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Neuroscience

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Abstract

Una linea di topo di tracciamento della trascrittasi inversa della telomerasi (Tert) è stata sviluppata per studiare il comportamento e il destino delle cellule staminali dei tessuti adulti, incrociando il sistema "Tet-On" oTet-Cre mouse con un nuovo transgene transattivatore inverso della tetraciclina (rtTA) collegato al promotore Tert, che abbiamo dimostrato segna una nuova popolazione di cellule staminali cerebrali adulte. Qui, la somministrazione del derivato tetraciclina doxiciclina a topi mTert-rtTA::oTet-Cre segnerà in modo indelebile una popolazione di cellule che esprimono un frammento di 4,4 kb della regione promotore del gene Tert. Quando combinato il reporter Rosa-mTmG, i topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG esprimeranno tdTomato di membrana (mTomato) fino a quando il trattamento con doxiciclina indurrà la sostituzione dell'espressione di mTomato con EGFP di membrana (mGFP) nelle cellule che esprimono anche Tert. Pertanto, quando questi topi di tracciamento del lignaggio triplo transgenico ricevono doxiciclina (il periodo di "impulso" durante il quale vengono marcate le cellule che esprimono TERT), queste cellule diventeranno cellule mGFP+ indelebilmente marcate, che possono essere monitorate per qualsiasi periodo di tempo desiderabile dopo la rimozione della doxiciclina (il periodo di "inseguimento"), anche se l'espressione di Tert viene successivamente persa. I cervelli vengono quindi fissati per perfusione ed elaborati per l'immunofluorescenza e altre applicazioni a valle al fine di interpretare i cambiamenti nell'attivazione delle cellule staminali, nella proliferazione, nell'impegno del lignaggio, nella migrazione a varie nicchie cerebrali e nella differenziazione verso tipi di cellule mature. Utilizzando questo sistema, qualsiasi topo rtTA può essere accoppiato a oTet-Cre e un reporter Rosa per condurre esperimenti di tracciamento del lignaggio "pulse-chase" inducibili dalla doxiciclina utilizzando marcatori di cellule staminali.

Introduction

Valore di una linea del mouse che traccia la discendenza
L'analisi delle cellule staminali in vivo può essere difficile poiché molti saggi che esaminano tali cellule si concentrano solo sulla caratterizzazione di queste cellule al momento della morte dell'animale, che rappresenta un'istantanea terminale nel tempo. Per comprendere meglio i processi di proliferazione, differenziazione e migrazione di progenitori, tipi di cellule intermedie / di transizione e cellule mature nel tempo, è necessario un approccio di analisi longitudinale. Ciò può essere ottenuto con studi di tracciamento del lignaggio in cui le cellule staminali / progenitrici sono contrassegnate in modo indelebile e possono essere seguite per qualsiasi periodo di tempo dopo1.

Nel cervello dei mammiferi adulti, il processo di neurogenesi mediante il quale i neuroni nati in età adulta vengono creati da cellule staminali e progenitrici è stato prima analizzato tramite ritenzione dell'etichetta con timidina-H3 2,3,4 o 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU)5,6,7,8 . In questi studi, le cellule proliferative sono state marcate con l'analogo della timina, che è stato incorporato nel DNA delle cellule durante la replicazione e la divisione / proliferazione cellulare. La cellula marcata, così come la loro progenie, conteneva quindi questo analogo, che è stato poi identificato post-mortem. Tuttavia, mentre la timidina-H3 e BrdU hanno permesso la marcatura delle cellule proliferative e della loro progenie nelle regioni del cervello in cui le cellule staminali erano poco conosciute, questi studi sono stati ostacolati dagli aspetti negativi di questi strumenti. La timidina-H3 induce l'arresto del ciclo cellulare, l'apoptosi e l'inibizione della sintesi del DNA dose-dipendente9, mentre BrdU segna le cellule a livelli variabili a seconda della via di somministrazione10 e viene assorbita dalle cellule durante la riparazione o l'apoptosi, nonché durante la divisione cellulare11. Di recente sono stati utilizzati metodi di etichettatura più efficienti, come l'etichettatura con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), ma molti degli stessi problemi di BrdU rimangono ancora12. Questi approcci sono anche limitanti in quanto marcano qualsiasi cellula proliferativa, non solo le cellule staminali, e quindi l'interpretazione dei risultati può essere confusa. Nel lignaggio neurogeno, tutte le cellule staminali e progenitrici mantengono la capacità mitotica e solo i neuroni terminali / maturi non sono proliferativi. Per gli astrociti e le microglia, ma non per gli oligodendrociti, la proliferazione viene mantenuta indefinitamente 13,14,15.

I topi transgenici usati per lignare tracciano solo le cellule che esprimono una proteina di interesse, come quella confermata per identificare le cellule staminali adulte come usiamo qui, sono quindi diventati più comuni quando si indagano le cellule staminali e la loro progenie. Sebbene difficili da generare attraverso approcci transgenici di topo, le linee di topo che tracciano il lignaggio consentono il tracciamento di cellule specificamente marcate nel cervello e non si basano solo sulla proliferazione. Nel sistema murino transgenico Tet-On, la somministrazione di tetraciclina o doxiciclina (un derivato della tetraciclina) induce l'espressione di Cre-ricombinasi in cellule che sono state ingegnerizzate con un transattivatore di tetracicline inversa (rtTA), che viene trascritto da un promotore di interesse. La ricombinazione cre-driven inducibile da Tet attiverà quindi l'espressione di una proteina fluorescente o luminescente indelebile nelle cellule di interesse, a seconda del topo Rosa-reporter impiegato. Queste cellule marcate in modo indelebile continuano ad esprimere questo reporter dopo la divisione, la differenziazione o la migrazione, consentendo il tracciamento di queste cellule e della loro progenie nel tempo o dopo diversi interventi16. I vantaggi degli approcci transgenici di tracciamento del lignaggio includono: 1) specificità del tracciamento su un particolare lignaggio cellulare o progenitore/cellula staminale contrassegnata dall'rtTA, 2) espressione indelebile della proteina fluorescente o luminescente nonostante il turnover o la differenziazione cellulare, 3) bassa tossicità, 4) attivazione condizionata durante qualsiasi punto del ciclo di vita dell'animale e 5) facilità d'uso con saggi comuni, compresa l'immunocolorazione/immunofluorescenza16.

Altri metodi di strumenti reporter temporalmente inducibili nei topi includono l'uso di topi Cre-ERT2, che possono essere abbinati a ROSA-GFP, ROSA-mTmG o altri transgeni reporter fluorescenti. In questi animali, un elemento regolatore cellulare specifico, come una regione di interesse promotore o potenziatore, guida la produzione di Cre ricombinasi, che può essere attivata solo attraverso la somministrazione di tamoxifene. Mentre le linee di topo Cre-ERT2 consentono l'induzione di Cre in linee cellulari specifiche, esiste una ricchezza di conoscenze che dettagliano gli effetti del tamoxifene sulla neurogenesi adulta17,18. Inoltre, esistono molti geni reporter fluorescenti guidati da ROSA che possono essere utilizzati al posto di GFP o mTmG, tra cui YFP o CFP, che consentirebbero l'etichettatura fluorescente alternata in altre lunghezze d'onda fluorescenti. Questi geni reporter fluorescenti possono essere utilizzati con i sistemi Tet-On o Cre-ERT2.

