CPu = 카우다테 푸타멘; LS = 측면 중격; MS = 내측 중격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

장 유래 대사 산물은부분적으로 신체의 여러 결합 부위 6,12,24로 인해 많은 정확한 메커니즘없이 뇌 매개 질환과 관련이 있습니다. 이전 보고서에 따르면 SCFA는 G 단백질 결합 수용체, 후성 유전 조절자 및 신체의 여러 부위에서 에너지 생산 원을위한 리간드 역할을 할 수 있습니다 6,12. 말초에서 발생하는 교란 요인 (예 : 면역 세포, 호르몬 및 자율 신경계)을 우회하기 위해 자유롭게 움직이는 마우스에서 가이드 캐뉼러를 통해 뇌에 SCFA를 뇌실 내 주사하는 방법을 채택하여 개발되었습니다. 또한, 캐뉼러화 및 주입 부위는 SCFA의 영향을 받을 수 있는 뇌 영역을 탐색하기 위해 검증되었습니다. 전체적으로이 논문은 장 뇌 축 연구를 위해 장 유래 대사 산물을 뇌에 전달하는 정확하고 세심하며 검증 된 방법을 제시합니다.

가이드 캐뉼러를 통해 동물로 약물과 화학 물질을 뇌실내 전달하는 것은 다양한 약물 검사29, 질병 모델링(26,28) 및 행동 검사27의 특정 설계에 대해 잘 확립되어 있습니다.25,26,27,28,29 . 가장 중요한 것은 여러 연구에서 뇌실 내 주사를 통해 장내 미생물 대사 산물을 뇌로 전달하고 생리 기능에 미치는 영향을 테스트했다는 것입니다30,31,32,33. 이 프로토콜은 실시간으로 뇌에 급성 방식으로 장 대사 산물을 투여하는 추가 속성을 제공하여 과학자들이 장 대사 산물이 뇌와 행동에 미치는 동적 영향을 이해할 수있게합니다.

대사 산물 주입의 전달 속도는 뇌실에서 뇌척수액의 흐름을 시뮬레이션하는 데 중요합니다. 한 연구에 따르면 생쥐의 뇌척수액 생성 속도는 5.3nL/s34입니다. 자유롭게 움직이는 마우스에서 SCFA의 유속을 자연적으로 제어하기 위해이 미세 주입 시스템의 유속을 평가했습니다 (그림 3 및 그림 4). SCFA는 350cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 자유롭게 움직이는 마우스에 SCFA를 주입한 경우에도 큰 저항 없이 원활하게 주입할 수 있었습니다. 폴리에틸렌 튜브의 액체 저항을 줄이기 위해 증류수와 미네랄 오일을 채우면 (프로토콜 섹션 5 및 6 참조) 유량을 100nL / s에서 7nL / s로 낮출 수 있습니다. SCFA 또는 ACSF를 7 nL/s의 유속으로 주입해도 마우스의 비정상적인 거동이 발생하지 않았습니다.

뇌실내 주사를 위한 장 유래 대사산물의 양과 투여량은 매우 중요합니다. 다양한 뇌 영역에서 장 유래 대사 산물의 절대 수준을 종합적으로 분석하는 것은 여전히 어렵습니다. 예를 들어, 뇌에서 SCFA의 생리적 수준의 검출을 보여주는 연구는 거의 없습니다35,36. 한 연구에 따르면 생쥐의 뇌에서 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 농도는 각각 약 1640.6-3281.2μg/g, 288.18-384.24μg/g 및 44.036-66.054μg/g입니다. 그러나 또 다른 연구에서는 뇌의 SCFA 수치가 낮다고 보고했습니다(아세테이트 128.1μg/g, 프로피오네이트 0.3883μg/g 및 부티레이트 0.1640μg/g)35. 이 프로토콜에서 채택 된 주입 된 아세테이트, 프로 피오 네이트 및 부티레이트의 양은 각각 5.81385 μg / g, 4.62378 μg / g 및 2.6124 μg / g이었다. 따라서이 프로토콜에 주입 된 SCFA의 농도는 생리 학적 농도와 비슷합니다. 그러나 SCFA의 농도가 별개의 뇌 영역에서 다를 수 있다는 가능성을 배제 할 수 없었다. 여러 연구에 따르면 뇌실 내 주사 (1 분에 0.26M 프로피온산 4μL, 약 249.756μg / g)에 의한 뇌실로의 프로 피오 네이트 전달은 쥐30,31의 사회적 행동과인지 장애를 일으킨다. 주입된 프로피오네이트의 투여량 및 유속은 마우스35 및 래트37에서 보고된 바와 같이 상대적으로 높았다. 따라서 뇌와 주변부의 대사 산물 분석 및 대사체 프로파일 링의 발전은 연구자들이 장 유래 대사 산물의 공간적 및 시간적 동적 변화를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

