Summary
Evnen til permanent at markere stamceller og deres afkom med en fluorofor ved hjælp af en inducerbar transgen afstamningssporingsmuslinje giver mulighed for rumlig og tidsmæssig analyse af aktivering, proliferation, migration og / eller differentiering in vivo. Afstamning kan afsløre nye oplysninger om afstamningsforpligtelse, reaktion på intervention (er) og multipotency.
Abstract
En telomerase reverse transkriptase (Tert) afstamningssporingsmuslinje blev udviklet for at undersøge voksne vævsstamcellers adfærd og skæbne ved at krydse 'Tet-On' -systemet oTet-Cre-musen med en ny omvendt tetracyclintransaktivator (rtTA) transgen forbundet med Tert-promotoren, som vi har demonstreret markerer en ny population af voksne hjernestamceller. Her vil administration af tetracyklinderivatet doxycyclin til mTert-rtTA::oTet-Cre mus uudsletteligt markere en population af celler, der udtrykker et 4,4 kb fragment af promotorområdet af genet Tert. Når rosa-mTmG-reporteren kombineres, vil mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-mus udtrykke membran tdTomato (mTomato), indtil doxycyclinbehandling inducerer udskiftning af mTomato-ekspression med membran EGFP (mGFP) i celler, der også udtrykker Tert. Derfor, når disse triple-transgene afstamningssporingsmus modtager doxycyclin ("puls" -perioden, hvor TERT-ekspressive celler er markeret), vil disse celler blive uudsletteligt markerede mGFP + -celler, som kan spores i enhver ønskelig tid efter fjernelse af doxycyclin ("jagtperioden"), selvom Tert-ekspression efterfølgende går tabt. Hjerner er derefter perfusionsfikseret og behandlet til immunfluorescens og andre downstream-applikationer for at fortolke ændringer i stamcelleaktivering, proliferation, afstamningsforpligtelse, migration til forskellige hjernenicher og differentiering til modne celletyper. Ved hjælp af dette system kan enhver rtTA-mus parres med oTet-Cre og en Rosa-reporter til at udføre doxycyclin-inducerbare "pulsjagt" afstamningssporingseksperimenter ved hjælp af markører af stamceller.
Introduction
Værdien af en muselinje til sporing af afstamning
Analyse af stamceller in vivo kan være vanskelig, da mange assays, der undersøger sådanne celler, kun fokuserer på at karakterisere disse celler på dyrets dødstidspunkt, hvilket repræsenterer et terminalt øjebliksbillede i tiden. For bedre at forstå processerne for spredning, differentiering og migration af stamfader, mellemliggende / overgangscelletyper og modne celler over tid kræves en langsgående analysemetode. Dette kan opnås med afstamningssporingsundersøgelser, hvor stamceller/stamceller markeres uudsletteligt og kan følges i længere tid efter1.
I den voksne pattedyrshjerne blev neurogeneseprocessen, hvorved voksne fødte neuroner skabes af stamceller og stamceller, først analyseret via etiketretention med thymidin-H3 2,3,4 eller 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU)5,6,7,8 . I disse undersøgelser blev proliferative celler markeret med thyminanalogen, som blev inkorporeret i cellernes DNA under replikation og celledeling / proliferation. Den markerede celle såvel som deres afkom indeholdt derfor denne analog, som derefter blev identificeret post mortem. Men mens thymidin-H3 og BrdU tillod mærkning af proliferative celler og deres afkom i hjerneområder, hvor stamceller var dårligt forstået, blev disse undersøgelser forhindret af ulemperne ved disse værktøjer. Thymidin-H3 inducerer cellecyklusstop, apoptose og dosisafhængig DNA-syntesehæmning9, mens BrdU markerer celler på forskellige niveauer afhængigt af indgivelsesvejen10 og optages af celler under reparation eller apoptose såvel som under celledeling11. Mere effektive mærkningsmetoder er blevet anvendt for nylig, såsom mærkning med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU), men mange af de samme problemer som BrdU forbliver stadig12. Disse tilgange er også begrænsende, idet de markerer enhver proliferativ celle, ikke kun stamceller, og dermed kan fortolkning af resultater forveksles. I den neurogene afstamning bevarer alle stamceller og stamceller mitotisk kapacitet, og kun terminale / modne neuroner er ikke proliferative. For astrocytter og microglia, men ikke oligodendrocytter, opretholdes proliferation på ubestemt tid 13,14,15.
Transgene mus, der bruges til at afstamning spore kun celler, der udtrykker et protein af interesse, såsom en bekræftet til at identificere voksne stamceller, som vi bruger her, er derfor blevet mere almindelige, når man undersøger stamceller og deres afkom. Selvom det er vanskeligt at generere gennem musetransgene tilgange, giver afstamningssporingsmuslinjer mulighed for sporing af specifikt markerede celler i hjernen og er ikke afhængige af spredning alene. I Tet-On transgene musesystem inducerer administration af tetracyclin eller doxycyclin (et tetracyclinderivat) Cre-recombinaseekspression i celler, der er konstrueret med en omvendt tetracyclintransaktivator (rtTA), som transskriberes af en promotor af interesse. Den Tet-inducerbare Cre-drevne rekombination vil derefter aktivere ekspressionen af et uudsletteligt fluorescerende eller selvlysende protein i cellerne af interesse, afhængigt af den anvendte Rosa-reporter-mus. Disse uudsletteligt markerede celler fortsætter med at udtrykke denne reporter efter opdeling, differentiering eller migration, hvilket muliggør sporing af disse celler og deres afkom over tid eller efter forskellige interventioner16. Fordele ved transgene afstamningsmetoder inkluderer: 1) specificitet af sporing til en bestemt celleslægt eller stamfader / stamcelle markeret med rtTA, 2) uudslettelig ekspression af det fluorescerende eller selvlysende protein på trods af celleomsætning eller differentiering, 3) lav toksicitet, 4) betinget aktivering under ethvert punkt i dyrets livscyklus og 5) brugervenlighed med almindelige assays, herunder immunstaining/immunfluorescens16.
Andre metoder til tidsmæssigt inducerbare reporterværktøjer i mus inkluderer brugen af Cre-ERT2-mus, som kan parres med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andre fluorescerende reportertransgener. I disse dyr driver et cellespecifikt reguleringselement, såsom en promotor eller forstærkerregion af interesse, produktionen af Cre-rekombinase, som kun kan aktiveres via administration af tamoxifen. Mens Cre-ERT2 muselinjer giver mulighed for induktion af Cre i specifikke cellelinjer, er der et væld af viden, der beskriver virkningerne af tamoxifen på voksen neurogenese17,18. Derudover findes der mange ROSA-drevne fluorescerende reportergener, der kan bruges i stedet for GFP eller mTmG, herunder YFP eller CFP, hvilket ville give mulighed for alternativ fluorescerende mærkning i andre fluorescerende bølgelængder. Disse fluorescerende reportergener kan bruges med Tet-On- eller Cre-ERT2-systemer.