La trascrittasi inversa della telomerasi (TERT) è il componente limitante della teloemerasi oloenzimatica, che lavora per estendere i telomeri dopo che sono stati accorciati durante la divisione cellulare19,20. TERT è stato identificato come un marker di cellule staminali tissutali adulte nell'intestino21,22, midollo osseo21, fegato23, adiposo24, endometrio25,26 e osso1. Non è ancora noto se l'espressione di TERT in queste cellule staminali adulte sia esclusivamente per l'attività di estensione della telomerasi o per svolgere ruoli TERT non canonici27. Le cellule staminali adulte quiescenti che esprimono TERT (qASC) sono state identificate e tracciate in tutto il corpo con topi che tracciano il lignaggio transgenico per studiare la multipotenza e la capacità di auto-rinnovamento di queste cellule staminali, nonché il loro potenziale di attivare, proliferare, differenziare e migrare 1,22,23,28. La creazione del transgene Tert-rtTA è stata eseguita in precedenza1. In questo articolo, descriveremo l'uso di una linea di topo TERT che traccia il lignaggio per studiare TERT + qASC che abbiamo identificato come una nuova popolazione ASC nel cervello del topo adulto.

Generazione di una linea di topo che traccia il lignaggio transgenico
Per generare una linea di topo che traccia il lignaggio utilizzando il sistema Tet-On, tre transgeni devono essere combinati all'interno di un singolo animale attraverso l'accoppiamento del topo. Il primo è un rtTA, espresso sotto il controllo del promotore del gene di interesse (il nostro è TERT-rtTA). In una cellula che esprime questo gene di interesse, verrà quindi espressa la rtTA. Il secondo è un gene oTet-Cre, che contiene un elemento di risposta tetraciclina (TRE) che consentirà la trascrizione della cre ricombinasi in presenza sia di un trascritto di fusione rtTA che di tetraciclina o doxiciclina. Tetraciclina o doxiciclina possono essere somministrati a un animale tramite acqua potabile o chow29. Infine, ci deve essere un gene che verrà attivato dalla scissione della Cre ricombinasi. In questo manoscritto, il gene di etichettatura che descriveremo è il gene Rosa26-mTmG, che fino alla ricombinazione Cre trascriverà ubiquitariamente mTomato (fluorescenza rossa di membrana in tutte le cellule). Tuttavia, se una cellula esprime il trascritto rtTA e contiene tetraciclina o doxiciclina, la ricombinazione cre di un insieme di siti lox P tra i siti mTomato e mGFP cambierà il sito R26 e farà sì che la cellula produca EGFP di membrana (mGFP, o fluorescenza verde di membrana) invece del pomodoro di membrana. La natura indelebile di questo segnale mGFP consentirà l'etichettatura e il tracciamento in vivo delle cellule mentre proliferano, migrano e si differenziano. Seguendo la traccia, le cellule possono essere analizzate per l'espressione di GFP tramite immunofluorescenza in criosezioni standard o cervelli otticamente più spessi.

In questo articolo, descriveremo l'uso della linea specifica del mouse, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Per creare questa tripla linea di topi transgenici, abbiamo prima accoppiato animali oTet-Cre (ceppo Jackson Lab #006234) con animali Rosa-mTmG (ceppo Jackson Lab #007676) per creare topi transgenici doppi oTet-Cre::Rosa-mTmG. Questi animali sono stati genotipizzati con primer e modelli PCR indicati nelle tabelle supplementari 1 e 2. I topi mTert-rtTA (creati da David Breault1) sono stati accoppiati con animali oTet-Cre::Rosa-mTmG per creare topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (Figura 1A)1,30. Il meccanismo d'azione della linea del mouse mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG è illustrato nella Figura 1B.

Induzione della doxiciclina e design dell'inseguimento degli impulsi
Quando si pianificano esperimenti, è importante considerare diversi fattori che influenzeranno l'esito degli esperimenti di tracciamento del lignaggio, tra cui l'età dell'animale all'induzione della doxiciclina, la durata della somministrazione di doxiciclina (il periodo di "impulso"), il periodo di tempo dopo la rimozione della doxiciclina prima della raccolta dei tessuti (il periodo di "inseguimento") e la tempistica di eventuali interventi durante questi processi. Queste considerazioni sul design dello studio sono essenziali per comprendere le cellule etichettate e la loro progenie alla conclusione dell'esperimento. Il primo passo nel processo è identificare l'età di interesse dell'animale e la durata della somministrazione di doxiciclina. Periodi di impulso più lunghi consentiranno di esprimere il potenziale per più cellule di esprimere il promotore legato all'rtTA e di contrassegnare in modo indelebile più cellule di interesse. Un tipo di cellula che mostra un'espressione transitoria del gene di interesse può richiedere un periodo di impulso più lungo rispetto alle cellule che esprimono continuamente il gene di interesse. Tuttavia, se l'obiettivo dello studio è comprendere gli effetti a breve termine della cellula di interesse o di un intervento acuto, il periodo di impulso non può essere troppo lungo, poiché una volta che una cellula è marcata, sarà tracciata attraverso un numero qualsiasi di cambiamenti durante il resto del periodo di impulso. In alcuni dei nostri studi, un impulso di 2 giorni senza periodo di inseguimento è stato utilizzato per imitare più da vicino un reporter diretto per TERT. Questo perché il periodo minimo di tempo per la ricombinazione del gene Rosa-mTmG è di 2 giorni31.

Il prossimo periodo essenziale in un esperimento di inseguimento a impulsi è la lunghezza tra la rimozione della doxiciclina e la perfusione dell'animale, nota anche come "inseguimento". L'emivita della doxiciclina nei topi è di circa 170 minuti indipendentemente dalla via di somministrazione, consentendo la conclusione che l'induzione della doxiciclina probabilmente non si verifica più diverse ore dopo la rimozione32. Tuttavia, è importante notare che il metabolismo della doxiciclina è più lento nei topi anziani, il che può portare a periodi di "polso" efficaci più lunghi rispetto agli animali giovani33.