마우스에서 뇌실내 주사를 위한 두 가지 유형의 가이드 캐뉼라가 이 프로토콜에서 제시되었습니다 - 상업용 가이드 캐뉼라 및 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라. 상업용 가이드 캐뉼러와 더미는 이식을 위해 잘 설계되었습니다. 마우스가 캡 때문에 맞춤형 더미를 제거하는 것은 쉽지 않습니다. 반대로, 스테인레스 스틸 더미는 1 주 회복 동안 마우스에 의해 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러에서 쉽게 제거 될 수있어 캐뉼러에서 혈액 / 뇌척수액 응고를 유발합니다. 그러나 상업용 맞춤형 캐뉼러는 64mg이고 이 캐뉼러의 더미는 86mg입니다. 따라서 상업용 맞춤형 캐뉼러 및 더미의 총 중량은 150mg입니다. 대조적으로, 맞춤형 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러는 18.3mg이고 이 캐뉼러의 더미는 8.5mg입니다. 따라서 맞춤형 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러의 총 중량은 26.8mg입니다. 이론적으로 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러 세트의 가벼운 무게는 캐뉼라가 동물의 움직임과 뇌에 미치는 영향을 최소화합니다. 또한 상업용 가이드 캐뉼러의 비용은 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러 및 인젝터보다 높습니다. 따라서 마우스에서 정위 수술을 수행하는 경험이없는 연구자에게 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러를 권장합니다.

이식 된 캐뉼러는 뇌 손상으로 인해 혈액과 뇌척수액에 의해 막힐 수 있습니다. 이러한 캐뉼러의 막힘은 상업용 캐뉼라 위의 스테인리스 스틸 캐뉼라에서 더 자주 발생할 수 있습니다. 더미는 상업용 캐뉼러를 단단히 조이기 위해 나사산을 꿰맬 수 있지만(그림 2A) 스테인리스 스틸 캐뉼러(그림 5A)에는 나사산을 꿰 수 없습니다. 따라서 복구 기간 동안 더미의 부착을 보장하면 캐뉼러의 막힘을 최소화 할 수 있습니다. 1 주일 복구 중에 분리가 발생하면 새 더미를 삽입해야합니다. 또한 폴리에틸렌 튜브를 연결하는 인젝터를 장착하기 전에 캐뉼러를 뚫기 위해 일회용 멸균 인젝터를 여러 번 삽입해야합니다.

마취제의 선택은 수술 및 행동 검사에 큰 영향을 미칩니다. 여기서, 흡입 마취제 이소플루란은 회복 시간이 짧고 인도적인 이유로 동물에게 덜 해롭기 때문에 주입된 마취제보다 선택되었다. 그러나, 이소플루란 흡입을 위한 투여량은 마우스의 상태 및 체중에 따라 달라질 수 있다. 따라서 전체 수술 과정에서 마취 상태를 면밀히 관찰해야하며 이소 플루 란 기화기는 그에 따라 조정되어야합니다. 최적화 된 호흡 속도는 모든 절차 중에 초당 1 회 호흡해야합니다. 또한 활성탄으로 채워진 가스 필터 캐니스터는 마취실과 노즈 콘 마스크에 연결하여 작동 영역의 이소 플루 란 및 배기 가스 오염을 제거해야합니다. 이것은 외과 의사를 이소 플루 란의 독성 효과로부터 보호합니다.

대표적인 결과는 SCFA 주입이 새로운 케이지의 운동에 극적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이 결과를 얻기 위해 적은 수의 동물이 사용되었기 때문일 수 있습니다(그림 6). 또한 새로운 케이지 운동 행동 테스트의 처음 5분 동안만 SCFA를 주입했지만 대부분의 동작이 짧은 시간(5-15분) 내에 테스트되었기 때문에 전체 테스트는 주입하지 않았습니다. 장 유래 미생물 대사 산물의 시간 창은 연구자의 가설에 따라 조정되어야합니다.