Telomerase revers transkriptase (TERT) er den hastighedsbegrænsende komponent i holoenzym telomerase, som arbejder for at udvide telomerer, efter at de er forkortet under celledeling19,20. TERT er blevet identificeret som en markør for voksne vævsstamceller i tarmen21,22, knoglemarv21, lever23, fedt24, endometrium25,26 og knogle1. Hvorvidt TERT-ekspression i disse voksne stamceller udelukkende er til telomeraseforlængende aktivitet eller til at udføre ikke-kanoniske TERT-roller27, vides stadig ikke. TERT-ekspressive hvilende voksne stamceller (qASC'er) er blevet identificeret og sporet i hele kroppen med transgene afstamningssporingsmus for at studere disse stamcellers multipotens og selvfornyelsesevne samt deres potentiale til at aktivere, proliferere, differentiere og migrere 1,22,23,28. Oprettelsen af Tert-rtTA-transgenet er blevet udført tidligere1. I dette papir vil vi beskrive brugen af en afstamningssporing AF TERT-muselinje til at studere TERT + qASC'er, som vi har identificeret som en ny ASC-population i den voksne musehjerne.
Generering af en transgen afstamningssporingsmuslinje
For at generere en afstamningssporingsmuslinje ved hjælp af Tet-On-systemet skal tre transgener kombineres inden for et enkelt dyr gennem museparring. Den første er en rtTA, udtrykt under kontrol af promotoren af genet af interesse (vores er TERT-rtTA). I en celle, der udtrykker dette gen af interesse, vil rtTA derfor blive udtrykt. Det andet er et oTet-Cre-gen, som indeholder et tetracyclinresponselement (TRE), der muliggør transkription af Cre-rekombinase i nærværelse af både et rtTA-fusionstransskript og tetracyclin eller doxycyclin. Tetracyclin eller doxycyclin kan administreres til et dyr via drikkevand eller chow29. Endelig skal der være et gen, der aktiveres af Cre rekombinase spaltning. I dette manuskript er mærkningsgenet, vi vil beskrive, Rosa26-mTmG-genet, som indtil Cre-rekombination allestedsnærværende transskriberer mTomato (membranrød fluorescens i alle celler). Men hvis en celle udtrykker rtTA-transkriptet og indeholder tetracyclin eller doxycyclin, vil Cre-rekombination af et sæt lox P-steder mellem mTomato- og mGFP-stederne ændre R26-stedet og få cellen til at producere membran EGFP (mGFP eller membrangrøn fluorescens) i stedet for membrantomat. Den uudslettelige karakter af dette mGFP-signal giver mulighed for in vivo-mærkning og sporing af celler, når de spredes, migrerer og differentierer. Efter sporet kan celler analyseres for ekspression af GFP via immunfluorescens i standard kryosektioner eller tykkere optisk ryddede hjerner.
I dette papir vil vi beskrive brugen af den specifikke muselinje, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. For at skabe denne tredobbelte transgene muselinje parrede vi først oTet-Cre-dyr (Jackson Lab-stammen #006234) med Rosa-mTmG-dyr (Jackson Lab-stammen #007676) for at skabe oTet-Cre::Rosa-mTmG dobbelt transgene mus. Disse dyr blev genotypet med primere og PCR-skabeloner angivet i supplerende tabel 1 og 2. mTert-rtTA mus (skabt af David Breault1) blev parret med oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr for at skabe mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus (figur 1A)1,30. Virkningsmekanismen for mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muselinjen er illustreret i figur 1B.
Doxycyclin induktion og puls-chase design
Ved planlægning af forsøg er det vigtigt at overveje flere faktorer, der vil påvirke resultatet af afstamningssporingsforsøg, herunder dyrets alder ved doxycyclin induktion, længden af doxycyclinadministration ("puls" -perioden), længden af tiden efter doxycyclinfjernelse før vævsindsamling ("jagt" -perioden) og tidspunktet for eventuelle interventioner under disse processer. Disse overvejelser om undersøgelsesdesign er afgørende for at forstå de mærkede celler og deres afkom ved afslutningen af eksperimentet. Det første skridt i processen er at identificere dyrets alder og længden af doxycyclinadministrationen. Længere pulsperioder vil gøre det muligt at udtrykke potentialet for flere celler til at udtrykke den rtTA-bundne promotor og flere celler af interesse at blive uudsletteligt markeret. En celletype, der udviser forbigående ekspression af genet af interesse, kan kræve en længere pulsperiode end celler, der kontinuerligt udtrykker genet af interesse. Men hvis målet med undersøgelsen er at forstå kortsigtede virkninger af cellen af interesse eller en akut intervention, kan pulsperioden ikke være for lang, da når en celle er markeret, vil den blive sporet gennem et hvilket som helst antal ændringer i resten af pulsperioden. I nogle af vores undersøgelser blev en 2-dages puls uden jagtperiode brugt til nærmere at efterligne en direkte reporter for TERT. Dette skyldes, at den mindste tid til rekombination af Rosa-mTmG-genet er 2 dage31.
Den næste væsentlige periode i et pulsjagtforsøg er længden mellem fjernelse af doxycyclin og perfusion af dyret, også kendt som 'jagten'. Halveringstiden for doxycyclin hos mus er ca. 170 minutter uanset administrationsvej, hvilket giver mulighed for at konkludere, at doxycyclininduktion sandsynligvis ikke længere forekommer flere timer efter fjernelse32. Det er dog vigtigt at bemærke, at doxycyclinmetabolismen er langsommere hos ældre mus, hvilket kan føre til længere effektive 'pulsperioder' end unge dyr33.
I jagtperioden vil mærkede celler fortsat blive mærket, selv efter spredning, differentiering eller migration. Afkommet af disse celler vil også blive mærket. Målet med undersøgelsen vil forme længden af pulsjagtparadigmet. Hvis målet med undersøgelsen er at forstå regenerering af et væv over en lang periode med cellerne af interesse, kan en lang jagtperiode være påkrævet. Endelig skal tidspunktet for eventuelle interventioner eller behandlinger besluttes. Administration i pulsperioden vil påvirke cellerne, der udtrykker genet af interesse, samt ethvert afkom, der er skabt i løbet af denne tid, mens administration i jagtperioden hovedsagelig kan påvirke afkom af de interesserede celler, selvom dette afhænger af, hvor hurtigt de mærkede celler deler sig eller differentierer. Eksempler på pulsjagt eksperimentelle designs, vi har brugt, er skitseret i figur 2A.