Durante il periodo di inseguimento, le cellule etichettate continueranno ad essere etichettate, anche dopo la proliferazione, la differenziazione o la migrazione. Anche la progenie di queste cellule sarà etichettata. L'obiettivo dello studio modellerà la lunghezza del paradigma dell'inseguimento degli impulsi. Se l'obiettivo dello studio è comprendere la rigenerazione di un tessuto per un lungo periodo di tempo con le cellule di interesse, può essere necessario un lungo periodo di inseguimento. Infine, devono essere decisi i tempi di eventuali interventi o trattamenti. La somministrazione durante il periodo di impulso influenzerà le cellule che esprimono il gene di interesse e qualsiasi progenie creata durante questo periodo, mentre la somministrazione durante il periodo di inseguimento può influenzare principalmente la progenie delle cellule di interesse, anche se questo dipenderà dalla velocità con cui le cellule etichettate si dividono o si differenziano. Esempi di progetti sperimentali di inseguimento a impulsi che abbiamo utilizzato sono descritti nella Figura 2A.

È anche importante essere consapevoli della possibilità di segnale GFP in background a causa dell'espressione che perde. L'espressione perdente si verifica a causa del potenziale di legame intrinseco tra rtTA e le sequenze di Otet in assenza di doxiciclina e dell'attività residua del transgene Otet in assenza di rtTA (esaminato in34). L'espressione permeabile rappresenta un punto debole dei sistemi Tet e, sebbene la perdita sia spesso un aspetto negativo accettabile per il sistema, le situazioni in cui l'espressione permeabile può portare a tossicità e mortalità, come con la tossina diptheria (DTA) negli animali Otet-DTA possono limitare l'uso di questi sistemi35.

Elaborazione cerebrale, sezionamento e immunofluorescenza di sezioni sottili per microscopia
Per analizzare il cervello dei topi dopo un esperimento di tracciamento del lignaggio, i topi devono prima essere perfusi tramite perfusione transcardica per rimuovere il sangue e il liquido cerebrospinale che possono portare ad un'elevata autofluorescenza nel cervello. Ci sono due fissativi comunemente usati con cui l'animale può essere perfuso: Histochoice Tissue Fixative, un glioxal fixative (GF) o 4% paraformaldeide (PFA). I fissativi gliossiali consentono un processo di fissazione relativamente delicato con meno reticolazione rispetto al PFA. Ciò riduce la rigidità dei tessuti, riduce la necessità di recupero dell'antigene e consente soluzioni anticorpali meno concentrate durante l'immunocolorazione. Tuttavia, se contengono metanolo questo può servire ad aumentare l'autofluorescenza36. D'altra parte, il PFA spesso consente una fissazione più robusta e, mentre il recupero dell'antigene sarà richiesto durante l'immunocolorazione, ci sono anticorpi che funzioneranno solo con tessuti fissati al PFA e la perfusione con PFA al 4% è necessaria per la tecnica di compensazione ottica descritta più avanti.

La perfusione successiva è una fase post-fissazione, in cui i cervelli sono immersi nello stesso tipo di fissativo utilizzato durante la perfusione durante la notte. Ciò consente a tutte le regioni del cervello che potrebbero non essere state completamente fissate durante la perfusione di continuare a riparare. Successivamente, i cervelli saranno incubati in saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere quanta più acqua possibile prima della fase di congelamento per prevenire la formazione di ghiaccio all'interno del tessuto ("crio-conservazione"). I cervelli possono quindi essere tagliati in qualsiasi numero di sezioni di tessuto sagittale, coronale o trasversale per l'elaborazione. Sia per la precisione che per la riproducibilità, i blocchi cerebrali calibrati devono essere utilizzati in modo da garantire tagli di bregma coerenti tra gli animali. Il fattore più importante che può influenzare il modo in cui i cervelli sono sezionati è la regione del cervello di interesse. Ad esempio, mentre un taglio sagittale può consentire di analizzare più regioni del cervello in una sezione di tessuto, questo taglio non consentirà l'analisi delle regioni neuro / gliogeniche della zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) poiché i lati laterale e mediale del ventricolo laterale saranno impossibili da discernere in quella dimensione e sono meglio osservati nel piano coronale. Questa può essere una distinzione importante da fare negli studi di neurogenesi adulta, poiché il lato laterale del ventricolo laterale contiene il V-SVZ neurogenico, mentre la parete mediale del ventricolo laterale è una nicchia più gliogenica37.

Dopo che i tessuti sono stati divisi in sezioni coronali, sagittali o trasversali, saranno congelati in blocchi utilizzando la soluzione di incorporamento della temperatura di raffreddamento ottimale (OCT). Qui, i cervelli sono congelati all'interno di questo materiale incorporante, con l'uso di una miscela di ghiaccio secco ed etanolo. Se è necessaria l'analisi a sezione sottile, i blocchi verranno tagliati su un criostato e, a seconda dell'analisi a valle richiesta, possono essere aderiti a vetrini caricati positivamente come sezioni sottili (<20 μm). Possono essere utilizzati anche vetrini che non sono carichi, ma l'uso di vetrini non caricati può comportare lo sblocco dei tessuti dalle diapositive38. Se sono necessarie sezioni di tessuto fluttuanti di medio spessore (>20 μm), i tessuti saranno raccolti come sezioni fluttuanti. Se sono necessarie sezioni spesse (0,5-4 mm), è necessario affettare sezioni cerebrali non congelate con un vibratoma. È importante notare le differenze di stoccaggio tra le sezioni sulle diapositive, che richiedono il congelamento a -20--80 °C e le sezioni fluttuanti, che saranno conservate a 4 °C.

Pulizia del cervello e microscopia confocale immunofluorescente a montaggio intero
Se si desidera un'analisi più ampia, ma meno dettagliata delle cellule tracciate nel lignaggio nel cervello del topo, è possibile un'analisi completa dei segmenti più spessi del tessuto cerebrale con iDISCObrain clearing 39 seguita da immunocolorazione e microscopia confocale z-stack piastrellata o microscopia a foglio luminoso. Qui, ampie sezioni del cervello del topo saranno cancellate otticamente (un processo di delipidazione39), che consente meglio l'imaging del segnale fluorescente su una sezione di tessuto di 1 mm. Gli svantaggi di questo processo sono l'elevata autofluorescenza e una ridotta capacità di ottenere immagini ad alta risoluzione della morfologia cellulare e un'analisi dettagliata della co-colorazione a causa delle maggiori distanze di lavoro richieste rispetto ai metodi più tradizionali (criosezioni sottili o sezioni fluttuanti). Per questo motivo, raccomandiamo la pulizia del cervello per analizzare i risultati del tracciamento del lignaggio su larga scala in più aree del cervello, invece di tentare di caratterizzare o analizzare le singole cellule.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University.

1. Creazione di un lignaggio che traccia la linea di topi Tet-On, strategie di allevamento e genotipizzazione per topi di coorte sperimentali

NOTA: Qui, delineiamo la creazione di un sistema di topi Tet-On con Rosa-mTmG come gene reporter fluorescente che subisce la ricombinazione Cre, tuttavia varie altre linee reporter guidate dalla ricombinazione Cre possono essere utilizzate anche con il sistema Tet-On.