마취 및 마취 후 의식 회복 시간은 행동 테스트에 중요합니다. 여기서, 마우스는 인젝터 이식 및 SCFAs 주입을 위해 짧게 마취되었고, 15분 후에 행동 테스트를 수행하였다. 흡입 마취 중단 후 회복하는 시간은 이전 연구38에 기초하여 결정되었다. 파일럿 연구는 마우스가 활동적이고 자유롭게 움직이며 마취 후 15 분 동안 불편하지 않은지 확인했습니다. 인젝터 장착을 위한 마취단계를 도입한 이유는 다음과 같습니다. 첫째, 인젝터 게이지는 33G입니다. 동물이 활발하게 움직일 때 캐뉼라에 섬세한 인젝터를 삽입하는 것은 매우 어렵습니다. 또한, 의식이 있는 마우스의 긁힘은 마우스(39)에 스트레스를 유발하여 행동 결과를 혼란스럽게 할 수 있다. 둘째, 캐뉼러는 때때로 혈액/뇌척수액의 응고로 인해 막힙니다. 인젝터를 장착하기 전에 캐뉼라를 부드럽게 막는 것이 대사 산물 주입에 이상적입니다. 이 두 가지 이유로 인젝터를 장착하기 위해 마우스를 간단히 마취시키는 것이 좋습니다. 조사관은 흡입 마취에서 동물의 회복에 대한 우려가있는 경우 더 오래 기다릴 수 있습니다 (30 분). 또한 폴리에틸렌 튜브를 연결하는 별도의 주입 주입기 세트를 설정하여 실험을 가속화 할 수 있습니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 가이드 캐뉼라와 연결 폴리에틸렌 튜브의 이식은 광유전학 및 섬유 측광을 위한 광섬유를 뇌의 동일한 좌표, 주변 영역 또는 심지어 동일한 반구에 이식하는 수술 영역을 제한합니다. 이식 된 가이드 캐뉼라와 함께 마우스 머리에 미세 내시경 용 렌즈를 이식하는 것은 훨씬 더 어려울 것입니다. 둘째, 가이드 캐뉼러의 이식은 마우스 머리에 상당한 무게를 발생시킬 수 있습니다. 맞춤형 캐뉼라 세트의 총 중량은 26.8-150mg, 나사는 ~48mg, 장착된 치과용 아크릴은 450-500mg입니다. 전체 설치 세트는 마우스의 움직임을 제한 할 수 있습니다. 그러나 최근 연구에서는 자유롭게 움직이는 마우스40,41에서 칼슘 신호를 모니터링하기위한 미니 스코프를 이식했습니다. 미니 스코프의 무게는 나사와 치과 용 아크릴을 제외하고 1.6g에서 4.5g입니다. 따라서, 가이드 캐뉼러의 무게는 마우스 행동 테스트에 대해 상대적으로 허용가능한 것으로 간주될 수 있다. 셋째, 주입을위한 연결 폴리에틸렌 튜브의 길이는 ~ 350cm이며, 이는 행동 테스트 중에 마우스의 움직임을 제한 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 마우스 모터 기능에 대한 연결 폴리에틸렌 튜브의 영향을 평가하기 위해 개방 필드 테스트에서 운동에 대한 사전 테스트가 필요할 수 있습니다. 넷째, 치과 용 아크릴은 마우스에 신경 독성 효과를 일으킬 수 있습니다. 그러나 테스트 기간 동안 가이드 캐뉼러를 마우스 헤드에 부착해야합니다. 마우스에 대한 치과 용 아크릴의 잠재적 인 신경 독성 효과를 줄이려면 작업자가 치과 용 아크릴의 사용법에 익숙해야합니다. 치과 용 아크릴은 치과 용 아크릴 혼합물 (분말 및 액체)이 약간 응고되어 치과 용 아크릴 액체가 뇌로 침투하는 것을 줄일 때 더 잘 적용됩니다.

미생물총과 그 대사 산물은 뚜렷한 발달 이정표에서 행동 기능과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 체중이 26g에서 30g 사이인 성인 C57BL/6 마우스를 기반으로 하지만 연령과 크기가 다른 마우스에도 적용할 수 있습니다. 이전 연구에서는 어린 마우스42,43,44,45에서 정위 수술을 채택했습니다. 그러나 뇌 영역의 좌표는 마우스의 크기와 나이에 따라 다를 수 있습니다. 연령에 해당하는 지도책 또는 온라인 리소스(http://mouse.brain-map.org/static/atlas)를 참조하는 것이 좋습니다. 또한, 트리판 블루 또는 형광 염료를 어린 컬 마우스에 주입하여 좌표를 검증해야 하므로 실험 마우스에서 실행하기 전에 방법을 최적화해야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 가이드 캐뉼러는 모두 사용자 정의되며 다양한 크기의 마우스에 대한 좌표를 검증한 후 조정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 많은 수정없이 장치 위에 열린 경기장을 사용하여 대부분의 설치류 행동 테스트와 호환됩니다. 설치류 행동 테스트는 오픈 필드 테스트, 상승 된 플러스 / 제로 미로, 스텝 다운 테스트, 직접적인 사회적 상호 작용, 성인 초음파 발성, 강제 수영 테스트, 테일 서스펜션, 물 미로, T 또는 Y 미로, 새로운 물체 인식, 대리석 매장, 자체 손질 테스트, 빔 교차, 극 테스트 및 물 회피 스트레스 노출. 밀폐 된 챔버 또는 튜브를 사용하는 테스트는 3 챔버 사회 테스트, 밝은 어두운 상자, 공포 조건화, 자당 선호도, 구속 스트레스, 놀람 테스트 및 전 펄스 펄스 억제와 같이 폴리에틸렌 튜브가 마우스와 함께 자유롭게 움직일 수 있도록 수정해야합니다. 테스트하기 전에 컬 마우스의 폴리에틸렌 튜브에 필요한 길이를 사전 테스트하고 추정하는 것이 좋습니다.