Det er også vigtigt at være opmærksom på muligheden for baggrunds GFP-signal på grund af utæt udtryk. Utæt ekspression forekommer som et resultat af iboende bindingspotentiale mellem rtTA- og Otet-sekvenserne i fravær af doxycyclin og restaktivitet af Otet-transgenet i fravær af rtTA (gennemgået i34). Utæt udtryk repræsenterer en svaghed ved Tet-systemerne, og selvom lækagen ofte er en acceptabel ulempe ved systemet, kan situationer, hvor det utætte udtryk kan føre til toksicitet og dødelighed, såsom med diptheriatoksin (DTA) i Otet-DTA-dyr, begrænse brugen af disse systemer35.
Hjernebehandling, sektionering og immunfluorescens af tynde sektioner til mikroskopi
For at analysere hjernen hos mus efter et afstamningssporingsforsøg skal mus først perfunderes via transkardieperfusion for at fjerne blod og CSF, der kan føre til høj autofluorescens i hjernen. Der er to almindeligt anvendte fikseringsmidler, som dyret kan perfunderes med: Histochoice Tissue Fixative, et glyoxal fixativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoxalfikseringsmidler giver mulighed for en relativt skånsom fikseringsproces med mindre tværbinding end PFA. Dette reducerer vævsstivhed, reducerer behovet for antigenudtagning og giver mulighed for mindre koncentrerede antistofopløsninger under immunstaining. Men hvis de indeholder methanol, kan dette tjene til at øge autofluorescens36. På den anden side vil PFA ofte give mulighed for en mere robust fiksering, og mens antigenudtagning vil være påkrævet under immunstaining, er der antistoffer, der kun fungerer med PFA-fikseret væv, og perfusion med 4% PFA er påkrævet for den optiske clearingteknik, der er beskrevet senere.
Følgende perfusion er et postfikseringstrin, hvor hjerner nedsænkes i den samme type fikseringsmiddel, der anvendes under perfusion natten over. Dette gør det muligt for hjerneområder, der måske ikke er blevet fuldt fikseret under perfusionen, at fortsætte med at rette sig. Dernæst vil hjerner blive inkuberet i saccharose i fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne så meget vand som muligt før frysetrinnet for at forhindre isdannelse i vævet ("kryobevarelse"). Hjerner kan derefter skæres i et vilkårligt antal sagittale, koronale eller tværgående vævsafsnit til behandling. For både præcision og reproducerbarhed skal kalibrerede hjerneblokke anvendes på en måde, der sikrer ensartede bregmaskæringer mellem dyr. Den vigtigste faktor, der kan påvirke, hvordan hjerner er opdelt, er hjerneområdet (e) af interesse. For eksempel, mens et sagittalt snit kan give mulighed for at analysere flere hjerneområder i en vævssektion, vil dette snit ikke tillade analyse af neuro / gliogene regioner i den ventrikulære subventrikulære zone (V-SVZ), da de laterale og mediale sider af den laterale ventrikel vil være umulige at skelne i den dimension og observeres bedre i koronalplanet. Dette kan være en vigtig sondring at foretage i undersøgelser af voksen neurogenese, da den laterale side af lateral ventrikel indeholder den neurogene V-SVZ, mens den mediale væg i den laterale ventrikel er en mere gliogen niche37.
Efter at væv er blevet opdelt i koronale, sagittale eller tværgående sektioner, vil de blive frosset i blokke ved hjælp af optimal køletemperatur (OCT) indlejringsopløsning. Her fryses hjerner i dette indlejringsmateriale ved hjælp af en blanding af tøris og ethanol. Hvis der kræves analyse af tynd sektion, skæres blokke på en kryostat, og afhængigt af den krævede downstream-analyse kan de klæbes til positivt ladede glasglas som tynde sektioner (<20 μm). Glasglas, der ikke er opladet, kan også bruges, men brugen af ikke-opladede dias kan resultere i, at væv bliver løsnet fra diasene38. Hvis der kræves fritsvævende vævssektioner med medium tykkelse (>20 μm), opsamles væv som fritsvævende sektioner. Hvis der kræves tykke sektioner (0,5-4 mm), kræves udskæring af ikke-frosne hjernesektioner med en vibratom. Det er vigtigt at bemærke opbevaringsforskellene mellem sektioner på dias, som kræver frysning ved -20 til -80 ° C og fritsvævende sektioner, som vil blive opbevaret ved 4 ° C.
Hjernerensning og hel mount immunofluorescerende konfokal mikroskopi
Hvis der ønskes en bredere, men mindre detaljeret analyse af de afstamningssporede celler i musehjernen, er en omfattende analyse af tykkere segmenter af hjernevæv mulig med iDISCO-hjernerensning39 efterfulgt af immunostaining og flisebelagt z-stack konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi. Her vil store dele af musehjernen blive optisk renset (en delipideringsproces39), hvilket bedre giver mulighed for fluorescerende signalbilleddannelse på tværs af en 1 mm vævssektion. Ulemperne ved denne proces er høj autofluorescens og en nedsat evne til at opnå billeder i høj opløsning af cellemorfologi og detaljeret co-farvningsanalyse på grund af de øgede arbejdsafstande, der kræves sammenlignet med mere traditionelle metoder (tynde kryosektioner eller fritsvævende sektioner). Af denne grund anbefaler vi hjernerensning for at analysere de store afstamningsresultater gennem flere hjerneområder i stedet for at forsøge at karakterisere eller analysere individuelle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University.
1. Oprettelse af en afstamning, der sporer Tet-On muselinje, avlsstrategier og genotypning for eksperimentelle kohortemus
BEMÆRK: Her skitserer vi oprettelsen af et Tet-On-musesystem med Rosa-mTmG som det fluorescerende reportergen, der gennemgår Cre-rekombination, men forskellige andre Cre-rekombinationsdrevne reporterlinjer kan også bruges med Tet-On-systemet.
- Opsæt et parringsbur af en oTet-Cre (+/-) han med en eller flere R26 (mTmG) (+/+) hunner. Se figur 1 for en oversigt over opsætningen af eksperimentel parring af mus.
- Resulterende hvalpe (F1) vil være oTet-Cre (+/-) eller oTet-Cre (-/-) og R26 (mTmG) (+/-). Udfør genotypning i henhold til primerne i supplerende tabel 1 og protokoller i supplerende tabel 2.
- Ved fravænning skal du udføre kimlinjetest ved at tage et øreslag fra hver fravænning. Undersøg øreslaget under et epifluorescerende mikroskop i GFP / FITC-spektret for at afgøre, om dyret havde gennemgået kimlinjerekombination under udvikling. I så fald vil dyret udtrykke GFP i hver celle, og øreslaget vil fluorescere med mGFP-signal. Disse dyr kan ikke bruges til parringer eller forsøg.