  1. Impostare una gabbia di accoppiamento di un maschio oTet-Cre (+/-) con una o più femmine R26 (mTmG) (+/+). Vedere la Figura 1 per una panoramica della configurazione sperimentale dell'accoppiamento dei topi.
  2. I cuccioli risultanti (F1) saranno oTet-Cre (+/-) o oTet-Cre (-/-) e R26 (mTmG) (+/-). Eseguire la genotipizzazione secondo i primer nella Tabella Supplementare 1 e i protocolli nella Tabella Supplementare 2.
  3. Allo svezzamento, eseguire il test della linea germinale prendendo un pugno all'orecchio da ogni svezzamento. Esaminare il pugno dell'orecchio sotto un microscopio epifluorescente nello spettro GFP / FITC per determinare se l'animale aveva subito la ricombinazione della linea germinale in fase di sviluppo. Se è così, l'animale esprimerà GFP in ogni cellula e il pugno all'orecchio fluorescerà con il segnale mGFP. Questi animali non possono essere utilizzati per accoppiamenti o esperimenti.
    NOTA: le clip auricolari di topi che non sono germinali mostrano solo fluorescenza endogena al microscopio (Figura 1C), mentre gli animali germinali mostrano un segnale GFP luminoso (Figura 1D). Le orecchie di controllo possono provenire da topi che non contengono transgeni fluorescenti. Come nota, i peli dell'orecchio hanno un'elevata fluorescenza endogena e non devono essere usati come fattore determinante (Figura 1C). Inoltre, le differenze nella fluorescenza endogena sono osservate tra topi di colore del mantello bianco e nero e in questa analisi dovranno essere utilizzati controlli da topi dello stesso colore del mantello dei topi in fase di test.
  4. Accoppiare un maschio oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) con uno o più topi oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) femmina.
  5. La generazione risultante (F2) sarà 1/4 R26 (mTmG) (+/+) e 1/2 Cre (+/-). Incrociare questi animali con animali mTert-rtTA (+/+) accoppiando un oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) con uno o più animali mTert-rtTA (+/+).
    NOTA: Abbiamo usato animali mTert-rtTA (+/+), ma questo processo può essere eseguito con qualsiasi linea di mouse rtTA30.
  6. Per gli animali da esperimento, impostare gli allevamenti per generare mTert-rtTA (+/+) o (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) o (+/-).

2. Induzione della doxiciclina di Cre e design pulse-chase

  1. Quando gli animali sono all'età corretta per l'inizio dello studio, sostituire la loro acqua potabile con acqua dox: acqua potabile contenente il 5% di saccarosio e 2 mg/ml di doxiciclina hyclate. Utilizzare animali Cre-negativi che ricevono lo stesso impulso di doxiciclina degli animali da esperimento come gruppo di controllo per i modelli di espressione fluorescente risultanti.
    1. Dopo la preparazione, conservare l'acqua dox a 4 °C per un massimo di 1 mese. Per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1 . L'acqua Dox può essere somministrata agli animali in bottiglie per un massimo di 5 giorni prima di essere sostituita, poiché la crescita fungina può verificarsi se l'acqua dox viene lasciata fuori a temperatura ambiente per periodi di tempo più lunghi.
      NOTA: è necessario un impulso doxiciclina di almeno 2 giorni per l'induzione del segnale mGFP quando si utilizza il transgene mTmG (documento mTmG iniziale).
      NOTA: Non abbiamo testato concentrazioni di doxiciclina diverse da 2 mg / mL. La letteratura precedente ha identificato che questa concentrazione ha gli effetti più elevati quando somministrata attraverso l'acqua potabile29. La quantità di doxiciclina consegnata può differire a seconda della quantità di bere fatto da ciascun animale. L'iniezione di doxiciclina o gavage può anche essere fatto per essere coerenti tra gli animali40.
  2. Al termine del periodo di impulso, rimuovere l'acqua dox dalle gabbie e sostituirla con acqua potabile normale. Gli animali saranno ora nel periodo di "inseguimento" fino alla morte.

3. Perfusione transcardica e dissezione cerebrale

  1. Rimuovi un topo dalla sua gabbia e trattieni l'animale usando il pollice sinistro e l'indice. Iniettare l'animale tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) con una soluzione di 100 mg/mL di ketamina e 20 mg/mL di xilazina in soluzione salina sterile allo 0,9% per una concentrazione finale di 200 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina. Per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1 .
    ATTENZIONE: I protocolli per l'anestesia possono differire a seconda del paese. Inoltre, ci sono effetti degli anestetici sul cervello, compresi i cambiamenti nella morfologia e nell'azione microgliale e i livelli di corticosterone che devono essere compresi quando si eseguono perfusioni ai fini della raccolta e dell'analisi del cervello41,42.
  2. Dopo circa 1-2 minuti l'animale perderà il suo riflesso di raddrizzamento. Per testare questo, basta arrotolare l'animale sulla schiena e se non può tornare in piedi, ha perso il riflesso di raddrizzamento.
  3. Dopo circa 5-10 minuti l'animale perderà il riflesso del pedale. Per controllare il riflesso del pedale, usa il pollice e l'indice per pizzicare ciascuno dei piedi dell'animale. Se non c'è risposta, sotto forma di salto o spasmo muscolare, usa le unghie del pollice e dell'indice per pizzicare ciascuno dei piedi dell'animale. Se non c'è risposta, l'animale ha perso il riflesso del pedale.
    NOTA: Se l'animale risponde al riflesso del pedale per più di 15 minuti dopo l'iniezione, può essere necessaria un'iniezione aggiuntiva di 1/2 dell'iniezione iniziale di ketamina/xilazina. Età, sesso, genotipo, fenotipo e trattamento possono influenzare la risposta dell'animale a questo cocktail di farmaci.
  4. Dopo aver perso i riflessi di raddrizzamento e pedale, testare il riflesso oculare contattando leggermente il bulbo oculare del mouse con un dito guantato. Una mancanza di risposta indica che il riflesso oculare è stato perso.
  5. Fissare il mouse in posizione supina con le zampe fissate a una superficie di lavoro pinnabile.
  6. Fare un'incisione attraverso la pelle con forbici chirurgiche lungo la linea mediana toracica a circa 1-2 cm sotto il processo xifoide. Tagliare superiore fino al processo xifoide.
  7. Afferrare la cartilagine del processo xifoide con una pinza. Inserire le forbici e tagliare la muscolatura e la gabbia toracica diagonalmente lungo il lato destro del mouse fino al livello delle clavicole.
    1. Sollevare la muscolatura toracica con una pinza e tagliare il diaframma fino a quando il cuore può essere visualizzato. Quindi effettuare un taglio diagonale identico lungo il lato sinistro del mouse, assicurandosi di evitare qualsiasi contatto con il cuore. Utilizzare un emostato per mantenere la muscolatura toracica lontano dalla cavità.
      NOTA: a questo punto, il mouse non sarà più in grado di respirare, quindi lavora rapidamente per prevenire la morte prima dei passaggi successivi.
  8. Fissare il cuore pulsante con una pinza smussata e inserire un ago di erogazione nel ventricolo sinistro attraverso la base dell'arco aortico.
  9. Bloccare la base dell'ago al ventricolo sinistro appena sopra il sito di inserimento.
  10. Fai un'incisione nell'atrio destro e, al primo segno di flusso sanguigno, inizia a perfondere l'animale con 20 ml di 1x PBS a 8,11 ml / minuto.
  11. Dopo che il PBS 1x ha perfuso il corpo, passare al fissativo appropriato per l'applicazione a valle e perfondere il mouse con 20 ml di fissativo.
    1. Per il sezionamento congelato e l'immunocolorazione, perfondere l'animale con il fissativo gliossale per la pulizia del cervello, perfondere l'animale con il 4% di PFA in 1x PBS (pH 7,4).
      NOTA: I segni di una perfusione di successo includono rigidità animale (leggera rigidità con gliossale, rigidità intensa con PFA) e mancanza di vasi sanguigni visibili in tutti i tessuti.
  12. Decapitare il topo e rimuovere il cervello inserendo le forbici nel tronco cerebrale e tagliando lungo la sutura squamosa fino alla sutura frontomascellare su ciascun lato. Quindi tagliare la sutura fontonasale per rimuovere la calotta cranica, facendo attenzione a non danneggiare il bulbo olfattivo. Da lì, capovolgi il cranio e usa una pinza curva per rimuovere il cervello, assicurandoti di recidere il nervo ottico.
  13. Posizionare il cervello perfuso in una cartuccia di tessuto e immergere nel fissativo utilizzato per perfondere l'animale durante la notte a 4 °C.