장내 미생물 대사 산물은 숙주 행동 8,46,47,48,49에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 과학자들은이 방법을 채택하여 장내 미생물 유래 대사 산물이 뇌와 생쥐의 행동에 미치는 시간적 및 공간적 영향을 직접 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, 미생물 대사 산물 4- 에틸 페닐 설페이트 (4EPS)는 ASD의 전임상 마우스 모델과 ASD46,48,49를 가진 사람에서 증가되었다. 4EPS의 주입 및 4EPS를 생성하는 박테리아의 집락화는 마우스46,48에서 시상 (PVT)의 뇌실 핵에서 불안과 유사한 행동을 증가시키고 희소 돌기 아교 세포 성숙을 손상시켰다. 불안과 같은 행동 테스트 동안 마우스의 PVT에 대한 4EPS의 직접적인 영향을 평가하는 것은 흥미로울 것입니다. 그러나 PVT에서 4EPS의 절대 농도는 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 용량-반응 테스트는 PVT에서 4EPS의 적절한 수준을 결정하는 데 중요 할 수 있습니다. 다른 미생물 대사 산물이 뇌와 행동에 미치는 영향에 대해서도 유사한 개념을 채택 할 수 있습니다.

광유전학, 화학유전학 및 생체 내 칼슘 이미징과 같은 회로 기반 신경 기술은 과학자들이 행동50,51,52의 제어에서 신경 회로를 이해할 수 있도록 하는 중요한 방법입니다. 장-뇌 축은 장내 미생물과 그 대사 산물이 숙주 행동을 매개하는 데 중요한 복잡한 연결입니다. 점점 더 많은 연구에서 장과 뇌 사이의 흥미로운 혼선을 이해하기 위해 회로 기반 신경 기술을 사용했습니다 33,53,54,55,56,57,58,59. 이 프로토콜은 장 대사 산물로 인한 행동의 뇌 영역 기반 제어를 이해하는 대체 방법을 제공합니다. 이 프로토콜을 회로 기반 신경 기술과 결합하면 연구자들은 장 대사 산물에 의해 기여하는 행동 및 뇌 활동의 회로 기반 제어에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

결론적으로, 장-뇌 축의 개념은 과학계에서 잘 받아 들여지고 있으며 신경 정신 장애에서 장 유래 대사 산물의 관여 가능성을 촉진합니다 11,13,60,61,62,63,64,65 . 장 유래 대사 산물이 생쥐의 뇌와 행동에 어떻게 그리고 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해서는 현장에서 포괄적이고 생리 학적 기반 방법론이 필요합니다. 이 기사는 장 유래 대사 산물을 뇌에 직접, 가장 중요한 것은 자유롭게 움직이는 마우스로 전달하는 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 디자인은 장 유래 대사 산물을 다양한 뇌 영역으로 전달함으로써 영역 특이 적 효과를 조사하기 위해 추가로 적용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는이 작업과 관련하여 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 동물을 돌보는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU)의 실험실 동물 센터 직원을 인정합니다. 이 작업은 CHENG-HSING 의료 재단의 Kun-Yen Huang 교수 교육 기금에서 C.-WL에 대한 장학금으로 지원되었습니다. 대만 과학 기술부 (MOST)의 기금 : (학부 연구 MOST 109-2813-C-006-095-B) TO T.-H.Y.; (대부분 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)에서 W.-L.W.로; 그리고 고등 교육 새싹 프로젝트, 교육부에서 NCKU에서 W.-L.W까지의 대학 진흥 본부에

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

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References

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신경 과학 184 호
자유롭게 움직이는 마우스에서 장 유래 미생물 대사 산물의 뇌실 내 전달
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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