BEMÆRK: Øreklip fra mus, der ikke er kimlinje, viser kun endogen fluorescens under mikroskopet (figur 1C), mens kimlinjedyr viser et lyst GFP-signal (figur 1D). Kontrolører kan være fra mus, der ikke indeholder fluorescerende transgener. Som en note har ørehår høj endogen fluorescens og må ikke bruges som en afgørende faktor (figur 1C). Derudover observeres forskelle i endogen fluorescens mellem mus med hvid vs. sort pelsfarve, og kontroller fra mus med samme pelsfarve som mus, der testes, skal anvendes i denne analyse. - Makker en oTet-Cre(+/-) x R26 (mTmG) (+/-) med en eller flere oTet-Cre-hunmus (-/-) x R26 (mTmG).
- Den resulterende generation (F2) vil være 1/4 R26 (mTmG) (+/+) og 1/2 Cre (+/-). Kryds disse dyr med mTert-rtTA (+/+) dyr ved at parre et oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) med et eller flere mTert-rtTA (+/+) dyr.
BEMÆRK: Vi brugte mTert-rtTA (+/+) dyr, men denne proces kan udføres med enhver rtTA muselinje30. - For forsøgsdyr skal der oprettes avl for at generere mTert-rtTA (+/+) eller (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) eller (+/-).
2. Doxycyclin induktion af Cre og puls-chase design
- Når dyrene har den korrekte alder, før undersøgelsen kan påbegyndes, erstattes deres drikkevand med doxvand: drikkevand indeholdende 5% saccharose og 2 mg/ml doxycyclinhyclat. Brug cre-negative dyr, der modtager den samme doxycyclin pulsjagt som forsøgsdyr som en kontrolgruppe for de resulterende fluorescerende ekspressionsmønstre.
- Efter tilberedning opbevares doxvand ved 4 °C i op til 1 måned. Se tabel 1 for yderligere oplysninger. Dox-vand kan indgives til dyr i drikkeflasker i op til 5 dage, før det skiftes ud, da svampevækst kan forekomme, hvis dox-vand udelades ved stuetemperatur i længere tid.
BEMÆRK: En doxycyclinpuls på mindst 2 dage er påkrævet for induktion af mGFP-signal ved brug af mTmG-transgenet (indledende mTmG-papir).
BEMÆRK: Vi har ikke testet andre doxycyclinkoncentrationer end 2 mg/ml. Tidligere litteratur har vist, at denne koncentration har de højeste virkninger, når den administreres gennem drikkevand29. Mængden af leveret doxycyclin kan variere afhængigt af mængden af drikke udført af hvert dyr. Doxycyclin injektion eller sonde kan også gøres for at være konsistent mellem dyr40.
- Efter tilberedning opbevares doxvand ved 4 °C i op til 1 måned. Se tabel 1 for yderligere oplysninger. Dox-vand kan indgives til dyr i drikkeflasker i op til 5 dage, før det skiftes ud, da svampevækst kan forekomme, hvis dox-vand udelades ved stuetemperatur i længere tid.
- Når pulsperioden er afsluttet, skal du fjerne doxvand fra burene og erstatte med normalt drikkevand. Dyrene vil nu være i 'jagtperioden' indtil døden.
3. Transkardie perfusion og hjernedissektion
- Fjern en mus fra buret og begræns dyret ved hjælp af venstre tommelfinger og pegefinger. Dyret injiceres via intraperitoneal (i.p.) injektion med en opløsning af 100 mg/ml ketamin og 20 mg/ml xylazin i 0,9 % steril saltvand ved en slutkoncentration på 200 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin. Se tabel 1 for yderligere oplysninger.
FORSIGTIG: Protokollerne for anæstesi kan variere afhængigt af landet. Derudover er der virkninger af anæstetika på hjernen, herunder ændringer i mikroglial morfologi og handling og kortikosteronniveauer, der skal forstås, når der udføres perfusioner med henblik på hjerneindsamling og analyse41,42. - Efter ca. 1-2 min vil dyret miste sin oprykkende refleks. For at teste dette skal du blot rulle dyret på ryggen, og hvis det ikke kan rulle tilbage på fødderne, har det mistet den rettende refleks.
- Efter ca. 5-10 minutter mister dyret sin pedalrefleks. For at kontrollere pedalrefleksen skal du bruge tommelfingeren og pegefingeren til at klemme hver af dyrets fødder. Hvis der ikke er noget svar, i form af et spring eller muskelspasmer, skal du bruge neglene på tommelfingeren og pegefingeren til at klemme hver af dyrets fødder. Hvis der ikke er noget svar, har dyret mistet pedalrefleksen.
BEMÆRK: Hvis dyret reagerer på pedalrefleksen i mere end 15 minutter efter injektionen, kan en yderligere injektion på 1/2 af den indledende ketamin/xylazininjektion være påkrævet. Alder, køn, genotype, fænotype og behandling kan påvirke dyrets respons på denne lægemiddelcocktail. - Når højre- og pedalreflekserne er gået tabt, skal du teste den okulære refleks ved let at kontakte museøjeæblet med en behandsket finger. Manglende respons indikerer, at den okulære refleks er gået tabt.
- Fastgør musen i en liggende stilling med poter fastgjort til en pinnable arbejdsflade.
- Lav et snit gennem huden med kirurgisk saks langs thorax midterlinjen ca. 1-2 cm under xiphoidprocessen. Skær overlegen indtil ved xiphoid-processen.
- Tag fat i brusk i xiphoidprocessen med tang. Indsæt saks og skær gennem muskulaturen og brystkassen diagonalt langs musens højre side til niveauet af kravebenene.
- Hæv thoraxmuskulaturen med tang og skær gennem membranen, indtil hjertet kan visualiseres. Lav derefter et identisk diagonalt snit langs musens venstre side, og sørg for at forhindre kontakt med hjertet. Brug en hæmostat til at holde thoraxmuskulaturen væk fra hulrummet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt vil musen ikke være i stand til at trække vejret længere, så arbejd hurtigt for at forhindre død inden de næste trin.
- Hæv thoraxmuskulaturen med tang og skær gennem membranen, indtil hjertet kan visualiseres. Lav derefter et identisk diagonalt snit langs musens venstre side, og sørg for at forhindre kontakt med hjertet. Brug en hæmostat til at holde thoraxmuskulaturen væk fra hulrummet.
- Fastgør det bankende hjerte med stump tang og indsæt en dispenseringsnål i venstre ventrikel gennem bunden af aortabuen.
- Klem nålebasen til venstre ventrikel lige over indsættelsesstedet.
- Lav et snit i højre atrium, og ved det første tegn på blodgennemstrømning begynder du at perfusere dyret med 20 ml 1x PBS ved 8,11 ml / minut.