4. Trattamento del cervello, affettamento e immunocolorazione

  1. Trattamento del cervello e affettamento
    1. Rimuovere le cartucce cerebrali dal fissativo gliossale e incubare in saccarosio al 15% in 1x PBS per 2 giorni a 4 °C o fino a quando il cervello affonda.
    2. Rimuovere le cartucce cerebrali dal 15% di saccarosio e incubare in saccarosio al 30% in 1x PBS per 2 giorni a 4 °C o fino a quando il cervello affonda.
      NOTA: per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1 .
    3. Rimuovere il cervello dal 30% di saccarosio in 1x PBS e separare il cervello in vari "blocchi" usando un blocco cerebrale coronale o un blocco cerebrale sagittale.
    4. Incorporare sezioni cerebrali coronali o sagittali nel composto OCT posizionando sezioni cerebrali su una miscela di ghiaccio secco ed etanolo (EtOH). Dopo che OCT è diventato bianco e diventato solido, rimuovere dal ghiaccio secco la miscela etOH e conservare avvolta in parafilm, all'interno di un sacchetto ermetico a -20 °C.
    5. Rimuovere i blocchi congelati dal congelatore e posizionarli all'interno di un criostato con una temperatura interna impostata su -20 °C. Utilizzare lo strumento di personalizzazione di Office per fissare il blocco a un mandrino metallico in modo che il tessuto sia fissato saldamente. Lasciare ~ 5 minuti affinché il tessuto si congeli al mandrino. Affettare il tessuto a 7 μm, posizionando ogni fetta di tessuto su un vetrino carico.
    6. Lasciare cuocere i vetrini durante la notte a 37 °C, quindi posizionare a -20 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'immunocolorazione.
  2. Immunocolorazione
    1. Vetrini caldi a temperatura ambiente (RT) e post-fissaggio con acetone ghiacciato per 15 min.
    2. Lavare i vetrini per 5 minuti in 1x tampone di risciacquo (ad esempio, IHC Select TBS Rinse Buffer), agitando a 60 rpm a RT tra ogni passaggio.
    3. Permeabilizzare per la colorazione di antigeni nucleari con 0,3% Triton X-100 per 10 min a RT. Permeabilizzare per la colorazione di antigeni citoplasmatici con 0,3% Tween-20 per 10 min a RT.
    4. Eseguire il recupero dell'antigene con vetrini a microonde in 50-100 mL di 1x soluzione di recupero dell'antigene DAKO in basso per 10 minuti, due volte. Quindi risciacquare con tampone di risciacquo per 5 minuti a RT.
    5. Incubare i vetrini in 0,3% Typogen Black in 70% EtOH per 20 minuti a RT e poi lavare con tampone di risciacquo.
    6. Disegna una barriera idrofobica attorno a ciascun tessuto senza permettere ai tessuti di asciugarsi. Quindi bloccare per 20 minuti a 37 °C con 1 goccia di Millipore Blocking Reagent per tessuto. Quindi aggiungere 100 μL di anticorpo primario diluito in diluente anticorpale a ciascun tessuto e incubare durante la notte a 4 °C.
    7. Il giorno dopo, incubare sezioni in anticorpi secondari Alexa Fluor per 10 minuti a RT. Quindi lavare i vetrini nel tampone di risciacquo.
    8. Coprire le sezioni cerebrali in 100 μL di anticorpo anti-GFP 1:500 coniugato ad AlexaFluor 488 per aumentare il segnale GFP endogeno che marca le cellule tracciate e incubare durante la notte a 4 ° C.
    9. Il giorno successivo, lavare con tampone di risciacquo 2x, quindi lavare in acqua CORRENTE DI per 5 minuti.
      NOTA: Assicurarsi di lavare delicatamente con acqua DI, avendo cura di evitare qualsiasi acqua corrente sugli scivoli stessi che potrebbe rimuovere le sezioni cerebrali dalle diapositive.
    10. Controcolorazione con 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 min. Quindi lavare in acqua corrente DI per 5 minuti.
    11. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni sezione di tessuto e sigillare con un coperchio di 22 mm x 22 mm. L'imaging è consigliato il giorno del montaggio per garantire un segnale ottimale.

5. iDISCO brain clearing (adattato da39)

  1. Fissazione e sezionamento
    1. Cervello post-fix in PFA al 4% durante la notte a 4 ° C e poi di nuovo per 1 ora a RT.
    2. Lavare il cervello in 1x PBS per un'ora, due volte, a RT. Quindi tagliare in sezioni spesse 1 mm usando il blocco cerebrale necessario e posizionare in tubi microcentrifuga da 5 ml contenenti 1x PBS.
  2. Pretrattamento di metanolo (con metanolo)
    NOTA: A causa della possibilità che il metanolo influisca sull'immunocolorazione di alcune proteine, gli autori vorrebbero indirizzare il lettore a Renier et al. 2014 per un protocollo a un'alternativa al protocollo iDISCO39 senza metanolo. Vedere la Tabella 1 per ulteriori informazioni sulle soluzioni seguenti in questa sezione.
    1. Lavare con 1x PBS per 1 ora due volte (agitando) a RT.
    2. Lavare in metanolo al 50% (in PBS) per 1 ora (agitazione) a RT.
    3. Lavare in metanolo all'80% per 1 ora (agitazione) a RT.
    4. Lavare in metanolo al 100% per 1 ora due volte (agitando) a RT.
    5. Campioni di candeggina con perossido di idrogeno al 5% (H2O2) in 20% di dimetilsolfossido (DMSO)/metanolo (1 volume 30% H2O2/1 volume DMSO/4 volume metanolo, ghiacciato) a 4 °C durante la notte (agitazione).
    6. Dopo lo sbiancamento, lavare i campioni in metanolo per 1 ora due volte (agitazione) a RT.
    7. Lavare al 20% DMSO/metanolo per 1 ora due volte (agitazione) a RT.
    8. Lavare in metanolo all'80% per 1 ora (agitazione) a RT.
    9. Lavare in metanolo al 50% per 1 ora (agitazione) a RT.
    10. Lavare in PBS per 1 ora due volte (agitazione) a RT.
    11. Lavare in PBS/0,2% Triton X-100 per 1 ora due volte (agitazione) a RT.
  3. Immunocolorazione del cervello di compensazione
    1. Incubare campioni in 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glicina a 37 °C durante la notte su uno shaker orbitale.
    2. Blocco in 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% siero di capra a 37 °C per 3 giorni su uno shaker orbitale.
    3. Lavare i campioni in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/mL di sale sodico di eparina dalla mucosa suina per 1 ora due volte a 37 °C, quindi incubare in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/mL di eparina/5% DMSO/3% siero di capra contenente 1:500 concentrazione di coniglio anti-GFP AlexaFluor 488 a 37 °C su uno shaker orbitale per 2 giorni.
    4. Lavare i campioni in 1x PBS/0,2% Tween-20 con 10 μg/mL di eparina per 1 ora a 37 °C su agitatore orbitale, tre volte, e poi una volta al giorno per 2 giorni.
    5. Incubare i campioni durante la notte in 10 mL di 50% v/v Tetraidrofurano (THF)/H2O in un tubo conico da 15 mL.
    6. Incubare campioni per 1 ora in 10 mL di 80% THF/H2O.
    7. Incubare i campioni due volte per 1 ora in 100% THF.
    8. Asciugare i campioni con una salvietta sterile e incubare in diclorometano fino a quando non affondano sul fondo del flaconcino (circa 40 minuti). Non incubare >60 min.
      NOTA: Assicurarsi di maneggiare il diclorometano sotto una cappa aspirante.
    9. Incubare i campioni in 18 mL di etere dibenzile (DBE) fino a quando non è chiaro (>2 h).
    10. Memorizza i campioni in DBE su RT fino a quando non sono pronti per l'immagine.
      NOTA: per ottenere risultati ottimali, è importante visualizzare i campioni di immagini il prima possibile al termine della cancellazione.

6. Imaging di vetrini macchiati o cervelli cancellati

  1. Per visualizzare sezioni cerebrali immunocolorate, analizzare i vetrini tramite microscopia confocale, dove può essere confermata la co-espressione di più anticorpi. Utilizziamo un microscopio Leica Stellaris 5 con rivelatori ibridi HyD S, ma qualsiasi microscopio confocale a scansione puntuale funzionerà. Gli obiettivi includono HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 e HC PL APO 63x/1.40.
    1. Configurare le linee laser e i filtri di emissione corretti. I laser richiesti e le corrispondenti intensità laser sono soggetti all'utilizzo delle combinazioni di microscopio e fluoroforo.
      NOTA: Utilizziamo una combinazione di diodi 405 nm e laser a luce bianca per mettere a punto gli spettri di eccitazione ed emissione per ciascun fluoroforo, o gruppi di fluorofori, utilizzati per ridurre ed eliminare la diafonia. Risultati simili possono essere ottenuti anche utilizzando le tradizionali combinazioni laser/filtro, ma prestare molta attenzione al sanguinamento del canale. Il sanguinamento può essere identificato attivando una singola linea laser in combinazione con ciascuna delle combinazioni di filtri di emissione desiderate per vedere quali canali sono influenzati da ciascun laser specifico. Ad esempio, se il laser a diodi da 405 nm produce fluorescenza visibile nel filtro di emissione GFP, si verifica un'emorragia. Assicuratevi che più canali vengano ripresi in sequenza fotogramma per fotogramma per ridurre notevolmente il verificarsi di qualsiasi al vivo.
    2. Per i cervelli Tet-On co-colorati con un reporter mTmG, selezionare DAPI (es. 405 nm, em. 450 nm), GFP (es. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (es. 555 nm, em. 582 nm) e il corrispondente fluoroforo rosso lontano per abbinare il fluoroforo utilizzato sull'anticorpo secondario. Consigliamo Alexa Fluor 647 (es. 651 nm, em. 667 nm).
    3. Stabilisci prima le impostazioni con un cervello Cre-control macchiato sia con GFP che con il secondario fluorescente. Queste fette di cervello controlleranno la fluorescenza di fondo dagli anticorpi fluorescenti e non mostreranno alcun segnale GFP reale.
    4. Analizza ogni sezione del cervello dall'alto verso il basso, da sinistra a destra, per verificare che nessun segnale sia stato perso nell'analisi. Se si esegue l'imaging della stessa sezione cerebrale a vari ingrandimenti, si consiglia di utilizzare prima gli ingrandimenti inferiori, poiché l'ingrandimento più elevato sbianca più rapidamente il segnale mTomato.
  2. Per visualizzare i cervelli cancellati, utilizzare un microscopio confocale invertito con uno stadio automatizzato e una funzione di piastrellatura automatizzata. Usiamo il microscopio Leica Stellaris 5. Poiché i campioni sono così spessi (>500 μm), sono necessarie distanze di lavoro maggiori che limitano l'ingrandimento che può essere efficacemente raggiunto. Utilizziamo l'obiettivo HC PL APO 10x/0.40 CS2 per tutte le immagini cerebrali cancellate.
    1. Inizia posando una sezione cerebrale ripulita piatta contro un piatto di fondo di vetro e immergiti nell'etere dibenzile.
      NOTA: l'etere dibenzil è corrosivo per la maggior parte delle lenti oggettive e la maggior parte delle materie plastiche. Per questo motivo, qualsiasi plastica interna nel piatto di fondo di vetro deve essere rivestita con elastomero siliconico ad asciugatura rapida.
    2. Configurare le linee laser e i filtri di emissione corretti. Per i cervelli Tet-On co-macchiati con un reporter mTmG, selezionare DAPI, GFP, tdTomato e il corrispondente fluoroforo rosso lontano per abbinare il fluoroforo utilizzato sull'anticorpo secondario. Imposta la risoluzione desiderata, ti consigliamo almeno 1024 x 1024. Impostare il foro stenopeico su 1 AU.
    3. Stabilisci prima l'intensità del laser e il guadagno del rilevatore con un cervello cre-controllo macchiato sia con GFP che con il secondario fluorescente. Queste fette di cervello controlleranno la fluorescenza di fondo dagli anticorpi fluorescenti e non mostreranno alcun segnale GFP reale.
    4. Una volta ottimizzate le intensità del laser e il guadagno del rilevatore, mappare il cervello per l'imaging. Inizia localizzando l'intero perimetro della sezione cerebrale per impostare l'asse X e Y dell'acquisizione dell'immagine. Quindi, identificare l'asse Z impostando il punto focale approssimativamente sulla profondità centrale del tessuto e utilizzare i controlli di posizionamento Z per individuare il punto "più alto" del tessuto (valore Z più positivo). Scansiona varie regioni del tessuto aumentando l'altezza massima dell'asse Z, se necessario.
      1. Ripetere per il punto "più basso" (valore Z più negativo) necessario per ottenere l'intero spessore del tessuto. Lo Stellaris 5 ha un limite di ± 250 um del punto focale. Questo limita le sezioni ottiche a 500 μm di spessore nell'asse Z. L'area 3D della sezione cerebrale è ora nota.
    5. Impostare la dimensione Z-step su 6 μm e iniziare ad acquisire l'immagine. Il tempo di acquisizione dipende da diversi fattori e può variare da ore a giorni a seconda dei parametri desiderati. Per ridurre il tempo di acquisizione delle immagini, prova a ridurre le risoluzioni, aumentare la velocità di scansione laser o aumentare le dimensioni dei passaggi.
    6. Una volta acquisita l'immagine piastrellata dell'intera sezione cerebrale cancellata, analizzare come desiderato.