- Når 1x PBS har perfunderet kroppen, skal du skifte til det passende fikseringsmiddel til downstream-applikationen og gennemstå musen med 20 ml fikseringsmiddel.
- Til frossen sektionering og immunostaining skal du gennemskue dyret med det glyoxale fikseringsmiddel til hjernerensning, gennemskue dyret med 4% PFA i 1x PBS (pH 7,4).
BEMÆRK: Tegn på en vellykket perfusion omfatter dyrestivhed (let stivhed med glyoxal, intens stivhed med PFA) og mangel på synlige blodkar i hele vævene.
- Til frossen sektionering og immunostaining skal du gennemskue dyret med det glyoxale fikseringsmiddel til hjernerensning, gennemskue dyret med 4% PFA i 1x PBS (pH 7,4).
- Halshug musen og fjern hjernen ved at indsætte en saks i hjernestammen og skære langs squamosal suturen igennem til frontomaxillær suturen på hver side. Skær derefter over fontonasal suturen for at fjerne kraniet, og pas på ikke at beskadige den olfaktoriske pære. Derfra skal du vende kraniet på hovedet og bruge buede tang til at fjerne hjernen og sørge for at skære synsnerven over.
- Anbring den perfunderede hjerne i en vævspatron, og nedsænk det fikseringsmiddel, der bruges til at gennemse dyret natten over ved 4 °C.
4. Hjernebehandling, udskæring og immunstaining
- Hjernebehandling og udskæring
- Hjernepatroner fjernes fra det glyoxale fikseringsmiddel, og der inkuberes i 15 % saccharose i 1x PBS i 2 dage ved 4 °C, eller indtil hjernen synker.
- Fjern hjernepatroner fra 15% saccharose og inkuberes i 30% saccharose i 1x PBS i 2 dage ved 4 ° C eller indtil hjernen synker.
BEMÆRK: Se tabel 1 for yderligere oplysninger. - Fjern hjerner fra 30% saccharose i 1x PBS og adskil hjernen i forskellige 'blokke' ved hjælp af en koronal hjerneblok eller sagittal hjerneblok.
- Integrer koronale eller sagittale hjerneafsnit i OCT-forbindelse ved at placere hjerneafsnit på en blanding af tøris og ethanol (EtOH). Når OCT er blevet hvid og blevet fast, fjernes den fra tøris-EtOH-blandingen og opbevares indpakket i parafilm i en lufttæt pose ved -20 °C.
- Frosne blokke fjernes fra fryseren, og de anbringes i en kryostat med en indre temperatur på -20 °C. Brug OCT til at fastgøre blokken til en metalpatron, så vævet er solidt fastgjort. Lad ~ 5 min for vævet at fryse til chuck. Skær vævet ved 7 μm, og læg hver vævsskive på et ladet glasglas.
- Lad dias bage natten over ved 37 °C, og anbring derefter ved -20 °C, indtil de anvendes til immunstaining.
- Immunstaining
- Varm glider til stuetemperatur (RT) og efterfikseres med iskold acetone i 15 min.
- Vaskeglas i 5 minutter i 1x skyllebuffer (f.eks. IHC Select TBS Rinse Buffer), der rystes ved 60 o / min ved RT mellem hvert trin.
- Permeabiliser til farvning af nukleare antigener med 0,3% Triton X-100 i 10 minutter ved RT. Permeabiliser til farvning af cytoplasmatiske antigener med 0,3% Tween-20 i 10 min ved RT.
- Udfør antigenhentning ved mikrobølgeovn i 50-100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution på lav i 10 minutter, to gange. Skyl derefter med skyllebuffer i 5 min ved RT.
- Inkuber dias i 0,3% Typogen Black i 70% EtOH i 20 min ved RT og vask derefter med skyllebuffer.
- Tegn en hydrofob barriere omkring hvert væv uden at lade væv tørre. Bloker derefter i 20 minutter ved 37 °C med 1 dråbe Millipore Blocking Reagens pr. væv. Derefter tilsættes 100 μL primært antistof fortyndet i antistoffortyndingsmiddel til hvert væv og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Den næste dag inkuberes sektioner i Alexa Fluor sekundære antistoffer i 10 minutter ved RT. Vask derefter glider i skyllebuffer.
- Dæk hjernesektioner i 100 μL 1:500 anti-GFP-antistof konjugeret til AlexaFluor 488 for at øge det endogene GFP-signalmærkning af sporede celler og inkubere natten over ved 4 °C.
- Den næste dag vaskes med skyllebuffer 2x, og vaskes derefter i rindende DI-vand i 5 min.
BEMÆRK: Sørg for forsigtigt at vaske med DI-vand, og sørg for at undgå rindende vand på selve dias, der kan fjerne hjernesektioner fra dias. - Modtain med 100 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 min. Vask derefter i rindende DI-vand i 5 min.
- Tilsæt en dråbe monteringsmedium oven på hver vævssektion og forsegl med en 22 mm x 22 mm dækslip. Billeddannelse anbefales på monteringsdagen for at sikre optimalt signal.
5. iDISCO hjernerensning (tilpasset fra39)
- Fiksering og sektionering
- Post-fix hjerner i 4% PFA natten over ved 4 ° C og derefter igen i 1 time ved RT.
- Vask hjerner i 1x PBS i en time, to gange, på RT. Skær derefter i 1 mm tykke sektioner ved hjælp af den nødvendige hjerneblok og læg i 5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1x PBS.
- Methanol forbehandling (med methanol)
BEMÆRK: På grund af muligheden for, at methanol påvirker immunostaining af visse proteiner, vil forfatterne gerne henvise læseren til Renier et al. 2014 for en protokol til et methanolfrit iDISCO-protokolalternativ39. Se tabel 1 for mere information om følgende løsninger i dette afsnit.- Vask med 1x PBS i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- I 50% methanol (i PBS) vaskes i 1 time (omrystning) ved RT.
- I 80% methanol vaskes i 1 time (omrystning) ved RT.
- Vask i 100% methanol i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- Blegeprøver med 5% hydrogenperoxid (H2O2) i 20% dimethylsulfoxid (DMSO)/methanol (1 volumen 30% H2O 2/1 volumen DMSO/4 volumen methanol, iskoldt) ved 4 °C natten over (omrystning).
- Efter blegning vaskes prøverne i methanol i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- I 20% DMSO/methanol vaskes i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- I 80% methanol vaskes i 1 time (omrystning) ved RT.
- I 50% methanol vaskes i 1 time (omrystning) ved RT.
- Pbs vaskes i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- I PBS/0,2% Triton X-100 vaskes i 1 time to gange (omrystning) ved RT.