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Representative Results

Mentre il segnale fluorescente risultante da un sistema Tet-On con un reporter fluorescente varierà a seconda del promotore di interesse e dei fluorofori utilizzati, descriveremo come i risultati sono stati analizzati con gli animali mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L'analisi del cervello adulto dopo un inseguimento del polso ha portato a cellule che esprimono GFP di membrana in varie nicchie anatomiche. La differenza di intensità fluorescente tra i vari tipi di cellule deve essere notata. Una variabile per quanto riguarda l'intensità fluorescente è la dimensione della membrana cellulare. Ad esempio, le cellule epiteliali coroidiche (CPEC) nel plesso coroideo hanno una membrana cellulare spessa e un forte segnale fluorescente che è stato facilmente distinto dalle cellule circostanti (Figura 4A, B). Tuttavia, altri tipi di cellule più piccoli e attualmente non identificati nello stroma del plesso coroideo avevano un segnale GFP più debole (Figura 4C). Nel cervelletto, le cellule gliali di Bergmann esprimevano livelli più elevati di mGFP rispetto alle cellule del cesto e la variazione nell'espressione di mGFP esisteva anche tra le singole cellule del cesto (Figura 4D). Anche gli assoni neuronali sensoriali olfattivi all'interno dello strato glomerulare del bulbo olfattivo esprimevano alti livelli di mGFP (Figura 4A,E). Per garantire che tutte le cellule mGFP+ siano identificate, è quindi importante identificare sia le cellule GFP+ luminose che quelle deboli in tutto il cervello degli animali mTmG. Negli animali mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG, abbiamo osservato un'espressione di mGFP a basso fondo in tutte le regioni del cervello, compresa la corteccia cerebrale (Figura 4A). È interessante notare che il cervelletto e il tronco cerebrale hanno mostrato un'espressione mGFP di fondo inferiore in questo modo (Figura 4A).

Durante l'analisi del tessuto cerebrale dopo una traccia di lignaggio ci saranno differenze nei modelli di espressione di mGFP e mTomato sia nelle regioni del cervello che nei tipi di cellule. Gli assoni neuronali sensoriali olfattivi che riempiono lo strato glomerulare del bulbo olfattivo hanno espresso alti livelli di pomodoro a membrana rispetto alla maggior parte delle altre regioni del cervello, anche quando gli stessi neuroni sono mGFP +, indicando che alcune cellule sembravano perdere il segnale mTomato più lentamente (Figura 4D). Al contrario, nel plesso coroideo, le cellule mGFP+ hanno espresso un basso mTomato (Figura 4B,C). Nella maggior parte delle altre regioni del cervello il segnale del pomodoro è distribuito uniformemente tra i tipi di cellule, con le cellule endoteliali che sono alcune delle uniche cellule il cui segnale fluorescente era abbastanza luminoso da distinguersi dallo sfondo fluorescente rosso (Figura 4B). L'attivazione dell'espressione di mGFP e la scissione di mTomato dal genoma durante la ricombinazione provoca una perdita di espressione di mTomato, ma i fluorofori mTomato che sono espressi sulla membrana vengono trattenuti fino a quando non si degradano. Per questo motivo, le cellule mGFP+ spesso esprimono il segnale mTomato variabile, che dipenderà dalla recency della ricombinazione, dal tipo di cellula e dalle dimensioni della membrana cellulare. Pertanto, è importante analizzare le cellule in base all'espressione di mGFP e non escluderle dall'analisi se esprimono sia mGFP che mTomato.

I reporter alternativi possono anche essere utilizzati in combinazione con il sistema Tet-On. La ricombinazione cre può agire per indurre l'espressione di GFP o RFP in cellule che normalmente non esprimono alcun tag fluorescente negli animali Rosa-GFP o Rosa-RFP. Qui, l'analisi di GFP o RFP indicherà l'espressione del promotore di interesse e nessun segnale fluoroforo verrà rimosso come con gli animali mTmG. I reporter a singolo fluoroforo consentono l'immunocolorazione con più combinazioni di anticorpi fluorescenti, poiché il pomodoro a membrana negli animali mTmG impedisce la colorazione nella lunghezza d'onda rossa.

Figure 1
Figura 1. Generazione di una linea di mouse Tet-On. (A) Schema di allevamento per la creazione di topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG da singole linee di topo. (B) Schema del sistema Tet-On nella linea del mouse mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (C-D) Immagini rappresentative di clip auricolari ripresi con canale FITC di un microscopio epifluorescente da topi non germinali (C) e germinali (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Disegni sperimentali con topi Tet-On che tracciano il lignaggio. Illustrazioni di esperimenti possibili con topi Tet-On dalla proliferazione basale, migrazione e differenziazione (1) a trattamenti durante l'impulso dox senza inseguimento per la rigenerazione o il riequilibrio (2), interventi durante il polso con l'opportunità di visualizzare effetti a lungo termine (3). Un breve impulso di 2 giorni senza inseguimento successivo fornirà informazioni su uno stato quasi basale delle cellule TERT +, poiché queste cellule avranno poco tempo per attivarsi, proliferare, migrare o differenziarsi (4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Pulizia cerebrale dei cervelli di topo mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (A) Sezionamento sagittale di sezioni cerebrali di 1 mm dopo la fissazione. (B) Le singole sezioni cerebrali sono collocate in tubi da 5 ml per la pulizia del cervello iDISCO39. (C) I cervelli eliminati vengono collocati in piastre di fondo di vetro e immersi in DBE per la corrispondenza dell'indice di rifrazione durante l'acquisizione dell'immagine. (D) Cattura l'intera area del cervello come una serie di Z-stack che saranno uniti per formare un'immagine 3D completa del cervello. Questa può quindi essere l'intensità massima Z proiettata per creare un'immagine 2D dal set di dati 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Tracciamento del lignaggio dei cervelli di topo adulti mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG dopo un polso di 3 settimane e un inseguimento di 11 giorni di doxiciclina. (A) Sezione cerebrale cancellata di topo adulto mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG con aree specifiche del segnale mGFP mostrate con inserti (N = 3 topi maschi). (B-C) Immagine rappresentativa del plesso coroideo mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG che identifica le CPEC mGFP+ (B) e i tipi di cellule mGFP+ più piccoli e più deboli (C; N = 4 maschi, N = 6 femmine). (D) Immagine rappresentativa di mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG cerebellare Bergmann glia (luminosa) e cellule cesto nello strato molecolare del cervelletto (dim; N = 4 maschi, N = 6 femmine). (E) Immagine rappresentativa dello strato glomerulare olfattivo del cervello mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Le linee tratteggiate indicano compartimenti glomerulari (N = 4 maschi, N = 6 femmine). Le barre della scala sono 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Tabella complementare 2. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Viene descritto un metodo per la creazione, l'utilizzo e l'analisi di un triplo lignaggio transgenico che traccia la linea di topo che segna le cellule staminali all'interno del cervello di topo adulto in vivo. Se combinato con l'immunocolorazione o la pulizia del cervello, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule fluorescenti tracciate attraverso il cervello possono essere realizzate. Questa tecnica offre la capacità di comprendere il potenziale plastico / rigenerativo / rimodellante delle cellule staminali etichettate mentre si attivano, migrano, si differenziano o proliferano. Mentre i dati precedenti ottenuti tramite ritenzione dell'etichetta con timidina-H3 e BrdU hanno concluso che il V-SVZ, il bulbo olfattivo e la zona subgranulare del giro dentato erano le uniche regioni cerebrali neurogeniche nei mammiferi adulti 2,3,4,5,6,7,8,43, ora è chiaro che la neurogenesi adulta si verifica anche nella corteccia 44, ipotalamo45,46 e striato 47,48,49, così come potenzialmente altre nicchie nuove che non sono state ben studiate. La gliogenesi adulta, il processo attraverso il quale le cellule precursori gliali creano astrociti e oligodendrociti appena nati, si verifica anche in tutto il cervello37, e si ipotizza che glia e neuroni derivino dalla stessa cellula staminale multipotente. Per questi motivi, gli studi di tracciamento del lignaggio sono stati parte integrante della comprensione del ruolo di vari tipi di cellule staminali che contribuiscono a reintegrare e rigenerare i neuroni e la glia nel cervello dei mammiferi adulti (recensito in50).

Per gli studi sulla plasticità cerebrale adulta, l'età ottimale è di 12 settimane di età, quando il cervello murino ha completato lo sviluppo51. Quando si pianifica la lunghezza dell'impulso doxiciclina e il successivo inseguimento, è fondamentale comprendere il processo di interesse, in modo che i tempi di inseguimento dell'impulso siano abbastanza lunghi da consentire il verificarsi dei processi di interesse. Ad esempio, la creazione di neuroni appena nati nel bulbo olfattivo da cellule staminali neurali adulte (ANSC) nel V-SVZ è di circa 4 settimane, come determinato da precedenti studi di tracciamento del lignaggio52. Uno studio di pulse-chase che etichetterà le ANSC nel V-SVZ deve quindi essere entro quel lasso di tempo per consentire alle ANSC nel V-SVZ di dividersi, affinché queste ANSC si differenzino in tipi di cellule intermedie e che questi tipi di cellule intermedie migrino verso il bulbo olfattivo e si differenzino in neuroni nati da adulti. La durata dell'inseguimento determinerà la quantità di tempo in cui le cellule etichettate e la loro progenie devono continuare la loro migrazione e differenziazione, sebbene questi processi si verifichino anche durante l'impulso. Nel complesso, è importante comprendere i processi coinvolti, poiché la tempistica di ogni esperimento di tracciamento del lignaggio deve consentire il verificarsi dei processi appropriati.

Mentre questo manoscritto descrive in dettaglio il sistema Tet-On, esistono altri transgeni di tracciamento del lignaggio che possono essere utilizzati. Il transgene CreERT2 consente l'espressione di una Cre ricombinasi attiva solo in presenza di tamoxifene o 4-OHT, un derivato del tamoxifene. Quando questo Cre è regolato da un promotore di interesse, la somministrazione di 4-OHT o tamoxifene produrrà solo la ricombinazione di Cre nelle cellule che esprimono quel promotore. Se abbinato a un gene reporter come Rosa-LSL-GFP o Rosa-mTmG, la ricombinazione Cre-lox segnerà in modo indelebile le cellule che esprimono Cre durante la somministrazione di tamoxifene. Uno svantaggio di questo sistema è l'uso del tamoxifene, che ha effetti avversi di lunga durata sulla neurogenesi nel cervello prenatale e adulto17. Per questo motivo, gli studi di tracciamento del lignaggio con le linee CreERT2 dovranno considerare gli avvertimenti coinvolti.

Gli studi di tracciamento del lignaggio nel cervello adulto sono spesso eseguiti con marcatori di cellule staminali come Nestin o marcatori di cellule precursori gliali tra cui NG253,54. Mentre i dati risultanti indicano il turnover e la differenziazione di queste cellule in tipi di cellule mature neonatali, l'espressione di questi marcatori da parte di vari altri tipi di cellule nel cervello adulto può essere confondente. Ad esempio, nestin, una proteina del filamento intermedio coinvolta nella mitosi55, è espressa anche dai neuroni maturi56 e dai tipi di cellule meningee57. Altri marcatori di cellule staminali includono la proteina acida fibrillare gliale (GFAP)58,59 e il trasportatore dell'aspartato di glutammato 1 (GLAST)60, che sono espressi dagli astrociti in tutto il cervello adulto e61. Per questo motivo, sono necessari studi di tracciamento del lignaggio con marcatori aggiuntivi. Mentre impariamo di più sull'ampio impatto della plasticità adulta nel cervello, la caratterizzazione e l'analisi delle cellule che svolgono un ruolo in questi processi e nella loro progenie rimangono di vitale importanza per la nostra comprensione dei percorsi neurogenici e gliogeni coinvolti nella salute neurodegenerativa e altro ancora.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) e il dottor Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) per la guida utilizzando animali mTert-rtTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscienze Numero 183
Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto
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Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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