- Immunostaining af clearing hjerner
- Inkuber prøver i 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glycin ved 37 °C natten over på en orbitalryster.
- Blok i 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% gedeserum ved 37 °C i 3 dage på en orbital shaker.
- Prøverne vaskes i 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/ml heparinnatriumsalt fra svineslimhinden i 1 time to gange ved 37 °C, og der inkuberes derefter i 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/ml heparin/5 % DMSO/3 % gedeserum indeholdende 1:500 koncentration af kaninanti-GFP AlexaFluor 488 ved 37 °C på en orbitalryster i 2 dage.
- Prøverne vaskes i 1x PBS/0,2 % Tween-20 med 10 μg/ml heparin i 1 time ved 37 °C på orbitalryster tre gange og derefter en gang dagligt i 2 dage.
- Der inkuberes prøver natten over i 10 ml 50% v/v Tetrahydrofuran (THF)/H2O i et 15 ml konisk rør.
- Der inkuberes prøver i 1 time i 10 ml 80% THF/H2O.
- Inkuber prøver to gange i 1 time i 100% THF.
- Tør prøver med en steril klud og inkuberes i dichlormethan, indtil de synker til bunden af hætteglasset (ca. 40 min). Inkuber ikke >60 min.
BEMÆRK: Sørg for at håndtere dichlormethan under en røghætte. - Prøverne inkuberes i 18 ml dibenzylether (DBE), indtil de er klare (>2 timer).
- Gem prøver i DBE på RT, indtil de er klar til afbildning.
BEMÆRK: For de bedste resultater er det vigtigt at afbilde prøver så hurtigt som muligt, efter at rydningen er afsluttet.
6. Billeddannelse af farvede dias eller ryddede hjerner
- For at afbilde immunsplettede hjernesektioner skal du analysere dias via konfokal mikroskopi, hvor co-ekspression af flere antistoffer kan bekræftes. Vi bruger et Leica Stellaris 5 mikroskop med HyD S hybriddetektorer, men ethvert punktscanningskonfokalt mikroskop fungerer. Målene omfatter HC PL APO 10x/0,40 CS2, HC PL APO 40x/1,30 OIL CS2 og HC PL APO 63x/1,40.
- Konfigurer de korrekte laserlinjer og emissionsfiltre. De krævede lasere og tilsvarende laserintensiteter er underlagt mikroskop- og fluoroforkombinationerne, der anvendes.
BEMÆRK: Vi bruger en kombination af diode 405 nm og hvide lyslasere til at finjustere excitations- og emissionsspektre for hver fluorofor eller grupper af fluorophorer, der bruges til at reducere og eliminere krydstale. Lignende resultater kan også opnås ved hjælp af traditionelle laser/ filterkombinationer, men vær meget opmærksom på kanalblødning. Gennemblødning kan identificeres ved at tænde en enkelt laserlinje i forbindelse med hver af de ønskede emissionsfilterkombinationer for at se, hvilke kanaler der påvirkes af hver specifik laser. For eksempel, hvis dioden 405 nm laser producerer synlig fluorescens i GFP-emissionsfilteret, forekommer der blødning. Sørg for, at flere kanaler afbildes sekventielt ramme for ramme for i høj grad at reducere enhver blødning fra at forekomme. - For co-farvede Tet-On-hjerner med en mTmG-reporter skal du vælge DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) og den tilsvarende langt røde fluorofor for at matche fluoroforen, der anvendes på det sekundære antistof. Vi anbefaler Alexa Fluor 647 (ex. 651 nm, em. 667 nm).
- Opret indstillinger først med en Cre-kontrol hjerne farvet med både GFP og den fluorescerende sekundære. Disse hjerneskiver vil kontrollere for baggrundsfluorescens fra de fluorescerende antistoffer og vil ikke vise noget reelt GFP-signal.
- Analyser hvert hjerneafsnit fra top til bund, fra venstre mod højre, for at kontrollere, at intet signal er blevet savnet i analysen. Hvis billeddannelse af den samme hjernesektion ved forskellige forstørrelser anbefales det, at de lavere forstørrelser anvendes først, da den højere forstørrelse hurtigere vil blegge mTomato-signalet.
- Konfigurer de korrekte laserlinjer og emissionsfiltre. De krævede lasere og tilsvarende laserintensiteter er underlagt mikroskop- og fluoroforkombinationerne, der anvendes.
- For at afbilde ryddede hjerner skal du bruge et omvendt konfokalt mikroskop med et automatiseret trin og automatiseret flisefunktion. Vi bruger Leica Stellaris 5 mikroskopet. Fordi prøverne er så tykke (>500 μm), kræves der større arbejdsafstande, hvilket begrænser den forstørrelse, der effektivt kan opnås. Vi bruger HC PL APO 10x/0.40 CS2-målet til al ryddet hjernebilleddannelse.
- Start med at lægge en ryddet hjernesektion fladt mod en glasbundsskål og nedsænke i dibenzylether.
BEMÆRK: Dibenzylether er ætsende for de fleste objektive linser og de fleste plastmaterialer. Af denne grund skal enhver indvendig plast i glasbundsskålen overtrækkes med hurtigtørrende silikoneelastomer. - Konfigurer de korrekte laserlinjer og emissionsfiltre. For co-farvede Tet-On-hjerner med en mTmG-reporter skal du vælge DAPI, GFP, tdTomato og den tilsvarende langt røde fluorofor for at matche fluoroforen, der anvendes på det sekundære antistof. Indstil den ønskede opløsning, vi anbefaler mindst 1024 x 1024. Sæt pinhole til 1 AU.
- Etabler laserintensiteten og detektorforøgelsen først med en Cre-control hjerne farvet med både GFP og den fluorescerende sekundære. Disse hjerneskiver vil kontrollere for baggrundsfluorescens fra de fluorescerende antistoffer og vil ikke vise noget reelt GFP-signal.
- Når laserintensiteter og detektorforstærkning er optimeret, skal du kortlægge hjernen til billeddannelse. Start med at lokalisere hele omkredsen af hjernesektionen for at indstille X- og Y-aksen for billedoptagelsen. Identificer derefter Z-aksen ved at indstille fokuspunktet til omtrent vævets centerdybde, og brug Z-positioneringskontroller til at lokalisere vævets "højeste" punkt (mest positive Z-værdi). Scan forskellige områder af vævet, hvilket øger den maksimale Z-aksehøjde efter behov.
- Gentag for det "laveste" (mest negative Z-værdi) punkt, der kræves for at opnå hele vævets tykkelse. Stellaris 5 har en grænse på ± 250 um af fokuspunktet. Dette begrænser optiske sektioner til 500 μm tykke i Z-aksen. 3D-området i hjernesektionen er nu kendt.
- Indstil Z-trinstørrelsen til 6 μm, og begynd at erhverve billedet. Anskaffelsestiden afhænger af flere faktorer og kan variere fra timer til dage afhængigt af de ønskede parametre. For at reducere billedoptagelsestiden kan du prøve at reducere opløsninger, øge laserscanningshastigheden eller øge trinstørrelsen.
- Når det flisebelagte billede af hele den ryddede hjernesektion er taget, skal du analysere efter ønske.
- Start med at lægge en ryddet hjernesektion fladt mod en glasbundsskål og nedsænke i dibenzylether.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens det fluorescerende signal, der er resultatet af et Tet-On-system med en fluorescerende reporter, vil variere afhængigt af den pågældende promotor og den eller de anvendte fluoroforer, vil vi beskrive, hvordan resultaterne blev analyseret med mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dyr. Analyse af voksne hjerner efter en pulsjagt resulterede i membran GFP-ekspressive celler gennem forskellige anatomiske nicher. Forskellen i fluorescerende intensitet mellem forskellige celletyper skal bemærkes. En variabel med hensyn til fluorescerende intensitet er størrelsen af cellemembranen. For eksempel har choroid epitelceller (CPEC'er) i choroid plexus en tyk cellemembran og stærkt fluorescerende signal, der let kunne skelnes fra de omgivende celler (figur 4A, B). Imidlertid havde andre mindre og i øjeblikket uidentificerede celletyper i choroid plexus stroma et svagere GFP-signal (figur 4C). I lillehjernen udtrykte Bergmann-gliaceller højere niveauer af mGFP end kurvceller, og variation i mGFP-ekspression eksisterede endda mellem individuelle kurvceller (figur 4D). Olfaktoriske sensoriske neuronaksoner i det glomerulære lag af den olfaktoriske pære udtrykte også høje niveauer af mGFP (figur 4A, E). For at sikre, at alle mGFP+-celler identificeres, er det derfor vigtigt at identificere både lyse og svage GFP+-celler i hele hjernen hos mTmG-dyr. I mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr observerede vi lav baggrund mGFP ekspression på tværs af hjerneområder inklusive hjernebarken (figur 4A). Interessant nok viste lillehjernen og hjernestammen lavere baggrund mGFP-udtryk på denne måde (figur 4A).
Under analyse af hjernevæv efter et afstamningsspor vil der være forskelle i mGFP- og mTomato-ekspressionsmønstre på tværs af både hjerneområder og celletyper. Olfaktoriske sensoriske neuron axoner, der fylder det glomerulære lag af den olfaktoriske pære, udtrykte høje niveauer af membrantomat sammenlignet med de fleste andre hjerneområder, selv når de samme neuroner er mGFP +, hvilket indikerer, at nogle celler syntes at miste mTomato-signalet langsommere (figur 4D). I modsætning hertil udtrykte mGFP+ celler i choroid plexus lavt mTomato (figur 4B,C). I de fleste andre hjerneområder fordeles tomatsignalet jævnt mellem celletyper, hvor endotelceller er nogle af de eneste celler, hvis fluorescerende signal var lyst nok til at skille sig ud fra den røde fluorescerende baggrund (figur 4B). Aktiveringen af mGFP-ekspression og spaltning af mTomato fra genomet under rekombination resulterer i et tab af mTomato-ekspression, men mTomato-fluoroforer, der udtrykkes på membranen, bevares, indtil de nedbrydes. Af denne grund vil mGFP + celler ofte udtrykke variabelt mTomato-signal, hvilket afhænger af rekombinationens aktualitet, celletypen og størrelsen af cellemembranen. Derfor er det vigtigt at analysere celler baseret på ekspressionen af mGFP og ikke udelukke dem fra analyse, hvis de udtrykker både mGFP og mTomato.
Alternative journalister kan også bruges i forbindelse med Tet-On-systemet. Cre-rekombination kan virke til at inducere ekspression af GFP eller RFP i celler, der normalt ikke udtrykker noget fluorescerende mærke i Rosa-GFP- eller Rosa-RFP-dyr. Her vil analyse af GFP eller RFP indikere udtryk for promotorens interesse, og intet fluoroforsignal vil blive fjernet, såsom med mTmG-dyr. Enkeltfluororeportere giver mulighed for immunstaining med mere fluorescerende antistofkombinationer, da membrantomaten i mTmG-dyr forhindrer farvning i den røde bølgelængde.
Figur 1. Generering af en Tet-On muselinje. (A) Oversigt over avlsplanen for oprettelse af mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus fra individuelle muselinjer. (B) Skematisk over Tet-On-systemet i mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muselinjen. (C-D) Repræsentative billeder af øreklip afbildet med FITC-kanal af et epifluorescerende mikroskop fra ikke-kimlinje (C) og kimlinje (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Eksperimentelle designs med afstamning af Tet-On mus. Illustrationer af eksperimenter mulige med Tet-On mus fra basal proliferation, migration og differentiering (1) til behandlinger under doxpuls uden jagt på regenerering eller re-ækvilibrering (2), interventioner under puls med mulighed for at visualisere langsigtede virkninger (3). En kort puls på 2 dage uden efterfølgende jagt vil give indsigt i en næsten basal tilstand af TERT + celler, da disse celler vil have lidt tid til at aktivere, proliferere, migrere eller differentiere (4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Hjernerensning af mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG musehjerner. (A) Sagittal sektionering af 1 mm hjerneafsnit efter fiksering. (B) Individuelle hjernesektioner placeres i 5 ml rør til iDISCO hjernerensning39. (C) Ryddede hjerner placeres i glasbundsfade og nedsænkes i DBE for brydningsindeksmatchning under billedoptagelse. (D) Fang hele hjernens område som en række Z-stakke, der vil blive flisebelagt sammen for at danne et omfattende 3D-billede af hjernen. Dette kan derefter være Z-maksimal intensitet projiceret for at oprette et 2D-billede fra 3D-datasættet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Afstamning af voksne mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG musehjerner efter en 3 ugers puls og 11 dages jagt på doxycyclin. (A) Ryddet hjernesektion af voksen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus med specifikke områder af mGFP-signal vist med indsatser (N = 3 hanmus). (B-C) Repræsentativt billede af mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG choroid plexus, der identificerer mGFP+ CPEC'er (B) og mindre, svagere mGFP+-celletyper (C; N = 4 mænd, N = 6 kvinder). (D) Repræsentativt billede af mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG cerebellar Bergmann glia (lyse) og kurvceller i det molekylære lag af lillehjernen (dim; N = 4 mænd, N = 6 kvinder). (E) Repræsentativt billede af det olfaktoriske glomerulære lag af mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hjerner. Stiplede linjer angiver glomerulære rum (N = 4 mænd, N = 6 kvinder). Vægtstænger er 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode til oprettelse, udnyttelse og analyse af en tredobbelt transgen afstamning, der sporer muselinjemærkning af stamceller i den voksne musehjerne in vivo, er beskrevet. Når det kombineres med immunostaining eller hjernerensning, kan identifikation og karakterisering af sporede fluorescerende celler på tværs af hjernen opnås. Denne teknik giver mulighed for at forstå plast / regenerativ / remodelingspotentialet for mærkede stamceller, når de aktiverer, migrerer, differentierer eller formerer sig. Mens tidligere data opnået via etiketretention med thymidin-H3 og BrdU konkluderede, at V-SVZ, olfaktorisk pære og subgranulær zone af dentatgyrus var de eneste neurogene hjerneområder hos voksne pattedyr 2,3,4,5,6,7,8,43, forstås det nu, at voksen neurogenese også forekommer i cortex 44, hypothalamus45,46 og striatum 47,48,49 samt potentielt andre nye nicher, der ikke er blevet godt undersøgt. Voksen gliogenese, den proces, hvormed gliale forløberceller skaber nyfødte astrocytter og oligodendrocytter, forekommer også i hele hjernen37, og glia og neuroner antages at stamme fra den samme multipotente stamcelle. Af disse grunde har afstamningssporingsundersøgelser været integreret i forståelsen af rollen for forskellige stamcelletyper, der bidrager til at genopfylde og regenerere neuroner og glia i den voksne pattedyrshjerne (gennemgået i50).
For undersøgelser i voksen hjerne plasticitet er den optimale alder 12 uger, når murinhjernen har afsluttet udviklingen51. Når man planlægger længden af doxycyclinpulsen og den efterfølgende jagt, er en forståelse af processen af interesse afgørende, så pulsjagtens timing er lang nok til at tillade, at de interessante processer kan forekomme. For eksempel er oprettelsen af nyfødte neuroner i den olfaktoriske pære fra voksne neurale stamceller (ANSC'er) i V-SVZ ca. 4 uger, som bestemt af tidligere slægtssporingsundersøgelser52. En pulsjagtundersøgelse, der vil mærke ANSC'erne i V-SVZ, skal derfor være inden for denne tidsramme for at give MULIGHED for, at ANSC'erne i V-SVZ kan opdeles, for at disse ANSC'er kan differentiere sig til mellemliggende celletyper, og for at disse mellemliggende celletyper migrerer til den olfaktoriske pære og differentierer sig til voksnefødte neuroner. Jagtens længde bestemmer den tid, som mærkede celler og deres afkom skal fortsætte deres migration og differentiering, selvom disse processer også vil forekomme under pulsen. Samlet set er det vigtigt at forstå de involverede processer, da tidslinjen for hvert slægtssporingseksperiment skal give mulighed for, at de korrekte processer kan forekomme.
Mens dette manuskript beskriver Tet-On-systemet, findes der andre slægtssporingstransgener, der kan bruges. CreERT2-transgenet muliggør ekspression af en Cre-rekombinase, der kun er aktiv i nærværelse af tamoxifen eller 4-OHT, et tamoxifenderivat. Når denne Cre er reguleret af en promotor af interesse, vil 4-OHT eller tamoxifen administration kun producere Cre rekombination i celler, der udtrykker denne promotor. Når det er parret med et reportergen som Rosa-LSL-GFP eller Rosa-mTmG, vil Cre-lox-rekombination uudsletteligt markere de celler, der udtrykker Cre under administration af tamoxifen. En ulempe ved dette system er brugen af tamoxifen, som har langvarige bivirkninger på neurogenese i både prænatal og voksen hjerne17. Af denne grund skal slægtssporingsundersøgelser med CreERT2-linjer overveje de involverede forbehold.
Afstamningssporingsundersøgelser i den voksne hjerne udføres ofte med markører af stamceller såsom Nestin eller markører for gliaprecursorceller, herunder NG253,54. Mens resulterende data indikerer omsætningen og differentieringen af disse celler i nyfødte modne celletyper, kan ekspressionen af disse markører af forskellige andre celletyper i den voksne hjerne være forvirrende. For eksempel udtrykkes Nestin, et mellemliggende filamentprotein involveret i mitose55, også af modne neuroner56 og meningealcelletyper57. Andre stamcellemarkører omfatter gliaflimren surt protein (GFAP)58,59 og glutamat aspartattransportør 1 (GLAST)60, som udtrykkes af astrocytter i hele den voksne hjerne såvel61. Af denne grund er der behov for afstamningsundersøgelser med yderligere markører. Efterhånden som vi lærer mere om den brede virkning af voksen plasticitet i hjernen, er karakteriseringen og analysen af de celler, der spiller en rolle i disse processer og deres afkom, fortsat meget vigtig for vores forståelse af neurogene og gliogene veje involveret i neurodegenerativ sundhed og mere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) og Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) til vejledning ved hjælp af mTert-rtTA dyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | Agilent | S080983-2 | |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent | S2367 | |
| anti-GFP antibody | Invitrogen | A2311 | Use at 1:500-1:000 |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J | The Jackson Laboratory | JAX:006234 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX:007676 | |
| Blocking Solution (IHC) | Millipore Sigma | 20773 | |
| Blunt needle | BSTEAN | X0012SYHIV | |
| Coronal brain block | Braintree | BS-2000C | |
| Cover slip | Corning | 2850-22 | |
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D564 | |
| Dibenzyl ether | Millipore Sigma | 33630 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Doxycycline Hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | |
| Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative | Amresco | H120 | This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265) |
| Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| IHC Select TBS Rinse Buffer | Millipore Sigma | 20845 | |
| Ketamine | Westward | 0143-95095-10 | This product requires a DEA license for storage and use. |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Milipore Block | Millipore | 20773 | |
| Mounting medium | Millipore Sigma | 5013 | |
| Optimal Cutting Temperature Solution | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS Solution (10X) | Teknova | P0496 | |
| Sagittal brain block | Braintree | RBM-2000S | |
| Saline | Braun | S8004-5264 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Sudan (Typogen) Black | Millipore Sigma | 199664 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Tissue cartridge | Simport | M512 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween-20 | Millipore Sigma | 655205 | |
| Xylazine | AnaSed | sc-362950Rx |
References
- Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
- Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
- Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
- Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
- Eriksson, P. S., et al.
- Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
- Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
- Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
- Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G.
- Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
- Bradl, M., Lassmann, H.
- Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
- Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
- Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
- Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
- Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
- Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
- Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
- Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
- Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
- Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
- Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
- Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
- Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
- Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
- Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
- Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 67-73 (2010).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
- Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
- Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
- Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
- Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
- Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
- Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
- Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G.
- Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
- Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
- Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -, Lopez-Mascaraque, L. - Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
- Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
- Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
- Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
- Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
- Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
- DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).
